Sveučilište u Zgrebu Prirodoslovno- mtemtički fkultet Biološki odjsek Božn Ćvrušić Učink dušik n fotosintetsku učinkovitost i pigmente u lišj Everni prunstri Diplomski rd Zgreb, 2017.
Ovj rd, izrđen n Botničkom zvodu Biološkog odsjek Prirodoslovno-mtemtičkog fkultet Sveučilišt u Zgrebu, pod vodstvom izv. prof. dr. sc. Mirte Tklec, predn je n ocjenu Biološkom odsjeku Prirodoslovno-mtemtičkog fkultet Sveučilišt u Zgrebu rdi stjecnj zvnj mgistr edukcije biologije i kemije.
Zhvljujem se od src svojoj mentorici Mirti Tklec n velikoj pomoći i puno strpljenj tijekom pisnj ovog rd. Veliko hvl mmi Gordni i sestrm Sneli i Mreli n velikoj potpri, strpljenju i bodrenju kd je bilo njteže. Bez vs moj bi put bio puno teži. Od src se zhvljujem i svom dečku Ivici što je svo vrijeme studij bio uz mene, bodrio me i dvo mi sngu koju drugi nisu mogli. Hvl n svoj ljubvi, strpljenju i vjeri u mene. Hvl svim prijteljim i kolegm koji su svojom prisutnošću olkšli i uljepšli godine studirnj. Posebno hvl bki Mrici i didi Mići bez kojih ne bih dobil mogućnost pisti ovj rd.
TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA Sveučilište u Zgrebu Prirodoslovno-mtemtički fkultet Biološki odsjek Diplomski rd Učink dušik n fotosintetsku učinkovitost i pigmente u lišj Everni prunstri Božn Ćvrušić Rooseveltov trg 6, 10000 Zgreb, Hrvtsk Lišjevi su fotosintetski orgnizmi koji se često koriste ko bioindiktori zgđenj zrk. Vrst lišj Everni prunstri vrlo je osjetljiv n zgđenje zrk dušikovim spojevim. Štetn utjecj dušikovih spojev povezn je i s drugim okolišnim prmetrim poput osvjetljenj i vlžnosti. Cilj ovog istrživnj bio je provjeriti kko dušik u obliku monijevih ion odnosno nitrt djeluje n fotosintetsku učinkovitost i pigmente lišj Everni prunstri. Uzorci lišjev tretirni su 30 minutnim urnjnjem u 1 M otopinu klijevog nitrt, 1 M otopinu monijevog nitrti 0,5 M otopinu monijevog sulft. Dio uzork tijekom trjnj pokus izložen je slbijem intenzitetu svjetl (40 µmol foton m -2 s -1 ), dio jčem (100 µmol foton m -2 s -1 ) kko bi se utvrdio utjecj osvjetljenj. Mjerenje fluorescencije klorofil i određivnje udjel klorofil, klorofil b, ukupnih krotenoid te kvocijent feofitinizcije nprvljeno je 3., 7. i 14. dn nkon tretmn dušikom. Rezultti su pokzli d dušikovi spojevi imju znčjn negtivn učink n fotosintezu u lišj Everni prunstri budući d su uzrokovli sniženje vrijednosti prmetr fluorescencije klorofil ko i smnjenje udjel fotosintetskih pigment u tkivu. Znčjniji utjecj pokzli su tretmni dušikom u obliku monijevih ion, nešto mnji utjecj oni gdje je dušik bio smo u obliku nitrt. Izlgnje lišjev tretirnih dušikom jčem intenzitetu svjetlosti imlo je negtivniji utjecj n fotosintetsku učinkovitost i pigmente u odnosu n izlgnje slbijem intenzitetu. (72 strnic, 34 slik, 29 tblic, 40 literturnih nvod, hrvtski jezik) Rd je pohrnjen u Središnjoj biološkoj knjižnici Ključne riječi: fotosintez, pigmenti, klijev nitrt, monijev nitrt, monijev sulft, svjetlost Voditelj: Dr. sc. Mirt Tklec, izv. prof. Ocjenitelji: Dr. sc. Mirt Tklec, izv. prof. Dr. sc. Ines Rdnović, izv. prof. Dr. sc. Iv Jurnović Cindrić, izv. prof. Dr. sc. Drginj Mrvoš- Sermek, izv. prof Rd prihvćen: 5.9.2017.
BASIC DOCUMENTATION CARD University of Zgreb Fculty of Science Deprtment of Biology Grdution Thesis The effect of nitrogen on photosynthetic efficiency nd pigments in the lichens Everni prunstri Božn Ćvrušić Rooseveltov trg 6, 10000 Zgreb, Croti Lichens re photosynthetic orgnisms tht re often used s bioindictors of ir pollution. One of the lichen species tht is very sensitive to ir pollution by nitrogen compounds is Everni prunstri. The hrmful effect of nitrogen compounds is relted lso to the other environmentl prmeters such s light intensity nd humidity. The gol of this reserch ws to find out how nitrogen in the form of mmonium ions or nitrtes ffects photosynthetic efficiency nd pigments of the Everni prunstri. Lichen smples were treted by immersion in 1 M potssium nitrte solution, 1 M mmonium nitrte solution nd 0,5 M mmonium sulfte solution for 30 minutes. In order to determine the influence of light, one group of the smples ws exposed to lower light intensity (40 µmol photon m -2 s -1 ) nd nother to higer light intensity (100 µmol photon m -2 s -1 ) during the experiment. Chlorophyll flourescence mesurements s well s the determintion of the content of chlorophyll, chlorophyll b nd crotenoids, nd the pheophytiniztion quotient were done on the 3rd, 7th nd 14th dy fter the nitrogen tretment. The results showed tht nitrogen compounds hve significnt negtive effect on photosynthesis of the Everni prunstri since they cused decrese of chlorophyll flourescence prmeters s well s decrese in the content of photosynthetic pigments in lichen tissue. A tretment with nitrogen in the form of mmonium ions hd more severe effect thn tretment with nitrogen pplied only in the form of nitrte. Exposure of nitrogen-treted lichen to higher light intensity hd more negtive effect on the photosynthetic performnce nd pigments thn exposure to lower light intensity. (72 pges, 34 figures, 29 tbles, 40 references, originl in: Crotin lnguge) Thesis deposited in the Centrl Biologicl Librry Supervisor: Dr. Mirt Tklec, Assoc.Prof. Key words: photosyntesis, pigments,potssium nitrte, mmonium nitrte, mmonium sulfte, light Reviewers: Dr. Mirt Tklec, Assoc.Prof. Dr. Ines Rdnović, Assoc.Prof. Dr. Iv Jurnović Cindrić, Assoc.Prof. Dr. Drginj Mrvoš Sermek, Assoc.Prof. Thesis ccepted: September 5, 2017
Sdržj 1. UVOD 1 1.1. Što su lišjevi? 1 1.2. Lišjevi- bioindiktori zgđenj 2 1.3. Everni prunstri (L.) Ach 4 1.4. Fotosintez 5 1.5. Ciljevi istrživnj 11 2. MATERIJALI I METODE 12 2.1. Istrživni mterijl 12 2.2. Kemiklije 12 2.3. Tretirnje kemiklijm 13 2.4. Mjerenje fluorescencije klorofil in vivo 15 2.5. Ekstrkscij i određivnje udjel fotosintetskih pigment 16 2.6. Sttističk obrd 16 3. REZULTATI 18 3.1. Fluorescencij klorofil in vivo 18 3.1.1. Mksimlni kvntni prinos fotosustv II (QYmx) 18 3.1.2. Efektivni kvntni prinos fotosustv II (QY) 23 3.1.3. Fotokemijsko gšenje fluorescencije (QP) 29 3.1.4. Nefotokemijsko gšenje fluorescecije (NPQ) 35 3.2. Fotosintetski pigmenti 42 3.2.1. Klorofil 42 3.2.2. Klorofil b 46 3.2.3. Ukupni krotenoidi 50 3.2.4. Kvocijent feofitinizcije 53 4. RASPRAVA 58 5. ZAKLJUČAK 68 6. LITERATURA 69 7. ŽIVOTOPIS 72
1. UVOD 1.1. Što su lišjevi? Lišjevi su orgnizmi koje čine predstvnici dvju crstv. Jedn predstvnik iz crstv je gljiv (mikobiont), drugi uvijek mor imti mogućnost proces fotosinteze (fotobiont). Ako ulogu fotobiont im lg td se tj čln nziv fikobiont, kd tu ulogu preuzim cijnobkterij nzivmo g cijnobiont. Prirod simbioze u lišj je još diskutbiln i zvrjeđuje dljnje istrživnje. Većin literture i mnog istrživnj slžu se d su lišjevi klsičn primjer mutulističkog odnos, u kojem ob čln imju korist od međusobnog odnos. Untoč tome, neki ih smtrju primjerom przitskog odnos s obzirom n to d u odnosu većinu koristi im mikobiont, fotobiont se sporije rzvij u tkvom odnosu nego ko slobodnoživući orgnizm (Ahmdijn, 1993 prem Nsh, 2008). U prilog tvrdnji d je odnos u lišjev mutulistički ide i činjenic d fotobiont fotosintetizir i mikobiont opskrbljuje potrebnim ugljikohidrtim koji su produkti tog proces. Mikobiont, s druge strne, opskrbljuje fotobiont potrebnom vodom i minerlnim tvrim koje crpi iz zemlje ili tmosfere, osim tog i štiti fotobiont od previsokog intenzitet svjetlosti. Neobičn zjednic, uprvo zbog simbiotskog odnos, može se nći u svim terestričkim područjim, od tropskih do polrnih regij (Nsh, 2008). Mogu se nći n područjim visokih i jko niskih tempertur, jko izrženog slinitet, poplvljenim ili ekstremno suhim tlim, tlim siromšnim minerlnim tvrim p i n područjim onečišćenog zrk. Ipk, većin je lišjev osjetljiv n promjene okoliš u kojem žive i koji je krkterističn z njihovu vrstu (Poli i sur, 2014) Lišjevi se nzivju i pioniri vegetcije zbog njihove velike tolerncije n stres što ih ujedno i odvj od ostlih eukriotskih orgnizm. Većin lišjev su spororstući i dugoživući orgnizmi p bismo mogli reći d tijekom dužih rzdoblj zdržvju prilično nepromijenjenu morfologiju (Nsh, 2008), smo rijetki među njim, oni koji žive u ekstremnim uvjetim, koriste krtk povoljn rzdoblj z brzi rst. Lišjevi nemju mogućnost periodički odbcivti svoje dijelove ko što biljke odbcuju lišće. Trdicionlno su podijeljeni u tri glvne skupine: korsti, liststi i grmsti tj. fruktozni lišjevi. Grđeni su iz 4 sloj (Slik 1). Prvi sloj nziv se plektenhim, čini g sloj gusto isprepletenih hif gljiv. Hife ulze u drugi, gendijlni sloj u kojem se nlze lge p iz tog sloj crpe ugljikohidrte koji su ondje nstli procesom fotosinteze. Srž lišj čini mrež hif gljiv te u njoj dolzi do izmjene plinov. Zdnji sloj grđen je 1
slično ko i prvi, od hif gljiv, sdrži i rizoide kojim se lišj pričvršćuje z podlogu (Nsh, 2008). Slik 1 Prikz slojevitosti ntomske grđe lišjev. Preuzeto i prilgođeno prem: https://s3-us-west-2.mzonws.com/courses-imges/wp-content/uplods/sites/1094/2016/11 /03154447/OSC_Microbio_05_05_lichenstr.jpg 1.2. Lišjevi - bioindiktori zgđenj Svjedoci smo sve većeg onečišćenj zrk koji je posljedic urbnizcije, industrijlizcije, pojčnog promet motornim vozilim ko smog povećnj broj ljudi n Zemlji. Tkođer, zbog nstnk urbnih središt sve je mnje zelenih površin n Zemlji te tko problemi onečišćenj zrk postju globlni ekološki problemi, problemi svih ns. Zimi zbog slbije cirkulcije zrk, onečišćeni se zrk zdržv bliže površini Zemlje te td problem onečišćenog zrk postje još jsniji. U onečišćenom zrku nlzi se velik količin teških metl. To su elementi gustoće veće od 4 g/cm 3. Neesencijlni teški metli toksični su ili otrovni u vrlo niskim koncentrcijm. Tkođer, tu su i rzni štetni sumporni i dušikovi spojevi, njčešće u obliku oksid nstli ko posljedic izgrnj fosilnih goriv. Poznto je d su kisele kiše nčinile mnoge štete kulturnoj bštini ko i živim orgnizmim n Zemlji. Z nstjnje kiselih kiš odgovorn je sumporov dioksid (SO 2) 2
koji u vlžnoj tmosferi oksidir te nstle kiseline snižvju ph vrijednost kiš koje potom pdju n tlo. U prošlosti sumporov dioksid bio je glvni onečišćivč zrk koji je utjeco štetno n fiziologiju lišjev ko i n prisutnost lišjev n nekom području. U poslijednjem desetljeću znčjno je po štetn utjecj sumporov dioksid n lišjeve i njegovo mjesto, ko glvnog globlnog onečišćivč, koji štetno djeluje i n lišjeve, preuzimju spojevi s dušikom (Munzi i sur, 2009). Dušik je element neophodno potrebn z život jer sudjeluje u formirnju protein i nukleinskih kiselin te molekul klorofil ko i enzim koji sudjeluju u procesu fotosinteze. Njegov ogrničen količin utječe n rst i produktivnost obju orgnizm koji čine lišj, li i n ekosustv u cijelosti (Nsh, 2008). Atmosferski dušik (N 2) u tom obliku ne ulzi u sstv Zemljine kore te g stijene ne ulžu u svoju strukturu tijekom formirnj ko što to rde s mnogim drugim elementim. Tkođer, u toj formi g ni većin orgnizm ne može iskoristiti. Nitrti (NO 3 ), monijk (NH 3) ili monijevi ioni (NH 4+ ) su norgnske forme dušik koje većin orgnizm univerzlno koristi. Dušik se u određenom okolišu može pojvljivti u pretjernim količinm npr. u mjestim gdje se povećn količin monijk nkuplj zbog odlgnj gnojiv ili u grdovim gdje je zbog tvorničke proizvodnje i motornih vozil, tj. sgorijevnj fosilnih goriv, povećn količin svih ispušnih plinov (CO, SO 2, NO X) (Nsh, 2008). Ponekd biljke zbog povećne koncentrcije dušik u tlu povećvju i njegovu koncentrciju u listu što rezultir povećnjem stope fotosinteze jer g one ugrđuju u ugljikov kostur klorofil čime se povećv koncentrcij klorofil (Ripullone i sur, 2003). Lišjevi u svojoj grđi nemju voštnu kutikulu te cijelom površinom svog tlus psorbirju tvri iz okoline p tko i onečišćivče iz zrk. U tkvim uvjetim količin psorbirnih i kumulirnih tvri često premšuje njihove fiziološke potrebe z tim tvrim te to može izzvti stres orgnizm. U lišjev koji imju lgu z fotobiont, količin pohrnjenog dušik ovisi o koncentrciji tih formi u zrku. Lišjevi koji z fotobiont imju cijnobkteriju mogu psorbirti i i dušik u obliku N 2. Rezultt tog je d lišji koji z fotobiont imju cijnobkterije mogu imti veću koncentrciju dušik pohrnjenu u svom tlusu (2,2-4,7%), oni koji z fotobiont imju lgu mogu imti mnju količinu pohrnjenog dušik u tlusu (0,4-0,85%) (Nsh, 2008). Međutim, mnoge vrste lišjev osobito cidofilne vrste osjetljive su n povećnu količinu dušik p nestju iz tkvog okoliš. Tko je u Sjevernoj Americi došlo do znčjnog smnjivnj osjetljivih vrst lišjev u blizini grdov i poljoprivrednih površin gdje su zbilježene i povećne količine dušik (Oliver, 2011). N primjer vrste Hypogymni physodes, Lecnor conizeoides i Prmeliopsis mbigu osobito su osjetljive n monijk otopljen u kiši i mgli dok su vrste Everni prunsri, Prmeli sxtilis, 3
Leprri incn, Hypogymni physodes, te vrste iz rodov Cloni i Usne osjetljive n dušikove okside u zrku. Nvedene krkteristike čine lišjeve dobrim bioindiktorim zgđenj zrk (Conti i Cecchetti, 2000). Rznolikost lišjev n nekom području ko i promjene fizioloških prmetr dju nm uvid u količinu okolišnog stres koji nstje u urbnim područjim. Učink štetnih tvri iz onečišćenog zrk, p tko i spojev s dušikom, n lišjeve uvelike ovisi i o prmetrim poput temperture, vlge i osvjetljenj kojim su lišjevi izloženi. Poznto je d jko osvjetljenje može imti štetn utjecj n fotosintezu lišjev (Demmig-Adms i Adms, 1996) u tkvim okolnostim. Uprvo je smnjen učinkovitost fotosinteze jedn od pokztelj jčine stres u lišjev. Tkođer, pokztelji štetnog učink onečišćenog zrk mogu biti pojčn produkcij etilen, gubitk elektrolit zbog oštećenj stničnih membrni, smnjenje sdržj ATP- i fikscije N 2, respircije, dolzi i do povećne degrdcije klorofil (Grty i sur, 2003). Uprvo koristeći se svim nvedenim krkteristikm lišjev možemo zključiti d oni tko postju vrlo efiksn, li i jeftin sredstv z određivnje stupnj onečišćenj zrk. 1.3. Everni prunstri (L.) Ach. Everni prunstri (L.) Ach, iz porodice Prmelicee, fruktozni je lišj. Tlus ove vrste dihotomski je rzgrnjen n mnje ili više ogrnk (Slik 2), može biti širine između 0,5 i 3 mm. Ako je lišj zdrv njegov gornj površin je zelenksto-sive boje do blijedo zeleno-žute. Donj površin tlus lišj bojom se ne rzlikuje puno od gornje ili je z nijnsu svjetlij. U slučju d lišj obolio ili je oštećen boj mu postje sivkst i slbijeg je intenzitet. Everni prunstri rste n kori listopdnog drveć, njčešće hrst, p s tog ne čudi d je vrst široko rsprostrnjen n području Slvonije. Voli vlžn, osunčn i vjetrovit područj nižih ndmorskih visin, smo rijetko nstnjuje područj do 1675 m ndmorske visine (Nsh, 2001). Vrst Everni prunstri spd u cidofilnu vrstu lišjev te je stog osjetljiv n prisutnost dušikovih spojev osobito monijk u zrku (Munzi i sur, 2010) ko i n prisutnost teških metl. Često se koristi u istrživnjim jer je lk z skupljnje, trnsport i pripremnje z nlizu (Poli i sur, 2014). 4
Slik 2 Vrst Everni prusstri (L) Ach, preuzeto i prilgođeno prem: https://i0.wp.com/www.herbl-supplement-resource.com/wp-content/uplods/2014/01/okmos s_everni_prunstri_img-e1474355017756.jpg?ssl=1 1.4. Fotosintez Fotosintez je proces u kojem se pomoću sunčeve energije i vode ugljikov (IV) oksid iz zrk ugrđuje u orgnske spojeve uz oslobđnje kisik. To je proces u kojem se sunčev energij pretvr u kemijsku energiju pohrnjenu u kemijskim vezm orgnskih molekul. Svjetlost je elektromgnetsko zrčenje vidljivo ljudskom oku. Nime, to je fizikln pojv širenj mgnetskih i električnih vlov odnosno foton. Povećnjem intenzitet svjetlosti linerno se povećv i učinkovitost fotosinteze sve dok u jednom trenutku dljnji dotok energije u obliku foton više ne utječe n stopu fotosinteze ili n nju djeluje čk i negtivno. Svi fotosintetski orgnizmi morju imti fotosintetske pigmente. Fotosintetski pigmenti smješteni su u grn i strom tilkoidnim membrnm koje odvjju prostor tilkoid od osttk kloroplst tj. njegove strome. U tilkoidnim membrnm nlze se klorofil i klorofil b i krotenoidi. U lišjevi koji z fotobiont imju cijnobkteriju u tilkoidnim membrnm se ko pomoćni pigmenti nlze fikobilini i fikoeritrini. Molekul klorofil izgrđen je od četiri pirolov prsten povezn u porfirinski prsten (Slik 3). Dijelovi konjugirnih dvostrukih vez odgovorni su z psorpciju vidljive svjetlosti. U tvorbi dvostrukih vez sudjeluju i elektroni koji se psorpcijom svjetlosti lko pobuđuju. U centru porfirinskog prsten nlzi se dvovlentni tom mgnezij povezn s dušikovim tomim pirolovih prsten. Porfirinski prsten nosi rzličite funkcionlne skupine ko što je viniln n prvom pirolovom prstenu, metiln skupin n drugom kod klorofil, 5
dok se u slučju klorofil b n tom mjestu nlzi ldehidn skupin. N porfirinskom prstenu nlzimo još metilne i etilnu skupinu. N pirolov prsten vezn je i lkohol fitol koji zntno pridonosi lipofilnim svojstvim molekule klorofil. Ako molekuli klorofil ne dostje tom mgnezij ond g nzivmo feofitin. Klorofil psorbir svjetlost vlnih duljin 430 nm i 663 nm, klorofil b 453 nm i 642 nm. Klorofil osobito je znčjn jer njemu pripd središnj ulog u fotosintezi. Klorofil b je pomoćni pigment jer on prenosi vlstitu pobudu n klorofil čime se povećv rspon vlnih duljin svjetlosti dostupnih z fotosintezu (Dubrvec i Regul, 1995). Krotenoidi su po grđi terpeni. Lipofilni su spojevi koji se sstoje od izoprenskih jedinic s jednim ili dv ionsk prsten. Apsorbirju svjetlost vlnih duljin od 380 nm do 550 nm te tkođer proširuju spektr svjetlosne energije koj može sudjelovti u fotosintezi. Budući d pigmenti psorbirju velike količine energije, može doći do oštećenj fotosintetske membrne. Ako pobuđeno stnje klorofil potrje dulje dolzi do rekcije s molekulskim kisikom, pri čemu nstje singletni kisik koji je vrlo rektivn i može oštetiti stnične sstojke, pogotovo lipide. Krotenoidi gse pobuđeno stnje klorofil i n tj nčin djeluju zštitnički (Pevlek- Kozlin, 2003). Slik 3 Prikz klorofil i klorofil b, preuzeto s https://istiqomhrrr.wordpress.com/ 2013/06/12/pigmen-klorofil/ U uvjetim pojčnog intenzitet svjetlosti, li i nekim drugim stresnim uvjetim ko što je onečišćenje zrk kko bi se izbjegl fotoinhibicij do koje u tim uvjetim dolzi, mijenj se omjer pigment tj. smnjuje se udio klorofil, povećv udio krotenoid (Wlters, 2005). Demming- Adms i Adms (1996, prem Frnck i sur, 6
2007) ustnovili su d se fotosintetski orgnizmi mogu zštiti od prejkog svjetl smnjujući ukupnu količinu klorofil (Chl +b), povećvjući udio krotenoid. U stresnim uvjetim tkođer često dolzi do degrdcije molekul klorofil i nstje feofitin. Ko što je već rečeno, feofitin im istu strukturu ko klorofil smo što u središtu porfirinskog prsten više nem Mg 2+ ion. Lišjevim, ko i biljkm, dje smećkstu boju. U istrživnjim n lišjevim degrdcij klorofil često se izržv ko kvocijent feofitinizcije (FC) odnosno ko omjer klorofil i feofitin te se koristi ko pokztelj stresnog učink n fotobiont u lišju (Bčkor i Loopi, 2009). U procesu fotosinteze, rzlikujemo svjetlosne rekcije fotosinteze (primrne) i one biokemijske odnosno rekcije Clvinovog ciklus (sekundrne). U svjetlosnim rekcijm se oksidcijom vode proizvodi kisik koji je nužn z proces oksidcijskog disnj svih erobnih orgnizm te nstju molekule ATP- i NADPH. One se dlje koriste pri procesu sinteze ugljikohidrt u rekcijm Clvinovog ciklus. Z procese svjetlosnih rekcij potrebni su fotosistem I (PS I) i fotosistem II (PSII). Svki od tih fotosistem im svoje ntenske dijelove što su zprvo pigmenti, ili tkozvni kolektori koji psorbirju fotone svjetlosti (Dubrvec i Regul, 1995). U tom trenutku dolzi do pobude (ekscitcije) molekul pigment, tj. njihovi elektroni prelze u više energetsko stnje. Oni rezonncijskim putem prenose energiju s jedne n drugu susjednu molekulu pigment do rekcijskog središt. U rekcijskom središtu PS I nlzi se specifičn molekul klorofil tj. P 700 koj im mksimum psorpcije pri 700 nm. U tko pobuđenom stnju P 700 je jko redukcijsko sredstvo i dv elektron se izbijju, prim ih feredoksin vezn z tilkoidnu membrnu. Končn kceptor tih elektron je NADP+ koji se reducir u NADPH + H +. Protoni (H + ) koji su potrebni z tu rekciju dobivju se iz medij. Preostli P + 700 elektrone ndoknđuje iz PS II. PS II u svom rekcijskom središtu im posebn klorofil tj. P 680 koji im mksimum psorpcije pri 680 nm. Kolektori PS II psorbirju fotone svjetlosti te tkođer uzrokuju pobuđivnje P 680 nkon čeg on izbcuje svoje elektrone. Elektroni putuju preko plstokinon, citokrom i plstocijnin n oksidirni P + 700 koji se reducir. Oksidirni P + 680 pk ndoknđuje svoj gubitk elektron fotolizom vode. Fotoliz vode proces je u kojem dolzi do rzgrdnje vode pomoću svjetlosti n elementrni kisik i vodikove ione. Cijeli proces prti ulženje H + ion u lumen tilkoidne membrne. Difuzijom H+ ion iz tilkoidnog prostor u stromu preko enzim ATP- sintetze dolzi do oslobđnj kemijske energije i pohrnjivnje u molekulm ATP- tko d u primrnim rekcijm fotosinteze nstje NADPH, ATP i O 2 (Pevlek- Kozlin, 2003). 7
Produkti primrnih rekcij ko NADPH i ATP su tvri koje povezuju primrne i sekundrne procese, jer nstju u primrnim, koriste se u sekundrnim procesim z redukciju CO 2. Rekcije se nzivju Clvinovim ciklusom i odvijju se u stromi kloroplst (Dubrvec i Regul, 1995). Rekcije su podijeljene u 3 stupnj. U prvom ko kceptor CO 2 služi ribuloz- 1,5- bisfosft. Tj proces ktlizir enzim Rubisco. N tj nčin nstju dvije molekule stbilnog intermedijer 3- fosfoglicert. Drugi stupnj uključuje korištenje ATP- i NADPH iz svjetlosnih rekcij z dobivnje glicerldehid 3- fosft. Treći stupnj je ponovno regenercij ribuloz- 1,5- bisfosft (Pevlek- Kozlin, 2003). Vžno je npomenuti d lišj mor biti dobro hidrtizirn kko bi se proces odvijo budući dlišjevi psorbirju vodu cijelom svojom površinom i vodni potencijl uvelike utječe n njihov metbolizm. Nime, kd je lišj dehidrirn postje dormntn i ne odvij se proces izmjene ugljikov dioksid p se ne odvij ni proces foto6sinteze. Lišj Everni prunstri koji živi pričvršćen n stblu i im rzgrnti tlus koji je slobodn u zrku vrlo brzo gubi vodu. K tome nem niti zštitni sloj koji smnjuje gubitk vode u lišjev. Deblji zštitni sloj koji sprječv gubitk vode imju foliozni lišjevi (Nsh, 2008). U optimlnim okolišnim uvjetim se njveći dio psorbirne energije (oko 95%) koristi z fotokemijske rekcije fotosinteze, međutim dio se energije gubi u obliku topline i svjetlosti, pri čemu nstje fenomen koji nzivmo fluorescencij klorofil (Vidković- Cifrek i sur, 2014). Fluorescencij je pojv do koje dolzi kd elektroni pri povrtku iz stnj više energije u osnovno stnje otpuštju foton. Fluorescencijsk svjetlost uvijek im veću vlnu duljinu i mnju energiju nego svjetlost koj ju je izzvl (Pevlek- Kozlin, 2003) (Slik 4). Tri spomenut nčin utrošk psorbirne energije su u međusobnoj kompeticiji što znči d povećnje učinkovitosti jednog od njih dovodi do smnjenj drug dv (Vidković- Cifrek i sur, 2014) 8
Slik 4 Apsorpcijski spektr klorofil i spektr svjetlosti oslobođene fluorescencijom (preuzeto iz Vidković- Cifrek i sur, 2014) Iz rzlog koji još nisu u potpunosti objšnjeni, glvnin fluorescencije potječe iz fotosistem II p se s tog izmjeren fluorescencij smtr odrzom stnj fotosistem II. Pri niskom intenzitetu svjetlosti molekule plstokinon su oksidirne i ko tkve mogu primiti elektrone. U tkvim se uvjetim ekscitcijsk energij s velikom učinkovitošću troši z fotokemijske rekcije, intenzitet fluorescencije je vrlo nizk. Međutim, pri jkom intenzitetu osvjetljenj ne može se iskoristiti sv psorbirn svjetlosn energij zbog mlog udjel oksidirnih plstokinon koji bi mogli primiti elektrone s PSII p se u tkvim uvjetim veći dio psorbirne svjetlosne energije oslobđ u obliku fluorescencije (Vidković- Cifrek i sur, 2014). Rzličiti stresni čimbenici smnjuju učinkovitost fotokemijskih rekcij čime se povećv prinos fluorescencije te se stog fluorescencij klorofil često koristi ko pokztelj učinkovitosti fotosinteze u istrživnjim štetnih učink n biljke (Vidković- Cifrek i sur, 2014), li u zdnje vrijeme i n lišjeve (Mslć i sur, 2016). N stopu fluorescencije u lišjev utječu i dušikovi spojevi u onečišćenom zrku jer ometju stopu prijenos energije rezonntnim putem (Poli i sur, 2010). Primjerice, niske koncentrcije monijev nitrt i monijev sulft su u početku tretmn slbo utjecle n fotosintetsku učinkovitost lišj Everni prunstri, li nkon određenog vremen ob su tretmn jsno pokzl inhibirjući utjecj n fotosintetsku učinkovitost (Munzi i sur, 2010). Fluorescencij klorofil in vivo se uspješno mjeri fluorimetrom. Jedn od metod mjerenj jest metod sturcijskog puls (Mxwell i Johnson, 2000). Prije mjerenj potrebno je uzorke ostviti u tmi kko bi se sve molekule plstokinon oksidirle. Mjerenje zpočinje mjerenjem minimlne rzine fluorescencije kd su 9
fotosintetski orgnizmi prilgođeni n tmu (F 0). Biljni mterijl obsj se crvenom svjetlošću niskog intenzitet koj nije dovoljn z pokretnje fotokemijske rekcije. Potom se obsjv krtkim sturcijskim pulsom, tj. krtkotrjnom svjetlošću jkog intenzitet koj uzrokuje redukciju svih kceptor elektron s reducirjuće strne PSII i bilježi se mksimln fluorescencij fotosustv II nkon dptcije u mrku (F m). Potom se u trjnju od nekoliko desetk do nekoliko stotin sekundi uzork izlže bijelom svjetlu, tj. ktiničkom zrčenju koje je dovoljne jkosti d može pokrenuti i podržti proces fotosinteze, kko bismo izzvli pd intenzitet fluorescencije do ujednčene vrijednosti (F T) (Slik 5). N posljetku, uzork se osvjetljv i sturcijskim pulsevim i biv zbilježen vrijednost mksimum fluorescencije u uvjetim svjetl tj. (F' m). Poslije sveg uzork se izlže fzi oporvk pomoću sturcijskih pulsev u tmi. Mjerenje zvršv očitnjem F' 0 vrijednosti tj. minimlne vrijednost fluorescencije pri crvenom osvjetljenju u uvjetim svjetl. Nkon mjerenj se fluorimetr sinhronizir s progrmom n rčunlu i podci se obrđuju. Jednk postupk može se primijeniti i n lišjevim. Fluorescencij klorofil često se mjeri n lišjevim ko pokztelj fiziološkog stnj fotobiont lišj (Poli i sur, 2015). Pri svom mjerenju koristil sm se FluorPen fluorimetrom i pripdjućim uputstvim (FluorPen Mnul nd User Guide, 2015). Koristil sm opciju NPQ protokol s obzirom n to d sm željel prtiti mksimlni kvntni prinos fotosustv II u mrku (QYmx), efektivni kvntni prinos fotosustv II n svjetlu (QY), fotokemijsko gšenje fluorescencije (QP) te nefotokemijsko gšenje fluorescencije (NPQ). NPQ protokol zprvo je metod sturcijskog puls. Određeni prmetri dju se izrčunti iz formul nvedenih u protokolu, nvest ću ih u poglvlju Mterijli i Metode. Slik 5 Prikz postupk mjerenj prmetr fluorescencije klorofil pomoću uređj FluorPen. Intenzitet svjetlosti oznčen je n y osi, vremenski intervl u kojem se mjerenje odvij n x osi grf. Preuzeto i prilgođeno prem FluorPen Mnul nd User Guide, 2015 10
1.5. Ciljevi istrživnj Budući d su lišjevi izvrsni indiktori zgđenj u okolišu, cilj ovog istrživnj je utvrditi kko Everni prunstri (L.) Ach regir n stres uzrokovn dušikom u obliku nitrt i monijevih ion prćenjem učinkovitosti fotosinteze i mjerenjem količine pigment nkon 3, 7 i 14 dn od tretmn. Tkođer, cilj je provjeriti hoće li učink istih n lišj biti jednk ili rzličit n jčoj i slbijoj količini osvjetljenj ko se drugi prmetri, ko vlg i tempertur, održvju stlnim. 11
2. MATERIJALI I METODE 2.1. Istrživni mterijl Istrživnje sm provodil n vrsti lišj Everni prunstri (L.) Ach. Mterijl je skupljen u npuštenom voćnjku u blizini Požege n terenu nepozntog onečišćenj. U lbortorij su dopremljeni u krtonskim kutijm kko bi se održl što već vlžnost. Budući d ih nije bilo lko odvojiti od kore drveć bez većeg oštećivnj n terenu, u lbortorij su dopremljeni n grnm drveć. Prvi kork bio je odvojiti uzorke od kore drveć. Nkon tog bilo je potrebno očistiti mterijl od mhovine ili drugih vrst lišjev. Z uzorke sm odbrl nizgled njzdrvije primjerke trudeći se d ms i, u koliko je to moguće, oblik tlus svih uzork budu podjednki. Pzil sm d svi uzorci imju vršni dio tlus, otprilike 1-2 cm udljenosti od rub. Time sm osigurl d svi uzorci budu podjednko metbolički ktivni. Koristeći se mrežicom, gumicm i Petrijevim zdjelicm pripremil sm 48 improvizirnih postolj z uzorke (Slik 6). N tj nčin smješteni lišjevi, koje prskmo vodom kko bismo ih vlžili, psorbirju količinu vode koj im je potrebn, višk vode prolzi kroz mrežicu n dno Petrijeve zdjelice. Vod s dn polgno isprv i lišjevi n mrežicm imju n rspolgnju potrebu vlgu dulje vrijeme. Nkon što sm uzorke smjestil n Petrijeve zdjelice poprskl sm lišjeve destilirnom vodom. Uzorci su potom klimtizirni 10 dn u klim- komori u uvjetim 16 h svjetl (60 µmol foton m -2 s -1 ) i 8 h tme uz temperturu 22 ± 2 C. Tijekom klimtizcije lišjeve sm prskl destilirnom vodom jednom dnevno dok ne postnu meki n dodir kko bi imli dovoljno vlge z normln rst. 2.2. Kemiklije Z istrživnje je bilo potrebno pripremiti 1 M otopinu klijev nitrt KNO 3, 1 M otopinu monijev nitrt NH 4NO 3 te 0,5 M otopinu monijev sulft (NH 4) 2SO 4. Z pripremu otopine KNO 3 volumen 0,5 L zdne koncentrcije bilo je potrebno vgnuti 50,5 g krutog KNO 3. Z pripremu istog volumen otopine NH 4NO 3 zdne koncentrcije bilo je potrebno vgnuti 40,0 g krute tvri, z pripremu 0,5 M otopine (NH 4) 2SO 4 jednkog volumen potrebno je vgnuti 33,0 g krutog (NH 4) 2SO 4. Izvgne mse tvri otopil sm u 0,4 L destilirne vode te nkon potpunog otpnj ndopunil destilirnom vodom do željenih volumen. Kko bih pospješil otpnje krutih tvri u proces sm uključil i mgnetnu miješlicu. Nkon pripreme otopinm sm pomoću ph- metr podesili ph vrijednost n 6,5. Pri tom procesu koristil sm otopine HCl i 12
NOH. Jednko sm učinil i s destilirnom vodom koju sm koristil z prsknje lišjev. 2.3. Tretirnje kemiklijm Uzorke sm podijelil u 4 skupine s po 12 uzork u svkoj (Tblic 1). Svku sm od pripremljenih otopin rzlil u 12 čšic pzeći d u svkoj bude podjednk volumen otopine. Uronivši prvih 12 uzork u 12 čšic s 1 M otopinom KNO 3 zpočel sm mjerenje od 30 min koji su plnirni z izlgnje lišj kemiklijm. Bitno je pziti d se svi uzorci u otopinu urone približno istovremeno. Ponovil sm postupk urnjnj 12 slijedećih uzork u 12 čšic s 1 M otopinom NH 4NO 3 mjereći isto vrijeme. U 12 čšic s 0,5 M otopinom (NH 4) 2SO 4 uronil sm tkođer 12 uzork n 30 min. Posljednjih 12 uzork služili su ko kontrol i oni su bili uronjeni n 30 min u destilirnu vodu određene ph vrijednosti (Slik 6). Nkon tretmn iz svke sm skupine tretirnih lišjev odvojil 6 uzork koje sm izložil jčem osvjetljenju (100 µmol foton m -2 s -1 ), 6 uzork izložil sm slbijem osvjetljenju (40 µmol foton m -2 s -1 ). U klim- komori tempertur je bil 20 ± 2 C. Tijekom dljnjeg pokus lišje sm jednom n dn prskl destilirnom vodom ph vrijednosti 6,5. Tblic 1 Opis tretmn. Uzorci su bili podijeljeni u 4 skupine. Jedn skupin bil je kontroln, drug skupin tretirn je klijevim nitrtom, treć skupin monijevim nitrtom i posljednj skupin monijevim sulftom. Sve otopine bile su zdnih koncentrcij i ph vrijednost im je bil 6,5. Tretmn je trjo 30 min. Potom je jednk broj uzork (6 replik) od svkog tretmn i kontrole izložen jčem osvjetljenju i slbijem osvjetljenju. TRETMAN 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. medij H2O H2O KNO3 KNO3 NH4NO3 NH4NO3 (NH4)2SO4 (NH4)2SO4 c (moldm -3 ) 1 1 1 1 1 1 0,5 0,5 t (min) 30 30 30 30 30 30 30 30 ph 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 jčin osvjetljenj (µmol foton m -2 s -1 ) 100 40 100 40 100 40 100 40 13
Mjerenj fluorescencije klorofil in vivo provel sm 3., 7. i 14. dn od početk pokus te sm izrčunl pripdjuće fluorescencijske prmetre. Istih dn izvršil sm i uzorkovnje lišjev. Uzorkovl sm lišjeve tko što sm od svkog uzork odrezl komdić tlus lišj, približno jednkih veličin, koje sm ztim spremil u rnije pripremljene i oznčene pketiće. Pketiće uzorkovnih lišjev osušil sm u liofiliztoru. Nkon tog uzorci tretirnih lišjev bili su spremni z dljnju obrdu i korištenje pri određivnju fotosintetskih pigment. Budući d je tretmn dušikovim spojevim djelovo jko negtivno n lišjeve, što se vidjelo u promjeni boje lišj iz zelene u smeđu, izvršil sm dodtno mjerenje fluorescencije korofil i 21. dn nkon početk pokus kko bih provjeril dolzi li do oporvk. Slik 6 Uzorci lišj Everni prunstri z vrijeme tretmn kemiklijm. Vidljiv je smještj lišjev n mrežice n Petrijevim zdjelicm. 14
2.4. Mjerenje fluorescencije klorofil u uvjetim in vivo Prije mjerenj fluorescencije klorofil u uvjetim in vivo uzorke sm poprskl destilirnom vodom određene ph vrijednosti te ih ostvil d odstoje u mrku kko bi se molekule plstokinon oksidirle. Ko što je već rečeno, pri mjerenju sm se koristil uređjem FluorPen fluorimetrom i pripdjućim protokolom. N tlus svkog lišj stvil sm kvčicu pzeći d što bolje tlusom lišj prekrijem otvor n kvčici kroz koji prolzi svjetlost tijekom mjerenj. Kvčicu sm potom pričvrstil z fluorimetr i odbrl protokol koji omogućuje mjerenje i izrčunvnje nefotokemijskog gšenje fluorescencije (NPQ), fotokemijskog gšenje fluorescencije (QP), mksimlni kvntni prinos fotosustv II u mrku (QYmx) te efektivni kvntni prinos fotosustv II (QY). Nkon što sm s svim uzorcim postupil isto, FluorPen fluorimetr sm povezl s odgovrjućim progrmom n rčunlu n koje sm spremil svoje dobivene podtke. Uređj FluorPen određuje vrijednosti fluorescencijskih prmetr prem formulm (FluorPen Mnul nd User Guide, 2015 i Vidković- Cifrek, 2014): ) MAKSIMALNI KVANTNI PRINOS FOTOSUSTAVA II U MRAKU QYmx= F v/f m F v= F m-f 0 b) EFEKTIVNI KVANTNI PRINOS FOTOSUSTAVA II QY= (F m F T) / F m c) FOTOKEMIJSKO GAŠENJE QP=(F m F T) / (F m F 0) d) NEFOTOKEMIJSKO GAŠENJE NPQ= (F m -F m)/f m pri čemu su: F m =mksimlni prinos fluorescencije uzork prilgođenog n uvjete tme F 0 = minimlni prinos fluorescencije F v = vrijbiln fluorescencij F m= mksimln fluorescencij u uvjetim svjetl F T= fluorescencij rvnotežnog stnj 15
2.5. Ekstrkcij i određivnje udjel fotosintetskih pigment Nkon sušenj lišjev u liofiliztoru tijekom 24 st, čuvl sm ih spremljene u hldnjku n +4 C. Sve sm uzorke njprije usitnil škricm što je više bilo moguće te sm odvgnul približno 10 mg usitnjenih uzork i rsporedil ih u rnije pripremljene smeđe tubice z centrifugirnje. Smeđe tubice treble bi čuvti pigmente od svjetl koje ih može oštetiti. Uzorcim sm potom dodl 1 ml dimetilsulfoksid (DMSO) tj. jkog orgnskog otpl i n vrhu sptule MgCO 3. Sdržj tubic njprije sm vorteksirl, potom inkubirl 30 min u vodenoj kupelji n temperturi od 60 C. Nkon inkubcije uzorke sm centrifugirl n temperturi od 21 C, 15 minut, n 25000 g. Po zvršetku sm ispipetirl 1 ml superntnt u kojem se nlze pigmenti u nove, čiste tubice. Te sm uzorke koristil z mjerenje klorofil, klorofil b, ukupnih krotenoid i rčunnje kvocijent feofitinizcije (FC). Spektrofotometrijski sm izmjeril psorbnciju svkog uzork pri vlnim duljinm od 415, 435, 480, 649 i 665 nm i pri tome sm koristil stklene kivete. Koncentrciju fotosintetskih pigment odredil sm prem formulm (Krnner i sur, 2002): ) Mseni udio klorofil u tkivu (mg/g suhe tvri): c = b) Mseni udio klorofil b u tkivu (mg/g suhe tvri): : cb = 12,9 A665 3,45 A649 m 1000 21,99 A649 5,32 A665 m 1000 c) Mseni udio ukupnih krotenoid u tkivu (mg/g suhe tvri): ck = (1000 A480 2,14 c 70,16 cb)/220 m 1000 d) Kvocijent feofitinizcije: FC = A435 A415 A480/665/649/435/415 = psorbncije uzork pri određenim vlnim duljinm m = ms uzork 16
2.6. Sttističk obrd Dobivene rezultte istrživnj sm prikzl u rčunlnom progrmu Microsoft office Excel 2007 i Sttistic 13.1. Z rezultte svkog od tretmn (po šest replik uzork) izrzil sm srednju vrijednost i pripdjuću stndrdnu pogrešku. Koristeći te podtke nčinil sm grfičke prikze z svki prćeni prmetr tog dn. Postupk je bio isti pri obrdi podtk veznih uz količinu pigment ko i z izrdu pripdjućih grfičkih prikz. Provel sm fktorijlnu nlizu vrijnce (two- wy ANOVA) kojom sm provjeril koji prmetri utječu n promjene zbilježene u uzorcim. Potom sm provel nlizu vrijnce (one-wy ANOVA) kko bih detljnije provjeril kko se uzorci pojedinog tretmn rzlikuju od uzork kontrolne skupine i međusobno. 17
3. REZULTATI 3.1. Fluorescencij klorofil in vivo 3.1.1. Mksimlni kvntni prinos fotosistem II (QYmx) Rezultti dobiveni fktorijlnom nlizom pokzuju d je 3. dn pokus tretirnje dušikovim spojevim znčjno utjeclo n QYmx, tkođer je znčjn utjecj imo i intenzitet osvjetljenj kojem su lišjevi bili izloženi (Tblic 2). Tblic 2 Fktorijln nliz vrijnce nprvljen z QYmx s obzirom n rzličite dušikove spojeve (tretmn) kojim su lišjevi vrste Everni prunstri (L.) Ach bili tretirni te intenzitet svjetl pri kojem su rsli 3. dn nkon tretmn. Fktori koji znčjno utječu n QYmx (p<0,05) podebljni su i u kurzivu. EFEKT SUME KVADRATA STUPANJ SLOBODE F-vrijednost P-vrijednost svjetlo 0.250852 1 15.1142 0.000372 tretmn 1.337573 3 26.8636 0.000000 svjetlo x tretmn 0.052123 3 1.0468 0.382397 Dobiveni rezultti z mksimlni kvntni prinos fotosustv II u mrku (QYmx) pokzuju d 3. dn nkon tretmn (Slik 7) sve grupe tretirnih lišjev, neovisno o intenzitetu svjetl kojem su bile izložene, pokzuju nižu vrijednost QYmx u odnosu n kontrolne skupine. Znčjnije smnjenje u odnosu n kontrolnu skupinu, li i skupinu tretirnu klijevim nitrtom, pokzle su skupine tretirne monijevim nitrtom (p<0,001) i one tretirne monijevim sulftom (p<0,01). Tkođer, skupine koje su bile izložene slbijem osvjetljenju pokzuju veće vrijednosti u odnosu n tretirne skupine izložene jčem osvjetljenju. Znčjnije više vrijednosti (p<0,05) QYmx pokzuju grupe lišjev koji su tretirni monijevim nitrtom i monijevim sulftom te potom izloženi nižem intenzitetu osvjetljenj u odnosu n one izložene višem. Kontrolne grupe ne pokzuju znčjnu rzliku ovisno o intenzitetu svjetl. 18
QY_mx 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 b b bc de f cd ef LL HL 0,1 0 K KN NN NS Tretmni Slik 7 Mksimlni kvntni prinos fotosustv II (QYmx) z uzorke Everni prunstri mjereno 3. dn nkon tretmn. Tretmni: K kontrol, lišjevi prskni vodom ph vrijednosti 6,5, KN lišjevi tretirni otopinom klijev nitrt (c=1 M, ph=6,5), NN lišjevi tretirni otopinom monijev nitrt (c=1 M, ph=6,5), NS lišjevi tretirni otopinom monijev sulft (c=0,5 M, ph=6,5), HL- svjetlo jčeg intenzitet (100 µe m -2 s -1 ), LL svjetlo slbijeg intenzitet (40 µe m -2 s -1 ). Rzličit slov iznd stupc predstvljju sttistički znčjno rzličite rezultte (p<0,05). Rezultti dobiveni fktorijlnom nlizom pokzuju d je 7. dn pokus tretirnje dušikovim spojevim znčjno utjeclo n QYmx, tkođer je znčjn utjecj imo i intenzitet osvjetljenj kojem su lišjevi bili izloženi (Tblic 3). Tblic 3 Fktorijln nliz vrijnce nprvljen z QYmx s obzirom n rzličite dušikove spojeve kojim su lišjevi vrste Everni prunstri (L.) Ach bili tretirni te intenzitet svjetl pri kojem su rsli 7. dn nkon tretmn. Fktori koji znčjno utječu n QYmx (p<0,05) podebljni su i u kurzivu. EFEKT SUME KVADRATA STUPANJ SLOBODE F-vrijednost P-vrijednost svjetlo 0.365752 1 21.8083 0.000034 tretmn 1.324523 3 26.3253 0.000000 svjetlo x tretmn 0.121073 3 2.4064 0.081461 Sve skupine tretirnih lišjev nkon 7 dn tretmn, neovisno o intenzitetu svjetlosti kojem su bile izložene, pokzuju nižu vrijednost QYmx u odnosu n kontrolne skupine (Slik 8) i t rzlik je sttistički znčjn (p<0,001). Uspoređujući skupine tretirnih lišjev izloženih slbijem intenzitetu osvjetljenj međusobno, 19
QY_mx uočv se sttistički znčjn rzlik smo između onih tretirnih klijevim nitrtom i monijevim sulftom (p<0,05) koji je do njniže vrijednosti. Uspoređujući međusobno grupe tretirnih lišjev koji su izloženi jčem intenzitetu osvjetljenj ne uočv se sttistički znčjn rzlik (p>0,05). Tkođer je vidljivo d su vrijednosti QYmx lišjev koji su bili tretirni klijevim nitrtom i monijevim nitrtom te izloženi jčem intenzitetu osvjetljenj znčjnije smnjene u odnosu n one jednko tretirne, potom izložene slbijem osvjetljenju (p<0,05). Znčjnij rzlik ne uočv se smo uspoređivnjem grupe lišjev tretirnih monijevim sulftom i izloženih jčem odnosno slbijem intenzitetu osvjetljenj (p>0,05) gdje je kod obje grupe izmjeren zntno niž vrijednost ovog prmetr u odnosu n kontrole. Kontrolne grupe ne pokzuju znčjnu rzliku ovisno o intenzitetu svjetl. 0,7 0,6 0,5 b bc 0,4 cd 0,3 0,2 0,1 e e de e LL HL 0 K KN NN NS Tretmni Slik 8 Mksimlni kvntni prinos fotosustv II (QYmx) z uzorke Everni prunstri mjereno 7. dn nkon tretmn. Tretmni: K kontrol, lišjevi prskni vodom ph vrijednosti 6,5, KN lišjevi tretirni otopinom klijev nitrt (c=1 M, ph=6,5), NN lišjevi tretirni otopinom monijev nitrt (c=1 M, ph=6,5), NS lišjevi tretirni otopinom monijev sulft (c=0,5 M, ph=6,5), HL- svjetlo jčeg intenzitet (100 µe m -2 s -1 ), LL svjetlo slbijeg intenzitet (40 µe m -2 s -1 ). Rzličit slov iznd stupc predstvljju sttistički znčjno rzličite rezultte (p<0,05). Rezultti dobiveni fktorijlnom nlizom pokzuju d je 14. dn pokus tretirnje dušikovim spojevim znčjno utjeclo n QYmx, tkođer je znčjn utjecj imo i intenzitet osvjetljenj kojem su lišjevi bili izloženi (Tblic 4). 20
QY_mx Tblic 4 Fktorijln nliz vrijnce nprvljen z QYmx s obzirom n rzličite dušikove spojeve kojim su lišjevi vrste Everni prunstri (L.) Ach bili tretirni te intenzitet svjetl pri kojem su rsli 14. dn nkon tretmn. Fktori koji znčjno utječu n QYmx (p<0,05) podebljni su i u kurzivu. EFEKT SUME KVADRATA STUPANJ SLOBODE F-vrijednost P-vrijednost svjetlo 0.206719 1 12.1967 0.001183 tretmn 0.823123 3 16.1885 0.000000 svjetlo x tretmn 0.025406 3 0.4997 0.684638 Sve grupe tretirnih lišjev nkon 14. dn imju znčjno nižu (p<0,01) vrijednost QYmx od svojih kontrol (slik 9). Uspoređujući grupe tretirnih lišjev izloženih nižem intenzitetu svjetl među njim se ne uočv sttistički znčjn rzlik. Jednko je s tretirnim uzorcim koji su izloženi jčem intenzitetu osvjetljenj. 0,7 0,6 b bc 0,5 0,4 d cd cd 0,3 d d LL 0,2 HL 0,1 0 K KN NN NS Tretmni Slik 9 Mksimlni kvntni prinos fotosustv II (QYmx) z uzorke Everni prunstri mjereno 14. dn nkon tretmn. Tretmni: K kontrol, lišjevi prskni vodom ph vrijednosti 6,5, KN lišjevi tretirni otopinom klijev nitrt (c=1 M, ph=6,5), NN lišjevi tretirni otopinom monijev nitrt (c=1 M, ph=6,5), NS lišjevi tretirni otopinom monijev sulft (c=0,5 M, ph=6,5), HL- svjetlo jčeg intenzitet (100 µe m -2 s -1 ), LL svjetlo slbijeg intenzitet (40 µe m -2 s -1 ). Rzličit slov iznd stupc predstvljju sttistički znčjno rzličite rezultte (p<0,05). Tretirne grupe izložene jčem intenzitetu svjetlosti pokzle su nižu vrijednost QYmx od onih izloženih slbijem osvjetljenju. Međutim rzlik je sttistički znčjn 21
(p<0,05) smo kod uzork tretirnih klijevim nitrtom. Kontrolne grupe ne pokzuju znčjnu rzliku ovisno o intenzitetu svjetl. Rezultti dobiveni fktorijlnom nlizom pokzuju d je 21. dn pokus tretirnje dušikovim spojevim znčjno utjeclo n QYmx, tkođer je znčjn utjecj imo i intenzitet osvjetljenj kojem su lišjevi bili izloženi (Tblic 5). Tblic 5 Fktorijln nliz vrijnce nprvljen z QYmx s obzirom n rzličite dušikove spojeve kojim su lišjevi vrste Everni prunstri (L.) Ach bili tretirni te intenzitet svjetl pri kojem su rsli 21. dn nkon tretmn. Fktori koji znčjno utječu n QYmx (p<0,05) podebljni su i u kurzivu. EFEKT SUME KVADRATA STUPANJ SLOBODE F-vrijednost P-vrijednost svjetlo 0.220052 1 18.7818 0.000096 tretmn 0.664706 3 18.9112 0.000000 svjetlo x tretmn 0.059923 3 1.7048 0.181419 Sve skupine tretirnih lišjev su 21. dn nkon tretmn, u odnosu n kontrolne skupine, pokzle niže vrijednosti QYmx, rzlike su i sttistički znčjne (p<0,01) osim kod tretmn klijevim nitrtom pri slbijem intenzitetu svjetl (Slik 10). Uspoređujući grupe lišjev koji su nkon tretmn izloženi slbijem intenzitetu svjetl uočv se d je monijev nitrt znčjnije smnjio vrijednost QYmx u odnosu n klijev nitrt. Između grup lišjev koji su nkon tretmn izloženi jčem intenzitetu osvjetljenj nem znčjnije rzlike. Između grup lišjev koji su tretirni klijevim nitrtom i monijevim sulftom te potom izloženi rzličitom intenzitetu svjetl uočv se znčjno već vrijednosti (p<0,05) ko su lišjevi bili izloženi slbijem intenzitetu svjetl, rzlike nem ko uspoređujemo grupe lišjev koje su tretirne monijevim nitrtom te potom izložene rzličitom intenzitetu svjetl (p>0,05). Kontrolne grupe tkođer ne pokzuju znčjnu rzliku ovisno o intenzitetu svjetl. 22
QY_mx 0,7 0,6 b 0,5 0,4 0,3 d cd d bc d LL 0,2 HL 0,1 0 K KN NN NS Tretmni Slik 10 Mksimlni kvntni prinos fotosustv II (QYmx) z uzorke Everni prunstri mjereno 21. dn nkon tretmn. Tretmni: K kontrol, lišjevi prskni vodom ph vrijednosti 6,5, KN lišjevi tretirni otopinom klijev nitrt (c=1 M, ph=6,5), NN lišjevi tretirni otopinom monijev nitrt (c=1 M, ph=6,5), NS lišjevi tretirni otopinom monijev sulft (c=0,5 M, ph=6,5), HL- svjetlo jčeg intenzitet (100 µe m -2 s -1 ), LL svjetlo slbijeg intenzitet (40 µe m -2 s -1 ). Rzličit slov iznd stupc predstvljju sttistički znčjno rzličite rezultte (p<0,05). 3.1.2. Efektivni kvntni prinos fotosustv II (QY) Rezultti dobiveni fktorijlnom nlizom pokzuju d je 3. dn pokus smo tretirnje dušikovim spojevim znčjno utjeclo n QY, dok intenzitet osvjetnjenj nije imo znčjnijeg utjecj (Tblic 6). Tblic 6 Fktorijln nliz vrijnce nprvljen z QY s obzirom n rzličite dušikove spojeve kojim su lišjevi vrste Everni prunstri (L.) Ach bili tretirni te intenzitet svjetl pri kojem su rsli 3. dn nkon tretmn. Fktori koji znčjno utječu n QY (p<0,05) podebljni su i u kurzivu. EFEKT SUME KVADRATA STUPANJ SLOBODE F-vrijednost P-vrijednost svjetlo 0.003169 1 1.5505 0.220313 tretmn 0.200756 3 32.7431 0.000000 svjetlo x tretmn 0.002373 3 0.3870 0.762937 Sve grupe tretirnih lišjev 3. dn nkon tretmn pokzuju izrzito nižu vrijednost QY u odnosu n kontrolnu skupinu (Slik 11). Nstl je sttistički znčjn 23
QY rzlik (p<0,01), posebno velik sttistički znčjn rzlik nstl je između grupe lišjev tretirnih monijevim nitrtom i njegove kontrole skupine (p<0,001). Uspoređujući rezultte z grupe tretirnih lišjev koji su potom izloženi slbijem intenzitetu osvjetljenj, uočv se sttistički znčjn rzlik između onih tretirnih klijevim nitrtom gdje su vrijednosti veće i onih tretirnih monijevim nitrtom i monijevim sulftom (p<0,05). Slično je i s grupm tretirnih lišjev izloženih jčem intenzitetu osvjetljenj. Između kontrolnih grup međusobno te grup koje su nkon tretmn dušikovim spojevim izložene rzličitim intenzitetim svjetlosti ne pojvljuje se sttistički znčjn rzlik (p>0,05). 0,25 0,2 d d 0,15 0,1 0,05 c bc b LL HL 0 K KN NN NS Tretmni Slik 11 Efektivni kvntni prinos fotosustv II (QY) z uzorke Everni prunstri mjereno 3. dn nkon tretmn. Tretmni: K kontrol, lišjevi prskni vodom ph vrijednosti 6,5, KN lišjevi tretirni otopinom klijev nitrt (c=1 M, ph=6,5), NN lišjevi tretirni otopinom monijev nitrt (c=1 M, ph=6,5), NS lišjevi tretirni otopinom monijev sulft (c=0,5 M, ph=6,5), HL- svjetlo jčeg intenzitet (100 µe m -2 s -1 ), LL svjetlo slbijeg intenzitet (40 µe m -2 s -1 ). Rzličit slov iznd stupc predstvljju sttistički znčjno rzličite rezultte (p<0,05). Fktorijln nliz pokzl je d je 7. dn pokus tretirnje dušikovim spojevim znčjno utjeclo n QY, tkođer znčjn utjecj pokzuje i intenzitet osvjetljenj (Tblic 7). 24
Tblic 7 Fktorijln nliz vrijnce nprvljen z QY s obzirom n rzličite dušikove spojeve kojim su lišjevi vrste Everni prunstri (L.) Ach bili tretirni te intenzitet svjetl pri kojem su rsli 7. dn nkon tretmn. Fktori koji znčjno utječu n QY (p<0,05) podebljni su i u kurzivu. EFEKT SUME KVADRATA STUPANJ SLOBODE F-vrijednost P-vrijednost svjetlo 0.015052 1 8.64028 0.005439 tretmn 0.115673 3 22.13306 0.000000 svjetlo x tretmn 0.012340 3 2.36108 0.085761 Sve grupe tretirnih lišjev 7. dn nkon tretmn pokzuju izrzito nižu vrijednost QY od kontrolnih skupin (Slik 12). Posebno velik sttistički znčjn rzlik (p<0,001) uočv se uspoređujemo li lišjeve tretirne monijevim nitrtom i monijevim sulftom, koji su potom izloženi slbijem osvjetljenju, s njihovom kontrolnom skupinom i skupinom lišjev tretirnih klijevim nitrtom koji su izloženi istom intenzitetu svjetlosti. Tkođer, sttistički znčjn rzlik (p<0,001) uočv se uspoređivnjem svih grup tretirnih lišjev koji su izloženi jčem intenzitetu svjetlosti i imju puno niže vrijednosti odkontrolneskupine. Među grupm lišjev tretirnih i izloženih jčem intenzitetu svjetl nem sttistički znčjne rzlike (p>0,05). Tkođer je jči intenzitet svjetlosti utjeco n izrzito veliko sniženje QY vrijednosti koje se uočv u svih tretirnih skupin lišjev li ne i u kontrolnoj skupini (p<0,05). 25
QY 0,25 0,2 0,15 b bc cd 0,1 0,05 0 d e e e K KN NN NS Tretmni LL HL Slik 12 Efektivni kvntni prinos fotosustv II (QY) z uzorke Everni prunstri mjereno 7. dn nkon tretmn. Tretmni: K kontrol, lišjevi prskni vodom ph vrijednosti 6,5, KN lišjevi tretirni otopinom klijev nitrt (c=1 M, ph=6,5), NN lišjevi tretirni otopinom monijev nitrt (c=1 M, ph=6,5), NS lišjevi tretirni otopinom monijev sulft (c=0,5 M, ph=6,5), HL- svjetlo jčeg intenzitet (100 µe m -2 s -1 ), LL svjetlo slbijeg intenzitet (40 µe m -2 s -1 ). Rzličit slov iznd stupc predstvljju sttistički znčjno rzličite rezultte (p<0,05). Rezultti dobiveni fktorijlnom nlizom pokzuju d je 14. dn pokus tretirnje dušikovim spojevim znčjno utjeclo n QY ko i intenzitet osvjetljenj, li i kombincij tih dvju fktor (Tblic 8). Tblic 8 Fktorijln nliz vrijnce nprvljen z QY s obzirom n rzličite dušikove spojeve kojim su lišjevi vrste Everni prunstri (L.) Ach bili tretirni te intenzitet svjetl pri kojem su rsli 14. dn nkon tretmn. Fktori koji znčjno utječu n QY (p<0,05) podebljni su i u kurzivu. EFEKT SUME KVADRATA STUPANJ SLOBODE F-vrijednost P-vrijednost svjetlo 0.022969 1 7.9972 0.007285 tretmn 0.191023 3 22.1701 0.000000 svjetlo x tretmn 0.030456 3 3.5347 0.023116 14. dn nkon tretmn grupe lišjev tretirnih monijevim nitrtom i monijevim sulftom te izloženih slbijem intenzitetu svjetl pokzuju sttistički znčjno nižu vrijednost QY u odnosu n kontrolnu skupinu i skupinu tretirnu klijevim nitrtom koje su izložene jednkom intenzitetu svjetl (p<0,01) (Slik 13). Sve grupe tretirnih lišjev koji su izloženi jčem intenzitetu svjetlosti pokzuju 26
QY znčjno niže vrijednosti u odnosu n svoju kontrolnu skupinu (p<0,01), posebno se ističe grup tretirn monijevim sulftom koj im njnižu vrijednost. Sttistički znčjn rzlik uočv se među grupm lišjev tretirnih klijevim nitrtom koje su potom izložene slbijem intenzitetu svjetl gdje je vrijednost QY znčjno viš nego pri jčem intenzitetu svjetlosti (p<0,05). Sttistički znčjne rzlike nem među kontrolnim grupm ko niti grupm lišjev tretirnih monijevim nitrtom i monijevim sulftom koje su potom izložene rzličitom intenzitetu svjetlosti (p>0,05). 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 b b b b b LL HL 0 K KN NN NS Tretmni Slik 13 Efektivni kvntni prinos fotosustv II (QY) z uzorke Everni prunstri mjereno 14. dn nkon tretmn. Tretmni: K kontrol, lišjevi prskni vodom ph vrijednosti 6,5, KN lišjevi tretirni otopinom klijev nitrt (c=1 M, ph=6,5), NN lišjevi tretirni otopinom monijev nitrt (c=1 M, ph=6,5), NS lišjevi tretirni otopinom monijev sulft (c=0,5 M, ph=6,5), HL- svjetlo jčeg intenzitet (100 µe m -2 s -1 ), LL svjetlo slbijeg intenzitet (40 µe m -2 s -1 ). Rzličit slov iznd stupc predstvljju sttistički znčjno rzličite rezultte (p<0,05). Rezultti dobiveni fktorijlnom nlizom pokzuju d je 21. dn pokus smo tretirnje dušikovim spojevim znčjno utjeclo n QY, dok je utjecj intenzitet svjetlosti bio nezntn (Tblic 9). 27