PowerPoint Presentation

Транскрипт

1 Enzimi

2 Biohemijske reakcije su reakcije koje se odvijaju u živim organizmima. Poznavanje ovih pojava preduslov su za razumjevanje procesa koji se odvijaju in vivo. Kinetika kojom opisujemo procese u živom organizmu nešto je jednostavnija od one in vitro, jer na nju ne utiče promjena temperature, pritiska i volumena. U životinjskim organizmima toplokrvnih vrsta, nema promjene tjelesne temperature, jer ti organizmi imaju vlastitu termoregulaciju pa im je tako i tjelesna teperatura stalna. 2

3 Enzimi su biloški vrlo važna grupa proteina. Katalizatori žive stanice. Dva su osnovna preduslova za život: Organizam se mora sam replicirati; Organizam mora katalizirati kemijske reakcije efikasno i selektivno Sve hemijske pretvorbe u organizmu metabolizammoguće su zbog prisustva i djelovanja enzima. Supstratima zovemo spojeve koji su se promijenili djelovanjem enzima. 3

4 Osobine enzima Reverzibilno vežu supstrat Ne mijenjaju smjer hemijske reakcije, nego je ubrzavaju u oba smjera Iz reakcije izlaze hemijski nepromijenjeni (fizikalno se mijenjaju) Enzimska kataliza se može regulirati 4

5 Zatvoreni sistem ne izmjenjuje s okolinom ni materiju ni energiju. Prenos tvari i izmjena energije karakteristike su otvorenih sistema. Zatvoreni sistem u ravnoteži ne treba energiju za svoje održanje niti se energija iz njega može dobiti. Sistem može izvršiti rad samo ako nije u ravnoteži tj kad prema njoj teži. 5

6 Dinamička ravnoteža u smislu klasične termodinamike uspostavlja se tada kada u isto vrijeme nastaje toliko molekula C i D iz A i B koliko nastaje A i B iz C i D. A + B C + D U živim sisitemima možemo govoriti samo o (steady state) stacionarnom (stalnom) stanju u kojem neprestalno pristižu supstance, a izbacuju se reakcijski produkti. Organizam predstavlja ovakav sistem otvoreni sistem i samo kao takav se može razvijati i održavati. Organizam prima hranu i kisik, a izdvajaju se CO 2 i razgradni produkti. 6

7 Šema prikazuje sistem nepovratnih reakcija otvorenih sistema. U živom organizmu opstaju otvoreni sistemi i ireverzibilne reakcije koje teku jedna za drugom. 7

8 Hemijske reakcije u biološkim sistemima se odvijaju uz učešće enzima kao katalizatora. Bez enzimske katalize većina biohemijskih reakcija bila bi tako spora da se reakcije ne bi mogle odvijati u blagim uslovima temperature i pritiska u kojima se odvija život. Ubrzavaju reakcije oko milion puta. Često kataliziraju samo jednu hemijsku reakciju ili skup srodnih reakcija 8

9 Definicija aktivnog mjesta Za katalitičko djelovanje enzima odgovoran je aktivni centar, koji nastaje od određenih dijelova polipeptidnog lanca posebnim nabiranjem. S druge strane aktivno mjesto kod nekog enzima može imati definirano prostorno uređenje prije i poslije vezanja supstrata (slika B), ali može i mijenjati prostorno uređenje nakon povezivanja sa supstratom (slika C). 9

10 Proteinski dio enzimske molekule (apoenzim) treba se povezati s nekom neproteinskom molekulom (kofaktorom) da bi se dostigla katalitička moć. Aktivni oblik enzima naziva se holoenzim Apoenzim + kofaktor = holoenzim 10

11 Enzim se reakcijom ne mijenja pa hemijska ravnoteža ostaje nepromijenjena, jer je određena isključivo termodinamičkim svojstvima S i P. 11

12 Aktivno mjesto predstavlja mali broj aminokiselina smještenih u unutrašnjosti u hidrofobnom dijelu proteinske molekule, čije prostorno uređenje odgovara molekuli supstrata. U trenutku katalitičke promjene supstrat je s enzimom povezan slabim vezama (vodikove, Van der Walsove veze) 12

13 Npr. Stvaranje peptidne veze uključuje povezivanje dviju amino kiselina. U reakcijama tog tipa odvijanje reakcije pospješuje vezanje dva ili više supstrata na aktivno središte u pravom položaju i u pravoj orijentaciji. Enzim osigurava kalup koji okuplja reaktante usmjerene na pravi način da se pospješi stvaranje prijelaznog stanja putem kojeg će stupiti u međusobnu interakciju. 13

14 Enzimi ubrzavaju reakcije i time što mijenjaju konformaciju odgovarajućih supstrata radi približavanja konformaciji prijelaznog stanja. Najjednostavniji model interakcije enzim-supstrat je model»ključ-brava«u kojem supstrat savršeno pristaje u aktivno središte Model inducirane prilagodbe pretpostavlja da vezanje supstrata mijenja konformacije supstrata i enzima. Ta promjena približava supstrat konformaciji prijelaznoga stanja, što ubrzava reakciju. 14

15 Postoje četiri vrste aminokiselina u sastavu nekog enzima: Indiferentne ne učestvuju u aktivnosti enzima. Može ih se odstraniti bez umanjenja enzimske aktivnosti. Konformacijske Može ih se odstraniti, a enzimska aktivnost je i dalje prisutna, međutim enzim postaje vrlo osjetljiv i nepostojan. Pomoćne aminokiseline nemaju kontakt sa supstratom, ali pomažu pokretljivosti aminokiselinama u blizini aktivnog mjesta. Bez njih enzim uglavnom gubi katalitičku moć. Kontaktne aminokiseline izgrađuju aktivno mjesto i u direktnom su kontaktu sa supstratom. Ove aminokiseline osiguravaju katalitičku moć enzima. 15

16 Enzimska kinetika Brzina enzimske reakcije se izražava preko količine supstrata S promijenjenog u produkt P u jedinici vremena. Ova brzina ovisi o koncentraciji enzima [E], koncentraciji supstrata [S] i o afinitetu enzima za supstrat. 16

17 Michaelis i Menten su predložili jednostavan model za razrješenje kinetike enzimski kataliziranih kemijskih reakcija: Enzim se spaja sa supstratom i stvara enzim-supstrat kompleks uz konstantnu brzinu reakcije k 1. Enzim-supstrat kompleks može disocirati na enzim i supstrat uz konstantu brzine k 2 ili nastaviti dalje prema stvaranju produkta uz konstantu brzine k 3. U stacionarnom stanju brzina stvaranja enzim-supstrat kompleksa je jednaka brzini njegovog raspadanja 17

18 Iz dobivene jednadžbe može se izvesti gdje je K M = (k 2 +k 3 )/k 1 nova konstanta, nazvana Michaelisova konstanta. 18

19 K M predstavlja koncentraciju supstrata [S] pri kojoj je pola aktivnih mjesta na enzimu ispunjeno supstratom i kada enzim postiže polovicu maksimalne brzine reakcije. K M konstanta određuje koliki je afinitet enzima za supstrat. Kada je veći K M tada je manji afinitet enzima za supstrat i obrnuto. 19

20 Moduliranje enzimske aktivnosti Faktori koji utiču na enzimsku aktivnost dijele se na: enzimsku reverzibilnost, enzimsku specifičnost, fizičke uslove sredine, utjecaj hemijskih tvari. Reverzibilnost enzimskih aktivnosti. Sve biokemijske reakcije su reverzibilne, a enzimi kataliziraju reakcije u oba smjera i pri tome ubrzavaju uspostavljanje hemijske ravnoteže bez promjene konstante kemijske ravnoteže. 20

21 Specifičnost enzimskih reakcija. Neki enzim katalizira samo jednu određenu hemijsku reakciju ili grupu sličnih reakcija, a specifičnost prema supstratu je uglavnom potpuna, tolika da je potrebno zadovoljiti i stereospecifičnost. Enzimi se uglavnom dijele prema specifičnosti enzimskih reakcija u šest velikih grupa: Oksidoreduktaze kataliziraju reakcije oksidacije i redukcije. Transferaze kataliziraju transport hemijskih grupa s molekule na molekulu. Hidrolaze kataliziraju reakcije hidrolize. Liaze kataliziraju transport hemijskih grupa na supstrat uz nastajanje dvostruke veze. Izomeraze kataliziraju međumolekularno preuređenje. Ligaze kataliziraju reakcije sinteze i nastajanje kemijskih veza C-C, C-O, C-S, C-N. 21

22 Inhibitori enzimske aktivnosti djeluju na vrlo različite načine. Ireverzibilni inhibitori trajno denaturiraju enzim i prekidaju njegovu aktivnost. To su uglavnom kemijske tvari koje denaturiraju proteinski dio enzima i nemaju neki poseban značaj u biohemiji. Reverzibilni inhibitori utječu na enzimsku kinetiku i mogu čak zaustaviti kataliziranu reakciju, ali ova inhibicija može biti kontrolirana. Interes za reverzibilnim inhibitorima je vrlo velik, jer omogućavaju mijenjanje enzimske aktivnosti nekog enzima u datom trenutku što omogućava mnoge praktične primjene. 22

23 Razlikuju se dva tipa inhibitora: kompetitivni i nekompetitivni. Kompetitivni inhibitor je neki hemijski spoj po strukturi sličan supstratu koji se može smjestiti u aktivno mjesto enzima. Nekompetitivni inhibitor se ne veže na aktivno mjesto supstrata i nema natjecanja između supstrata i inhibitora. Inhibitor se veže izvan aktivnog mjesta i afinitet enzima za supstrat nije promijenjen. U ovakvim uvjetima inhibitor se može vezati na enzim-supstrat kompleks, kao što se i supstrat može vezati na enzim-inhibitor kompleks (na enzimu mogu istovremeno biti vezani i inhibitor i supstrat). 23

24 ACIDOBAZNA RAVNOTEŽA 24

25 Organizam je vodena sredina u kojoj su enzimski sistemi djelotvorni samo kod optimalne koncentracije hidrogenovih iona i već samo mala odstupanja mogu dovesti do značajnih promjena u njihovoj aktivnosti.

26 Hidrogenovi ioni se neprekidno oslobđaju i/ili vežu tokom mnogobrojnih fizioloških procesa. Živi organizmi zahtijevaju specifčni i konstantni ph u svim tjelesnim tekćinama održavajući biomolekule u njihovom optimalnom ionskom stanju.

27 Gotovo svaki proces koji se dešava u živom sisitemu je ovisan o ph: male promjene u ph izazivaju velike promjene u brzini procesa. Enzimi koji kataliziraju stanične reakcije i brojne molekule na koje oni djeluju, sadrže jonizirajuće grupe sa karakterističnim pka vrijednostima.

28 Npr. karboksilne i protonirane amino grupe aminokiselina i fosfatne grupe nukleotida funkcioniraju kao slabe kiseline, a njihovo jonsko stanje određeno je ph vrijednošću sredine Ćelije i organizmi održavaju specifičan i stalan citosolni ph, obično blizu ph 7, držeći biomolekule u njihovom optimalnom jonskom stanju. Konstantnost ph postiže se primarno biološkim puferima: smjesama slabih kiselina i njihovih konjugiranih baza.

29 Voda je dobro otapalo i za anorganske i za neke organske spojeve u živim sistemima. Pri otapanju može doći do potpunog disociranja soli u ione, a karboksilne kiseline najčešće samo djelomično disociraju. Po topljivosti u vodi razlikuju se hidrofilne (aminokiseline, šećeri, nukleinske kiseline) hidrofobne (masti i lipidi) vrste spojeva.

30 Voda može biti reaktant ili produkt neke hemijske reakcije. Prilikom nastajanja makromolekula - proteina i nukleinskih kiselina, formalno se sastojci povezuju uz odcjepljenje vode. U biohemiji je pojam ph vrlo važan, jer mnogi procesi u živim organizmima jako ovise o koncentraciji H + iona, tj. ph vrijednosti.

31 Citoplazma većine ćelija sadrži visoke koncentracije proteina, koji sadrže mnogo aminokiselina sa funkcionalnim grupama koje su slabe kiseline ili slabe baze. Nukleotidi kao što su ATP i brojni drugi niskomolekularni metaboliti, sadrže jonizirajuće grupe koje mogu doprinijeti puferskom kapacitetu citoplazme. Neke visokospecijalizirane organele i izvanstanični prostori imaju visoke koncentracije spojeva koji doprinose puferskom kapacitetu: organske kiseline puferiraju vakuole biljnih stanica; amonijak puferira urin itd.

32 U ekstracelularnom prostoru i krvnoj plazmi ph je jednak 7.4, tu je koncentracija H + iona stalna i normalan raspon je između ph = Neke vanstanične tekućine imaju ph vrijednosti koje mogu znatno odstupati: želučani sok (ph ), sadržaj tankog crijeva (ph oko 8), urin (ph oko 5).

33 Acido - bazna ravnoteža (acido-bazna homeostaza) je dio humane fiziološke homeostaze koja se tiče jednakog odnosa između kiselina i baza, drugim riječima, održavanju određene ph vrjednosti. Ljudski organizam je ekstremno osjetljiv na promjene ph vrijednosti, pa prema tome posjeduje snažne mehanizme održavanja ph vrijednosti u uskim granicama. Većim promjenama ph vrijednosti, proteini se denaturišu, enzimi gube svoje katalizatorske sposobnosti, što vodi ka letalnom ishodu. 33

34 Henderson-Hasselbalch-ova jednačina je vrlo praktična za izračunavanje ph vrijednosti koje se uspostavljaju u smjesama soli i kiselina. Puferi imaju osobinu da vežu H + -ione (i OH - ione) i tako ublažavaju promjene ph koje nastaju dodatkom kiselina, odnosno baza. Kao puferske smjese općenito služe slabe kiseline ili slabe baze u smjesi sa svojim solima. Njihovo pufersko djelovanje najbolje je u području pk vrijednosti.

35 Disociranje kiselih i baznih grupa aminokiselina podložno je zakonu o djelovanju masa jednako kao i disociranje slabih kiselina i baza. HA H + + A - Svaka skupina ima svoju konstantu disociranja K, kojoj se negativni logaritam označava kao pk vrijednost. Henderson-Hasselbalchova jednadžba prikazuje samo drugačiji izraz konstante disociranja. Zatim se uzima negativan logaritam s obje strane jednadžbe

36 Zamijeni se ph umjesto - log [H + ] i pk umjesto - log K i dobije se Ako se izvrši inverzija - log [HA]/[A - ], promijenit će se predznak i dobiti Henderson- Hasselbalchova jednadžba

37 Konstantni ph tjelesnih tekućina održava se putem tri puferska sistema Proteinskog Karbonatnog Fosfatnog Kiselinsko-bazna ravnoteža u organizmu, održava se Hemijskim pufeskim sistemima tjelesnih tečnosti - djeluju trenutno Dišni sistem 1-15 min Bubrezi više minuta i dana 37

38 ph rastvora zavisi od koncentracije H + iona. Dodatak ili uklanjane H + iona može imati veliki efekat na ph rastvora. U organizmu ph u ćeliji i ekstracelularnoj tečnosti varira, od ph 8 u pankreasu, do ph 1,5 u želudcu. Iako postoje varijacije u ph vrijednosti između tekućina u tijelu, male su varijacije unutar jednog sistema. Npr. ph krvi varira samo između kod zdravih osoba. 38

39 Normalan ph areterijske krvi je 7.4 i smatra se da osoba ima acidozu kada ph padne ispod ove vrijednosti, a alkalozu kada ph poraste iznad nje. Kada acidobazni poremećaji nastaju zbog primarnih promjena koncentracije bikarbonata u ekstracelularnoj tečnosti, to se označava kao metabolički acidobazni poremećaj. Zbog toga se acidoza uzrokovana primarno smanjenjem koncentracije bikarbonata naziva metabolička acidoza, dok se alkaloza uzrokovana primarnim povećanjem koncentracije bikarbonata naziva metabolička alkaloza. 39

40 Glavni uzroci metaboličke acidoze su: povećano stvaranje metaboličkih kiselina (mliječne kiseline) ili njihovo nedovoljno izlučivanje preko bubrega, dugotrajno gladovanje (stvaranje ketonskih tijela), gubitak baza iz tjelesnih tekućina, uzimanje određenih lijekova (salicilati) ili hrane itd. Acidoza se javlja i u nekim metaboličkim bolestima kao što je npr. diabetes mellitus.

41 Metabolička alkaloza nastaje uslijed dugotrajnog povraćanja (izbacivanje HCl iz želuca), kod uzimanja bazičnih lijekova (natrijevog bikarbonata), trovanja cijanidima, pojačanog lučenja aldosterona...

42 Acidoza uzrokovana porastom koncentracije CO 2 naziva se respiratorna acidoza Respiratorna acidoza je posljedica poremećaja disanja, a često se javlja u patološkim stanjima u kojima su oštećeni dišni centri Alkaloza uzrokovana smanjenjem koncentracije CO 2 naziva se respiratorna alkaloza. Pojačani fizički napori ili emocionalni stres uzrokuju hiperventilaciju koja vodi u respiracijsku alkalozu.

43 Puferski sistemi 43

44 Održavanje dinamičke ravnoteže Održavanje niskih koncentracija H + jona u izvanstaničnoj tekućini vrši se pomoću tri mehanizma Razrjeđivanjem u tjelesnim tekućinama Puferiranjem (umanjuju promjene ali bez aktivne intervencije) Odstranjivanje iz tijela Respiracijskim sistemom Bubrežnim sistemom

45 U vanćelijske (ekstracelularne) pufere spadaju bikarbonatni i amonijačni puferi Unutarćelijski (intracelularni) puferi su proteinski i fosfatni Npr. Ukoliko promjena acido-baznog statusa prevazilazi moć ovih hemijskih puferskih sistema, moguće je korigovati ga promjenama plućne ventilacije u kratkom vremenskom roku. 45

46 Kako organizam održava ph krvi konstantnim? Organizam koristi puferske sisteme kako bi održali ph konstantnim. Puferi su smjese slabe kiseline i njene konjugovane baze, ili slabe baze i njene konjugovane kiseline. Slaba kiselina ne otpušta H + ione lako, kao što ni slaba baza ne prima H + ione onako kako to čini jaka baza. Puferi održavaju ph vežući H + ili OH - ione i na taj način stabiliziraju promjene ph. 46

47 Bikarbonatni pufer Smjesa H 2 CO 3 i njenih soli NaHCO 3, ovaj pufer je važan samo kao vanćelijski pufer Dodatkom jake kiseline Hidrogenovi ioni reaguju s bikarbonatnim ionom stvarajući H 2 CO 3 ph rastvora blago raste 47

48 Bikarbonatni puferski sistem je kvantitativno najznačajniji, CO 2 može da daje karbonatnu kiselinu (H 2 CO 3 ) koja može da disocira na ione vodika i bikarbonatni ion (HCO 3- ). Ova promjena mijenja koncentraciju CO 2, na taj način pomjerajući ravnotežu reakcije prema Le Chatelier-ovom principu, što za posljedicu ima promjenu ph. Npr. ukoliko ph krvi opadne ispod normalne vrjednosti (acidoza), pluća će kompenzirati povećavajući respiraciju, odstranjujući CO 2, sto će reakciju pomjerati udesno. To znači da će manje vodonikovih iona biti slobodno, što za poslijedicu ima porast ph vrjednosti ka normalnoj. Za alkalozu važi obrnuto. 48

49 H 2 CO 3 u krvi je u ravnoteži sa CO 2 49

50 50

51 Bikarbonatni pufer 51

52 Koncentracija H + jona kod zdravog čovjeka je [H + ]=35-45 mmol/l ph = 7,35-7,45 (Ova koncentracija je oko milion puta manja od koncentracije HCO 3 - jona koji je njegov pufeski par, a oko 3,5 miliona puta manja od koncentracije Na + jona.)

53 čarobnih 20/1 7,4 = 6,1 + log[hco 3- ] / [CO 2 ] 7,4 = 6,1 + log 24 mmol/l / 1,2 mmol/l 7,4 = 6,1 + log 20/1 7,4 = 6,1 + 1,3

54 Npr. da se zbog neke plućne bolesti koncentracija CO 2 poveća 2 puta... 6,1 + log 24 mmol/l / 2,4 mmol/l = 6,1 + log 10/1 = 6,1 + 1 = 7,1 Na koji način homeostatski mehanizmi sada rade, kako bi se ph vratio u željeno područje tj. kako bi se željenji odnos koncentracija vratio na 20/1?

55 Ukoliko nije moguća trenutna intervencija tj. ako je ovakvo stanje duže, jedina intervencija je na koncentraciju bikarbonata (preko tjelesnih tekućina i radom bubrega) 6,1 + log 48 mmol/l / 2,4 mmol/l = 6,1 + log 20/1 = 6,1 + 1,3 = 7,4

56 Bubrezi se sporije uključuju, međutim posjeduju nekoliko snažnih mehanizama za kontrolu ph, kontrolom izlučivanja viška kiselina, odnosno baza. U odgovoru na acidozu, tubulske ćelije apsorbuju više bikarbonata (HCO 3- ) iz tubulske tečnosti, dok ćelije sabirnog kanalića luče više hidrogenovih iona i proizvode novi bikarbonat koji se dodaje u cirkulaciju, istovremeno podstiču amonijogenezu, vodeći ka povećanju koncentracije NH 3 pufera. U odgovoru na alkalozu, bubrezi izlučuju više bikarbonata tako što smanjuju količinu hidrogenovih iona koje luče tubularne epitelne ćelije, smanjujući proizvodnju glutamina i amonijaka. 56

57 Fosfatni pufer - smjesa H 2 PO 4 - i HPO 4 2- uz Na + Važan u tubulskoj tekućini bubrega zbog visokih koncentracija fosfata i u staničnoj tekućini. Fosfatni puferski sistem ima maksimalnu efikasnost pri ph bliskom njegovoj pka vrijednosti od 6,86, a odupire se promjeni ph u području između 5,9 i 7,9. 57

58 Proteinski pufer Proteini stanica i plazme ¾ snage hemijskih puferskih sistema Proteinski pufer je najobilniji tjelesni pufer, pogotovo u stanicama. Promjene staničnog ph razmjerne su promjenama izvanstaničnog ph 58

59 Proteinski pufer Plazma i unutarćelijski proteini su moćni puferi Neke aminokiseline imaju slobodne grupe organskih kiselina (slabe kiseline) grupe koje se ponašaju kao slabe baze (npr. amino grupe) Proteinske molekule imaju amfoteran karakter pa se mogu ponašati i kao kiseline i kao baze. 59

60 Kiselinsko bazni balans Molekule koje se rastvaraju u vodi mogu disocirati na nabijene ione. Kiseline povećavaju koncentraciju H + u rastvoru Baze smanjuju koncentraciju H + u rastvoru Ćelijski metabolizam zavisi od enzima, a enzimi su osjetljivi na promjene ph 60

61 Kliničke posljedice debalansa acidobazne ravnoteže mogu biti Slab vaskularni tonus Povećan rizik od aritmije Slabost mišićne strukture Abnormalnosti u sastavu elektrolita Koma...