Pridruživajuće kartiranje sastavnica eteričnog ulja ljekovite kadulje Jerko Gunjača Sveučilište u Zagrebu, Agronomski fakultet

Транскрипт

1 Pridruživajuće kartiranje sastavnica eteričnog ulja ljekovite kadulje Jerko Gunjača Sveučilište u Zagrebu, Agronomski fakultet jgunjaca@agr.hr HBMD, Zagreb, 18. studenog 2015.

2 Pridruživajuće kartiranje sastavnica eteričnog ulja ljekovite kadulje (A) Analiza kvantitativnih svojstava (B) Pridruživajuće kartiranje (C) Studija slučaja: Ljekovita kadulja

3 (A) Analiza kvantitativnih svojstava podrazumijeva, između ostalog, potragu za lokusima za kvanitativna svojstva (QTL-ima) uz pomoć molekularnih biljega izrađuju se genske karte na temelju procjene učestalosti rekombinacijskih događaja analizom povezanosti QTL-a s molekularnim biljezima određuje se njihov smještaj na genskim kartama (pridruživanje)

4 Kvalitativna i kvanitativna svojstva boja cvijeta širina liske grah 131 primka iz HBBG

5 Nasljeđivanje kvalitativna svojstva kontrolirana su malim brojem gena velikog učinka zbog čega je lako razlikovati nositelje različitih varijanti gena kvantitativna svojstva kontrolirana su velikim brojem gena relativno malog učinka, čija je ekspresija također pod jakim utjecajem različitih okolišnih faktora

6 Molekularni biljezi odlomci molekule DNA za čiju se izolaciju i identifikaciju koriste laboratorijske metode koje se mogu automatizirati RFLP SSLP AFLP RAPD RAD SNP DArT VNTR: mini micro (SSR/STR)

7 Rekombinacija razmjena dijelova DNA molekule između dvaju roditeljskih kromosoma tijekom mejotičke diobe udaljenosti između biljega na genskim kartama procjenjuju se na temelju učestalosti pojave rekombinacija

8 Potraga za QTL-ima pridruživanje biljega: traženje biljega koji su smješteni u tolikoj blizini gena, da je vjerojatnost pojave rekombinacije iznimno mala cilj: geni s relativno velikim učinkom! /P 1/P adj

9 Problemi za izradu genskih karata nužan je razvoj specifičnih populacija (biparentalna križanja) slaba razlučivost uslijed premalog broja rekombinacijskih događaja tijekom razvoja populacija, pa čak i dijelovi kromosoma koji su međusobno vrlo udaljeni ostaju povezani, tj. nasljeđuju se zajedno

10 (B) Pridruživajuće kartiranje primjena ovog pristupa omogućena je razvojem platformi za sekvenciranje DNA visoke propusnosti ne zahtjeva razvoj posebnih populacija za kartiranje koristi se za: analize pridruživanja na razini cjelokupnog genoma (GWAS) precizno kartiranje odabranih regija kromosoma genomsku selekciju

11 Preduvjeti ne zahtjeva razvoj posebnih populacija za kartiranje nužna visoka razina zasićenosti genoma molekularnim biljezima, odnosno gustoće njihovog smještaja unutar genoma potrebni intenzitet gustoće može se procijeniti prema stupnju opadanja neravnoteže vezanosti

12 Neravnoteža vezanosti (LD) nasljeđivanje alela sa različitih lokusa koje nije nezavisno Lokus A Lokus B P(A)=p A P(a)=q A P(B)=p B P(AB)=p A p B +D P(aB)=q A p B -D P(b)=q B P(Ab)=p A q B -D P(ab)=q A q B +D

13 Statistički model krajnje pojednostavnjeno, fenotip je zbroj djelovanja genotipa i okoline: P = G + E kod kvantitativnih svojstava, genotipski učinak je zbroj djelovanja velikog broja gena malog pojedinačnog učinka (QTL-a) stoga se ukupni genotipski učinak može rastaviti na niz učinaka pojedinačnih gena

14 Model jednog biljega je mješoviti model oblika: Y i = M ki + G i + e ij M k je učinak pretpostavljenog QTL-a povezanog s molekularnim biljegom (fiksni efekt) G i je učinak ostalih gena, odnosno genetsko zaleđe (slučajni efekt) modeliranje se provodi zasebno za svaki biljeg

15 Lažne asocijacije genetski uzroci: strukturiranost eksperimentalne populacije razlike u alelnim frekvencijama između subpopulacija različiti stupanj srodnosti genotipova različite korelacije/kovarijance fenotipova uklanjanje lažnih asocijacija modifikacija modela daljnjim raščlanjivanjem genotipskog učinka vodeći računa o strukturi i srodnosti

16 Model jednog biljega + Q uključuje i (fiksni) efekt strukture populacije Q: Y i = M ki + Q i + G i + e ij struktura populacije Q može se definirati pomoću molekularnih biljega: Bayesovskim pristupom program STRUCTURE (Pritchard i sur. 2000) analizom glavnih sastavnica (Price i sur. 2006)

17 Q + K model (Yu i sur. 2006) uključuje i matricu srodnosti K: Y i = M ki + Q i + G i K + e ij K se koristi kao matrica varijanci-kovarijanci slučajnog učinka genotipa i može se definirati: pomoću molekularnih biljega: izračunavanjem koeficijenta srodnosti (SpaGeDi Hardy i Vekemans, 2007) izračunavanjem genetskih udaljenosti (Stich et al. 2008) pomoću pedigrea

18 Korekcija za višestruke testove 1 biljeg = 1 model provođenje velikog broja testova koji nisu međusobno nezavisni uklanjanje lažnih asocijacija: Bonferronijeva korekcija stopa lažnih otkrića (FDR): Benjamini and Hochberg (1995) Storey (2002)

19 MLMM (Segura i sur. 2012) umjesto jednog u modelu se istovremeno može istražiti učinak više lokusa (biljega) primjenjuje se regresija korak po korak (stepwise); u koracima unaprijed se dodaju, a u koracima unazad izbacuju biljezi (jedan po jedan) optimalno se rješenje odabire prema jednom od dva kriterija (Bonferroni ili EBIC)

20 (C) Studija slučaja: Ljekovita kadulja 25 populacija 4/559 AFLP 8/161 SSR 62/8 komponente ulja

21 Metode Q+K model: Q na temelju SSR biljega uz pomoć programa STRUCTURE K na temelju SSR biljega pomoću programa SPAGEDI pridruživanje pojedinačnih AFLP biljega uz pomoć programa TASSEL regresija korak po korak na temelju AFLP biljega uz pomoć R paketa MLMM

22 Struktura populacije kadulja Slovenia Hungary CROATIA P01 P03 P04 P07 P02 P05 P06 P10 P08 Cluster: A: North Adriatic B: Middle Adriatic C: South Adriatic P09 P11 P13 P12 P14 P16 P15 P22 P21 Bosnia and Herzegovina P17 P19 P18 P20 P23 P24 P25

23 PC2 (18.09%) Kemotipovi P24 P21 trans-thujone P P23 camphene bornyl acetate P06 P19 borneol P15 P22 P10 P04 P12 P b-pinen P02 P01 P camphor P05 P11 P25 P13 P16 1,8-cineole P07 Chemotype: -0.5 P03 P20 A: cis-thujone P14 B: trans-thujone P18 C: camphor cis-thujone -1.0 PC1 (46.78%)

24 Optimalno rješenje za trans-tujon (MLMM) 3,88

25 Učinak lokusa (biljega) pogreška ostali genetski učinci učinak odabranih lokusa (biljega) učinak strukture populacije

26 Povezanost biljega i lokusa za trans-tujon Biljeg P(TASSEL) P(MLMM) korelacija M132 5,89E-07 2,45E-08 M201 7,03E-06-0,14 M131 M277 1,67E-05 0,43 M046 M131 3,05E-05 2,16E-05 M046 3,79E-05 6,36E-05 M097 M322 2,39E-05 1,02E-04

27 Trans i cis-tujon i kamfor cis-tujon: 4 signifikantna biljega (MLMM) kamfor: 6 signifikantnih biljega (MLMM) M046 i M132 signifikantni za trans-tujon i kamfor (MLMM)

28 Što dalje? istražiti metaboličke puteve? odabrane biljege koristiti u selekciji potpomognutoj biljezima?

29 Pridružujuće kartiranje od Q do K: Studija slučaja hrvatskih endemičnih kadulja Projekt financira Hrvatska zaklada za znanosti Projektni tim Zlatko Šatović Klaudija Carović-Stanko Martina Grdiša Ivan Biruš Zlatko Liber Toni Nikolić Ivana Rešetnik Ivan Radosavljević Marija Jug-Dujaković Jerko Gunjača Sandro Bogdanović Vlatka Zoldoš Vedrana Vičić