Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno- matematički fakultet Biološki odsjek Marija Čuček Učinak olova na fotosintetsku učinkovitost i pigmente u lišajev

Транскрипт

1 Sveučilište u Zgrebu Prirodoslovno- mtemtički fkultet Biološki odsjek Mrij Čuček Učink olov n fotosintetsku učinkovitost i pigmente u lišjev Flvoprmeli cpert (L.) Hle i Everni prunstri (L.) Ach Diplomski rd Zgreb, 2017.

2 Ovj rd, izrđen n Botničkom zvodu Biološkog odsjek Prirodoslovno-mtemtičkog fkultet Sveučilišt u Zgrebu pod vodstvom izv. prof. dr. sc. Mirte Tklec, predn je n ocjenu Biološkom odsjeku Prirodoslovno-mtemtičkog fkultet Sveučilišt u Zgrebu rdi stjecnj zvnj mgistr eksperimentlne biologije.

3 Zhvle Od src zhvljujem svojoj drgoj mentorici izv. prof. dr. sc. Mirti Tklec n nesebičnoj pomoći, strpljenju i rzumijevnju. Hvl Vm n prenesenom znnju i izdvojenom vremenu prilikom provedbe i pisnj ovog rd. Tkođer, hvl Mji n svoj pomoći i korisnim svjetim. Hvl svim djeltnicim Lbortorij z fiziologiju bilj n pomoći i ugodnom društvu. Veliko hvl Admu, Mtei i Jeleni n potpori i strpljenju u svim trenucim. Hvl i svim ostlim prijteljicm i prijteljim n vremenu koje smo proveli zjedno, posebice onom koje smo proveli u zjedničkim pustolovinm iznd i ispod površine Zemlje. Hvl F. jer zjedno svijetlimo u mrku. Njveće hvl mojim roditeljim i brtu n bezuvjetnoj podršci, neumornom strpljenju i ljubvi. Bez vs ovo me bi bilo moguće. Hvl!

4 TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA Sveučilište u Zgrebu Prirodoslovno-mtemtički fkultet Biološki odsjek Diplomski rd Učink olov n fotosintetsku učinkovitost i pigmente u lišjev Flvoprmeli cpert (L.) Hle i Everni prunstri (L.) Ach Mrij Čuček Rooseveltov trg 6, Zgreb, Hrvtsk Lišjevi su kozmopolitski orgnizmi i izvrsni bioindiktori zgđenj zrk. Sposobni su biokumulirti teške metle, toksičnost metl ovisi o kemijskim i fiziklnim fktorim. Cilj istrživnj je bio odrediti osjetljivost vrst Everni prunstri (L.) Ach i Flvoprmeli cpert (L.) Hle n izlgnje olovu te utvrditi kko ph vrijednost otopine (4 i 6) i vrst otopine (destilirn vod ili Hoglndov otopin), modificirju učink olov nkon 1., 7. i 14. dn. U obje vrste tretmn olovom je snizio QYmx (mksimlni kvntni prinos fotosustv II) nkon 1., 7. i 14. dn, što ukzuje n smnjenu učinkovitost fotosinteze. U vrste E. prunstri Hoglndov otopin smnjil je negtivn učink olov osobito pri ph vrijednosti 6, dok je u vrste F. cpert Hoglndov otopin smnjil negtivn učink olov tek nkon 14. dn. U obje vrste lišjev tretmn olovom je uglvnom snizio koncentrciju klorofil i klorofil b te krotenoid tek nkon 14 dn tretmn. Niži koeficijent feofitinizcije ukzuje n degrdciju klorofil uslijed tretmn olovom. Hoglndov otopin smnjil je negtivn učink olov n pigmente li u vrste E. prunstri to se očitovlo kod ph vrijednosti 6, u vrste F. cpert pri ph vrijednosti 4. U obje vrste lišj tretmn olovom je povisio rzinu lipidnih peroksid osobito pri ph vrijednosti 6. Hoglndov otopin ph vrijednosti 6 smnjil je negtivn učink olov n oštećenje membrn. N temelju rezultt može se zključiti d su obje vrste lišj osjetljive n tretmn olovom osobito pri ph vrijednosti 6 što je posljedic bolje dostupnosti olov pri toj ph vrijednosti. U obje vrste prisutnost ion iz Hoglndove otopine smnjil je negtivn učink olov li je efiksnost ovisil o ph vrijednosti otopine koj je bil rzličit z svku vrstu. (63 strnice, 16 slik, 14 tblic, 48 literturnih nvod, hrvtski jezik) Rd je pohrnjen u Središnjoj biološkoj knjižnici Ključne riječi: Flvoprmeli cpert, Everni prunstri, olovo, teški metli, fotosintez, pigmenti, lipidn peroksidcij, lišjevi Voditelj: Dr. sc. Mirt Tklec, izv. prof. Ocjenitelji: Dr. sc. Mirt Tklec, izv. prof., Dr. sc. An Glov, izv. prof, Dr. sc. Sndr Hudin, doc., Dr.sc. Rent Šoštrić, doc. Rd prihvćen: 16. veljče 2017.

5 BASIC DOCUMENTATION CARD University of Zgreb Fculty of Science Deprtment of Biology Grdution Thesis The effect of led on photosynthetic efficiency nd pigments in the lichens Flvoprmeli cpert (L.) Hle nd Everni prunstri (L.) Ach Mrij Čuček Rooseveltov trg 6, Zgreb, Croti Lichens re cosmopolitn orgnisms nd gret bioindictors of ir pollution. They bioccumulte hevy metls whose toxicity depends on chemicl nd physicl fctors. Aim of this reserch ws to determine sensitivity of Everni prunstri (L) Ach nd Flvoprmeli cpert (L) Hle to led exposure nd to determine if chnges in ph vlue (4 or 6) nd solution composition (Hoglnd solution or destilled wter) modulte led toxicity fter 1., 7. nd 14. dys of exposure. Both species showed lower QYmx (the lrgest light quntum efficiency of photosystem II) when tretted with led fter 1., 7. nd 14. dys of exposure which indictes decrese in photosynthetic efficiency. Hoglnd solution reduced negtive effect of led especilly t ph vlue 6 in E. prunstri, while in F. cpert it reduced negtive effect of led only fter 14. dys of exposure. In both species led tretment minly decresed chlorophyll, chlorophyll b nd crotenoid concentrtions only fter 14. dys of tretment. Decresed pheophytiniztion coefficient indictes chlorophyll degrdtion due to led tretment. Hoglnd solution decresed negtive effect of led on pigments, in E. prunstri t ph vlue 6 nd in F. cpert t ph vlue 4. In both species led tretment incresed concentrtion of lipid peroxides especilly t ph vlue 6. Hoglnd solution t ph vlue 6 decresed negtive effect of led on membrne dmge. These results confirmed sensitivity of both lichen species to led tretment, most notbly t ph vlue 6 when led vilbility is the highest. In both species vilbility od ions from Hoglnd solution decresed negtive effect od led, but it depended on the ph vlue of solution nd ws different for ech lichen species. (63 pges, 16 figures, 14 tbles, 48 references, originl in: Crotin lnguge) Thesis deposited in the Centrl Biologicl Librry Supervisor: Dr. sc. Mirt Tklec, Prof. Key words: Flvoprmeli cpert, Everni prunstri, led, hevy metls, photosyntesis, pigments, lipid peroxidtion, lichens Reviewers: Dr. sc. Mirt Tklec, Prof., Dr. sc. An Glov, Prof.,Dr. sc. Sndr Hudin, Asst. Prof., Dr. sc.rent Šoštrić, Asst. Prof. Thesis ccepted: Februry 16, 2017.

6 Sdržj 1. UVOD ŠTO SU LIŠAJEVI? LIŠAJEVI- BIOINDIKATORI ZAGAĐENJA U OKOLIŠU Teški metli u zrku i njihov utjecj n lišjeve FOTOSINTEZA U LIŠAJEVA I UTJECAJ OLOVA NA NJENU UČINKOVITOST ISTRAŽIVANI LIŠAJEVI Flvoprmeli cpert (L.) Hle Everni prunstri (L.) Ach CILJEVI ISTRAŽIVANJA MATERIJALI I METODE ISTRAŽIVANI MATERIJAL KEMIKALIJE TRETIRANJE OLOVOM MJERENJE FLUORESCENCIJE KLOROFILA U UVJETIMA IN VIVO EKSTRAKCIJA I ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE FOTOSINTETSKIH PIGMENATA SPEKTOFOTOMETRIJSKO ODREĐIVANJE LIPIDNIH PEROKSIDA ODREĐIVANJE MASA UZORAKA STATISTIČKA OBRADA PODATAKA REZULTATI FLUORESCENCIJA KLOROFILA IN VIVO Everni prunstri (L.) Ach Flvoprmeli cpert (L.) Hle FOTOSINTETSKI PIGMENTI Everni prunstri (L.) Ach Koncentrcij klorofil Koncentrcij klorofil b Koncentrcij ukupnih krotenoid Koeficijent feofitinizcije Flvoprmeli cpert (L.) Hle Koncentrcij klorofil Koncentrcij klorofil b Koncentrcij ukupnih krotenoid Koeficijent feofitinizcije RAZINA LIPIDNIH PEROKSIDA Everni prunstri (L.) Ach Flvoprmeli cpert (L.) Hle RASPRAVA ZAKLJUČAK LITERATURA ŽIVOTOPIS... 63

7 1 1. UVOD

8 1.1. Što su lišjevi? Lišjevi su orgnizmi koje čine njmnje dv predstvnik rzličitih crstv, gljiv (mikobiont) i čln koji može vršiti fotosintezu (fotobiont). U ulozi fotobiont možemo nći zelenu lgu ili cijnobkteriju p se on td nziv fikobiont odnosno cijnobiont. Neki lihenolozi smtrju d je tj odnos przitski, međutim mnogi podci idu u prilog tome d je mutulistički. Fotobiont fotosintetizir i mikobiont opskrbljuje ugljikohidrtim. U slučju zelene lge to su šećerni lkoholi, kd je u odnos uključen cijnobkterij, ond je to glukoz. Cijnobkterij mikobiont opskrbljuje i dušikom jer g može fiksirti iz tmosfere (Purvis, 2010). Mikobiont iz podloge ili tmosfere psorbir vodu i minerlne tvri, li i štiti fotobiont od previsokog intenzitet svjetlosti. Simbiotski odnos člnov lišjevim omogućuje d nstnjuju područj ekstremnih ekoloških uvjet. Mogu se prilgoditi visokim i niskim temperturnim ekstremim, suši, poplvi, visokom slinitetu, visokim koncentrcijm onečišćivč zrk, područjim koj su siromšn minerlnim tvrim te onim zsićenim dušikom. Ipk, većin je lišjev osjetljiv n promjene okoliš u kojem žive i koji je krkterističn z njihovu vrstu (Poli i sur, 2014, Stmenković i sur, 2013) Lišjevi - bioindiktori zgđenj u okolišu Tolerncij lišjev n jki stres u okolišu odvj ih od ostlih eukriot i omogućv im prisutnost n gotovo svim područjim Zemljine površine p se često nzivju pioniri vegetcije. Dominntni su živući oblici n njenih 8% površine, većinom u polrnim krjevim i n vrhovim plnin. Neke vrste nstnjuju ekstremn područj i krtke periode povoljnih uvjet iskorištvju z svoj brzi rst. Međutim, većin ih je ipk spororstuć i dugoživuć p bismo mogli reći d tijekom dužih period zdržvju prilično nepromijenjenu morfologiju (Nsh, 2008). Z rzliku od vskulrnih biljk koje odbcuju listove ili neke druge dijelove, kod lišjev nem te pojve. Grđeni su od četiri sloj. Površinu čini kor koju grde gljive i njihove hife isprepletene u debeli sloj tvoreći tkivo nzvno plektenhim. Hife ulze u lge koje se nlze u drugom, gonidijlnom sloju i iz njih crpe ugljikohidrte koje su lge proizvele fotosintezom. Srž lišj čini mrež hif i gljiv i ovdje dolzi do izmjene plinov. Zdnji je sloj izgrđen poput prvog, od hif gljiv i sdrži rizoide kojim se lišj pričvršćuje z podlogu (Nsh, 2008). Širok geogrfsk distribucij i sm grđ lišjev omogućuje d se pomoću 2

9 njih dokumentirju i prte zgđenj n svim prostorim plnete (Grty, 2001). S obzirom d nemju voštnu kutikulu, lišjevi cijelom svojom površinom mogu psorbirti onečišćivče iz tmosfere. Možd njbitnije od sveg, sposobni su kumulirti mnoge elemente do koncentrcije koj premšuje njihove fiziološke potrebe, z to su rzvili posebne mehnizme. Tvri iz onečišćenog zrk psorbirju intrcelulrno procesom izmjene ion i pohrnjuju u obliku čestic koje su bogte teškim metlim (Nsh, 2008). Toksičnost pohrnjenog metl ovisi o kemijskim i fiziklnim fktorim, primjerice kemijskom obliku, količini, topivosti u vodi, ph vrijednosti i temperturi (Bčkor i Loppi, 2009). Zgđenje zrk trenutno je zjednički problem većine grdov u svijetu i svkim dnom sve više utječe n ljudsko zdrvlje i cijeli ekosustv. Povećn urbnizcij, industrijlizcij, povećnje broj stnovnik i sve veći promet utječu n smnjenje kvlitete zrk. U tkvim prostorim sve je mnje vegetcijskog pokrov što tkođer pridonosi problemu. Zimi je zgđenje intenzivnije jer uz sve nvedeno dolzi i do temperturne inverzije i smnjuje se brzin vjetr p onečišćivči bivju zrobljeni blizu površine zemlje. Rznolikost epifitskih lišjev i promjene njihovih fizioloških prmetr služe z prćenje okolišnog stres u urbnim područjim. Izlgnje onečišćivčim dovodi do brojnih promjen. Potiče produkciju etilen, djeluje n gubitk elektrolit zbog oštećenj stničnih membrni, smnjen je sdržj ATP- i intenzitet fotosinteze, fikscije N2, respircije, degrdcij klorofil je povećn (Grty i sur, 2003). Svi ti fiziološki odgovori vrlo su korisni indiktori i pomžu d se nepovoljne promjene detektirju vrlo brzo i prilično jeftino. Onečišćenje mijenj ekološke uvjete stništ koje određen vrst lišj nstnjuje p može doći do njenog nestnk. Tko je primjerice u Indiji, točnije Kolkti, godine zbilježeno 53 vrste, sd ih je smo 25 (Mjumder i sur, 2012). Iko se u posljednje vrijeme kontrolir nčin i količin ispušnih plinov (CO, SO2, NOx) iz vozil, oni nisu u potpunosti eliminirni. Osim plinov problem predstvljju i teški metli. To su elementi gustoće veće od 4 g/cm 3. Toksični su ili otrovni u vrlo niskim koncentrcijm. Esencijlni teški metli potrebni su z prvilno funkcionirnje orgnizm, to su Cu, Fe, Mn, Zn, Mo, Ni, Cr i Co. Uz njih postoje i neesencijlni u koje spdju Cd, Pb, Hg, As i Sn (Duruibe i sur, 2007). Metli se oslobđju sgorijevnjem goriv, kvrenjem motor i drugih dijelov utomobil te rspdom utomobilskih gum (Poli i sur, 2012). 3

10 Teški metli u zrku i njihov utjecj n lišjeve Proveden su mnog istrživnj n lišjevim koj su pokzl d su sposobni vrlo brzo biokumulirti metle (Loppi i sur, 1999, Pirintsos i sur, 2006). Primjerice, Monnet i surdnici (2006) tretirli su lišjeve otopinom soli bkr, i već nkon nekoliko sti njegov koncentrcij u tlusu se zmjetno povećl. S druge strne, u pokusim gdje su korišteni trnsplntti tlus promjene koncentrcije metl u tmosferi mogle su se zbilježiti prćenjem fizioloških proces u lišju tijekom nekoliko mjeseci (Wlther i sur, 1990). Iko bi bilo z očekivti d će sdržj teških metl s funkcijom vremen biti sve veći, to nije uvijek slučj. On ponekd pd i rste unutr proučvnog vremenskog intervl. Do tog dolzi zbog fizioloških proces u lišju ili zbog ispirnj čestic zgđivč s površine tlus u kišnim periodim (Bergmschi i sur, 2007). Vez između morfologije lišj i nkupljnj metl još nije potpuno rzjšnjen, li zn se d krustozni lišjevi mogu pohrniti znčjne količine metl, čk do nekoliko posto svoje suhe mse (Pwlik-Skowrońsk i sur, 2006). Kod folioznih lišjev nđene su više koncentrcije pojedinih metl u središnjem dijelu, koji je njim bio dulje izložen, nego n perifernim dijelovim, međutim to nije slučj u svih vrst. Elementi koji su esencijlni z metbolizm (Co, Cu, Mo, Zn) zbilježeni su u većim koncentrcijm n perifernom dijelu tlus jer je tj dio metbolički njktivniji. Koncentrcij onih koji imju mnju metboličku znčjnost (Al, Cd, Pb) već je u centrlnom dijelu. Fotobiont i mikobiont rzličito su uključeni u kumulciju metl. Mikobiont sdrži 90% ukupne biomse lišj i kumulir većinu metl, posebice u hifm koje formirju gornji korteks. N kumulciju metl utječu ph vrijednost i tempertur. Smnjen ph vrijednost može povećti topivost nekih metl p se oni lkše oslobđju iz čestic u zrku ili tlu. Tkođer, proporcionlno porstu temperture rste kumulcij metl (Bčkor i Loppi, 2009). Onj dio teških metl koji lišju nije nužn z obvljnje fizioloških proces može biti pohrnjen u obliku okslt p n tj nčin ne izziv toksične učinke (Srret i sur, 1998). Osim tog, mikobiont izlučuje sekundrne metbolite. Do sd ih je nđeno više od 800. Djeluju ko keltori i n sebe vežu ktione uključujući one metlne, no zsd još nije dokzno d time štite fotobiont od toksičnog učink. Ktioni, uključujući teške metle, mogu se vezti z negtivno nbijen područj u stničnoj stijenci mikobiont s vnjske 4

11 strne. U tu interkciju uključene su krboksilne, fosftne, mino i hidroksilne skupine (Monnet i sur, 2005). Fiziološki prmetri koji se primjenjuju kod viših biljk d bi se procijenil rzin stres uzrokovn teškim metlim, primjenjuju se i kod lišjev. Njjednostvniji test kojim se ispituje jesu li membrne stnic mikobiont ostle očuvne jest kd dio tlus biv uronjen u deionizirnu vodu te se nkon tog mjeri električn provodljivost. Povećn prisutnost ion u otopini, posebice klij, pokzuje oštećenje membrn, time i rzinu stres kojem je mikobiont izložen (Mrques i sur, 2005). Spojevi koji nstju ko produkt lipidne peroksidcije odnosno oštećenj membrn, primjerice mlondildehid (MDA), koriste se u istu svrhu (Crrers i sur, 2003). Što se tiče učink n fotobiont, u pojedinih vrst lišj pod utjecjem metl, primjerice nikl ili bkr, dolzi do plzmolize stnic fotobiont, kod fotobiont Trebouxi jmesii dokzno je d može doći do promjene veličine stnice bubrenjem ili smnjenjem volumen (Pul i sur, 2004). S obzirom d fotobiont vrši fotosintezu, proces koji je osjetljiv n teške metle, prćenjem sdržj i degrdcije fotosintetskih pigment možemo ustnoviti rzinu stres. Degrdcij klorofil izržv se koeficijentom feofitinizcije (klorofil / feofitin ) koji u zdrvih lišjev iznosi 1.4, u prisutnosti teških metl vrijednost je niž (Bčkor i Loppi, 2009) Fotosintez u lišjev i utjecj olov n njenu učinkovitost Fotosintez je proces u kojem djelovnjem energije Sunčevog zrčenj dolzi do pretvorbe norgnskih tvri u orgnske spojeve. Svjetlosn energij se pretvr u kemijsku, ugljikov dioksid iz tmosfere i vod tvore orgnske spojeve. Fotosintezu čine svjetlosne rekcije i biokemijske rekcije (Clvinov ciklus). U prvim dolzi do oksidcije vode i otpuštnj kisik, u drugim do redukcije ugljikovog dioksid. Svjetlosnim rekcijm nstju ATP i NADPH iz kojih se u končnici sintetizirju ugljikohidrti. Sunčev svjetlost je skup foton rzličitih frekvencij. Fotone iz područj crvene i plve svjetlosti elektromgnetskog spektr orgnizmi iskorištvju z fotosintezu. U lišjev nlzimo klorofil, klorofil b te krotenoide, ukoliko je fotobiont cijnobkterij td uz klorofil, i krotenoide sdrže i fikobiline i fikoeritrine (Nsh, 2008). Klorofil mksimlno 5

12 psorbir svjetlost vlnih duljin 430 i 662 nm, klorofil b vlnih duljin 453 i 642 nm. Krotenoidi njjče psorbirju svjetlost vlnih duljin između 380 i 550 nm i time proširuju spektr vlnih duljin koje pokreću fotosintezu. Tkođer, imju zštitnu ulogu u fotosintezi i štite orgnizm od fotooksidcije. U lišj sm morfologij tkođer pridonosi zštiti od intenzivnog osvjetljenj. Nime, fotobiont se obično nlzi u sloju ispod kontrktilnog tkiv hif, tko d smo dio svjetlosti koji dopire do površine tlus probij do fotobiont. Kd je lišj u suhom stnju tj postotk svjetlosti iznosi %, u potpuno hidrirnom stnju % (Nsh, 2008). Spomenuti kolorofil, klorofil b i krotenoidi nlze se u tilkoidnim membrnm. U tilkoidnim membrnm postoje dv tip fotosustv - fotosustv I i fotosustv II koji se sstoje od ntenskog dijel te rekcijskog središt. Krotenoidi i molekule klorofil u ntenskom dijelu psorbirju fotone i prevode energiju do rekcijskog središt. U rekcijskom središtu nlzi se klorofil i primrni kceptor elektron koji može primiti pobuđeni elektron od molekule klorofil. U rekcijskom središtu fotosustv I nlzi se molekul klorofil s mksimumom psorpcije pri vlnoj duljini 700 nm (tmno crven svjetlost, nziv se P700), dok rekcijsko središte fotosustv II čini molekul klorofil (P680) koj mksimlno psorbir svjetlost vlne duljine 680 nm (Pevlek-Kozlin, 2003). Trnsportni lnc elektron povezuje rekcijsk središt fotosustv I i fotosustv II. Pet proteinskih kompleks (fotosustv II, kompleks citokrom b6-f, fotosustv I, NADP + reduktz i ATP-z) zslužni su z većinu kemijskih proces koji čine svjetlosne rekcije fotosinteze. U svjetlosnim rekcijm postoje dv nčin n koje se elektroni mogu prenijeti - ciklički i neciklički. Necikličkim tokom elektron nkon osvjetljenj fotosustv I i II, nizom redoks sustv elektroni bivju preneseni od vode do NADP + pri čemu nstje NADPH i ATP i oslobđ se kisik. Cikličkim tokom elektron stvr se dodtni ATP ond kd nem potrebe z NADPH, u njeg je uključen smo fotosustv I. Nkon što se u svjetlosnim rekcijm fotosinteze vod fotokemijski oksidir do molekulrnog kisik i nstnu ATP i reducirni NADPH, slijedi Clvinov ciklus. U Clvinovom ciklusu ATP i NADPH služe kko bi se CO2 ugrdio u orgnske spojeve, reduciro do ugljikohidrt, odnosno shroze ili škrob (Pevlek-Kozlin, 2003). N učinkovitost fotosinteze u lišj dost utječe sdržj vode. Nime, lišj psorbir vodu cijelom svojom površinom i vodni potencijl uvelike utječe n njegov metbolizm. 6

13 Ukoliko je tlus visoko dehidrirn, lišj je dormntn i nem izmjene CO2 niti je moguć fotosintez. Tek kd je sdržj vode u lišju 20%, stnice prelze u gel stnje i počinje fotosintez. U cijnolišjev sdržj vode mor biti čk 85 % d bi pokzli istu rzinu fotosintetske ktivnosti. Ukoliko lišjevi žive pričvršćeni n stblu i tlus im je rzgrnt slobodno u zrku ko u vrste Usne, td brzo gube vodu i brz je izmjen energije p je i tempertur tlus jednk temperturi zrk kd su u suhom i mokrom stnju. Tlus folioznih lišjev im deblji sloj koji ih štiti od gubitk vode (Nsh, 2008). Energij koju psorbirju molekule klorofil u lišj, isto ko i u biljk, može biti iskorišten u tri proces. Može pokrenuti fotosintezu, osloboditi se u obliku topline ili se osloboditi u obliku foton crvene svjetlosti što predstvlj fluorescenciju klorofil. T tri nčin iskorištenj energije, međusobno su zvisni, primjerice, ukoliko se smnji neki od njih, drug dv će se povećti (Mxwell i Johnson, 2000). Mjerenjem fluorescencije klorofil in vivo možemo dobiti podtke o učinkovitosti fotosustv II. Fotosustv II je njskloniji oštećenjim pri rzličitim stresnim uvjetim tko d određivnjem fluorescencije klorofil in vivo možemo dobiti pouzdnu informciju o stnju fotosintetskog prt odnosno o učinkovitosti proces fotosinteze (Mxwell i Johnson, 2000). Izloženost lišjev teškim metlim ko što su koblt, olovo i bkr djeluje n sniženje mksimlnog prinos fotosustv (Yiğittürk i sur, 2016, Grty i sur, 2001). Tkođer, sdržj i sstv fotosintetskih pigment jedn je od njosjetljivijih i njrširenijih prmetr z procjenu stres koji uzrokuju teški metli. Određeni metli oksidirju metilne skupine n drugom pirolskom prstenu klorofil, nstje klorofil b i ukupni sstv klorofil (+b) ostje stbiln, no omjer klorofil /b se smnjuje. Neki drugi metli pk smnjuju količinu klorofil i klorofil b podjednko (Bčkor i Zetíková, 2003). Stres teškim metlim uzrokuje i degrdciju klorofil koju izržvmo već spomenutim koeficijentom feofitinizcije. (Bčkor i Loopi, 2009). Izlgnje teškim metlim, posebno olovu, djeluje n povišenje produkcije rektivnih kisikovih rdikl (ROS), uključujući superoksidne rdikle, hidroksilne rdikle i hidrogen perokside (Verm i Dubey, 2003). Ukoliko su stnice fotobiont izložene visokim koncentrcijm metl ne mogu učinkovito neutrlizirti ROS p ih oni oštećuju. Rektivni kisikovi rdikli mogu regirti s stničnim komponentm (lipidi, proteini, pigmenti, nukleinske kiseline) i uzrokovti lipidnu peroksidciju, oštećenje membrn, inktivciju enzim i n te nčine utjecti n mnoge fiziološke procese ko i n vijbilnost stnice. 7

14 Fotosintez je osjetljiv n količinu ROS- zbog njihovog štetnog utjecj n sstve dijelove fotosintetskog prt. Oni djeluju n kloroplste, uzrokuju strukturn oštećenj tilkoid, kvntittivne i kvlittivne promjene kompozicije pigment, promjene u kompoziciji lipid, mijenjju ktivnost PSI i PSII te lnc prijenos elektron. Olovo inhibir fotosintezu tko d inhibir krboksilznu ktivnost ribuloz-1, 5-bisfosft krboksilz oksigenze (Rubisco), uzrokuje njegovu disocijciju čime on postje nektivn. Olovo može utjecti n enzimtsku ktivnost, ili direktno tko d regir s SH grupm, ili indirektno stvrnjem ROS- koji ztim oksidirju SH skupine protein. Fotobionti mogu izbjeći toksični učink teških metl, tko d brzo povećju produkciju tiolnih peptid koji se nzivju fitoheltini. Fitoheltini formirju komplekse s Cd, Pb i Zn i ti kompleksi mogu biti trnsportirni i kumulirni intrcelulrno. Drugi nčin obrne čine ntioksidtivni enzimi i proteini koji imju funkciju šperon. Primjerice neki od enzim mogu rdikle superoksidnih nion pretvoriti u hidrogen peroksid koji lge i biljke td reducirju u vodu (Alvrez i sur, 2012) Istrživni lišjevi Dvije vrste lišje, Flvoprmeli cpert (L.) Hle i Everni prunstri (L.) Ach pokzuju rzličitu osjetljivost n teške metle iz okoliš p tko i n olovo (Lckovičová i sur, 2013) Flvoprmeli cpert (L.) Hle Flvoprmeli cpert (L.) Hle je epifitski foliozni lišj čiji tlus može nrsti od 5 do 20 cm u promjeru. Tlus je zelenksto- žute ili sivo- zelene boje i čine g režnjevi širine 0,05 do 0,13 cm (slik 1). Donj strn tlus u sredini je crn, prem rubnim dijelovim prelzi u smeđu boju. Gornji korteks sdrži usninsku kiselinu i trnorin, dok se u meduli nlze protocetrričn i kpertičn kiselin. Ovj lišj živi n otvorenim stništim, njčešće n stblim (vrlo često hrst), grmovim, ponekd i n kmenu. Rsprostrnjen je diljem svijet, u Južnoj i Sjevernoj Americi, Europi, Aziji i Africi (Nsh, 2010). Velik površin tlus ovoj vrsti omogućuje dobru kumulciju element što je čini pogodnim kndidtom z istrživnje tmosferskog onečišćenj (Mjumder, 2012). Tkođer, široko je rsprostrnjen 8

15 n područjim koj su istrživn u ovom diplomskom rdu. F.cpert neutrofiln je i nitrofiln vrst tolerntn n povišenu rzinu dušik ( nstlu oslobđnjem ispušnih plinov iz utomobil i od strne industrije. Slik 1. Vrst Flvoprmeli cpert (L.) Hle. Preuzeto i prilgođeno prem: /lichens/cnalh/201602/flvoprmeli_cpert_de.jpg Everni prunstri (L.) Ach Everni prunstri (L.) Ach fruktikozni je lišj koji pripd porodici Prmelicee ko i prethodn vrst. Tlus ove vrste čine dihotomski rzgnjeni ogrnci, kojih može biti mnje ili više, širin im se kreće između 0,5 do 3 mm (slik 2). Gornj površin lišj je zelenkstosiv ili blijedo zeleno-žute boje. Ukoliko je lišj str ili oštećen, izblijedio je i sivkste je boje. Donj površin tlus obojen je poput gornje ili je nešto svjetlij. Sekundrni metboliti ove vrste su usninsk kiselin, trnorin, klortrnorin i everičn kiselin. E. prunstri njčešće obitv n neutrlnoj ili kiseloj kori hrst ili nekog drugog listopdnog stbl. Većinom nstnjuje područj koj su vlžn, osunčn i često vjetrovit. Nlzimo je n nižim ndmorskim visinm, no ponekd može nstniti i više (do 1675 m) (Nsh, 2001). Ov vrst je široko rsprostrnjen n području Slvonije i utjecj teških metl n nju prilično je 9

16 dobro istržen u mnogim studijm p sm je zto koristil prilikom svog pokus. E. prunstri cidofiln je vrst (Spier i sur, 2010) osjetljiv n dušik i teške metle prisutne u zgđenom okruženju (Lckovičová i sur, 2013). Slik 2. Vrst E. prunstri. Fotogrfiro: Mrko Doboš 1.5. Ciljevi istrživnj Zbog svojih brojnih krkteristik lišjevi su izvrsni bioindiktori onečišćenj okoliš. Rzličit osjetljivost pojedine vrste omogućuje prćenje koncentrcije onečišćivč u okolišu. Cilj ovog rd bio je: ustnoviti osjetljivost vrst E. prunstri i F. cpert n izlgnje olovu prćenjem učinkovitosti fotosinteze, određivnjem koncentrcije fotosintetskih pigment te rzine lipidnih peroksid, utvrditi kko ph vrijednost (4 i 6) otopine i vrst otopine (destilirn vod ili Hoglndov otopin), kojom se lišjevi prskju, modificirju učink olov nkon 1., 7. i 14. dn 10

17 11 2. MATERIJALI I METODE

18 2.1. Istrživni mterijl Istrživnje sm provel n dvije vrste lišjev - Everni prunstri (L.) Ach i Flvoprmeli cpert (L.) Hle. Uzorci su skupljeni krjem ožujk godine u blizini Požege n stništu bez pozntog onečišćenj. Nkon uzorkovnj lišjevi su stvljeni u krtonsku kutiju kko bi se što mnje isušili prije nego što budu dopremljeni u lbortorij gdje sm nstvil pokus. Uzorci E. prunstri skupljni su u npuštenom voćnjku s kore ili zjedno s grnčicm, ukoliko se n terenu nisu mogli odvojiti. Prvi kork u lbortoriju bio je odvojiti lišjeve od kore i potpuno ih očistiti od svih strnih mterijl. Vrst F. cpert skupljn je u šumi zjedno s korom te sm i kod te vrste njprije morl potpuno očistiti uzorke. Nkon što sm uzorke očistil, izbrl sm lišjeve što sličnijeg oblik tlus i podjednkih ms. Mse su se kretle između 0,09 i 0,2 g. Kod vrste F. cpert pzil sm d uzorci sdrže dio tlus koji je mlđi, odnosno onj koji se nlzi oko 1 cm uz rub lišj. Time sm osigurl d svi uzorci budu podjednko metbolički ktivni (Bjerke i sur. 2004, 2005). Lišjevi su ztim smješteni n mrežice učvršćene n petrijevim posudm čije sm dno prethodno prekril s nekoliko slojev filter ppir ntopljenog destilirnom vodom (slik 3). Slik 3. Uzorci vrste E. prunstri smješteni n klimtizciju u klim-komoru n mrežice učvršćene n petrijeve posude. 12

19 Petrijeve posudice su stvljene n klimtizciju u klim-komoru tijekom 3 dn kko bi se uzorci prilgodili uvjetim u kojim će se odvijti pokus. Uvjeti u klim komori su bili 16 h svjetl (60 µmol foton m 2 s -1 ) i 8 h tme uz temperturu 22 ± 2 C. Nkon klimtizcije uzorci su tretirni olovom Kemiklije U istrživnju sm koristil kemiklije proizvođč Kemik: (NH4)2H2PO4, KNO3, C(NO3)2 4H2O, MgSO4 7H2O, KH2PO4, H3BO3, MnCl2 4H2O, ZnSO4 7H2O, CuSO4 5H2O, NMoO4 2H2O, MgCO3 i triklorocten kiselin (TCA) te proizvođč Sigm: Fe-N-EDTA, dimetil sulfoksid (DMSO), tiobrbiturtn kiselin (TBA). Uzorke sm prskl deionizirnom vodom ili 1/10 Hoglndovom otopinom (tblic 1) čiju sm ph vrijednost prilgodil pomoću HCl i NOH otopin. Prilikom priprvljnj otopine olov koristil sm spoj Pb(NO3)2. Tblic 1. Sstv Hoglndove otopine z pripremu 1 L otopine (Hoglnd i Arnon, 1950). Volumen (ml) Koncentrcij mtične otopine Spoj M (NH4)2H2PO4 6 1 M KNO3 4 1 M C(NO3)2 4H2O 2 1 M MgSO4 7H2O M KH2PO % Fe-N-EDTA g 1.81 g 0.22 g g g do 1 L H3BO3 MnCl2 4H2O ZnSO4 7H2O CuSO4 5H2O NMoO4 2H2O destilirn H2O 13

20 2.3. Tretirnje olovom Nkon klimtizcije uzorke lišjev sm podijelil u dvije skupine. Jednu sm uronil, u trjnju od pol st, u otopinu olov koncentrcije 20 mm i ph vrijednosti 4, drugu u otopinu olov iste koncentrcije, li ph vrijednosti 6. Lišjeve koji su mi služili ko kontrol, uronil sm u vodu odgovrjuće ph vrijednosti, odnosno ph 4 i ph 6. Tijekom dljnjeg trjnj pokus dio lišjev iz svke skupine prskl sm destilirnom vodom odgovrjuće ph vrijednosti, dok sm drugi dio prskl 1/10 Hoglndove otopine odgovrjuće ph vrijednosti. Prskl sm ih dv put dnevno, od čeg sm ih jednom prskl destilirnom vodom odgovrjuće ph vrijednosti, drugi put je dio lišjev prskn 1/10 Hoglndove otopine. Provel sm tri uzorkovnj. Prvo nkon 1., drugo nkon 7. i treće nkon 14. dn (tblic 2). Tretmni su bili jednki z obje vrste. Tblic 2. Opis tretmn. Uzorci su bili podijeljeni u 8 grup. Dio je bio uronjen pol st u otopinu olov koncentrcije 20 mm i ph vrijednosti 4, dio u otopinu olov iste koncentrcije, li ph vrijednosti 6. Ko kontrol korišteni su lišjevi uronjeni u vodu odgovrjuće ph vrijednosti. Tijekom pokus uzorci su bili prskni medijem odgovrjuće ph vrijednosti, medij je bio ili Hoglndov otopin ili destilirn vod. Lišjevi su uzorkovni u tri vremenske točke, nkon 1., 7. i 14. dn. Tretmn ph medij H2O H2O H2O H2O Hoglndov otopin Hoglndov otopin Hoglndov otopin Hoglndov otopin Pb Nkon svkog uzorkovnj izmjeril sm fluorescenciju klorofil in vivo te odredil fluorescencijske prmetre (Lichethler i sur, 2005.). Ztim sm uzorke sušil u liofiliztoru te usitnil kko bih iz njih ekstrhirl klorofile i spektrofotometrijski odredil udio lipidnih peroksid. Svi uzorci mjereni su u 5 ili 6 replik Mjerenje fluorescencije klorofil u uvjetim in vivo Prije smog mjerenj fluorescencije uzorke sm poprskl odgovrjućom otopinom i stvil u tmu n 30 minut. Z mjerenje fluorescencije klorofil in vivo koristil sm uređj FluorPen fluorimetr i pripdjuć uputstv (FluorPen Mnul nd User Guide, 2015). 14

21 Tlus svkog lišj smjestil sm u kvčicu koju sm pričvrstil n fluorimetr. Njbitnije je bilo lišjnim mterijlom prekriti otvor kroz koji prolzi snop svjetlosti. N fluorimetru sm odbrl protokol koji omogućuje mjerenje OYmx (mksimlni kvntni prinos fotosustv II). U tom protokolu definirni su prmetri ktiničkog i sturcijskog svjetl. Z prvi iznose 30%, z drugi 70%. Mjerenje po tom protokolu počinje obsjvnjem tlus lišj svjetlošću niskog intenzitet i td uređj zbilježi minimlnu fluorescenciju (F0). Nkon tog slijedi osvjetljenje krtkim sturcijskim pulsom koji smnjuje pool plstokinon i bilježi se mksimln fluorescencij u tmi (Fm). Ztim se uzork izlže krtkom ktiničkom zrčenju u trjnju od nekoliko desetk do nekoliko stotin sekundi kko bi se izzvo krtkotrjn Kutsky-jev efekt odnosno pd intenzitet fluorescencije do ujednčene vrijednosti Ft zbog pokretnj fotokemijskih rekcij. N krju ponovno slijedi osvjetljvnje sturcijskim pulsom i biv zbilježen vrijednost kvntni prinos fotosustv II (quntum yield - QY) u uvjetim svjetl. Nkon izlgnj kontinuirnom osvjetljenju slijedi fz oporvk pomoću sturcijskih pulsev u tmi (slik 4). Slik 4. Prikz postupk mjerenj prmetr QY mx pomoću uređj FluorPen, s oznčenim intenzitetom svjetlosti n y osi u određenom vremenskom intervlu koji je nznčen n x osi grf. Preuzeto i prilgođeno prem FluorPen Mnul nd User Guide, Nkon mjerenj, n rčunlu sm pokrenul progrm koji je povezn s FluorPen fluorimetrom kko bih prenijel dobivene podtke i očitl dobivene vrijednosti. Uređj Fluorpen određuje vrijednosti fluorescencijskih prmetr prem formulm (FluorPen Mnul nd User Guide, 2015): 15

22 QY mx= F v/f m F v= F m-f 0 QYmx = mksimlni kvntni prinos fotosustv II F0 = prinos fluorescencije uzork prilgođenog n uvjete tme Fm =mksimlni prinos fluorescencije uzork prilgođenog n uvjete tme dobiven tijekom sturcijskog puls Fv = vrijbiln fluorescencij 2.5. Ekstrkcij i određivnje koncentrcije fotosintetskih pigment Prije ekstrkcije i određivnj koncentrcije fotosintetskih pigment uzorke sm osušil u liofiliztoru (Alf 1-2, Christ, Njemčk). Od svkog uzork njprije sm izvgl 20 mg usitnjenog tlus. Nkon što sm usitnjeni mterijl stvil u tubice z centrifugirnje, dodl sm 1,5 ml DMSO i n vrhu sptule MgCO3. Tko priprvljene uzorke sm vorteksirl, ztim stvil n inkubciju 40 minut pri 60 C. Nkon inkubcije, homogente sm centrifugirl pri sobnoj temperturi, 10 minut n g. Superntnt, u kojem se nlze fotosintetski pigmenti, prelil sm u prethodno oznčene čiste tubice. Pripremljene ekstrkte koristil sm z mjerenje klorofil, klorofil b, ukupnih krotenoid i rčunnje koeficijent feofitinizcije (FC). Uzorke sm prelil u stklenu kivetu te pomoću spektrofotometr odredil psorbnciju pri vlnim duljinm od 415, 435, 480, 649 te 665 nm. Koncentrciju fotosintetskih pigment odredil sm prem formulm (Krnner i sur, 2002): ) Z klorofil : c = b) Z klorofil b: cb =,,,, c) Z ukupne krotenoide: ck = (,, )/ d) Koeficijent feofitinizcije: FC = c = sdržj klorofil (mg/g suhe tvri) cb = sdržj klorofil b (mg/g suhe tvri) ck = sdržj krotenoid (mg/g suhe tvri) FC = koeficijent feofitinizcije A480/665/649/435/415 = psorbncije uzork pri određenim vlnim duljinm m = ms uzork 16

23 2.6. Spektofotometrijsko određivnje lipidnih peroksid Rzinu lipidnih peroksid odredil sm spektrofotometrijski prem prilgođenoj metodi Mjumder i surdnici (2012). Izvgl sm 50 mg tlus lišj koji sm potom homogenizirl u trioniku s 1 ml 0,1%-tne (w/v) trikloroctene kiseline (TCA). Sdržj sm prebcil u tubice te sonificirl 15-k minut. Ztim sm uzorke centrifugirl 20 minut n sobnoj temperturi (24 C) i g. U stklene epruvete stvil sm 0,5 ml uzork i dodl 1,5 ml 0,6%-tne tiobrbiturtne kiselin (TBA) u 10% TCA. Uzorke sm nkon tog stvil u sušionik 30 minut n 95 C. Nkon što sm ih izvdil, nglo sm ih ohldil u hldnjku 10- k minut. N spektrofotometru sm izmjeril psorbnciju pri vlnim duljinm 532 i 600 nm. Ko slijepu probu sm koristil regens kojim sm ekstrhirl uzorke. Lipidni peroksidi, među kojim je njzstupljeniji mlondildehid (MDA) regirju s TBA i dju mjerljivo obojenje te se smtrju pouzdnim indiktorom oksidcijskog oštećenj, odnosno lipidne peroksidcije. Apsorbnciju sm mjeril n 600 nm zbog nespecifične zmućenosti, od tog sm oduzel psorbnciju pri 532 nm. Rzinu lipidnih peroksid izrzil sm u nmol po grmu suhe tvri (nmol/gst) koristeći ekstincijski koeficijent z MDA ( = 157 mm -1 cm -1 ) prem formuli (Hodges i sur. 1998): MDA = (A₅₃₂ - A₆₀₀) / x 10⁶ m x 1000 [nmol/gst] MDA - udio mlondildehid (nmol/gst) A₅₃₂/₆₀₀ - psorbncij pri 532, 600 nm m - ms suhe tvri (gst) 2.7. Određivnje ms uzork Prije tretmn svim uzorcim sm izvgl msu u suhom stnju. Nkon što je zvršio neki od 8 tretmn, uzorci su ostvljeni u liofiliztoru (Alf 1-2, Christ, Njemčk) otprilike 24 st pri temperturi -65 C i tlku 0,05 mbr kko bi se u potpunosti osušili. Nkon tog izvgl sm suhu msu uzork. 17

24 2.8. Sttističk obrd podtk Rezultte istrživnj prikzl sm u rčunlnom progrmu Microsoft office Excel 2007 i Sttistic Dobivene vrijednosti njprije sm izrzil u postotku od kontrole i ztim prikzl grfički ko srednju vrijednost 5 ili 6 replik po tretmnu ± stndrdn pogrešk. Provel sm fktorijlnu nlizu vrijnce kko bih ustnovil koji čimbenici ili njihove kombincije utječu n uzorke prilikom pojedinog mjerenj. Ztim sm provel nlizu vrijnce (one-wy ANOVA), koristeći Fisher's LSD test z svki pojedini pokztelj utvrdil sm koji se uzorci znčjno rzlikuju n rzini p 0,05. U slučju znčjnije rzlike rezulttim sm n grfu pridružil rzličit slov. 18

25 19 3. REZULTATI

26 Sttističkom nlizom prirst ms dobil sm rezultte koji su pokzli d uopće nije bilo prirst tijekom pokus p tj pokztelj nism prikzl u rezulttim Fluorescencij klorofil in vivo Everni prunstri (L.) Ach Zbog velikog broj čimbenik nvesti ću smo one z koje je fktorijln nliz vrijnce pokzl d sttistički znčjno utječu n mjereni pokztelj. Kod vrste E. prunstri mksimlni kvntni prinos fotosustv II (QYmx) nkon 1. i 7. dn znčjno ovisi o mediju i olovu. I kombincij tih dvju čimbenik prilikom ob uzorkovnj utječe n QYmx. Utjecj medij, olov i njihove kombincije znčjn je i nkon 14. dn. U lišj uzorkovnih nkon 14. dn, osim spomenutih čimbenik, n QYmx utječe i ph vrijednost u kombinciji s medijem te u kombinciji s olovom. Sv tri čimbenik zjedno (medij, olovo, ph vrijednost) tkođer pokzuju sttistički znčjn utjecj n QYmx (tblic 3). 20

27 Tblic 3. Fktorijln nliz vrijnce nprvljen z mksimlni kvntni prinos fotosustv II (QY mx) s obzirom n medij kojim su uzorci prskni tijekom pokus, njegovu ph vrijednost te prisutnost olov z vrstu E. prunstri (L.). Fktori koji znčjno utječu n QY mx podebljni su i u kurzivu (p 0,05). 1. dn 7. dn 14. dn efekt sume kvdrt F vrijednost medij 284,1 8,76 0, ph 131,4 4,05 0, olovo 789,2 24,35 0, medij*ph 131,4 4,05 0, medij*olovo 188,0 5,80 0, ph*olovo 14,6 0,45 0, medij*ph*olovo 42,5 1,31 0, medij 814,7 4,183 0, ph 691,4 3,550 0, olovo 2467,0 12,667 0, medij*ph 475,3 2,440 0, medij*olovo 1546,9 7,943 0, ph*olovo 789,2 4,052 0, medij*ph*olovo 84,9 0,436 0, medij 4417,4 29,406 0, ph 441,0 2,936 0, olovo 10673,7 71,054 0, medij*ph 866,5 5,768 0, medij*olovo 3315,9 22,074 0, ph*olovo 946,7 6,302 0, medij*ph*olovo 716,7 4,771 0, p Jednosmjern nliz vrijnce pokzl je znčjno smnjenje QYmx nkon 1. dn tretmn olovom i prsknj destilirnom vodom ph vrijednosti 4 i 6 u usporedbi s onim uzorcim koji su prskni smo destilirnom vodom odgovrjućeg ph. Kombincij olov i Hoglndove otopine pri obje ph vrijednosti nije pokzl znčjn učink n ovj prmetr. Nkon 7. dn tretmn olovom i destilirnom vodom pri obje ph vrijednosti i dlje je utjeco n smnjenje QYmx. Kod uzork tretirnih olovom i Hoglndovom otopinom kod obje ph vrijednosti nije bilo sttistički znčjne rzlike s obzirom n kontrolne skupine koje nisu bile tretirne olovom. Trend snižvnj QYmx u uzork tretirnih olovom i prsknih destilirnom vodom, nstvio se i nkon 14. dn. Učink olov bio je veći u lišj koji su prskni destilirnom vodom ph vrijednosti 6, nego u lišj prsknih vodom ph vrijednosti 4. Što se tiče lišj koji su bili izloženi olovu i Hoglndovoj otopini, sttistički znčjno smnjenje mjerenog prmetr zbilježil sm smo kod ph vrijednosti 6 (slik 5). 21

28 F v /F m (% od kontrole) V (4) V+Pb (4) H (4) H+Pb (4) V (6) V+Pb (6) H (6) H+Pb (6) b bc b b b b b b b b c bc c c c d 1. dn 7. dn 14. dn Slik 5. Mksimlni kvntni prinos fotosustv II (QYmx=Fv/Fm), izržen ko postotk od kontrole, u vrste E. prunstri nkon 1., 7. i 14. dn pokus. Crtkn linij oznčv kontrolnu skupinu lišjev n početku pokus prije tretirnj rzličitim otopinm. Uzorci lišjev tretirni su n slijedeći nčin: V (4) - kontroln skupin lišjev prskn tijekom pokus destilirnom vodom ph vrijednosti 4, V+Pb (4) - lišjevi tretirni olovom te prskni tijekom pokus destilirnom vodom ph vrijednosti 4, V (6) - kontroln skupin prskn destilirnom vodom ph vrijednosti 6, V+Pb (6) - lišjevi tretirni olovom te prskni destilirnom vodom ph vrijednosti 6; H (4) - lišjevi prskni tijekom pokus 1/10 Hoglndove otopine ph vrijednosti 4, H+Pb (4) - lišjevi tretirni olovom te prskni tijekom pokus 1/10 Hoglndove otopine ph vrijednosti 4, H (6) - lišjevi prskni 1/10 Hoglndove otopine ph vrijednosti 6, H+Pb (6) - lišjevi tretirni olovom te prskni 1/10 Hoglndove otopine ph vrijednosti 6. Rezultti su prikzni ko srednj vrijednost od njmnje pet replik ± stndrdn pogrešk. Rzličit slov iznd stupc oznčuju d su vrijednosti međusobno sttistički znčjno rzličite (p 0,05) unutr istog dn Flvoprmeli cpert (L.) Hle Fktorijln nliz vrijnce z vrstu F. cpert z mksimlni kvntni prinos fotosustv II (QYmx) pokzl je znčjn učink olov nkon prvog dn tretmn. Osim olov, kombincij medij i ph te kombincij sv tri čimbenik utjecl je n QYmx. Nkon 7 dn vidljiv je znčjn utjecj ph vrijednosti te kombincij ph vrijednosti i medij. Anliz nkon 14 dn pokzl je d medij i olovo, utječu n QYmx svki zsebno, li i u kombinciji (tblic 4). 22

29 Tblic 4. Fktorijln nliz vrijnce nprvljen z mksimlni kvntni prinos fotosustv II (QY mx) s obzirom n medij kojim su uzorci prskni tijekom pokus, njegovu ph vrijednost te prisutnost olov z vrstu F. cpert. Fktori koji znčjno utječu n QY mx podebljni su i u kurzivu (p 0,05). 1. dn 7. dn 14. dn efekt sume kvdrt F vrijednost medij 7,1 0,21 0, ph 48,6 1,43 0, olovo 604,4 17,80 0, medij*ph 247,7 7,29 0, medij*olovo 255,1 7,51 0, ph*olovo 136,1 4,01 0, medij*ph*olovo 327,1 9,63 0, medij 0,0 0,000 0, ph 4102,1 25,656 0, olovo 359,0 2,245 0, medij*ph 721,2 4,511 0, medij*olovo 205,3 1,284 0, ph*olovo 125,4 0,784 0, medij*ph*olovo 420,8 2,632 0, medij 2519,3 8,8167 0, ph 0,9 0,0032 0, olovo 16311,8 57,0859 0, medij*ph 150,6 0,5270 0, medij*olovo 2488,7 8,7096 0, ph*olovo 12,6 0,0442 0, medij*ph*olovo 76,6 0,2682 0, p Jednosmjern nliz vrijnce pokzl je d je već nkon prvog dn tretmn olovom u kombinciji s vodom pri obje ph vrijednosti djelovo n smnjenje QYmx u usporedbi s pripdjućim kontrolnim skupinm. Kombincij olov i Hoglndove otopine pri ph vrijednosti 6 nije iml znčjn utjecj dok je pri ph vrijednosti 4 uočeno smnjenje mjerenog prmetr. Nkon 7. dn kod lišjev tretirnih olovom i destilirnom vodom QYmx je i dlje bio niži nego kod pripdjućih kontrolnih skupin i to kod obje ph vrijednosti. Tkođer tretmn olovom u kombinciji s Hoglndovom otopinom pri ph 4 sttistički je znčjno snizio QYmx u odnosu n kontrolnu skupinu dok pri ph 6 nije bilo znčjne rzlike s obzirom n kontrolnu skupinu. Uspoređujući lišjeve koji su prskni smo Hoglndovom otopinom QYmx je bio sttistički znčjno niži pri ph vrijednosti 6. Tkođer vrijednosti su bile niže u odnosu n lišjeve prskne destilirnom vodom ph vrijednosti 6. N krju pokus (nkon 14. dn) njniži QYmx imli su lišjevi tretirni olovom i destilirnom vodom pri obje 23

30 istrživne ph vrijednosti. Tretmni kombincijom olov i Hoglndove otopine pri obje ph vrijednosti imli su nešto viši QYmx (slik 6), li su njegove vrijednosti bile znčjno više od onih izmjerenih u kontrolnih lišjev prsknih Hoglndovom otopinom. F v /F m (% od kontrole) V (4) V+Pb (4) H (4) H+Pb (4) V (6) V+Pb (6) H (6) H+Pb (6) b b c c c b b b b b b b c c 1. dn 7. dn 14. dn Slik 6. Mksimlni kvntni prinos fotosustv (QYmx=Fv/Fm), izržen ko postotk od kontrole, u vrste F. cpert nkon 1., 7. i 14. dn pokus. Crtkn linij oznčv kontrolnu skupinu lišjev n početku pokus prije tretirnj rzličitim otopinm. Uzorci lišjev tretirni su n slijedeći nčin: V (4) - kontroln skupin lišjev prskn tijekom pokus destilirnom vodom ph vrijednosti 4, V+Pb (4) - lišjevi tretirni olovom te prskni tijekom pokus destilirnom vodom ph vrijednosti 4, V (6) - kontroln skupin prskn destilirnom vodom ph vrijednosti 6, V+Pb (6) - lišjevi tretirni olovom te prskni destilirnom vodom ph vrijednosti 6; H (4) - lišjevi prskni tijekom pokus 1/10 Hoglndove otopine ph vrijednosti 4, H+Pb (4) - lišjevi tretirni olovom te prskni tijekom pokus 1/10 Hoglndove otopine ph vrijednosti 4, H (6) - lišjevi prskni 1/10 Hoglndove otopine ph vrijednosti 6, H+Pb (6) - lišjevi tretirni olovom te prskni 1/10 Hoglndove otopine ph vrijednosti 6. Rezultti su prikzni ko srednj vrijednost od njmnje pet replik ± stndrdn pogrešk. Rzličit slov iznd stupc oznčuju d su vrijednosti međusobno sttistički znčjno rzličite (p 0,05) unutr istog dn Fotosintetski pigmenti Everni prunstri (L.) Ach Koncentrcij klorofil Fktorijlnom nlizom vrijnce dobil sm rezultte koji ne pokzuju znčnije rzlike između tretmn nkon prvog dn. Sedmog dn znčjn utjecj n koncentrciju klorofil imlo je olovo. Četrnesti dn, osim olov, utjecl je i kombincij medij i ph vrijednosti (tblic 5). 24

31 Tblic 5. Fktorijln nliz vrijnce nprvljen z koncentrcije klorofil s obzirom n medij kojim su uzorci prskni tijekom pokus, njegovu ph vrijednost te prisutnost olov z vrstu E. prunstri. Fktori koji znčjno utječu n koncentrciju klorofil podebljni su i u kurzivu (p 0,05). 1. dn 7. dn 14. dn efekt sume kvdrt F vrijednost medij 3,744 0,007 0,936 ph 104,943 0,182 0,672 olovo 1344,116 2,337 0,134 medij*ph 0,352 0,001 0,980 medij*olovo 242,339 0,421 0,520 ph*olovo 1259,553 2,190 0,147 medij*ph*olovo 15,609 0,027 0,870 medij 36,859 0,047 0,830 ph 1923,493 2,447 0,126 olovo 3650,773 4,644 0,037 medij*ph 526,624 0,670 0,418 medij*olovo 12,082 0,015 0,902 ph*olovo 737,620 0,938 0,339 medij*ph*olovo 216,949 0,276 0,602 medij 1365,020 2,165 0,149 ph 192,990 0,306 0,583 olovo 40532,041 64,288 0,000 medij*ph 2918,708 4,629 0,038 medij*olovo 455,136 0,722 0,401 ph*olovo 866,471 1,374 0,248 medij*ph*olovo 1039,876 1,649 0,206 p Jednosmjern nliz vrijnce z prvi dn pokzl je d nem sttistički znčjne rzlike u koncentrciji klorofil između tretmn. Nkon sedm dn znčjn rzlik uočen je smo između lišjev tretirnih olovom i Hoglndovom otopinom ph vrijednosti 4 te onih koji su bili prskni destilirnom vodom iste ph vrijednosti. Nkon 14. dn tretmn olovom u kombinciji s destilirnom vodom znčjno je snizio koncentrciju klorofil, znčjno veće sniženje uočil sm pri ph vrijednosti 6. Tretmn olovom u kombinciji s Hoglndovom otopinom tkođer je djelovo n sniženje koncentrcije klorofil i to slično pri obje ph vrijednosti. Međutim, lišjevi tretirni olovom u kombinciji s Hoglndovim medijem ph vrijednosti 6 imli su višu koncentrciju klorofil nego oni tretirni olovom u kombinciji s vodom (slik 7). 25

32 Koncentrcij klorofil (% od kontrole) V (4) V+Pb (4) H (4) H+Pb (4) V (6) V+Pb (6) H (6) H+Pb (6) b b b b b b b b b b bc c 1. dn 7. dn 14. dn Slik 7. Koncentrcij klorofil, izržen ko postotk od kontrole, u vrste E. prunstri nkon 1., 7. i 14. dn pokus. Crtkn linij oznčv kontrolnu skupinu lišjev n početku pokus prije tretirnj rzličitim otopinm. Uzorci lišjev tretirni su n slijedeći nčin: V (4) - kontroln skupin lišjev prskn tijekom pokus destilirnom vodom ph vrijednosti 4, V+Pb (4) - lišjevi tretirni olovom te prskni tijekom pokus destilirnom vodom ph vrijednosti 4, V (6) - kontroln skupin prskn destilirnom vodom ph vrijednosti 6, V+Pb (6) - lišjevi tretirni olovom te prskni destilirnom vodom ph vrijednosti 6; H (4) - lišjevi prskni tijekom pokus 1/10 Hoglndove otopine ph vrijednosti 4, H+Pb (4) - lišjevi tretirni olovom te prskni tijekom pokus 1/10 Hoglndove otopine ph vrijednosti 4, H (6) - lišjevi prskni 1/10 Hoglndove otopine ph vrijednosti 6, H+Pb (6) - lišjevi tretirni olovom te prskni 1/10 Hoglndove otopine ph vrijednosti 6. Rezultti su prikzni ko srednj vrijednost od njmnje pet replik ± stndrdn pogrešk. Rzličit slov iznd stupc oznčuju d su vrijednosti međusobno sttistički znčjno rzličite (p 0,05) unutr istog dn. 26

33 Koncentrcij klorofil b Obrdom podtk fktorijlnom nlizom vrijnce uočil sm d 1. dn nije bilo znčnog utjecj tretmn n koncentrciju klorofil b. Nkon 7. i 14. dn olovo je imlo znčjn utjecj n koncentrciju klorofil b (tblic 6). Tblic 6. Fktorijln nliz vrijnce nprvljen z koncentrciju klorofil b s obzirom n medij kojim su uzorci prskni tijekom pokus, njegovu ph vrijednost te prisutnost olov z vrstu Everni prunstri (L.) Ach. Fktori koji znčjno utječu n koncentrciju klorofil b su i u kurzivu (p 0,05). 1. dn 7. dn 14. dn efekt sume kvdrt F vrijednost medij 58,416 0,088 0,768 ph 167,695 0,253 0,618 olovo 2188,492 3,301 0,077 medij*ph 12,933 0,020 0,890 medij*olovo 368,316 0,555 0,460 ph*olovo 919,689 1,387 0,246 medij*ph*olovo 73,217 0,110 0,741 medij 4,570 0,005 0,943 ph 2254,286 2,520 0,120 olovo 3893,244 4,352 0,043 medij*ph 453,367 0,507 0,481 medij*olovo 223,686 0,250 0,620 ph*olovo 1596,148 1,784 0,189 medij*ph*olovo 218,168 0,244 0,624 medij 1354,994 1,524 0,224 ph 311,958 0,351 0,557 olovo 43840,833 49,320 0,000 medij*ph 2514,946 2,829 0,100 medij*olovo 174,615 0,196 0,660 ph*olovo 480,545 0,541 0,466 medij*ph*olovo 635,082 0,714 0,403 p Jednosmjern nliz vrijnce pokzl je d nkon 1. dn nije bilo znčjne rzlike između tretmn. Nkon 7. dn koncentrcij klorofil b smnjil se u uzork tretirnih olovom pri ph vrijednosti 4 i prsknih vodom pripdjućeg ph u odnosu n kontrolnu skupinu. Isti tretmn pri ph vrijednosti 6 nije imo utjecj. Tretmni koji su uključivli olovo i Hoglndovu otopinu nisu imli znčjn utjecj n koncentrciju klorofil b. Međutim lišjevi koji su tretirni Hoglndovom otopinom ph vrijednosti 4 imli su znčjno nižu 27

34 koncentrciju klorofil b od onih koji su bili prskni destilirnom vodom iste ph vrijednosti. Nkon 14. dn tretmni olovom i u kombinciji s vodom i u kombinciji s Hoglndovom otopinom znčjno su snizili koncentrciju klorofil b u odnosu n kontrolne skupine koje nisu bile tretirne olovom. Olovo u kombinciji s Hoglndovom otopinom ph vrijednosti 4 uzrokovlo je znčjno sniženje koncentrcije klorofil b u odnosu n ph vrijednost 6 (slik 8). Koncentrcij klorofil b (% od kontrole) V (4) V+Pb (4) H (4) H+Pb (4) V (6) V+Pb (6) H (6) H+Pb (6) b b b b b b b b bc c bc 1. dn 7. dn 14. dn Slik 8. Koncentrcij klorofil b, izržen ko postotk od kontrole, u vrste E. prunstri nkon 1., 7. i 14. dn pokus. Crtkn linij oznčv kontrolnu skupinu lišjev n početku pokus prije tretirnj rzličitim otopinm. Uzorci lišjev tretirni su n slijedeći nčin: V (4) - kontroln skupin lišjev prskn tijekom pokus destilirnom vodom ph vrijednosti 4, V+Pb (4) - lišjevi tretirni olovom te prskni tijekom pokus destilirnom vodom ph vrijednosti 4, V (6) - kontroln skupin prskn destilirnom vodom ph vrijednosti 6, V+Pb (6) - lišjevi tretirni olovom te prskni destilirnom vodom ph vrijednosti 6; H (4) - lišjevi prskni tijekom pokus 1/10 Hoglndove otopine ph vrijednosti 4, H+Pb (4) - lišjevi tretirni olovom te prskni tijekom pokus 1/10 Hoglndove otopine ph vrijednosti 4, H (6) - lišjevi prskni 1/10 Hoglndove otopine ph vrijednosti 6, H+Pb (6) - lišjevi tretirni olovom te prskni 1/10 Hoglndove otopine ph vrijednosti 6. Rezultti su prikzni ko srednj vrijednost od njmnje pet replik ± stndrdn pogrešk. Rzličit slov iznd stupc oznčuju d su vrijednosti međusobno sttistički znčjno rzličite (p 0,05) unutr istog dn Koncentrcij ukupnih krotenoid Fktorijln nliz vrijnce u vrste E. prunstri nije pokzl znčjn učink fktor n ukupne krotenoide prilikom prv dv uzorkovnj. Anlizom lišjev 28