Microsoft Word - Editovanje RNK 2019.docx

EDITOVANJE RNK DEZAMINACIJOM ADENOZINA U INOZIN 1. UKRATKO O RAZLIČITIM TIPOVIMA EDITOVANJA RNK Editovanje RNK je post-transkripciona promena sekvence RNK tako da se ona razlikuje od sekvence gena. Ovaj proces doprinosi povećanju informacionog potencijala i plastičnosti genoma kroz stvaranje većeg broja izoformi RNK i proteina od jednog gena. Editovanje prekursora irnk, rrnk, trnk i malih regulatornih RNK opisano je kod velikog broja organizama, počev od bakterija do čoveka. Prvi primer editovanja RNK opisan je 1996. godine, kada je otkriveno da kod irnk preipisane sa mitohondrijskog gena coxii tripanozome dolazi do post-transkripcione insercije uridina (U) vođene vodičem RNK (eng. guide RNA, grna). Nakon toga, otkriveni su drugi tipovi editovanja RNK, i postalo je jasno da je reč o široko rasprostranjenom fenomenu. U transkriptima mitohondrijskih i hloroplastnih gena kod biljaka, široko je zastupljena konverzija citidina (C) u U (editovanje C-u-U), a manje je česta konverzija U u C (editovanje U-u-C). Editovanje C-u-U dešava se i u rrnk male subjedinice mitohondrijskih ribozoma Dictyostelium discoideum. Kod ameboidne praživotinje Physarum polycephalum opisani su različiti tipovi editovanja mitohondrijskih irnk i rrnk: insercija većeg broja C, insercija dinukleotida CU, GU, UA, AA, UU i GC, kao i delecija AAA. Insercija većeg broja guanozina (G) opisana je u irnk prepisanoj sa negativnog lanca RNK virusa. Transportne RNK podležu različitim tipovima editovanja. Kod ameboidne praživotinje Acanthamoeba castellanii opisano je editovanje 5'-kraja mitohondrijskih trnk. Editovanje adenozina (A) u inozin (I) (editovanje A-u-I) u trnk, katalizovano familijom adenozin dezaminazama koje deluju na trnk (eng. adenosine deaminases acting on trna, ADATs), opisano je kod eukariota, ali i kod Escherichia coli. ADAT1 edituje A 37 (u blizini antikodona) u trnk Ala, dok heterodimeri ADAT2-ADAT3 edituju A 34 na kolebljivoj (eng. wobble) poziciji antikodona u određenoj grupi molekula trnk. Kod sisara su opisane dve vrste editovanja RNK nukleotidnim dezaminacijama. Prvi opisani tip bila je dezaminacija C u U, katalizovana APOBEC1 citidin dezaminazom, na primeru irnk prepisane sa gena za apolipoprotein E (APOE). Editovanje C-u-U u APOE irnk je tkivno specifično i dovodi do promene kodona za glutamin u stop kodon, omogućavajući sintezu izoformi apolipoproteina B sa različitim funkcijama u metabolizmu lipida. U ćelijama creva, nakon editovanja, sintetiše se kraća izoforma (APOB48), koja učestvuje u transportu lipida unetih hranom do različitih tkiva. U ćelijama jetre ne dolazi do editovanja i sintetiše se izoforma pune dužine (APOB100), koja učestvuje u transportu endogeno sintetisanih triglicerida i holesterola. Drugi tip editovanja RNK u ćelijama sisara je editovanje A-u-I u dvolančanim regionima RNK, katalizovano familijom adenozin dezaminaza koje deluju na RNK (eng. adenosine deaminases acting on RNA, ADARs) (slike 1 i 2). Iako se verovalo da je editovanje A-u-I redak događaj, analize na nivou 1

transkriptoma pokazale su da je ovaj proces široko rasprostranjen i veoma korišćen kod sisara. Prisustvo I umesto A u kodirajućim ili nekodirajućim regionima pre-irnk/irnk utiče na njihovu strukturu, stabilnost, lokalizaciju, translaciju i splajsovanje, čime značajno doprinosi diverzifikaciji transkriptoma i proteoma. Editovanju A-u-I podležu i prekursori malih regulatornih RNK, čime se može promeniti njihova obrada ili interakcija zrelih malih regulatornih RNK sa ciljnim molekulima (na primer, interakcija mirnk sa ciljnom irnk). 1. EDITOVANJA ADENOZINA U INOZIN 1.1. Adenozin dezaminaze koje deluju na RNK (proteini ADAR) Editovanje A-u-I podrazumeva hidrolitičku dezaminaciju A u I u dvolančanim regionima RNK, katalizovanu enzimima familije ADAR (slika 1). Inozin se u pogledu saprivanja baza ponaša kao G (slika 1). Enzimi ADAR su originalno identifikovani u jajnim ćelijama i embrionima Xenopus laevis, kada su opisani kao proteini koji odmotavaju dvolančane RNK. Prvi otkriveni gen sisara je bio ADAR (ranije označavan kao ADAR1) u genomu čoveka, u kome su zatim identifikovana jod dva gena, ADARB1 i ADARB2 (ranije označavana kao ADAR2 i ADAR3, redom). Ortolozi ADAR gena su evoluciono očuvani kod kičmenjaka, a samo nekoliko je identifikovano kod beskičmenjaka. Drosophila melanogaster ima jedan gen označen kao dadar, koji je sličan sa ADARB1, dok Cenorabditis elegans ima dva gena, c.e.adar-1 i c.e.adar-2. U genomima biljaka i gljiva nisu identifikovani ADAR geni. Smatra se da su ADAR geni tokom evolucije nastali od ADAT gena. Slika 1. Dezaminacija adenozina u inozin. a) Adenozin se hidrolitičkom dezaminacijom prevodi u inozin. b) Adenozin se bazno sparuje sa uridinom; c) Inozin se bazno sparuje sa citidinom. Enzimi familije ADAR odlikuju se zajedničkim funkcionalnim domenima (slika 2). Poseduju dva do tri vezivna domena za dvolančanu RNK (eng. dsrna-binding domain, dsrbd), dužine oko 65 aminokiselina, pomoću kojih ostvaruju direktne kontakte i vezuju se za dvolančanu RNK. Na C-kraju sadrže katalitički dezaminazni domen. Pretpostavlja se da se ciljni A iz unutrašnjosti dvolančane RNK 2

okreće (eng. base flipping) i smešta u aktivni centar enzima. Protein ADAR na N-kraju sadrži dva Z-DNK-vezivna domena, označena kao Zα and Zβ, od kojih samo Zα ima vezivni kapacitet. Njihove funkcije nisu sasvim jasne. S obzirom da se struktura Z-DNK stabilizuje prolaznom negativnom superspiralizacijom uzvodno od aktivne RNK polimeraze, smatra se da bi Zα domen mogao da vezuje ADAR na mesto gde se odigrava transkripcija, što bi proteinu ADAR omogućilo da obavi editovanje pre splajsovanja. Zα domen se vezuje i za dvolančane RNK koje imaju Z strukturu i podležu editovanju A-u-I. Takve su virusne RNK tokom tranksripcije, što bi proteinu ADAR moglo omogućiti da ih efikasno modifikuje. Takođe, smatra se da Zα domen specifično povećava afinitet ADAR za kratke dvolančane RNK, kao što su male interferirajuće RNK (sirnk). ADARB2 na N-kraju poseduje domen bogat argininom (R), koji vezuje jednolančanu RNK, ali njegova funkcija u ovom proteinu još nije poznata. Manje zastupljena izoforma ADARB1, takođe, sadrži R domen. Slika 2. Familija proteina ADAR. a) Članovi familije proteina ADAR kod čoveka (ADAR, ADARB1 i ADARB2, sa označenom dužinom proteina i pozicijom njihovih gena na hromozomima), Drosophile melanogaster (dadar) i Cenorabditis elegans (c.e.ada1 i c.e.ada2). Svi proteini ADAR poseduju RNK-vezivne domene za dvolančanu RNK (dsrbd) i katalitički dezaminazni domen. Protein ADAR čoveka poseduje Z-DNK vezivne domene (Zα i Zβ), dok ADARB2 sardži vezivni domen za jednolančanu RNK bogat argininom (R). b) Alternativna obrada i izoforme ADAR: ADARp150 se eksprimira sa interferon/dvolančana RNK inducibilnog promotora, a egzon E1A, koji sadrži start kodon, splajsuje se sa egzonom E2. ADARp110 se eksprimira sa jednog od dva konstitutivna promotora, a egzon E1B ili E1C slajsuju se sa egzonom E2 koji sadrži start kodon. c) Proteine ADAR pomoću dsrbd prepoznaju svoje supstrate, dvolančane regione RNK, u okviru kojih dezaminaznim domenom katalizuju dezaminaciju jednog ili većeg broja A. Geni ADAR i ADARB1 se eksprimiraju u mnogim tkivima, najviše u nervnom, dok se ADARB2 eksprimira samo u mozgu. Kao rezultat alternativnog korišćenja promotora i egzona gen ADAR kodira dve proteinske izoforme: izoformu pune dužine (ADARp150 ili ADARL) i kraću, okrnjenu na N-kraju (ADARp110 ili ADARS) (slika 2). ADARp150 se transkribuje sa promotora inudukovanog interferonom ili dvolančanom RNK, i pojačano se eksprimira nakon ćelijskog stresa ili virusne infekcije. Druge dve 3

ADAR irnk prepisuju se sa dva konstitutivna promotora i alternativno se splajsuju preskakanjem egzona sa start kodonom. Njihova translacija se inicira sa nizvodnog kodona za Met, usled čega se sintetiše kraća izoforma ADARp110. ADARp150 kruži između nukleusa i citoplazme i uglavnom lokalizuje u citoplazmi, što je verovatno uslovljeno lokalizacijom njegovih ciljnih molekula (na primer, virusnih RNK ili prekursora sirnk). ADARp110 i ADARB1 lokalizuju u nukleusu. Akumuliraju u neukleolusu, verovatno, kroz interakciju dsrbd sa dvolančanim regionima rrnk ili snornk. Imajući u vidu da nukleolus obavlja funkciju mesta za čuvanje nekih proteina u cilju inhibicije njihove aktivnosti, pretpostavlja se da bi ADARp110 i ADARB1 mogli da se čuvaju u nukleolusu, odakle bi se "pomerali" u nukleoplazmu kada se pojave dvolančani supstrati RNK. ADAR i ADARB1 su funkcionalno aktivni kao homodimeri, koji se formiraju nezavisno od prisustva dvolančane RNK. Prilikom prepoznavanja supstrata, dsrbd u homodimerima funkcionišu kooperativno. ADARB2 ne formira homodimere. Skoro sve reakcije editovanja A-u-I pripisuju se aktivnostima enzima ADAR i ADARB1. Iako su funkcionalne osobine dezaminaznog domena očuvane kod ADARB2, smatra se da je odsustvo njegove katalitičke aktivnosti upravo vezano za nemogućnost homodimerizacije. Funkcija ADARB2 je za sada nepoznata. Smatra se da bi mogao delovati kao repesor aktivnosti ADAR i ADARB1 vezujući se za njihove potencijalne supstrate bez mogućnosti da ih edituje, ili da bi mogao formirati nefunkcionalne heterodimere sa ADAR i ADARB1. 1.2. Specifičnost enzima ADAR za supstrat Supstrati proteina ADAR su dvolančane strukture RNK sa kojima stupaju u interkaciju pomoću dsrbd. U strukturni dvolančane RNK funkcionalne grupe koje nose informaciju o specifičnosti sekvence smeštene se duboko u unutrašnjosti molekula, tako da proteini ADAR ne prepoznaju specifičnu sekvencu dsrnk, već specifičnu strukturu dvolančane RNK. Supstrati za proteine ADAR su intramolekulske, ređe, intermolekulske dvolanačne RNK duže od 20 bp, što odgovra dvolančanoj zavojnici RNK sa dva okreta (slika 2). Efikasnost i determinante specifičnosti proteina ADAR razlikuju se u zavisnosti od dužine i sekundarne strukture RNK. Visoka efikasnost (i neselektivno) editovanje velikog broja A dešava se u perfektno ili skoro perfektno komplementarnim dvolančanim RNK dužim od 100 bp, a njihova sekundarna struktura i stabilnost diktiraju selekciju mesta editovanja (slike 3b i 7). Sam proces editovanja dovodi do destabilizacije (odmotavanja) RNK supstrata, usled nemogućnosti sparivanja I sa U, i verovatno se odvija do trenutka kada enzim više ne prepoznaje supstrat kao dvolančanu RNK. Suprotno, u kraćim dvolančanim strukturama RNK dužine 30 do 70 bp ili u dužim, parcijalno komplementarnim dvolančanim RNK sa pogrešno sparenim bazama, jednolančanim izbočinama i petljama specifično se edituje samo jedan ili nekoliko A. Dezaminacija jednog ili nekoliko A u takvim supstratima menja njegovu strukturu i smanjuje stabilnost ispod praga koji prepoznaju proteini ADAR. Editovanje specifičnog A u dvolančanim strukturama RNK određeno je strukturom, ali i sekvencom RNK koja okružuje mesto editovanja i koje prepoznaju dsrbd. Takođe, sam dezaminazni domen pokazuje preferenciju za editovanje u određenom kontekstu sekvence. Neka mesta editovanja u dvolančanim strukturama RNK mogu biti supstrat za ADAR ili ADARB1, dok su neka preferencijalni supstrat za ADAR ili ADARB1. Ovo ukazuje da se specifičnost za 4

supstrat može razlikovati između funkcionalnih formi ADAR, verovatno usled različitog broja i međusobne udaljenosti dsrbd, koji omogućavaju razlikovanje RNK različite strukture i stabilnosti. Efekati dezaminacije A-u-I na nivou molekula RNK su: 1) promena informacionog potencijala RNK, vezana za činjenicu da se I preferencijalno sparuje sa C, tako da ga mašinerije za translaciju i splajsovanje interpretitraju kao G; 2) promena trodimenzionalne strukture i stabilnosti RNK stvaranjem ili uklanjanjem jednolančanih izbočina, što se odražava na njenu interakciju sa raznim RNK-vezivnim proteinima uključenim u svim koracima metabolizma irnk. Editovanje A iz baznog para A-U dovodi do formiranja pogrešnog baznog para I-U i destabilizacije strukture dvolančane RNK, dok ređe editovanje A iz pogrešnog baznog para A-C formira bazni par I-C i stabilniju dvolančanu RNK. 2. TIPOVI I EFIKASNOST EDITOVANJA A-U-I Dezaminacija jednog ili nekoliko tačno određenih A označena je kao editovanje specifično za mesto. Suspstrati za ovaj tip editovanja su pre-irnk koje formiraju kratke dvolančane regione (30-70 bp) nastale sparivanjem dela egzona i introna (eng. editing-site-complementary sequence, ECS), u okviru kojih editovanju podležu uglavnom kodirajući nukleozidi (slika 3a). Ovaj proces doprinosi diverzifikaciji proteoma. Inicjalno se smatralo da su supstrati za ADAR samo kodirajući regioni irnk. Danas je poznato da se svega oko pedesetak pre-irnk edituje u kodirajućim regionima, dok se ogroman broj mesta editovanja (oko 1,6 miliona!) nalazi u nekodirajućim regionima pre-irnk. Naime, 2004. godine je otkriveno da su najčešća mesta editovanja A-u-I duge (>100 bp), visoko-komplementarne dsrnk nastale sparivanjem invertovanih ponovaka Alu ili LINE, smeštenih u intronima i netranslatirajućim regionima pre-irnk. U ovim dvolančanim strukturama RNK visoko-efikasno i neselektivno edituje se i do 50% A, čime se značjano menja lokalna struktura i stabilnost irnk. Ovaj tip editovanja poznat je pod nazivom globalno hipereditovanje ili promiskuitetno editovanje. Proces značajno doprinosi diverzifikaciji transkriptoma. Od 2006. godine poznato je da postoje interakcije procesa editovanja A-u-I i RNK interferencije (RNKi) zasnovane na editovanju prekursora malih regulatornih RNK i na nekim funkcijama proteina ADAR nezavisnim od dezaminazne aktivnosti. Editovanju podležu specifični A u prekursorima mikrornk (mirnk), dok hipereditovanju podleže veliki broj A u prekursorima malih interferirajućih RNK (sirnk). Proces je važan mehanizam regulacije malih nekodirajućih RNK. Efikasnost editovanja transkripta određene vrste kreće se u rasponu od 0 do 100% i zavisi od vrste supstrata, faze razvića i sredinskih signala. Ova osobina editovanja A-u-I dozvoljava istovremenu ekspresiju editovanih i needitovanih produkata jednog gena u različitim odnosima. Kroz regulisanje stepena editovanja određene vrste transkripata, postiže se graduisano regulisanje funkcije njihovih proteina, što značajno povećava plastičnost u funkcionisanju ćelije. 5

Slika 2. Tipovi editovanja A-u-I katalizovanih proteinima ADAR. a) Editovanje specifčno za mesto. b) Hipereditovanje (promiskuitetno editovanje). c) Editovanje prekursora malih regulatornih RNK. 2.1. Mesto-specifično editovanje i diverzifikacija proteoma Mesto-specifično editovanje A-u-I u kodirajućim regionima menja informacioni potencijal pre-irnk, jer se I sparuje sa C, a ribozom i splajsozom ga interpretiraju kao G (slika 1). Posledice su promena značenje kodona (rekodiranje) (slika 3a) ili mesta splajsovanja (slika 3b). Usled suspstitucije aminokiseline ili novog događaja alternativnog splajsovanja stvaraju se proteinske izoforme, koje uglavnom obavljaju iste funkcije, ali se međusobno razlikuju u stepenu funkcionalnosti. 2.1.1. Rekodiranje Rekodiranju podleže oko pedesetak pre-irnk kod sisara. One ukupno sadrže oko 300 visoko-konzervisanih A koji su supstrati za precizno regulisano editovanje sa posledicama na funkcionalnost proteina. Većina takvih irnk eksprimira se u centralnom nervnom sistemu (CNS), a njihovi proteini, uglavnom, učestvuju u hemijskoj i električnoj neurotransmisiji ili drugim sinaptičkim funkcijama. 6

Slika 3. Efekti editovanja A-u-I u transkriptima koji kodiraju proteine: a) Promene kodona koje mogu nastati usled editovanja A-u-I, zasnovane na interpretaciji I kao G od strane translacione mašinerije. Aminokiseline su grupisane prema naelektrisanju i hidrofobnosti. b) Nastanak alternativno splajsovanih izoformi pomoću editovanja RNK. Visokokonzervisana sekvenca GU u 5'-mestu splajsovanja može biti kreirana editovanjem (AU IU=GU), kao i visokokonzervisana sekvenca AG u 3'-mestu splajsovanja (AA AI=AG). Slično, editovanje AG u 3'-mestu splajsovanja (AG IG = GG) može eliminsati ovo mesto. Savijena linija označava granice introna koji se iskraja u odsustvu editovanja RNK. Isprekidane linije označavaju alternativno splajsovane forme nastale usled editovanja RNK. Primeri editovanih transkripata za receptore za neurotransmitere ili jonske kanale kod sisara su receptori AMPA i GABA A, serotoninski receptor 2C, kanal za kalijum Kv1.1 i kanal za kalcijum Ca v1.3, na primer. Kod D. melanogaster je opisano editovanje transkripta za Na-kanale, a kod lignje kanala za kalijum Kv1.1A. Poslednjih godina opisano je editovanje još nekih proteina koji se specifično eksprimiraju u neuronima. Među njima su triptofan hidroksilaza 2, odgovorna za sintezu serotonima u mozgu, i RNK-vezivni proteini važni za post-transkripcionu regulaciju irnk u neuronima (HuB, HuD i NOVA1). Supstrati za editovanje A-u-I su i transkripti za proteine uključene u različite korake reorganizacije aktina (CyFip2, filamin A i filamin B), koji su esencijalni za pokretljivost i migraciju ćelija, a u neuronima i za formiranje dendritskih trnova i sinapsi. Takođe, transkripti nekih proteina uključenih u proliferaciju ćelije podležu editovanju A-u-I. Pored ćelijskih transkripata supstrati za editovanje A-u-I su i neki virusni transkripti (na primer, transkript gena za antigen hepatitis delta virusa). Rekodiranjem se stvaraju proteinske izoforme koje, za razliku od proteinskih izoformi nastalih alternativnim splajsovanjem, skoro uvek obavljaju istu funkciju ali se međusobno fino razlikuju po osobinama koje utiču na efikasnost obavljanja njihove funkcije. Tako, rekodiranje utiče na kintetiku enzima (na primer, TPH2) ili jonskog kanala i receptora, asembliranje subjedinica i ekspresiju jonskog kanala i receptora na površinu ćelije, afinitet vezivanja za RNK supstrat (na primer, Hu proteini), stabilnost proteina (na primer, NOVA1) ili na interakciju sa partner proteinima (na primer, CyFip2, filamin A i filamin B). Ako se ima u vidu precizna vremenska i prostorna regulacija editovanja kojom se dodatno postiže da editovanjem bude obuhvaćeno 0 do 100% populacije određenog transkripata, onda postaje jasno da u određenom trenutku u određenoj ćeliji istovremno funkcioniše veći broj proteinskih izoformi koje sa graduisanom efikasnošću obavljaju svoje funkcije. Upravo ove osobine proces editovanja RNK čine možda i najmoćnijim procesom u pogledu obzbeđivanja izuzetne plastičnosti odgovora ćelije na stimuluse koje prima. 7

Značaj rekodiranja za funkcionalnost nekog proteina lepo se može ilustrovati primerom editovanja pre-irnk za serotonincki receptor 2C (5-HT 2CR). 5-HT2CR je protein sa sedam tansmembranskih domena koji kupluje sa proteinom G. Njegovom aktivacijom inhibira se dopaminska i norepinefrinska signalizacija u određenim regionima mozga. Učestvuje u regulaciji raspoloženja, anksioznosti, ishrane i reproduktivnog ponašanja. 5-HT 2CR pre-irnk edituje se na pet specifičnih mesta u egzonu 5, označenih kao mesta A, B, E, C i D (slika 4b), što menja genomski kodirane aminokiseline Ile, Asn i Ile na pozicijama 156, 158 i 160, redom (slika 4b). Kratka dvolančana RNK sa izbočinama i petljama, koja je supstrat za proteine ADAR, formira se parcijalnim sparivanjem sekvence egzona 5 i nizvodne sekvence introna. Različite kombinacije editovanja pet mesta dovode do promene tri kodona (AUA za Ile, AAU za Asn i AUU za Ile) u mogućih šest novih (slika 4b) i potencijalne ekspresije čak 24 izoforme receptora. Mesta A i B specifično edituje ADAR, mesto D ADARB1, dok mesta C i E ne pokazuju specifičnost prema jednom ili drugom enzimu. Egzon 5 gena 5-HT 2CR kodira drugu unutarćelijsku petlju koja je domen za kuplovanje sa G proteinom (slika 4b). Funkcionalnost izoformi se graduisano razlikuje u pogledu kuplovanja sa G proteinom, afiniteta za serotonin i agoniste, konstitutivne aktivnosti i ekspresije na površinu ćelije. Potpuno editovana izoforma 5-HT 2CR (VGV) ima 20 puta manju potencijaciju sa serotoninom, 5 puta smanjeno kuplovanje sa G proteinom i 6 puta manje efikasno vezuje agoniste u poređenju sa needitovanom izoformom (INI). Dalje, potpuno editovana izoforma VGV ima najmanju konstitutivnu aktivnost i potpuno se eksprimira na površini ćelije, needitovana izorma ima najveću konstitutivnu ativnost, konstitutivno internalizuje i akumulira u endozomima, dok se parcijalno editovana VSV izoroma delimično eksprimira na površini ćelije, a delimično akumulira u endozomima. Obrazac editovanja 5-HT 2CR pre-irnk moduliše njeno alternativno splajsovanje, čime se kontroliše količina sinteze funkcionalnog 5-HT 2CR. Intron 5 iskraja se korišćenjem jednog od tri alternativna 5'-mesta splajsovanja (GU1, GU2 i GU3). Mesto GU1 se nalazi u egzonu 5, GU2 na granici egzon 5-intron 5 i GU3 u intronu 5. Samo korišćenje mesta GU2 daje zrelu irnk koja kodira funkcionalni protein pune dužine. Većina editovanih pre-irnk splajsuje se korišćenjem ovog mesta splajsovanja. Needitovana pre-irnk, uglavnom, se splajsuje korišćejem mesta GU1, što rezultuje izostankom sinteze proteina. Ukoliko je editovanje neefikasno, povećan nivo splajsovanja u mestu GU1 deluje kao kontrolni mehanizam za smanjenje nivoa sinteze needitovane izoforme INI, kako bi se ograničio odgovor ćelije na serotonin. Editovanjem 5-HT 2CR irnk moduliše se (smanjuje se) odgovor ćelije na nivo serotonina, ali i sam nivo serotonina povratnom spregom utiče na nivo i obrazac editovanja 5-HT 2CR irnk, što omogućava modulaciju serotoninske signalizacije i optimalan odgovor ćelije na signale koje prima. AMPA receptor (L-α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolproprionat receptor) za glutamat, koji je ujedno i jonski kanal za kalcijum, posreduje u brzoj ekscitatornoj transmisiji u neuronima CNS-a, Sastoji se od četiri subjedinice, označene kao GluR-A, -B, -C i -D. Njihove pre-irnk sadrže ukupno osam A koji se edituju različitom efikasnošću. Editovanje kodona za glutamin (Q) u egzonu 11 pre-irnk za subjedinicu GluR-B katalizuje ADARB1. Kodon CAG za Q menja se u kodon CIG, koji se intrpretira kao kodon za arginin (R), a mesto editovanja se označava kao Q/R mesto (slika 4a). Aminokiseline Q ili R smeštene su u domenu petlje GluR-B koja je okrenuta ka samom jonskom kanalu tako da se editovanjem bitno menja propustljivost receptora AMPA za jone Ca 2+ : prisustvo R čini kanal 8

nepropustljivim za Ca 2+, dok prisustvo genomski kodiranog Q dozvoljava influks Ca 2+ u ćelije. Q/R mesto editovanja, takođe, utiče na unutarćelijski transport subjedinica i njihovo asembliranje. Ovo mesto editovanja je jedino za sada poznato mesto koje se edituje sa efikasnošću od 100% i esencijalno je za preživljavanje. Slika 4. Supstitucije aminokiselina u proteinima usled editovanja A-u-I i modulacija korišćenja mesta splajsovanja. a) AMPA receptor za glutamat, subjedinica GluR-B; b) receptor za sertonin 2C); c) modulacija odabira alternativnog mesta splajsovanja editovanjem pre-irnk za serotoninski receptor 2C. 2.1.2. Promena obrasca splajsovanja Editovanje A-u-I može promeniti obrazac splajsovanja jer ima potencijal da kreira 5 -mesto splajsovanja, kreira ili eliminiše 3 -mesto splajsovanja ili eliminiše mesto grananja (slika 3b). Takođe, može uticati i na odabir jednog od alternativnih mesta splajsovanja. 9

Kod sisara ADARB1 edituje sopstveni transkript (auto-editovanje) kreirajući alternativno 3'-mesto splajsovanja (AA AI=AG) (slika 5). Auto-editovanje rezultuje u uključivanju 47 nukleotida iz intronske sekvence usled čega dolazi do promene faze okvira čitanja i posledično do smanjenjanja nivoa ADARB1. Auto-regulacija splasovanja ADARB1 predstavlja mehanizam negativne povratne sprege kojim se moduliše nivo proetina ADARB1. Slika 5. Editovanje A-u-I menja obrazac splajsovanja ABARB1 pre-irnk. ADARB1 kod sisara edituje sopstvaenu pre-irnk, kreirajući novo 3'-mesto splajsovanja (crvena slova), što rezultuje uključivanjem 47 nukleotida introna, koje dovodi do promene faze okvira čitanja i smanjenja nivoa ADARB1. 2.2. Globalno hipereditovanje i diverzifikacija transkriptoma U poli-a frakciji RNK izolovanoj iz mozga pacova zapažen je veliki procenat zastupljenosti I, što se nije moglo objasniti editovanjem A-u-I u kodirajućim regionima transkripata prepisanih sa nekoliko destina gena za proteine. Ova nepodudarnost inicirala je bioinformatičko pretraživanje potencijalnih mesta editovanja u kodirajućim i nekodirajućim regionima sekvenci EST. Ovakvim pristupom identifikovan je mnogo veći broj mesta editovanja A-u-I od očekivanog, a najveće iznenađenje je bilo da su skoro sva nova mesta editovanja u transkriptomu čoveka (oko 15 000 mesta u oko 2 000 gena) identifikovana u nekodirajućim regionima pre-irnk koji se sastoje od invertovanih elemenata Alu (u 90% slučajeva) i LINE (slika 6a). Predikcija izvedena na osnovu bioinformatičkog pretraživanja je ukazala da bi više od 85% pre-irnk moglo da se edituje, i to u 90% slučajeva u intronima, a ostatak u netranslatirajućim regionima. Sličnom strategijom pretraživanja koja je bila ograničena na kodirajuće regione pre-irnk, identifikovano je svega nekoliko potencijalnih mesta editovanja. Savremenim analizama transkriptoma dubokim RNK sekvenciranjem identifikovno je čak 1,6 miliona mesta editovanja u nekodirajućim regionima pre-irnk. Dakle, analizama na nivou transkriptoma postalo je jasno da su najčešći supstrati za ADAR nekodirajuće sekvence transkriptoma, i to dvolančane RNK formirane intramolekulaskim sparivanjem invertovanih ponovljenih elementa Alu, a da je rekodiranje kao rezultat editovanja A-u-I mnogo ređe. Iako su elemenati Alu karakteristika genoma primata, utvrđeno je da je hipereditovanje A-u-I nekodirajućih ponovljenih elemenata u molekulima RNK široko rasprostranjen fenomen sa različitom zastupljenošću kod različitih organizama. U genomima drugih organizama postoje drugi tipovi elemenata SINE, za koje se smatra da imaju zajedničko poreklo sa elementima Alu. Editovanje elemenata SINE u transkriptomu miša je ređe u odnosu editovanje elemenata Alu barem za jedan red veličine i može se objasniti njihovom manjom dužinom (150 bp, u odnosu na 300 bp za Alu), kao i manjim stepenom međusobne homologije u odnosu na elemenate Alu. Skrining editovanja A-u-I u transkriptomu pacova, kokoške i vinske mušice, potvrdilo je da su nekodirajuće ponovljene sekvence glavni supstrati za ADAR, ali da je učestalost editovanja mnogo češća kod čoveka, pri čemu je 90% ovog povećanja vezano je za editovanje elemnata Alu u Pol II transkriptima. 10

Dosadašnja istraživanja ukazuju da je globalno hipereditovanje važno za finu post-transkripcionoj regulaciji ekspresije gena i da značajno doprinosi diverzifikaciji transkriptoma. Hipereditovanje invertovanih elemenata Alu može promeniti mesta splajsovanja, a nekoliko ćelijskih procesa, vezanih za specifično prepoznavanje i funkcionisanje molekula RNK obogaćenih inozinom, povezuje se sa izmenjenim transportom, strukturom i stabilnošću irnk. 2.2.1. Egzonizacija elemenata Alu Izvestan broj gena čoveka sadrži alternativne egzone čije sekvence odgovaraju elementima Alu. Oni se nazivaju Alu egzonima. Njihova mesta splajsovanja bi mogla nastajati editovanjem A-u-I dvolančane RNK formirane sparivanjem inverotvanih elemenata Alu (slika 6b). Na primer, editovanje jedne takve dvolančane strukture u genu NARF (nuclear prelamin A recognition factor), dovodi do stvaranja 3'-mesta splajsovanja uzvodno od elementa Alu, i posledično do njegovog uključivanja u zrelu irnk. Smatra se da bi modulisanje alternativnog splajsovanja editovanjem A-u-I u dvolančanim RNK formiranim sparivanjem inverotvanih elemenata Alu mogao biti široko rasprostranjen fenomen. Postoje mišljenja da je egzonizacija elemanata Alu kontolisana editovanjem mogla biti glavna pokretačka snaga evolucije CNS-a čoveka koja je omogućila oprobavanje različitih formi proteina sa novim funkcijama (bez narušavanja funkcija postojećih proteina), od kojih su opstale one koje su davale selektivnu prednost. 2.2.2. Nukleusna retencija hipereditovanih transkripta Afinitetnom hromatografijom u kojoj je korišćena sintetička RNK bogata inozinima izolovan je protein p54 nrb. Ovaj protein lokalizuje u nukleusu, gde obavlja veći broj funkcija: stupa u interakciju sa jednim faktorom splajsovanja (PSF) i jednim proteinom nukleusnog matriksa (matrinom 3), jedan je od proteina koji lokalizuje u nukleusnim parapegama i predstavlja protein koji "hvata" hipereditovane RNK polioma virusa. Pretpostavljeno je da bi editovanje A-u-I moglo biti zadržati i ćelijske transkripte u nukleusu, i da protein p54 nrb i nukleusne parapege verovatno imaju ključnu ulogu u tom procesu. Dobro je proučen primer nukleusne retencije hipereditovane irnk za katjonski transporter aminokiselina 2 (mcat2), koji ćeliju snabdeva prekursorima azotmonoksida (NO) (slika 6c). Gen mcat2 eksprimira se sa dva promotra dajući dve RNK koje nose identične okvire čitanja za mcat2. Jedna od njih, mcat2 RNK, se nakon transkripcije eksportuje se u citoplazmu i translatira u protein. Duži transkript, Ctn RNK, sadrži produženi 3 -UTR sa invertovanim ponovcima Alu koji su supstrat za proteine ADAR. Hipereditovanu Ctn RNK vezuje protein p54 nrb i ona biva zadržana u nukleusnim parapegama. U uslovima stresa, signali koji se primaju određenim receptorima na površini ćelije, pokreću sečenje zarobljenih Ctn RNK i de novo poliadenilaciju na alternativnom mestu. Oslobođeni transkripti se eksportuju u citplazmu i translatiraju u katjonski transporter koji ćeliju snabdeva prekursorima za NO. Opisana regulacija katjonskog transportera za rezultat ima povećanu proizvodnju NO kao odgovor na stres. 11

Slika 6. Editovanje invertovanih ponovljenih elemenata Alu i LINE u nekodirajućim regionima transkripata i potencijalni efekti na njihovu regulaciju ekspresije. a) Editovanje intramolekularnih dvolančanih RNK nastalih sparivanjem invertovanih elemenata Alu i LINE; b) Modulisanje splajsovanja egzonizacija Alu; c) Nuklearna retencija Ctn RNK; d) Degradacija transkripta sa Tudor-SN. Objašnjenje u tekstu. Iako se smatra se da bi nukleusna retencija mogla da reguliše ekspresiju brojnih drugih gena čiji se transkripti hiperedituju, opšta uloga hipereditovanja invertovanih ponovaka u nukleusnoj retenciji transkripata je donekle dovedena u pitanje. Naime, pokazano je da se neke irnk sa formiranim dvolančanim strukturama RNK eksportuju u citoplazmu, asembliraju u polizome i efikasno translatiraju nezavisno od statusa editovanja. 12

Interesantno je da diferencirane ćelije čoveka veliki broj hipereditovanih RNK preferencijalno zadržavaju u parapegama, dok embrionalne matične ćelije u nukleusima nemaju parapege a hipereditovane RNK ekspotuju u citoplazmu gde se translatiraju. Ovo skorašnje otkriće dovelo je do pretpostavke da eksport hipereditovanih RNK u citoplazmu doprinosi održavanju puripotentnosti matičnih ćelija, a nukleusne parapege se smatraju markerima diferencijacije. 2.2.3. Degradacija hipereditovanih transkripta U ćelijama sisara identifikovana je ribonukleaza koja specifično prepoznaje RNK koje sadrže inozine i preferencijalno seče oba lanca dvolančane RNK sa većim brojem baznih parova I-U. Kao potencijalni protein sa ovom funkcijom identifikovana je Tudor stafilokokusna nukleaza (Tudor-SN), koja obavlja različite uloge u metabolizmu irnk u ćelijama sisara, uključujući transkripciju, splajsovanje i degradaciju. Smatra se da bi hipereditovanje invertovanih elemenata Alu i LINE moglo dovesti do degradacije pre-irnk katalizovane sa Tudor-SN, čime bi se kontrolisao nivo ekspresije gena koje nose ponovljene sekvence Alu i LINE (slika 6d). 2.3. Interakcije puteva editovanja RNK i RNK interferencije Skoro paralelno sa otkrićem hipereditovanja ponovljenih elemenata Alu i LINE, otkriveno je postojanje interakcije između procesa editovanja A-u-I i puteva RNK interferancije (crosstalk between editor and silencer). Editovanje A-u-I i RNK interferencija (RNKi) su procesi koji funkcionišu na ćelijskim ili virusnim dvolančanim RNK, a njihovi ključni proteini (proteini ADAR, Drosha, DGCR8, Dicer i TRBP) sadrže dsrbd. Ovi domeni ne prepoznaju specifične sekvence, već dvolančanu strukturu RNK, tako da osnovu interakcije procesa editovanja A-u-I i RNKi predstavlja kompeticija za dvolančani RNK supstrat. Modulaciju obrade i ekspresije malih regulatornih RNK proteini ADAR ostvaruju editovanjem prekursora malih regulatornih RNK, dok se protein ADAR ostvaruje i dodatne funkacije u regulaciji RNKi koje su nezavisne od njegove dezaminazne aktivnosti. Znajući da mali regulatorni molekuli RNK regulišu veliki broj ciljnih irnk, editovanje njihovih dvolančanih prekursora ukazuje na novi mehanizam kojim proteini ADAR utiču na globalnu ekspresiju gena. 2.3.1. Efekat editovanja A-u-I na put sirnk RNKi može biti indukovana dugim dvolančanim molekulima RNK koji su supstrat za Dicer (slika 7). Nastaju male interferirajuće (sirnk), koje pokreću endonukleolitičku degradaciju ciljnih RNK ili epigenetičko utišavanje ciljnih sekvenci u genomau. Interakcije editovanja A-u-I i RNKi posredovane sa sirnk ostvaruju se na dva načina. (1) Dvolančani prekursor sirnk može biti suspstrat za protein ADAR i nakon editovanja postati otporniji na delovanje Dicera, čime se smanjuje količina stvorenih zrelih sirnk. (2) Supresija sirnk sa ADARp150 ostvaruje se čvrstim vezivanjem ADARp150 za sirnk, što smanjuje efektivnu koncentraciju sirnk. Ekekti oba mehanizma su smanjenje efikasnosti RNKi posredovane sa sirnk. Duge dvolančane RNK koje su supstart za Dicer predstavljaju i idealne supstrate za proteine ADAR. U takvim molekulima RNK ADAR može nespecifično editovati više od 50% A (slika 7a). Uvođenje velikog broja pogrešnih baznih parova I-U menja strukturu dvolančane RNK, čineći je "otpornijom" na delovanje Dicera. Rezultat je stvaranje nefunkcionalnih ili manjeg broja sirnk, i 13

posledično suprimiranje RNKi. Pored navedenog, editovana dvolančana RNK može postati supstrat za TudorSN, usled čega se opet smanjuje produkcija sirnk Slika 7. Efekti editovanja A-u-I na RNK interferenciju posredovanu sa sirnk. a) Duga dvolančana RNK, kao što je na primer virusna RNK, efikasno se i nespecifično edituje sa ADAR, što vodi do inhibicije RNK interferencije i degradacije editovane dvolančane RNK sa Tudor-SN. b) ADARp150 se čvrsto vezuje za male interferirajuće RNK (sirnk), a da ih pri tome ne edituje. Na taj način smanjuje se efektivna koncentracija sirnk i efikasnost RNK interferencije. Potvrda ovog modela interakcije editovanja A-u-I i RNKi dobijena je reverzijom fenotipa izmenjene hemotaksije (sposobnosti traženja ili izbegavanja određene supstance) kod C. elegans. Soj C. elegans sa homozigotnim delecijama gena adar-1 i adar-2 ispoljava defekte u hemotaksiji, a reverzija se postiže kod onih jedinki koji imaju defektnu RNKi mašineriju. Ovi podaci ukazuju da je fenotip izmenjene hemotaksije kod C. elegans rezultat hiperaktivnosti puta RNKi, koji je u normalnim uslovima suprimiran aktivnošću enzma ADAR. Kod divljih sojeva C. elegans, ekspresija gena koji kontrolišu hemotaksiju je pod kontrolom ravnoteže između editovanja A-u-I i RNKi, procesa koji deluju na dvolančane RNK formirane u transkriptima ovih gena. Još jedan primer antagonističkih efekata editovanja RNK i RNKi kod C. elegans je sprečavanje utišavanja transgena sa invetovanim ponovljenim sekvencama putem RNKi. Utišavanje ovakvih transgena sprečeno je editovanjem dvolančanih RNK nastalih sparivanjem invetovanih ponovljenih sekvenci. 14

Pored toga što su enzimi ADAR u kompeticiji sa Dicerom za dvolančane RNK supstrate, izoforma ADARp150 se čvrsto vezuje za obrađene dvolančane sirnk, smanjujući njihovu efektivnu koncentraciju u citoplazmi, a time i efikasnost RNKi (slika 7b). U ovom slučaju ADARp150 ne edituje sirnk, tako da je ova njegova funkcija nezavisna od dezaminazne aktivnosti. Ovaj model interakcije ADAR i RNKi potvrđuju rezultati eksperimenta u kome su mišu injecirane nespecifične sirnk u velikoj dozi. Nakon toga uočena je indukacija ekspresije ADAR, što ukazuje da je ADAR sastavni deo ćelijskog mehanizma koji se javlja kao odgovor na sirnk. Endogeni molekuli sirnk koji bi mogli biti regulisani sa ADARp150 još uvek nisu identifikovani, a sličan efekat proteini ADAR bi mogli imati na pirnk. ADAR je ćelijski faktor koji ograničava potencijal sirnk u ćelijama sisara, smanjenjem efektivne koncentracije sirnk i sprečavanjem njene inkorporacije u kompleks RISC. U prilog ovome govori podatak da je utišavanje invazivnih nukleinskih kiselina (transpozona, virusne RNK i transgena) sa sirnk značajno efikasnije kod organizama koji nemaju ADAR sistem, kao što su biljke i gljive. Kod ovih organizama RNKi predstavlja jedini odbrambeni mehanizam protiv invazije transpozona i virusa. Smatra se da je ADAR sistem mogao evoluirati kao protivtežnja RNKi kod organizama koji su razvili savršeniji imunski sistem i drugačije mehanizme za odabranu od transpozona. 2.3.2. Efekat editovanja A-u-I na put mirnk MikroRNK (mirnk) su male regulatorne RNK kodirane eukariotskim genomom, koje post-transkripciono regulišu ekspresiju gena putem RNKi. S obzirom da ne moraju biti perfektno komplementarne ciljnim molekulima RNK, jedna mirnk može regulisati veliki broj irnk, a jedna irnk može biti regulisana sa većim brojem mirnk. Geni za mirnk se prepisuju u primarnu mirnk (pri-mirnk), koja formira strukturu drška-petlja (slike 7a). Kompleks Drosha-DGCR8 endonukleolitički seče pri-mirnk, čime nastaje prekursor mirnk (pre-mirnk) koji se transportuje u citoplazmu. Pre-miRNK je u citoplazmi supstrat za kompleks Dicer-TRBP, koji endonukleolitičkim sečenjem stvara dvolančanu mirnk dugačku oko 22 bp. Dvolančana mirnk stupa u interkciju sa nekim od proteina Argonaut, formirajući utišavajući kompleks RISC, u okviru koga se dešava selekcija aktivnog lanca mirnk (lanca "vodiča"), dok drugi lanac (lanac putnik ) biva degradovan. MikroRNK usmerava kompleks RISC ka ciljnom mestu, obično 3'-UTR-u određene irnk, dovodeći do translacione represije i destabilizacije irnk, ili endonukleolitičke degradacije. Transkripcija gena za mirnk je obično kontrolisana promotorima drugih gena, tako da se modulacija obrade mirnk smatra jednim od glavnih načina za regulaciju nivoa mirnk u ćeliji. Editovanje A-u-I je, upravo, jedan od procesa koji bi moduliše biogenezu mirnk. Uočeno je kod mnogih primarnih RNK (pri-mirnk), a postoje i in vitro dokazi za editovanje prekursora mirnk (pre-mirnk). Sistematična pretraživanja editovanja pokazuju da se oko 6% pri-mirnk kod čoveka edituje, dok in vitro ispitivanja editovanja nasumično odabranih pri-mirnk ukazuje da bi čak 50% pri-mirnk moglo biti specifično editovano sa ADAR. 15

Slika 8. Efekti editovanja A-u-I u nekodirajućim transkriptima. a) Biogenza mirnk; b) Editovanje primarne mirna (pri-mirnk) može suprimirati ili pojačati njenu obradu sa Drosha. Pri-miRNK čija je obrada sa Drosha suprimirana, može dalje podleći degradaciji sa endonukleazom Tudor-SN; c) Ako editovanje pri-mirnk na utiče na obradu sa Drosha, ili ako je editovana buduća mirnk, takva pre-mirnk odlazi u citoplazmu, gde njena obrada sa Dicerom može biti promenjena. d) Ukoliko editovanje nije uticalo na obradu pre-mirnk nastaće zrela editovana mirnk koja može imati promenjen afinitet za ciljne irnk ili može delovati na novu grupu ciljnih RNK. Editovanje mirnk može dovesti i do promene izbora lanca putnika, i time opet do promene ciljnih molekula RNK. Editovanje pri-mirnk može imati značajne posledice na biogenezu i ekspresiju mirnk, s obzirom da kratki i neperfektni dvolančani regioni pri- i pre-mirnk dozvoljavaju enzimima ADAR da se uključe u put biogeneze mirnk. Editovanje sa ADAR može uticati na obradu mirnk inhibicijom endonukleolitičkog sečenja sa Drosha ili Dicerom (slika 8, b i c), što dovodi do smanjenja nivoa zrelih mirnk. Hipereditovana pri-mirnk se dalje degraduje sa Tudor-SN (slika 8b). Ukoliko obrada mirnk nije narušena editovanjem A-u-I, eksprimira se zrela mirnk koja ima A-u-I supstitucije, odnosno editovana zrela mirnk (slika 8d). Editovana mirnk može imati promenjen afinitet za ciljne irnk ili može utišati set gena koji je različit u odnosu na set koji se utišava needitovanim parnjakom. Setovi ciljnih irnk molekula se naročito razlikuju ukoliko je editovanje izvršeno u regionu "semena" mirnk, koji je ključan za prepoznavanje ciljne irnk. Selekcija aktivnog lanca mirnk bazirana je na termodinamičkoj stabilnosti 5'-kraja dvolančane mirnk, čija lokalna stabilnost može biti izmanjena 16

editovanjem. Takve izmene mogu uticati da za aktivni lanac bude izabran lanac putnik, koji deluje na različitu grupu ciljnih irnk. Iako još uvek nisu opisani takvi primeri, editovanje A-u-I bi moglo uticati i na supresiju transporta pre-mirnk iz nukleusa u citoplazmu. 3'-UTR-ovi irnk često podležu editovanju. Pokazano je da promena genomskog A u G u 3'-UTR-u dovodi do stvaranja novog ciljnog mesta za mirnk, tako da je moguće da editovanje 3'-UTR-ova može pojačati ili reprimirati utišavanje specifične irnk. Slično, editovanje može destabilizovati sekundarnu strukturu u 3'-UTR-u, dozvoljavajući kompleksu RISC da stupi u interakciju sa prethodno nedostupnim ciljnim mestom. Kroz sve ove mehanizme, A-u-I editovanje ima potencijal da brzo promeni nivo ekspresije gena kao odgovor na neki stimulus. Nedavno je opisana uloga ADAR1 u obradi mirnk koja je nezavisna od njegove uloge u editovanju RNK. Naime, pokazano je da ADAR1 formira kompleks sa Dicerom kroz direktne proteinprotein interakcije. ADAR1 povećava maksimalnu brzinu sečenja pre-mirnk sa Dicerom i olakšava interakciju mirnk sa kompleksom RISC. ADAR1 "razlikuje" svoje funkcije u editovanju RNK i RNKi formiranjem ADAR1/ADAR1 homodimera ili ADAR1/Dicer heterodimera, redom. Kod embriona Adar1 knockout miševa, koji imaju letalan fenotip, ekspresija mirnk je globalno inhibirana, što dovodi do poremećene ekspresije velikog broja ciljnih gena i verovatno doprinosi letalnom fenotipu. 3. REGULACIJA EDITOVANJA A-U-I Specifični molekularni mehanizmi koji regulišu prostorni i vremenski nivo editovanja A-u-I su uglavnom nepoznati. Prisustvo irnk za ADAR proteine obično nije u korelaciji sa aktinošću proteina ADAR u ćelijama, zbog čega se smata do postoji složena regulacija ovog procesa na posttranskripcionom i post-translacionom nivou. Ona uključuje alternativno splajsovanje (izoforme ADAR i ADARB1 se razlikuju u lokalizaciji, enzimskoj aktivnosti i/ili prepoznavanju ciljnih irnk), formiranje heterodimera sa ADARB2 i sa drugim partner proteinima (FMR1), regulaciju na nivou individualnih ciljnih irnk (kompeticija i koregulacija sa splajsovanem), post-translacione modifikacije (SUMOilacija ADAR smanjuje editaznu aktivost) i regulaciju kroz lokalizaciju ADAR proteina u nukleusu. 4. FIZIOLOŠKA ULOGA EDITOVANJA A-U-I Fenotipske promene opisane kod različitih model organizama sa mutacijama u genima za ADARs, ukazuju da njihova inaktivacija ima značajne fiziološke posledice. D. melanogaster sa homozigotnom delecijom dadar ispoljava promene vezane za centralni nervni sistem, kao što su gubitak koordinacije kretanja i neurodegeneracija zavisna od starosti. Sojevi C. elegans sa homozigotnom delecijom oba gena za ADARs, c.e.adar-1 i c.e.adar-2, imaju poremećaj hemotaksije. Knockout miš za Adar2 umire nekoliko nedelja nakon rođenja. Karakterišu ga epileptički napadi, vezani za povećan influks jona Ca 2+ uzrokovanog needitovanim mestom Q/R u irnk za GluR-B, usled čega dolazi do umiranja neurona. Inaktivacija Adar1 kod miša je letalna tokom embrionalnog razvića, usled poremećene eritropoeze i sveprisutne apoptoze. 17

4.1. Editovanje A-u-I i centralni nervni sistem Tokom evolucije kičmenjaka došlo je do značajnog povećanja zastupljenosti editovanja A-u-I, naročito u nervnom sistemu, tako da je fenomen editovanih i višestruko editovanih transkripata najčešći u nervnom sistemu čoveka. Šatviše, poređenjem zastupljenosti editovanja u različitim tkivima čoveka pokazano je da je ono retko u krvi, mišićima i pankreasu (1%), da je zastupljeno sa 8,2% u prostati, 12,8% u timusu, i generalno je tri puta češće u moždanom u odnosu na ostala tkiva. Kroz modifikacije transkripata koji kodiraju proteine uključene u brzu transmisiju nervnog impulsa, kao što su ligandzavisni jonski kanali, editovanje RNK omogućava da informacija iz sredine moduliše genetičku i epigenetičku informaciju tokom razvića i funkcionisanja nervnog sistema. različitom regulacijom postiže se da editovanjem RNK bude obuhvaćeno 0 do 100% populacije transkripata, kao i da ono bude prostorno i vremenski kontrolisano. Sa druge strane, mutacije u genomu fiksiraju heterogenost molekula na tačno 50%, ili heterogenost potpuno izostaje. Znači, za razliku od mutacija u molekulu DNK, editovanje A-u-I obično ostavlja proporciju originalnih transkripata, što omogućava stvaranje nove funkcije bez uništavanja originalne, koja može biti neophodna za preživljavanje. Na primer, kombinatorna editovanja subjedinice GluR-B i receptora 5-HT2C stvara veliki broj editovanih izoformi koje su različito distribuirane u različitim regionima mozga, doprinoseći tako složenoj regulaciji brojnih i funkcionalno različitih produkata istog gena. Takođe, editovanje subjedinica receptora AMPA, receptora 5-HT2C i GABA je regulisano tokom razvića. Editovanje transkripata u mozgu je razvojno regulisano i generalni trend jeste porast efikasnosti editovanja supstrata, kao što su transkripti za subjedinice, 5-HT2CR, α3 subjedinica GABAa receptora i sam transkript za ADARB1. Needitovane izoforme proteina bitne su za normalni razviće mozga, dok su editovane izoforme potrebne za normalno funkcionisanje adultnog mozga. Diverzifikacija proteoma u CNS-u editovanjem A-u-I Triptofan hidroksliaza 2 (TPH2) katalizuje prvi korak u sintezi serotonina u mozgu, i predstavlja rate-limiting enzim za njegovu sintezu. Dve alternativno splajsovne forme TPH2 transkripta u mozgu čoveka (TPH2A i TPH2B) se ekstenzivno edituju, što omogućava sintezu velikog broj proteinskih izoformi koje se razlikuju po katalitičkoj aktivnosti i, posledično, fino podešavanje sinteze serotonina u CNS-u. Generalno, editovane forme imaju manju enzimsku aktivnost. Familija proteina Hu su RNK-vezivni proteini uključeni u post-transkripcionu regulaciju ekspresije gena (transport, stabilnost ili translaciju irnk). Proteini HuB i HuD (kodirani genima ELAVL2 i ELAVL4, redom) imaju važnu ulogu u diferencijaciji i plastičnosti neurona. Transkripti ELAVL2 i ELAVL4 podležu editovanju specifičnih A u regionima koji kodiraju RNK-vezivne domene RRM, što verovatno ima posledice na njihove interakcije sa transkriptomom u neuronima. Protein NOVA1 se specifično eksprimira u neuronima gde reguliše alternativno splajsovanje preko 700 egzona gena čiji su proteini uključeni u sinaptičke funkcije i rast aksona. Editovanje specifično za mesto prevodi kodon za Ser na poziciji 383 u kodon za Gly u okviru nestrukturisanog regiona proteina između dva RNK-vezivna domena KH. Iako ovaj region NOVA1 pokazuje mali stepen evolucione očuvanosti, mesto editovanja je visoko očuvano među amniotama. Editovanje ne menja efikasnost NOVA1 u pogledu regulacije alternativnog splajsovanja, već utiče na njegovu stabinost editovana izoforma ima duži poluživot usled smanjene ostetljivosti na degradaciju proteazomom, i time globalno 18

veću aktivnost. Ovaj primer pokazuje da se proteinske izoforme koje imaju iste katalitičke osobine ili iste osobine u pogledu vezivanja za supstrat, mogu biti funkcionalno različite ako su različito regulisane. CyFip2 protein je deo kompleksa koji reguliše nukleaciju aktina i uključen je u održavanju sinaptičke plastičnosti. ADARB1 editovanje pre-irnk za CyFip2 dovodi do supstitucije lizina (K) na poziciji 320 u glutaminsku kiselinu (E). Biološki značaj ovog editovanja za sada nije poznat. Filamin A i filamin B su glavni regulatori ortogonalnog grananja aktinskih filamenata, učestvuju u signalizaciji u ćeliji, a filamin A je bitan i za pozicioniranje receptora na površini ćelije. Editovanje pre-irnk za filamin A i filamin B dovodi do supstitucije glutamina (Q) na poziciji 2341 u arginin (R). Zamena aminokiselina se dešava u regionu proteina koji nije uključen u interakcije sa aktinom, već sa brojim drugim proteinima. Pretpostavlja se da editovanja pre-irnk za filamine menja njihove interakcije sa brojnim proteinima, što bi u neuronima moglo uticati na organizaciju receptora na sinaptičkoj membrani i na sinaptičku transmisiju. 4.2. Hipereditovanje i pluripotentnost 4.3. Uloga editovanja RNK u urođenom imunskom sistemu Mnogi virusi sadrže RNK genome, ili replikuju svoje genome preko intermedijera RNK, koji su obično u dvolančanoj formi. Duge dvolančane RNK se retko produkuju endogeno u ćeliji, a mnogi ćelijski sistemi ih brzo prepoznaju. Hipereditovanje ovakvih dvolančanih RNK sa ADAR, potencijalno pokreće njihovu degradaciju nukleazom Tudor-SN (slika 6a). Virusna RNK izolovana iz mozga bolesnika sa rubeolom pokazuje veliki broj konverzija U-u-C i A-u-G, što je u skladu sa hipereditovanjem kako sense, tako i antisense lanca genoma virusa. S obzirom da je reč o citoplazmatičnom virusu, ovo editovanje je katalizovano formom ADARp150 koja se eksprimira sa interferon inducibilnog promotora, što može biti odgovor na virusnu infekciju. Interesantan izuzetak je virus Hepatitis delta, koji koristi editovanje kao prednost da bi stop kodon (UGA) editovao u kodon za triptofan (UGG), što za rezultat ima sintezu dužeg virusnog antigena. Drugim rečima, virus koristi mašineriju za editovanje domaćina kako bi obavio esencijalan korak u svom životnom ciklusu. Nedavno otkriće interferon inducibilnih mirnk, čiji su targeti virusne RNK, ukazuje na mogućnost kooperativne interkacije između mirnk i editovanja RNK u imunskom odgovoru. Sa druge strane, mir122, koja se eksprimira u jetri, olakšava replikaciju hepatitis C virusa. Iako nije poznato da li mir122 podleže editovanju, povećanje citoplazmatičnog ADAR bi moglo za rezultat imati editovanje drugih pre-mirnk, i time usporiti replikaciju virusnog genoma. 5. EDITOVANJE A-U-I I BOLESTI ČOVEKA Heterozigotne mutacije u genu ADAR1, koje se nasleđuju autozomno dominantno, dovode do poremećaja pigmentacije kože (dyschromatosis symmetrica hereditaria). Poremećaji u editovanju RNK vezuju se i za bolesti centralnog nervnog sistema i maligne bolesti. Smatra se da smanjenje efikasnosti editovanja mesta Q/R u irnk za GluR-B dovodi do smrti motoneurona kod bolesnika sa sporadičnom amiotrofičnom lateralnom sklerozom, do apoptotoze neurona prilikom ishemije uzrokovane srčanim udarom ili poremećajem cirkulacije u mozgu, a moglo bi biti povezano i sa epilepsijom. Postoje indikacije da je imbalans u editovanju RNK vezan za razne neuropsihijatrijske bolesti. Pokazano je da je 19