Univerzitet u Beogradu Hemijski fakultet Korelacija sadržaja soli, masnih kiselina i ukupnih masti u uzorcima namirnica sa tržišta Republike Srbije SP

Univerzitet u Beogradu Hemijski fakultet Korelacija sadržaja soli, masnih kiselina i ukupnih masti u uzorcima namirnica sa tržišta Republike Srbije SPECIJALISTIČKI RAD Nada Gnjatović Beograd, 2019 1

Mentor: Dr Dušanka Milojković-Opsenica, redovni profesor Univerzitet u Beogradu Hemijski fakultet Članovi komisije: Dr Jelena Trifković, vanredni profesor Univerzitet u Beogradu Hemijski fakultet Dr Kristina Lazarević, naučni saradnik Centar za ispitivanje namirnica, Beograd Datum odbrane: 2

Spisak skraćenica GC Gasna hromatografija (engl. Gas Chromatography) FID Plameno jonizujući detektor (engl. Flame Ionization Detector) ZMK Zasićene masne kiseline MNMK Mononezasićene masne kiseline PNMK Polinezasićene masne kiseline TMK Trans masne kiseline HDL Lipoproteini velike gustine (engl. High Density Lipoprotein) LDL Lipoproteini male gustine (engl. Low Density Lipoprotein) RSD Relativna standarna devijacija WHO Svetska zdravstvena organizacija (engl. World Health Organization) DHA Dokosaheksaenska kiselina EPA Eikosapentaenska kiselina ANOVA Analiza varijansi PCA Analiza glavnih komponenata ISO Internatiomal Standard Organization AOCS The American Oil Chemists' Society FAAS Atomske apsorpcione spektrometrije plamenom tehnikom NMKL Nordic Committee on Food Analysis K-W Kruskal-Wallis 3

Sadržaj: 1. Uvod... 5 2. Teorijski deo... 6 2.1 Masti i ulja u hrani... 6 2.2 Natrijum u hrani... 11 2.3 Statistička analiza... 12 2.3.1 Kruskal-Valisov (Kruskal-Wallis, K-W) test... 12 2.3.2 Analiza glavnih komponenata (PCA)... 13 3. Eksperimentalni deo... 13 3.1 Uzorci... 13 3.2 Određivanje ukupne masti... 14 3.2.1 Reagensi... 14 3.2.2 Postupak... 14 3.3 Određivanje masnih kiselina... 14 3.3.1 Reagensi i standardi... 14 3.3.2 Ekstrakcija masti... 15 3.3.3 Priprema metil-estara masnih kiselina... 15 3.3.4 Određivanje gasnom hromatografijom sa plameno-jonizujućim detektorom... 15 3.3.5 Izračunavanje sadržaja masnih kiselina... 16 3.4 Određivanje sadržaja soli... 17 3.4.1 Reagensi i standardi... 18 3.4.2 Priprema uzorka... 18 3.4.3 Određivanje primenom atomske apsorpcione spektrometrije plamenom tehnikom (FAAS)... 18 3.4.4 Izračunavanje sadržaja soli... 19 3.5 Obrada podataka i statistička analiza... 19 4. Rezultati i diskusija... 19 4.1 Analiza varijansi i multivarijantna analiza... 28 4.2 PCA... 30 5. Zaključak... 33 6. Literatura... 35 Prilog... 37 4

1. Uvod U poslednjih nekoliko decenija zbog ubrzanog porasta svetske populacije postoji potreba za industrijskom proizvodnjom hrane. Primarni zahtevi industrijske proizvodnje hrane su ekonomičnost, odgovarajuća senzorska svojstva i produženi rok trajanja, što je često u koliziji sa kvalitetom i bezbednošću tako dobijenih namirnica. Shodno tome, rizici vezani za hranu u razvijenim zemljama su uglavnom rizik vezan za bezbednost hrane i nutritivni rizik. Bolesti povezane sa hranom su svetski zdravstveni problem i pridaje im se veliki značaj, naročito nakon niza incidentnih situacija koje su se dogodile u poslednjih nekoliko godina. Istovremeno, u razvijenim zemljama sve je više hroničnih bolesti koje su posledica nepravilnih prehrambenih navika i fizičke neaktivnosti, što je dovelo do velikog porasta broja gojaznih osoba. U prevenciji najzastupljenijih hroničnih degenerativnih bolesti ključnu uloga imaju prehrambene navike i hranjive vrednosti hrane koja se unosi putem redovnih obroka. Rezultati istraživanja Svetske zdravstvene organizacije - Regionalnog komiteta za Evropu (WHO Regional Committee for Europe WHO RCE (2014) European Food and Nutrition Action Plan 2015 2020. EUR/RC64/14) ukazuju da su vodeći faktori rizika povezani sa hranom povećana telesna masa (body mass index > 25 kg/m 2 ), povećano konzumiranje visoko energetske hrane, zasićenih masti, trans masti, šećera i soli, ali i nedovoljno konzumiranje povrća, voća i integralnih žitarica. Gojaznost (body mass index > 30 kg/m 2 ) označena je kao faktor rizika za brojna oboljenja i stanja organizma, tako da je gojaznost uvrštena u Internacionalnu klasifikaciju bolesti WHO (WHO International Classification of Diseases). U Srbiji je 8. marta 2017. godine usvojen Pravilnik o deklarisanju, označavanju i reklamiranju hrane (Sl. Glasnik RS, broj 19/17) sa obaveznom primenom od 15. juna 2018. godine. Ovaj Pravilnik je usaglašen sa evropskom uredbom i propisuje obavezno navođenje nutritivnih podataka na deklaraciji proizvoda. Obaveza deklarisanja nutritivne vrednosti podrazumeva prikaz energetske vrednosti, količine proteina, ugljenih hidrata, šećera, masti, zasićenih masnih kiselina i natrijuma, u formatu propisanom Pravilnikom, s tim da se sadržaj obavezne deklaracije o nutritivnoj vrednosti može dopuniti i podacima o sadržaju drugih prisutnih sastojaka (vlakana, vitamina i minerala, omega-3 masnih kiselina, itd). Deklarisanje i označavanje prehrambenih proizvoda ima za cilj informisanje i zaštitu potrošača kroz prikaz detaljnih informacija o stvarnom sastavu i karakteristikama kvaliteta proizvoda, na standardizovan, ujednačen, jednostavan i razumljiv način. Ne treba očekivati da će samo postojanje deklaracije na proizvodu biti dovoljno da promeni ponašanje koje bi vodilo ka 5

boljem zdravlju, ali je preduslov da potrošač napravi adekvatan izbor hrane i može predstavljati korisno i motivaciono sredstvo. Možda je najznačajniji uticaj u domenu deklarisanja proizvoda, uticaj na industriju hrane. Naime, deklaracije pružaju mogućnost lakšeg poređenja brendova, što može stimulisati proizvođače da preformulišu svoje proizvode i ponude nutritivno vrednije i atraktivnije alternative. Ovakav indirektan uticaj je od ogromnog značaja na ishranu i zdravlje populacije. U ovom rada su prikazani rezultati određivanja sadržaj natrijuma, soli, ukupnih masti, zasićenih, mononezasićenih i polinezasićenih masnih kiselina, kao i trans masnih kiselina u različitim namirnica sa tržišta Republike Srbije. Sva ispitivanja su sprovedena u okviru izrade nutritivnih deklaracija u laboratoriji Centra za ispitivanje namirnica u Beogradu. Cilj ovog rada je da se prikaže sadržaj pomenutih sastojaka u namirnicama koje se stavljaju u promet na teritoriji Republike Srbije u periodu donošenja i neposredno nakon stupanja na snagu Pravilnika o deklarisanju, označavanju i reklamiranju hrane (Sl. Glasnik RS, broj 19/2017), kao i da se utvrdi da li postoji korelacija između sadržaja nekih od ovih sastojaka unutar grupa namirnica najzastupljenijih u ishrani. 2. Teorijski deo 2.1 Masti i ulja u hrani Masti imaju veoma značajne uloge u metabolizmu, zbog čega ih je neophodno svakodnevno unositi u organizam. One su bogati izvori energije, esencijalnih nutritijenata (liposolubilnih vitamina, esencijalnih masnih kiselina), važni gradivni elementi tkiva i biomembrana i regulatori gena. Masti, kao sastojci prehrambenih proizvoda, utiču na fizičke, senzorne i reološke karateristike tih proizvoda. U prehrambenoj tehnologiji su veoma važne za postizanje željene teksture i punoće ukusa, a imaju i pozitivan efekat na svežinu proizvoda. Masti i ulja su, po svom hemijskom sastavu, trigliceridi, ili triacilgliceroli triestri trihidroksilnog alkohola glicerola i dugolančanih karboksilnih kiselina (masnih kiselina) (McMurry, 2008). Masne kiseline koje ulaze u sastav masti i ulja su uglavnom nerazgranati lanci i sadrže paran broj atoma ugljenika, između 12 i 20. One mogu biti zasićene i nezasićene. Zasićene masne kiseline ne sadrže dvostruke veze, niti druge funkcionalne grupe duž lanca. Termin zasićene ukazuje na to da atomi ugljenika, pored međusobnih, grade veze samo sa vodonikom (osim u COOH grupi). S obzirom na prave lance koje poseduju, vrlo gusto se pakuju i na taj način omogućavaju živim bićima da na manjem prostoru skladište veliku 6

hemijsku energiju. Upravo zato imaju najveći udeo u masnom tkivu životinja. Nezasićene masne kiseline su slične građe, ali poseduju jednu ili više dvostrukih veza u osnovnom ugljeničnom lancu (mono- i polinezasićene). Ako su prisutne dvostruke veze onda su uglavnom u Z ili cis geometriji. U Tabeli 1 dat je pregled najrasprostranjenijih nezasićenih masnih kiselina. U određenom molekulu triacilglicerola mogu biti prisutne različite masne kiseline. Masti i ulja iz različitih namirnica biljnog i životinjskog porekla su složene smeše različitih triacilglicerola. U Tabeli 1 su date masne kiseline koje se najčeće javljaju u mastima i uljima, a u Tabeli 2 je dat približan sastav masti i ulja iz različitih izvora biljnog i životinjskog porekla. Poznato je više od 100 masnih kiselina, od kojih se njih 40 najčešće javljaju. Palmitinska (C16) i stearinska (C18) su najzastupljenije zasićene masne kiseline; oleinska i linolna kiselina (obe C18) su najzastupljenije nezasićene kiseline. Oleinska kiselina (18:1 cis-9) je mononezasićena jer ima samo jednu dvostruku vezu, dok su linolna (18:2 cis 9,12), linolenska (18:3 cis-9,12,15) i arahidonska (20:4 cis-5,8,11,14) polinezasićene masne kiseline zbog toga što imaju više od jedne dvostruke veze. Tabela 1. Neke od najzastupljenijih masnih kiselina u mastima i uljima (McMurry, 2008) Naziv Broj C atoma Formula Tačka topljenja ( o C) Zasićene Laurinska 12 CH3(CH2)10CO2H 43,2 Miristinska 14 CH3(CH2)12CO2H 53,9 Palmitinska 16 CH3(CH2)14CO2H 63,1 Stearinska 18 CH3(CH2)16CO2H 68,8 Arahidinska 20 CH3(CH2)18CO2H 76,5 Nezasićene Palmitooleinska 16 (Z)-CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7CO2H - 0,1 Oleinska 18 (Z)-CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7CO2H 13,4 Linolna 18 (Z,Z)- -12,0 CH3(CH2)4(CH=CHCH2)2(CH2)6CO2H Linolenska 18 (sve Z)-CH3CH2(CH=CHCH2)3(CH2)6CO2H -11,0 7

Arahidonska 20 (sve Z)- CH3(CH2)4(CH=CHCH2)4CH2CH2CO2H - 49,5 Tabela 2 Približan sastav nekih masti i ulja (McMurry, 2008) Nezasićene masne Zasićene masne kiseline (%) kiseline (%) Poreklo C18 Oleinska C18 Linolna C12 Laurinska C14 Miristinska C16 Palmitinska C18 Stearinska Životinjske masti Mast 50 6-1 25 15 Puter 25 5 2 10 25 10 Kitovo ulje 35 10-8 12 3 Biljna ulja Kokos 6 1 50 18 8 2 Kukuruz 35 45-1 10 4 Maslina 80 7-1 5 5 Kikiriki 60 20 - - 7 5 Podaci u Tabeli 1 pokazuju da nezasićene masne kiseline uglavnom imaju niže tačke topljenja od zasićenih, a tako je i sa triacilglicerolima. Biljna ulja imaju veći udeo nezasićenih nego zasićenih masnih kiselina i niže tačke topljenja, dok je kod životinjskih masti (Tabela 2) obrnuto i tačke topljenja su im više. Ova razlika je posledice strukture. Zasićene masti imaju isti oblik (ravni, pravi lanci) što im omogućava da se efikasnije pakuju u kristalnu rešetku. Kod nezasićenih biljnih masti, međutim, zbog prisustva dvostrukih C=C veza ugljovodnični lanac je presavijen što otežava formiranje kristala. Ukoliko ima više dvostrukih veza molekul teže kristalizuje i niža je tačka topljenja ulja. Dvostruke C=C veze u biljnim uljima se mogu redukovati katalitičkom hidrogenizacijom, na visokoj temperaturi u prisustvu nikla kao katalizatora radi proizvodnje zasićenih čvrstih ili polučvrstih masti. Na žalost, reakciju hidrogenizacije prati i cis-trans izomerizacija dela dvostrukih veza, usled čega se dobijaju masti sa 10% do 15% trans nezasićenih masnih kiselina. 8

Trans masne kiseline nastaju prirodnim putem u buragu preživara procesom bakterijske hidrogenizacije, odakle se apsorbuju i dalje prenose u ćelije, uključujući mamarne žlezde, zbog čega ih ima u mleku. Ove trans masne kiseline nalaze se u malim količinama u masnim frakcijama mesa, mleka i mlečnih proizvoda, a od skoro postaju vrlo interesantne, zbog pozitinih efekata po ljudsko zdravlje, za razliku od od onih dobijenih industrijskim putem koje su štetne. Od ukupne energije koju ljudi unose hranom, masne kiseline doprinose 30-35% (Rustan et al., 2005). Glavni izvori masnih kiselina u ishrani su biljna ulja, mlečni proizvodi, proizvodi od mesa, masne ribe i riblja ulja. Palmitinska kiselina (16:0) se najčešće javlja u životinjskim mastima, biljnim uljima i u mikroorganizmima. Stearinska kiselina (18:0) je najzastupljenija kod životinja i nekih gljiva. Miristinska kiselina (14:0) se javlja često, a ponekad i kao glavna komponenta. Zasićene kiseline kraćih lanaca sa 8 do 10 C atoma se nalaze u mleku i kokosu. Oleinska kiselina (18:1) je najčešća mononezasićena masna kiselina u biljkama, životinjama i mikrorganizmima. Palmitooleinska (16:1) se javlja u biljkama, životinjama i mikrorganizmima i glavna je komponenta nekih ulja semenki. Linolna kiselina (18:2) je najprisutnija u biljnim uljima. Arahidonska kiselina (20:4) je glavni sastojak fosfolipida životinjskih ćelijskih membrana. Alfa linolenska se nalazi u višim biljkama (seme uljane repice, ulje od soje) i u algama. Eikosapentaenska (EPA; 20:5) i dokosaheksaenska (DHA; 22:6) su zastupljene u morskim algama, masnim ribama i ribljim uljima. DHA se nalazi u visokim koncentracijama u fosfolipidima u mozga, retine, testisa (Rustan et al., 2005). Ljudski organizam može da sintetiše sve, osim dve masne kiseline koje su mu neophodne. S obzirom na to, one se nazivaju esencijalnim i moraju se unositi hranom. To su linolna i α-linolenska. Mogu se naći u velikim količinama u biljkama i ribljem ulju, a u organizmu se prvenstveno koriste za sintezu hormona, koji regulišu krvni pritisak, nivo masti u krvi, utiču na imuni sistem i odbranu organizma od infekcija, sastavni su deo membranskih lipida i prekursori prostaglandina. Ove kiseline poseduju dvostruke veze na ω-3 i ω-6 ugljenikovom atomu. U ljudskom telu ne postoji mehanizam za sintezu upravo tih veza. Njihov nedostatak može izazvati depresiju ili agresiju u ponašanju (Jorga, J., i sar. 2014). Preporučeni raspon unosa za ukupne masti je minimum 15% od ukupne energije, odnosno 20% za žene i pothranjene osobe sa BMI manjim od 18,5, a maksimalno 30-35% od ukupne energije (Jorga i sar., 2014). Preporučeni unos za zasićene masne kiseline je maksimalno 10% od ukupne energije a za polinezasićene masne kiseline je od 6 do 11% od ukupne energije. Od toga, preporučeni dnevni unos za esencijalne masne kiseline je minimum 3% od ukupne energije (2,5% za linolnu i 0,5% za alfa-linoleinsku kiselinu) (Jorga i sar., 2014). 9

Kako bi se ljudski organizam normalno razvijao i funkcionisao neophodan je pravilan unos hranljivih sastojaka, a posebno masti i ulja. Naime, veoma ozbiljni poremećaji u organizmu, koji imaju za posledicu pojavu nekih oboljenja, sve češćih u savremenom društvu, pripisuju se u najvećoj meri nepravilnom unosu masti. Po mnogim autorima (Erkkilä et al., 2008), visok sadržaj lipida i holesterola u krvi, ateroskleroza, gojaznost, hipertenzija, koronarne bolesti srca, u najužoj su vezi sa vrstom i količinom masti koja se svakodnevno unosi u organizam. Zasićene masne kiseline podižu nivo lošeg holesterola u krvi i zbog toga je potrebno posebno paziti na njihov unos. Od devedesetih godina XX veka sprovedena su brojna ispitivanja koja pokazuju da se pored zasićenih masnih kiselina, i trans masne kiseline smatraju štetnim i nepoželjnim sastojcima prehrambenih proizvoda. Mnogobrojne kliničke i eksperimentalne studije su potvrdile da trans masne kiseline dovode do porasta ukupnog holesterola i lipoproteina male gustine (low density lipoprotein, LDL), kao i lipoproteina (a), a snižavaju nivo lipoproteina velike gustine (high density lipoprotein, HDL) (Mensink & Katan, 1990; Zock & Katan, 1992; Judd et al., 1994; Aro et al., 1997; Lichtenstein et al., 1999; Gatto et al., 2003; Acherio, 2006; Müller et al., 2001). Osim negativnih efekata na kardiovaskularni sistem, trans masne kiseline su dovedene u vezu i sa razvojem nekih karcinoma, dijabetesa tipa 2 (Bradley R. 2018), tromboza, alergija i astme kod dece (Kravić, 2010). S obzirom da su mnogobrojne studije pokazale da zasićene i trans masne kiseline štetno deluju na ljudsko zdravlje, WHO preporučuje da ukupni unos masti ne bude veći od 30%, a udeo zasićenih masnih kiselina manji od 10% dnevno potrebne energije (po poslednjim preporukama čak ispod 7%), dok su TMK ograničene na manje od 1% dnevno potrebne energije (https://www.who.int). U Evropsku strategiju za prevenciju i kontrolu nezaraznih bolesti 2012-2016. uneta je kao prioritetna oblast za delovanje eliminacija trans masti u hrani i njihova zamena sa polinezasićenim mastima (World Health Organization, 2012). Međutim, većina evropskih zemalja nije ograničila sadržaj trans masnih kiselina u hrani, izuzev Austrije, Švajcarske, Islanda, Norveške, Danske i Mađarske koje su ograničile saržaj trans masnih kiselina na manje od 2% od ukupnog sadržaja masti u namirnicama. Evropska uredba br. 1169/2011 o informisanju potrošača o hrani, koja utvrđuje opšta načela, zahteve i odgovornosti u vezi informacija o hrani, a posebno u vezi s označavanjem, ne propisuje kao obavezno naznačavanje sadržaja trans masnih kiselina na nutritivnoj deklaraciji prehrambenih proizvoda (Evropski parlament / Savet Evropske Unije, 2011). U Srbiji je 8. marta 2017. godine donet Pravilnik o deklarisanju, označavanju i reklamiranju hrane (Sl. Glasnik RS, broj 19/17) sa obaveznom primenom od 15. juna 2018. godine 1

2.2 Natrijum u hrani Kuhinjska so (NaCl) glavni je izvor jona natrijuma i hlora za ljude. Važna je za normalan rad ljudskog organizma i učestvuje u brojnim fiziološkim procesima kao što su regulisanje krvnog pritiska i prenos nervnih impulsa. Kuhinjska so je prvi dodatak hrani čiji je konzervišući efekat poznat od davnina, i kroz istoriju kuhinjska so je prvi korišćeni konzervans u prehrambenoj industriji. Smatra se da se antimikrobni efekat soli zasniva na snižavanju aktivnosti vode. Osim toga što osigurava mikrobiološku ispravnosti gotovog proizvoda, kuhinjska so ima važnu ulogu u formiranju ukusa i teksture hrane. So u proizvodima od mesa povoljno utiče na senzorne i teksturalne karakteristike, povećanje sposobnosti vezivanja vode, odnosno hidrataciju mesa, a smanjivanje aktivnosti vode u proizvodu, ima i bakteriostatski efekat. Količina kuhinjske soli u proizvodima od mesa nije definisana Pravilnikom o kvalitetu usitnjenog mesa, poluproizvoda od mesa i proizvoda od mesa (Službeni glasnik RS 94/2015), i može se reći da je količina soli u proizvodima od mesa definisana preko senzornih osobina ukusa (Stamenković T., 2004). U prerađenom mesu, pored natrijum-hlorida, nekoliko korišćenih sastojaka sadrži i natrijum u znatnim količinama. To su natrijum-nitrit i nitrati, natrijum-fosfati, natrijum-askorbat, mononatrijum-glutamat, hidrolizovani biljni protein, nemasno suvo mleko, natrijum-semat, mešavine surutke i sojini proteini. U proizvodnji sireva, so usporava rast neželjenih bakterija, pomaže razvoju željene flore, pomaže u kontroli brzine fermentacije mlečne kiseline i razvoju ukusa i teksture tokom procesa zrenja (Renner, E., 1987). U pekarskim proizvodima, so ima ulogu u kontroli brzine fermentacije kvasca, a dodaje se i da bi se poboljša opšti osećaj ukusa. So koju unosimo uglavnom potiče iz prerađenih namirnica koje koristimo u ishrani, ali i prirodna i neprerađena hrana sadrži natrijum. Prirodno natrijum se javlja u mesu, plodovima mora, jajima, nekim vrstama povrća i mlečnim proizvodima. Prekomerno unošenje soli, odnosno natrijuma, predstavlja jedan od čestih uzroka hipertenzije i utiče na pojavu različitih drugih oboljenja. Prekomerno unošenje natrijumhlorida dovodi do: direktnog rizika od srčanih udara (Perry & Beevers, 1992), hipertrofije leve komore (Schmieder & Messerli, 2000), retencije natrijuma u ekstracelularnoj tečnosti, odnosno do retencije (zadržavanja) vode i kliničkih idiopatskih edema, naročito kod žena (MacGregor & de Wardener, 1997); povećanja tvrdoće, odnosno smanjenja elastičnosti zidova krvnih 1

sudova, naročito arterija, nezavisno od krvnog pritiska (Avolio et al.,1986); proteinurije, u prvom redu do urinarne ekskrecije albumina, a time i do povećanog rizika za oboljenja srca i bubrega (Du Cailar et al., 2002); veće mogućnosti infekcije izazvane Helicobacter pylori i rizika od nastanka raka želuca (Tsugane et al., 2004); povećanja urinarne ekskrecije kalcijuma i rizika od stvaranja kamena u bubregu (Capuccio et al., 2000), zatim rizika od smanjenja gustine kostiju, a shodno tome i do osteoporoze i kompresivnih fraktura kostiju, naročito kod žena u menopauzi (Devine et al., 1995); pojačavanja astmatičnih napada (Mickleborough et al., 2005) itd. Bolesti srca i krvnih sudova su vodeći uzrok smrtnosti u Srbiji, sa učešćem od 55,8% u svim uzrocima smrti (Kravić, 2010). Radi prevencije kardiovaskularnih bolesti Svetska zdravstvena organizacija (World Health Organization, WHO) je 2013. godine preporučila unos soli za odrasle manje od 5 g/dan, a za decu manje od 2 g/dan (https://www.who.int). 2.3 Statistička analiza Univarijantnom statistističkom analizom (deskriptivna statistika) obrađuje se svaka promenljiva pojedinačno, dok se multivarijantnim tenikama analiziraju međusobni odnosi između više varijabli (više od dve), simultano prema odgovarajućem modelu na kojem se zasniva ta tehnika. Multivarijantna analiza podataka omogućava otkrivanje obrazaca ponašanja u međusobnom odnosu velikog broja promenljivih, ukazujući na trendove koje je inače teško uočiti. 2.3.1 Kruskal-Valisov (Kruskal-Wallis, K-W) test Kruskal-Valisov (Kruskal-Wallis, K-W) test spada u neparametrijske testove koji se baziraju na rangiranju podataka i poređenju celokupne populacije. Rangiranjem se obezbeđuje normalna raspodela i homoskedastičnost podataka. Nakon rangiranja redosled vrednosti u transformisanim skupovima je isti kao i u originalnim skupovima podataka, međutim, nije isključeno da skup koji je imao manju aritmetičku sredinu ili medijanu, nakon rangiranja dobije veće vrednosti aritmetičke sredine ili medijane rangova, u odnosu na drugi skup sa kojim se poredi. Nulta hipoteza ANOVA-e je da posmatrani setovi podataka pripadaju istoj populaciji, tj. da imaju jednake srednje vrednosti, dok je nulta hipoteza K-W testa da setovi podataka imaju jednake srednje vrednosti rangiranih podataka. Osobina K-W testa je da poredi 1

populaciju na generalnom nivou, umesto da se fokusira na njihove aritmetičke sredine (Kanji, 2006). 2.3.2 Analiza glavnih komponenata (PCA) Analiza glavnih komponenata je multivarijantna metoda za određivanje linearnih latentnih varijabli (komponenata). Može se shvatiti kao metoda pomoću koje se formira novi koordinatni sistem sačinjen od međusobno normalnih latentnih varijabli usmerenih na pravac najvećeg varijabiliteta među podacima. PCA uzima u obzir sve varijable i može se primeniti na bilo koju matricu podataka X, pri čemu se y-podaci ne uzimaju u obzir. Smanjenje dimenzionalnosti podataka koristi se u cilju: vizualizacije multivarijantnih podataka pomoću grafika rasutosti (scatter plot), prevođenja visokokorelisanih x-varijabli u manji set nekorelisanih latentnih varijabli koje mogu da se koriste u daljoj hemometrijskoj analizi i razdvajanja značajnih informacija sadržanih u podacima (opisanih pomoću nekoliko latentnih varijabli) od onih koje su manje bitne. PCA se sastoji u pronalaženju pravca među varijablama koji na najbolji način odražava relativno rastojanje između objekata i opisuje maksimum varijanse skorova. Skorovi predstavljaju projekcije vrednosti podataka na latentnu varijablu, odnosno pravac. Ovaj pravac se naziva prva glavna komponenta (PC1) i definiše se pomoću vektora koeficijenata latentnih varijabli (loading vector). Odgovarajući skorovi predstavljaju linearnu kombinaciju koeficijenata i varijabli. Druga glavna komponenta (PC2) predstavlja pravac normalan na PC1 kojim se opisuje maksimum preostalog varijabiliteta među podacima. Sve dalje glavne komponente su normalne na prethodne i njihov pravac pokriva varijanse među podacima projektovane na posmatrani pravac. Ukupan broj glavnih komponenata jednak je broju varijabli. PC1 poseduje najveću varijansu dok svaka naredna glavna komponenta opisuje sve manji udeo varijabiliteta. Preostale glavne komponente sa niskim vrednostima varijansi pružaju informacije koje su od malog značaja za posmatranu analizu (Trifković, 2013). 3. Eksperimentalni deo 3.1 Uzorci Uzorci namirnica su prikupljeni u toku 2018. i 2019. godine i predstavljaju komercijalne uzorke koji su ispitivani u Hemijskom odeljenju Centra za ispitivanje namirnica u Beogradu (www.cin.co.rs). 1

Uzorci su grupisani u sedam grupa: proizvodi od mesa (n = 19); mlečni proizvodi (n = 17); pekarski proizvodi (n = 19); fini pekarski i snek proizvodi, žita za doručak (n = 21); čokolade i krem proizvodi (n = 12); orašasti plodovi, semenke i proizvodi (n = 16) i proizvodi od ribe (n = 4). Uzorci su čuvani u skladu sa uputstvima na deklaraciji i ispitivani su pre isteka roka upotrebe. 3.2 Određivanje ukupne masti 3.2.1 Reagensi Voda, u skladu sa ISO 3696 (grade 3), 3M hlorovodonična kiselina, petrol-etar, filterpapir. 3.2.2 Postupak Ukupne masti se određuju hidrolizom hlorovodoničnom kiselinom uz zagrevanje. Rastvor se hladi i filtrira. Ostatak se ispere i osuši, a zatim ekstrahuje petrol-etrom. Rastvarač se ukloni destilacijom i sušenjem. Odmeri se 2-10 g uzorka, doda 100 ml vode i 60 ml 3M hlorovodonične kiseline, rastvor se zagreje do ključanja, ostavi da ključa 20 min, a potom ohladi do sobne temperature. Ohlađeni rastvor se filtrira kroz filter paper (tip 751, Macherey-Nagel). Ekstrakcija masti je vršena petrol-etrom na aparatu Soxhterm (Soxtherm SOX 416, Gerhardt, Nemačka). Dobijeni ostatak je sušen 30 min na 103 C ± 2 C, do konstantne mase. Rezultati se izražavaju u g/100g. 3.3 Određivanje masnih kiselina Metil esteri se formiraju transesterifikacijom hladnim metanolnim rastvorom kalijumhidroksida (SRPS EN ISO 12966-2:2011, Rapid method). Ova brza metoda transmetilovanja u alkalinim uslovima je primenjiva na rutinske analize masti i ulja koja sadrže masne kiseline od buterne kiseline (C4:0). 3.3.1 Reagensi i standardi Metanol, sa sadržajem vode ne više od 0,5% (m/m); Voda, u skladu sa ISO 3696, (grade3); Natrijum-hidrogensulfat, anhidrovani; 1

n-heksan Kalijum-hidroksid, metanolni rastvor koncentracije oko 2 mol/l (rastvori se 13,1 g kalijumhidroksida u 100 ml apsolutnog metanola) Natrijum-hlorid, 40% vodeni rastvor Referentni standard je 37-komponentna smeša masnih kiselina (Food Industry FAME Mix, RESTEK, lot: 24140). 3.3.2 Ekstrakcija masti Odmeri se oko 10 g uzorka i doda 120 ml petrol-etra. Rastvor se meša oko 60 min, u zavisnosti od vrste uzorka, da bi se izvršilo razdvajanje faza. Gornji sloj (organska faza) se suši sa natrijum-sulfatom (Na2SO4) i filtrira (filter-papir tip 751, Macherey-Nagel). Petrol-etar se upari. 3.3.3 Priprema metil-estara masnih kiselina U vijale od 3 ml se prenese oko 100 µl ekstrahovanog ulja. Doda se 1,5-2 ml n- heksana, snažno se protrese ili promeša na vortexu. Doda se 200 µl 2 M metanolnog rastvora kalijum-hidroksida, jako mućka 60 sekundi (ili meša na vortexu). Ostavi se da se slegne dok se rastvor ne izbistri (oko 2 minuta). Doda se 0,5-1 ml rastvora natrijum-hlorida i blago promućka. Centrifugira se oko 60 sekundi na 6200 obrtaja/min. Dekantuje se gornji sloj koji sadrži metil-estre u drugu vijalu i doda 1 g natrijum-hidrogensulfata. 3.3.4 Određivanje gasnom hromatografijom sa plameno-jonizujućim detektorom Sadržaj metil-estara masnih kiselina određen je primenom GC (Agilent 7890B GC System) sa plamenojonizujućim detektorom (FID). Hromatografsko određivanje je sprovedeno pod sledećim uslovima: Tabela 3: Eksperimentalni uslovi pri određivanju metil-estara masnih kiselina INSTRUMENT GC: Detektor: Program za prikupljanje i obradu podataka: Agilent 7890B FID Chemstation 1

EKSPERIMENTALNI USLOVI Temperatura injektora: Metod injektovanja: Kolona: Noseći gas: Temperaturni program: Detektor: 250 o C Splitflow 38 ml/min, 1 µl split/splitless, split odnos 40:1, temperature 250 o C CP-Sil 88 za FAME 100 m 0,25mm df=0,2µm Azot, konstantnog protoka 1,0 ml/min 80 C (0 min hold), 4 C/min do 220 C (5 min hold); 4 C/min do 240 C (10 min hold) 270 C, Mekeup gas: azot (25 ml/min), Protok vazduha: 400 ml/min, protok H2:30 ml/min Pojedinačni metil-estri masnih kiselina se identifikuju na osnovu poređenja retencionog vremena sa retencionim vremenom standardne smeše metil-estara masnih kiselina. Kao referentni standard korišćen je 37-komponentna smeša metil-estara masnih kiselina (Food Industry FAME Mix, RESTEK, lot: lot: 24140). Smeša sadrži: metil-butirat (C4:0), metilkaproat (C6:0), metil-kaprilat (C8:0), metil-dekanoat (C10:0), metil-undekanoat (C11:0), metil-dodekanoat (C12:0), metil-tridekanoat (C13:0), metil-miristat (C14:0), metilmiristooleat (C14:1, cis-9), metil-pentadekanoat (C15:0), metil-pentadecenoat (C15:1, cis-10), metil-palmitate (C16:0), metil-palmitooleat (C16:1, cis-9), metil-heptadekanoat (C17:0), metil-heptadecenoat (C17:1, cis-10), metil-stearate (C18:0), metil-oktadecenoat (C18:1, trans- 9), metil-oleat (C18:1, cis-9), metil-linoleaidat (C18:2, trans-9,12), metil-linoleate (C18:2, cis- 9,12), metil-arahidat (C18:0), metil-linolenat (C18:3, cis-6,9,12), metil-eikosadienoat (C20:1, cis-11), metil-linolenat (C18:3, cis-9,12,15), metil-heneikosanoat (C21:0), metil-eikosenoat (C20:2, cis-11,14), metil-behenat (C22:0), metil-eikosatrienoat (C20:3, cis-8,11,14), metilerukat (C22:1, cis-13), metil-eikosatrienoat (C20:3, cis-11,14,17), metil-arahidonat (C20:4, cis-5,8,11,14), metil-trikosanoat (C23:0), metil-dokosadienoat (C20:2, cis-13,16), metillignocerat (C24:0), metil-cis-5,8,11,14,17-eikosapentaenoat, metil-nervonat (C24:1, cis-15), metil-dokosaheksaenoat (C22:6, cis-4,7,10,13,16,19). 3.3.5 Izračunavanje sadržaja masnih kiselina Za kvalitativnu analizu se koristi metoda unutrašnjeg normiranja, tj. pretpostavka da su sve komponente uzorka prisutne na hromatogramu, tako da ukupna površina ispod pikova 1

predstavlja 100% sastojaka smeše (potpuno eluiranje). Količina date komponente, izražena kao maseni procenat metil-estara, se izračunava kao procenat površine odgovarajućeg pika u odnosu na sumu površina svih pikova. Relativna površina odgovarajućeg pika predstavlja maseni udeo te komponente u smeši. Izračunavanje površinske frakcije pojedinačnih metilestara masnih kiselina (X), izražena u procentima, vrši se na osnovu sledeće formule: X = A/ A 100, gde je: A - površina ispod pika individualnog metil-estra masnih kiselina A - zbir površina ispod svih pikova pojedinačnih metil-estara masnih kiselina. Za većinu masti i ulja, površinska frakcija metil-estara masnih kiselina je jednaka masenoj frakciji triacilglicerola u gramima na 100 g uzorka. Prema postupku AOCS Ce 1h-05 faktori za konverziju metil-estara masnih kiselina u triacil-glicerole su između 0,8627 (C4:0) i 0,9965 (C24:1) i stoga su zanemarljivi. Na osnovu vrednosti ovih faktora može se pretpostaviti da je odnos površina pikova metil-estara masnih kiselina identičan odnosu masnih frakcija. Određeni udeli pojedinačnih masnih kiselina se saberu na osnovu pripadnosti sledećim grupama: zasićene masne kiseline, mononezasićene masne kiseline (cis izomeri), polinezasićene masne kiseline (cis izomeri) i trans masne kiseline. Σ zasićenih masnih kiselina (Σ ZMK = C4:0 + C6:0 + C8:0 + C10:0 + C11:0 + C12:0 + C13:0 + C14:0 + C15:0 + C16:0 + C18:0 + C20:0 + C21:0 + C22:0 + C23:0 + C24:0); Σ mononezasićenih masnih kiselina (Σ MNMK = C14:1, cis-9 + C15:1, cis-10 + C16:1, cis-9 + C17:1, cis-10 + C18:1, cis-9 + C20:1, cis-11 + C22:1, cis-13 + C24:1, cis-15); Σ polinezasićenih masnih kiselina (Σ PNMK = C18:2, cis-9,12 + C18:3, cis-6,9,12 + C18:3, cis-9,12,15 + C20:2, cis-11,14 + C20:3, cis-8,11,14 + C20:3, cis-11,14,17 + C20:4, cis- 5,8,11,14 + C22:2, cis-13,16 + C20:5, cis-5,8,11,14,17 + C22:6, cis-4,7,10,13,16,19) Σ trans masnih kiselina (Σ TMK = C18:1, trans-9 + C18:2, trans-9,12) 3.4 Određivanje sadržaja soli Sadržaj soli u uzorku izračunava se računski iz sadržaja natrijuma određenog apsorpcionom spektrometrijom. 1

Natrijum se određuje na talasnoj dužini od 589,0 nm (slit width 0,2 nm). Prvo se izmere apsorbancije radnih standardnih rastvora, a zatim apsorbancije slepe probe (blanka) i rastvora analiziranog uzorka. 3.4.1 Reagensi i standardi Sve korišćene hemikalije su analitičke čistoće nabavljene od Merck (Darmstadt, Germany): azotna kiselina 65% (for analysis EMSURE ISO); vodonik-peroksid 30% (for analysis EMSURE ISO); cezijum-hlorid (for analysis EMSURE ). Dejonizovana voda (električne otpornosti 18,2 MΩ cm -1 ) je dobijena upotrebom Simplicity Sistema za prečišćavanje vode (Merck Millipore, Burlington MA, USA). Za određivanje količine natrijuma korišćeni su sertifikovani standardi (Certipur, Merck, Darmstadt, Germany) u koncentracijama od 1000 μg ml -1. 3.4.2 Priprema uzorka Za pripremu uzoraka je korišćen mikrotalasni digestioni sistem Ethos Up (Milestone, Bergamo, Italy). U zavisnosti od karakteristika, u teflonsku kivetu se odmeri odgovarajuća količina uzorka. Za suve ili uzorke sa većim sadržajem masti odmerava se 0,2-0,5 g. Za uzorke čiji je sadržaj vode oko 50% maksimalna odvaga je 1 g, dok je za veoma vlažne uzorke (sadržaj vode oko 90%) maksimalna odvaga 2 g. Zatim se u teflonsku kivetu doda 9 ml konc. azotne kiseline i 1 ml vodonik-peroksida. Kiveta se zatvori i postavi u segment rotora mikrotalasne peći. Režim rada peći se programira zavisno od vrste uzorka. Nakon završenog programa i ventilacije, segmenti rotora se vade iz peći. Ohlađen rastvor se kvantitativno prenese iz kivete za razaranje u normalni sud od 50 ml. Kiveta se više puta ispira malim porcijama dejonizovane vode. Kada se rastvor u normalnom sudu ohladi dopuniti ga dejonizovanom vodom do crte. Pri svakom setu određivanja priprema se i slepa proba, na potpuno isti način kao i uzorak. U zavisnosti od sadržaja natrijuma u uzorku, u normalni sud od 50 ml se odmeri alikvot određene zapremine, tako da finalna koncentracija rastvora bude unutar kalibracione prave. Zatim se doda 1 ml rastvora cezijum-hlorida i dopuni 1% rastvorom azotne kiseline do oznake. Pri svakom setu određivanja priprema se i slepa proba, na potpuno isti način kao i uzorak. 3.4.3 Određivanje primenom atomske apsorpcione spektrometrije plamenom tehnikom (FAAS) 1

Primenjena je standardna metoda NMKL No. 180 (2005) Sodium. Determination in Foodstuffs by Flame Atomic Absorption Spectrometry after Microwave Digestion. Korišćen je atomski apsorpcioni spektrometar GBC 932 plus (GBC Scientific Equipment, Dandenong, Australia) sa softverom Avanta ver. 1.33 (GBC Scientific Equipment). 3.4.4 Izračunavanje sadržaja soli Sadržaj natrijuma u uzorku se računa u okviru softvera AAS, na osnovu standardne prave dobijene merenjem apsorbancija radnih standardnih rastvora. Sadržaj soli se izračunava tako što se nađeni sadržaj natrijuma množi sa faktorom 2,5 (stehiometrijski odnos NaCl/Na). 3.5 Obrada podataka i statistička analiza Eksperimentalni rezultati su prikupljeni i u Microsoft Excel 2010 programu sortirani za dalju statističku obradu. Statistička analiza je obuhvatala univarijantnu analizu (deskriptivnu statistiku), analizu varijansi (Kruskal-Wallis-ov test) i multivarijantnu analizu (analiza glavnih komponenata, PCA). Deskriptivna statistička analiza i Kruskal-Walllisov test su sprovedena korišćenjem demo verzije programa NCSS statistical software package (Hintze, 2001, Number Cruncher Statistical Systems, KayVille, Utah; www.ncss.com). Analiza glavnih komponenta (PCA) je sprovedena korišćenjem PLS_Toolbox statističkog paketa (Eigenvectors Inc. v. 5.7) u okviru MATLAB verzije 7.4.0.287 (R2007a) (MathWorks INC, Natick, MA, USA). Pre analize svi podaci su centrirani u odnosu na srednju vrednost i normirani na jediničnu vrednost standardne devijacije. Nakon izvršenog autoskaliranja svi objekti su simetrično raspoređeni oko koordinatnog početka, varijable su istih dimenzija i promenjen je međusobni odnos objekata. 4. Rezultati i diskusija U okviru ovog specijalističkog rada ispitano je ukupno 108 uzoraka različitih vrsta namirnica sa tržišta Republike Srbije, prikupljenih u periodu 2018-2019. godine, i određeni su 1

sledeći parametri: sadržaj natrijuma, preračunat na sadržaj soli, sadržaj ukupne masti i sadržaj zasićenih, mononezasićenih, polinezasićenih i trans-masnih kiselina. Namirnice su klasifikovane u sedam grupa, prema pripadnosti odgovarajućim pravilnicima o kvalitetu: proizvodi od mesa, mlečni proizvodi, pekarski proizvodi, fini pekarski proizvodi, snek proizvodi i žita za doručak, orašasti plodovi i semenke i čokolade i krem proizvodi. U Tabeli P1 u Prilogu prikazani su dobijeni rezultati za pojedinačne uzorke. Na osnovu dobijenih rezultata izračunate su srednja vrednost, medijana, standardna devijacija (SD) i opseg ispitivanih parametara. Dobijene vrednosti prikazane su u Tabeli 4. Na Box plot graficima (Slike 1-7) je dat grafički prikaz parametara deskriptivne statistike za svaku promenljivu (sastojak), tj. predstavljena raspodela podataka unutar svake od sedam grupa namirnica. U Tabeli 4 i Box plot graficima (Slike 1-7) se primećuje da se namirnice razlikuju na osnovu sadržaja soli, masti, ZMK, MNMK, PNMK i TMK, kao i da su ovi sastojci prisutni u veoma širokim opsezima. Tabela 4. Parametri deskriptivne statistike za sadržaj soli, masti, ZMK, MNMK, PNMK, TMK (g/100 g prehrambrenog proizvoda) Prehrambeni proizvod So Mast ZMK MNMK PNMK TMK x 2,0 19,2 7,7 9,1 2,1 0,1 Proizvodi od mesa (n = 19) x 2,0 19,9 7,6 9,1 2,5 0,1 s 0,9 10,8 4,6 5,1 1,3 0,1 min 1,0 2,0 1,0 0,9 0,1 0,0 max 4,0 37,7 15,3 18,3 4,5 0,6 x 1,0 4,9 1,1 1,8 1,6 0,2 Perkarski proizvodi (n = 17) x 1,1 3,5 0,6 1,2 1,6 0,0 s 0,4 4,4 1,3 1,7 1,0 0,4 min 0,2 0,8 0,3 0,0 0,2 0,0 max 1,9 16,7 4,5 6,5 3,7 1,6 Mlečni proizvodi x 1,1 19,6 12,5 5,3 0,8 0,5 x 0,5 17,3 11,6 4,7 0,6 0,4 2

(n = 19) s 1,3 15,8 10,8 4,0 0,8 0,5 min 0,1 2,2 1,1 0,6 0,1 0,0 max 5,6 55,1 37,2 14,2 3,3 2,0 Fini pekarski i snek, žita za doručak (n = 21) x 0,6 15,3 7,2 4,9 2,8 0,4 x 0,6 17,6 7,0 5,2 1,4 0,0 s 0,4 8,6 4,8 3,3 3,3 0,8 min 0,2 0,9 0,3 0,2 0,1 0,0 max 1,4 27,6 15,8 10,4 11,4 2,6 x 0,2 32,0 11,5 11,3 6,4 2,2 Čokolade i krem proizvodi (n = 12) x 0,2 30,5 8,7 10,1 3,5 0,0 s 0,1 11,3 8,6 4,7 5,8 4,8 min 0,0 7,3 4,5 2,5 0,3 0,0 max 0,5 56,6 36,6 19,0 15,4 15,9 Orašasti plodovi, semenke i proizvodi (n = 16) x 0,5 41,3 6,2 24,0 11,1 0,0 x 0,2 46,1 6,3 24,7 12,0 0,0 s 0,6 18,9 3,5 15,9 5,9 0,0 min 0,0 6,1 0,6 3,8 1,2 0,0 max 1,8 67,4 11,2 54,3 24,4 0,0 x 1,3 20,4 3,7 6,5 9,7 0,0 Proizvodi od ribe (n = 4) x 1,4 14,6 4,4 4,5 4,8 0,0 s 0,7 22,0 2,6 7,5 12,7 0,0 min 0,4 1,5 0,3 0,4 0,9 0,0 max 2,1 50,9 5,8 16,7 28,4 0,0 Iz Tabele 4 vidimo da se sadržaj masti u svim grupama kreće u širokom opsegu, a najveći prosečni sadržaj masti je određen kod orašastih plodova i semenki i iznosi 41,3 g /100 g, zatim u grupi proizvoda čokolade i krem proizvodi i iznosi 32,0 g/ 100 g. Proizvodi od ribe, proizvodi od mesa i mlečni proizvodi imaju približno isti prosečan sadržaj ukupnih masti (Slika 1). 2

Najveći sadržaj masti je određen u lešnik pasti 67,4 g/100 g, a zatim u čoko lešnik kremu 56,6 g/100g (Tabela P1). Visok sadržaj masti je prisutan i u kajmak kremu, 55,1 g/ 100 g. Imajući u vidu da je preporučeni unos masti za prosečnu odraslu osobu 70 g dnevno (Evropska uredba br. 1169/2011, Evropski parlament / Savet Evropske Unije, 2011), jasno je koliko prekomerno konzumiranje određenih prehrambenih proizvoda sa visokim sadržajem masti doprinosi povećanom dnevom unosu masti u oranizam. Širok opseg sadržaja masti, ali i drugih parametara u okviru grupa definisanih prema kriterijumima pravilnika o kvalitetu, posledica je različitog sastava i različitih postupaka tehnološke obrade proizvoda koji po svojoj osnovnoj kategorizaciji pripadaju istoj grupi. Tako da u grupi mlečnih proizvoda postoji velika razlika u sadržaju masti, a samim tim i sadržaju zasićenih masnih kiselina u punomasnim sirevima (uzorci broj 46, 48, 50 i 53) i sladoleda i voćnih jogurta (uzorci broj 41, 42, 43, 47). Slika 1. Box-plot grafik grafički prikaz parametara deskriptivne statistike za sadržaj masti Najveću prosečnu vrednost sadržaja natrijuma, odnosno soli preračunate iz sadržaja natrijuma, imaju proizvodi od mesa, a najmanju čokolade i krem proizvodi (Slike 2 i 3). Prosečni sadržaj soli u proizvodima od mesa je 2 g/ 100 g, a u pojedinim uzorcima 3,8 g/ 100 g (kolenica) i 4,0 g/ 100 g (hamburska slanina) što je i očekivano, jer tehnološki postupak 2

proizvodnje suvomesnatih proizvoda i slanine podrazumeva dodavanje veće količine soli, koja je uz ostale činioce, potrebna da bi se ovakav proizvod učinio mikrobiološki stabilnim (Stamenković, 2004). Imajući u vidu da je preporuka Svetske zdravstvene organizacije da unos soli za odrasle bude manje od 5 g/ dan, a za decu manje od 2 g/ dan, konzumiranje mesnih proizvoda znatno doprinosi pevećanju unosa natrijuma i soli u organizam. Takođe, zapažena je varijabilnost u sadržaju soli među sličnim proizvodima (uzorci konzervi od mesa u komadima br. 4 i 13, kao i uzorci barenih kobasica, br. 2 i 3), što ukazuje da je u ovim proizvodima moguće smanjiti sadržaj soli, a da proizvod bude senzorski prihvatljiv i time doprineti smanjenju unosa soli putem proizvoda od mesa. U grupi mlečnih proizvoda prosečan sadržaj soli je 1,1 g/ 100 g, pri čemu uzorak broj 46, rendani sir nije uzet u obzir prilikom statističke obrade zbog ekstremno visokog sadržja soli od 5,6 g/ 100 g. Osim rendanog sira, i ostali uzorci tvrdih i polutvrdih sireva, kao i mlečni namazi, imaju visok sadržaj soli. Soljenje sireva se praktikuje zbog kontroliranja mikroflore koja utiče na zrenje sireva. Pri proizvodnji sireva so, uz to što deluje kao inhibitor rasta i razvoja patogenih mikroorganizama, istovremeno kontroliše aktivnost starter kultura, utiče na razvoj sekundarne flore i flore zrenja sireva, deluje na aktivnost enzima koji su odgovorni za zrenje, ima ulogu u razvoju teksture sira i značajan je činilac koji kreira ukus sira (M. Mesner, 1962). Fermentisani mlečni proizvodi - jogurti, sladoledi i sveži sirevi, imaju nizak sadržaj soli (od 0,2 g/ 100 g do 0,5 g/ 100 g), koji uglavnom potiče od natrijuma prirodno prisutnog u mleku. Konzervisani proizvodi od ribe, kao i slani snek proizvodi, takođe sadrže značajan sadržaj soli (oko 1,5 g/ 100 g). Sa druge strane, tehnološki proces proizvodnje čokolade i krem proizvoda ne podrazumeva dodavanje soli, a sirovine za njihovu proizvodnju (kakao, šećer, biljne masti) imaju prirodno nizak sadržaj natrijuma, kao i orašasti plodovi, pa je sadržaj soli u ovim grupama uglavnom posledica prirodnog sadržaja natrijuma i kreće se u opsegu od 0,2 do 0,5 g/ 100 g. 2

Slika 2. Box-plot grafik grafički prikaz parametara deskriptivne statistike za sadržaj Na soli. Slika 3. Box-plot grafik grafički prikaz parametara deskriptivne statistike za sadržaj 2

Zasićene masne kiseline su pisutne u najvećoj prosečnoj koncentraciji (12,5 g/100 g) i u najširem opsegu u mlečnim proizvodima (Slika 4), zatim u čokoladama i krem proizvodima (11,5 g/ 100 g) i potom u proizvodima od mesa (7,7 g/ 100 g). Ove vrednosti za mlečne i proizvode od mesa su očekivane s obzirom da su zasićene masne kiseline najprisutnije u proizvodima animalnog porekla. U čokoladama i krem proizvodima zasićene masne kiseline potiču od mleka, kao i palminog ulja koje je bogato zasićenim masnim kiselinama, a koriste se za proizvodnju ovih proizvoda. Veoma visok sadržaj ZMK je određen u grupi finih pekarskih proizvoda (u kolačima), u uzorku tiramisu (15,6 g/ 100 g), kao i opera cake i valentines cake. Ovi proizvodi imaju ovako visok sadržaj ZMK jer u njihov sastav ulaze mleko, sir i biljna ulja. U cilju smanjenja unosa, sa zdravstvenog aspekta nepoželjnih zasićenih masnih kiselina, trebalo bi konzumirati mlečne proizvode, proizvode od mesa, a i ostale sa smanjim sadržajem masti, jer će tada i sadržaj ZMK u njima biti manji, imajući u vidu da je preporučeni ZMK za prosečnu odraslu osobu 20g dnevno (Evropska uredba br. 1169/2011, Evropski parlament). ZMK Slika 4. Box-plot grafik grafički prikaz parametara deskriptivne statistike za sadržaj Najveći prosečan sadržaj mononezasićenih masnih kiselina (24,0 g/ 100 g), kao i polinezasićenih masnih kiselina (11,1 g/ 100 g) imaju orašasti plodovi, semenke i proizvodi (Slike 5 i 6). Oni imaju veći udeo nezasićenih masnih kiselina od zasićenih, usled čega je sastav masti u njima nutritivno kvalitetniji. 2

Slika 5. Box-plot grafik grafički prikaz parametara deskriptivne statistike za sadržaj MNMK Najveći sadržaj polinezasićenih masnih kiselina, 28,4 g/ 100 g, ima uzorak broj 108 (Dimljeni šaran), što je i očekivano jer je meso ribe bogat izvor polinezasićenih masnih kiselina, a naročito jako korisnih nezasićenih omega 3 masnih kiselina. Slika 6. Box-plot grafik grafički prikaz parametara deskriptivne statistike za sadržaj PNMK 2

Najveće vrednosti sadržaja trans masnih kiselina su određene u grupi čokolada i krem proizvoda, a zatim kod mlečnih proizvoda. Za mlečne proizvode je očekivana veća količinama TMK jer ih oni prirodno sadrže. Ovako visoka vrednost trans masnih kiselina kod grupe čokolada i krem proizvoda je posledica prisustva jednog uzorka sa visokom vrednošću od 15,9 g/ 100 g za uzorak Kakao krem table (Tabela P1, uzorak br. 79). Visoku vrednost od 7,2 ima i uzorak Kakao krem tabla punjena mlečnim filom (Tabela P1, uzorak br. 84). Kada bi se ove dve vrednosti isključile srednja vrednost ostalih proizvoda od čokolade bi iznosila 0,2, dakle bila bi slična ostalim proizvodima. Trans masne kiseline su u najširem opsegu prisutne u grupi čokolade i kakao proizvodi, zbog ekstremnih vrednosti dobijenih za ova dva uzorka (Slika 7). Kod mlečnih proizvoda, pekarskih proizvoda i finih pekarskih proizvoda sadržaj trans masnih kiselina se kreće u sličnim opsezima. U orašastim plodovima i proizvodima od ribe nisu bile prisutne trans masne kiseline. Prosečan sadržaj trans masnih kiselina u svim grupama prehrambenih proizvoda je približno isti i iznosi 0,2 g/ 100 g. Preporuka Organizacije za hranu i poljoprivredu (Food and Agriculture Organization) je da unos trans masnih kiselina bude manji od 2 g dnevno (FAO, 2010). Vrednosti dobijene ispitivanjem dva uzoraka iz grupe čokolada i krem proizvoda su znatno iznad ove vrednosti i ukazuju da su se za proizvodnju tih čokoladnih proizvoda koristile masti niske nutritivne vrednosti, odnosno masti koje su različitim tehnološkim postupcima prerađena biljna ulja. 2

Slika 7. Box-plot grafik grafički prikaz parametara deskriptivne statistike za sadržaj TMK 4.1 Analiza varijansi i multivarijantna analiza Dobijene vrednosti za sadržaj masti, sastav masti i sadržaj soli u prehrambenim proizvodima ne podležu normalnoj raspodeli, zbog čega je za procenu razlika između grupa proizvoda korišćen neparametarski K-W test. Da bi se dobila opšta slika (analiza svih uzoraka i promenljivih istovremeno) primenjena je multivarijantna analiza - analiza glavnih komponenata. PCA je izvedena sa ciljem utvrđivanja promenljivih koje su u korelaciji u svakoj grupi proizvoda i otkrivanja da li se na osnovu njih može utvrditi jasna razlika između grupa proizvoda. Statistička značajnost je definisana kao p < 0,05 za sve analize. K-W test je primenjen na svaki parametar pojedinačno, posmatrajući grupe namirnica kao faktor poređenja. U slučaju kada je utvrđena statistički značajna razlika između medijana, primenjen je Z-test kojim se upoređuju dva seta podataka međusobno, za svaki parameter pojedinačno. Tabela 5. Rezultati Kruskal-Wallis-ovog testa Kruskal-Wallis test P Z test* Č(M,Ml,P,R,Snek) M(Č,Ml,O,Snek) Ml(Č,M) So 0,0000 O(M,P,R) P(Č,M,O) R(Č,O) Snek(Č,M) Č(M,Ml,P,Snek) M(Č,O,P) Ml(Č,O,P) Mast 0,0000 O(M,Ml,P,R,Snek) P(Č,M,Ml,O,Snek) R(O) Snek(Č,O,P) 2

Č(P,R) M(P) Ml(P,R) ZMK 0,0000 O(P) P(Č,M,Ml,O,Snek) R(Č,Ml) Snek(P) Č(Ml,P,Snek) M(Ml,O,P,Snek) Ml(Č,O,P) MNMK 0,0000 O(M,Ml,P,R,Snek) P(Č,M,Ml,O,Snek) R(O) Snek(Č,M,O,P) Č(Ml) M(Ml,O) Ml(Č,M,O,R,Snek) PNMK 0,0000 O(M,Ml,P,Snek) P(O) R(Ml) Snek(Ml,O) Č(O) M(O,P,R) Ml(O,P,R,Snek) TMK 0,0033 O(Č,M,Ml,Snek) P(M,Ml) R(M,Ml) Snek(Ml,O) *Č - Čokolade i krem proizvodi, M - Proizvodi od mesa, Ml - Mlečni proizvodi, O - Orašasti plodovi, semenke i proizvodi, P - Pekarski proizvodi R - Proizvodi od ribe, Snek - žita za doručak K-W test ukazuje na postojanje statistički značajne razlike između posmatranih grupa namirnica za svaki od parametara (p < 0,05) (Tabela 5). Primenom post-hoc testa za višestruko poređenje Z-vrednosti ustanovljeno je da se čokoladni i krem proizvodi značajno razlikuju u 2

sadržaju soli u odnosu na ostale grupe namirnica (imaju značajno manji sadržaj soli). Takođe, orašasti plodovi sadrže statistički značajno veće količine ukupne masti u odnosu na ostale grupe namirnica, za razliku od pekarskih proizvoda, koji imaju u odnosu na ostale grupe manji sadržaj ukupnih masti. Orašasti plodovi se značajno razlikuju u sadržaju MNMK, kao i u sadržaju PNMK od proizvodi od mesa, mlečnih proizvoda, pekarskih proizvoda i finih pekarskih proizvoda, proizvoda od riba i snek proizvoda. Mlečni proizvodi imaju značajno manji sadržaj PNMK u odnosu na druge grupe proizvoda. 4.2 PCA PCA, primenjena na sadržaj soli, ukupne masti i sastav masnih kiselina u ispitivanim uzorcima hrane rezultovala je trokomponentnim modelom kojim se objašnjava 80,92% ukupnog varijabiliteta među podacima. Prva glavna komponenta (PC1) obuhvata 42,72% varijabiliteta, dok druga glavna komponenta (PC2) pokriva 20,67%. Informacije sadržane u preostalim varijablama nisu bile značajne za analizu posmatranih podataka (Tabela 6). Tabela 6. Procenat varijanse dobijen pomoću PCA modela Broj glavne komponente % Varijanse za svaku glavnu komponentu pojedinačno 1 42,72 42,72 2 20,67 63,38 3 17,53 80,92 % Ukupne varijanse Vrednost skorova, odnosno njihove uzajamne projekcije za prve dve komponente predstavljene su na Slici 8. U odnosu na PC1 osu, uzorci su donekle podeljeni u dve grupe. Većina uzoraka orašastih plodova i čokoladnih i krem proizvoda su grupisani sa desne strane grafikona, dok uzorci ostalih namirnica čine klaster uglavnom na suprotnoj strani PC1 ose. Preklapanje grupa namirnica sa leve starne PC1 ose uslovljeno je velikim varijabilitetom podataka unutar ovih grupa objekata. Duž PC2 pravca nije bilo značajnog razdvajanja, ali uzorci pekarskih proizvoda su jasno grupisani i imaju mali unutrašnji varijabilitet u donjem delu PC2 ose. Mesni proizvodi formiraju širi klaster u gornjem delu PC2 ose. Ostali uzorci su raspoređeni u širem PC1 - PC2 prostoru, naročito uzorci snek proizvoda i mlečnih proizvoda. 3