prof. dr Ivana Novaković TEHNOLOGIJA REKOMBINOVANE DNK I GENETIČKO INŽENJERSTVO TESTOVI HIBRIDIZACIJE, MOLEKULARNA CITOGENETIKA, PCR Primena tehnologi

Транскрипт

1 prof. dr Ivana Novaković TEHNOLOGIJA REKOMBINOVANE DNK I GENETIČKO INŽENJERSTVO TESTOVI HIBRIDIZACIJE, MOLEKULARNA CITOGENETIKA, PCR Primena tehnologije rekombinantne DNK i savremenih molekularnobioloških metoda u medicinskoj genetici omogućila je nove prodore ne samo u oblasti istraživanja humanog genoma već i u praktičnoj dijagnostici i terapiji naslednih i drugih oboljenja. Ove metode nalaze neposrednu primenu u medicini pre svega u domenu monogenskih bolesti, gde direktna ili indirektna detekcija genskih mutacija omogućava postavljanje dijagnoze i davanje preciznog genetičkog saveta obolelom i njegovoj porodici. Od nekoliko hiljada identifikovanih monogenskih bolesti, pomenućemo samo najčešće: cistična fibroza, Dišenova/Bekerova mišićna distrofija, hemofilija, brojni neurološki i metabolički poremećaji itd. Novi standardi u proučavanju multifaktorskih poremećaja, kao što su kardiovaskularne bolesti, dijabetes melitus, maligne bolesti isl., predvidjaju primenu DNK analize i za otkrivanje nasledne sklonosti oboljevanju, kao i za utvrdjivanje genetičkih varijacija i specifičnosti koje dovode do različitog odgovora na terapiju. Pored toga, molekularna genetika se primenjuje i u visoko specifičnim oblastima, kao što su npr. forenzička medicina (najpre ciznija identifikacija osoba pomoću»dnk otiska«tj. DNK profila), i mikrobiologija (dijagnostika infekcije na osnovu prisustva genoma infektivnog agensa u biološkom materijalu). Molekularnogenetičke metode podrazumevaju rad sa naslednim materijalom pre svega DNK, a po potrebi i RNK i proteinima. DNK koja se koristi u ovim postupcima može se izolovati iz svake ćelije sa jedrom, a u medicinskoj praksi najčešće se dobija iz limfocita periferne krvi. Izvor DNK može da bude, po potrebi, i uzorak horionskih resica ili amnionske tečnosti, koren dlake, trag telesnih tečnosti (kap krvi, semena tečnost, pljuvačka) urin, likvor, isl. Procedure su maksimalno pojednostavljene i skraćene primenom komercijalnih»kitova«za prečišćavanje i izolaciju. Izolovana ukupna genomska DNK može da se čuva u vidu vodenog rastvora ( -20 ili 70 0 C) dugo vremena, i da se koristi za različite analize. Primera radi, iz 5ml krvi dobija se materijal za više od sto pojedinačnih analiza. Izolacija RNK je osetljiv postupak zbog velike megućnosti kontaminacije, a obavezno je čuvanje materijala na 70 0 C. Pojam rekombinantne ili rekombinovane DNK označava molekul koji je nastao kombinovanjem dva različita molekula DNK. U tehnologiji rekombinantne DNK postoji pet bitnih faza rada: 1. stvaranje fragmenata DNK, sa ciljem da se u nekom od njih nadje odredjeni gen ili deo molekula DNK, 2.

2 2 ugradjivanje fragmenata DNK u pogodan vektor, što je u stvari rekombinantni deo procesa, 3. uvodjenje vektora u pogodnog domaćina (najčešće E. coli), 4. kultivisanje kompleksa domaćin-vektor na hranljivim podlogama radi dobijanja klonova domaćina, tj. dobijanja brojnih kopija fragmenta DNK ugradjenog u vektor, 5. ubiranje klonova koji sadrže odrdjeni fragment DNK. 1. Do fragmenta DNK se može doći i mehaničkim seckanjem, ali je ovo nasumično pa su dobijeni fragmenti uvek nedefinisani. Ranih sedamdesetih godina je postignut ogroman napredak otkrićem da izvesni enzimi, poreklom od odredjenih bakterijskih sojeva, presecaju DNK na specifičnim mestima nukleotidnih nizova. Ovi enzimi su nazvani restrikcioni enzimi, a njihova uloga u bakterijskoj ćeliji je da isecaju stranu DNK iz genoma bakterije (npr. fag), dok je bakterijska DNK zaštićena od restrikcije metilacijom. Restrikcione endonukleaze prepoznaju specifične, najčešće palindromske, sekvence od 4-8 nukleotida i seku DNK na tačno odredjenom mestu u okviru tih nizova. Mesta preseka se zovu restrikciona mesta. Zahvaljujući komplementarnom karakteru baznog sparivanja u molekulu DNK, restrikcione endonukleaze dovode uvek do prekida oba lanca DNK. Svaka restrikciona endonukleaza označava se prema mikroorganizmu iz koga potiče, a postoji preko 300 vrsta ovih enzima. 2. Kada se molekul DNK iseče pomoću odredjene restrikcione endonukelaze dobijeni fragmenti imaju jednolančane krajeve, koji su»lepljivi«. Na DNK vektora se takodje deluje istim restrikcionim enzimom, a aztim se pomoću enzima ligaze spajaju komplementarni krajevi fragmenta i DNK vektora. Tako dobijeni molekul DNK se naziva rekombinovani ili hibridni molekul. U pomenute svrhe koriste se različiti tipovi vektora, koji svi imaju sposobnos replikacije (umnožavanja) u bakterijskoj ćeliji. Klasični vektori su plazmidi (kružni, dvolančani molekuli DNK koji se nalaze van glavnog hromozoma bakterije i stabilno se nasledjuju), bakteriofagi (virusi koji obavljaju životni ciklus u bakteriji) i kozmidi (plazmidna DNK smeštena u omotač faga). Izbor vektora zavisi od vrste upotrebljenog restrikcionog enzima, veličine fragmenta isl. Od navedenih vektora, najveći fragment može da se klonira u kozmidu (veličine do 50kb kilo baza, tj. hiljada baznih parova). U novije vreme postoje vektori koji omogućavaju ugradnju i kloniranje znatno većih fragmenata DNK, od nekoliko stotina kb, i koji stoga imaju značajnu ulogu u projektu sekvenciranja genoma čoveka. To su npr. YAC (yeast arteficial chromosome) ili BAC (bacterial arteficial chromosome). 3. Vektori se unose u ćeliju domaćina, a to je najčešće E. coli, na više načina: tarnsformacijom, transfekcijom, mikroinjiciranjem. 4. Kompleks domaćin-vektor se umnožava kultivacijom in vitro, u cilju dobijanja klonova koji sadrže odredjene fragmente ispitivane DNK. 5. Za odabiranje klonova sa rekombinovanim fragmentom DNK se koristi čitav niz postupaka. To može da bude selekcija na osnovu promenjenih svojstava rekombinovane bakterije, ili hibridizacija otisaka bakterijskih kolonija sa obeleženim DNK probama. Kloniranjem različitih fragmenata DNK omogućeno je dobijanje genskih, hromozomskih i genomskih biblioteka.

3 3 Dve osnovne metode molekularne genetike, koje se primenjuju i u medicinskoj genetici, su Southern analiza tj. test hibridizacije i PCR metoda. Southern analiza (Southern blotting, test hibridizacije) se zasniva na testu hibridizacije ispitivane DNK sa obeleženom genskom probom (S outhern, 1979.). Prvi korak u ovoj metodi je isecanje genomske DNK na fragmente, korišćenjem restrikcionih enzima koji prepoznaju specifične nukleotidne nizove. Dobijeni restrikcioni fragmenti DNK se u postupku gel-elektroforeze medjusobno razdvajaju, jer se u električnom polju DNK kreće ka pozitivnom polu, pri ćemu se kraći fragmenti kreću brže a duži sporije. Sledi postupak denaturacije tj. razdvajanja dvolančanih molekula DNK na jednolančane strukture, i blotting tj. prenošenje fragmenata DNK sa gela na specijalne nitrocelulozne filtere ili najlonske membrane. Ovako pripremljena DNK se inkubira sa denaturisanom i radioaktivno obeleženom genskom probom, pod tačno definisanim uslovima (temperatura, ph). Genska proba je deo molekula DNK koji se koristi u testu hibridizacije. Izvor genske probe može da bude biblioteka kloniranih segmenata DNK. Takodje, genska proba može da bude tzv. cdnk ili komplementarna DNK, koja se dobija na osnovu molekula RNK, pomoću enzima reverzna transkriptaza. U samom činu hibridizacije genska proba prepoznaje sebi komplementaran segment DNK i sa njim ponovo formira dvolančanu strukturu (renaturacija). Nastali hibrid može da se vizuelizuje autoradiofrafijom. a njegov položaj tj. veličina odredjuje se poredjenjem sa poznatim standardima. Southern analiza je jedna od klasičnih metoda molekularne genetike, medjutim, u rutinskom radu ona pokazuje izvesne nedostatke. Osnovna ograničenja su dužina postupka, koji traje nekoliko dana, i rad sa radioaktivnim obeleživačima. Analogno Southern analizi na principima elektroforeze i blotting-a razvijene su tehnike Northern blotting (DNK proba hibridizuje sa ispitivanim uzorcima RNK) i Western blotting (analiza proteina, pri čemu se obeleženo specifično antitelo spaja sa odgovarajućim proteinom). Najjednostavniji test hibridizacije se vrši pri dot-blot analizi (ukupna genomska DNK iz uzorka se ne iseca, već samo denaturiše i inubira sa DNK probom; rezultat se očitava u vidu tačke većeg ili manjeg intenziteta, odakle i potiče naziv). Test hibridizacije može da se izvede i na hromozomskim odnosno histološkim preparatima; to je hibridizacija in situ. Na preparatima metafaznih hromozoma danas se široko primenjuje hibridizacija sa probama obeleženim fluorescentnim bojama FISH metoda (fluorescentna in situ hibridizacija). FISH metoda može da se primeni i na jerima u interfazi, što je od koristi npr. za brzu detekciju hromozomskih aberacija u prenatalnoj dijagnostici. PCR (polymera se chain reaction) ili reakcija lančane polimerizacije je metod koji omogućava selektivno umnožavanje odredjenog segmenta molekula DNK (Mullis u sar., 1986.). Preduslov za izvodjenje reakcije je poznavanje strukture (sekvence) graničn ih regiona željenog segmenta, i posedovanje sintetskih jednolančanih oligonukleotida - tzv. prajmera, koji su komplementarni ovim regionima. Reakcija se odvija na principu cikličnog ponavljanja replikacije molekula DNK, pri čemu se prajmeri vezuju za matrične niti i služe DNK polimerazi kao početnice za sintezu

4 4 komplementarnih lanaca nukleotida. Svaka faza PCR reakcije je odredjena temperaturom na kojoj se odvija i vremenom trajanja. Ključni korak u razvoju metode označila je izolacija termostabilne DNK polimeraze, koja može da sačuva efikasnost tokom cikličnih temperaturnih promena. Takav enzim dobijen je iz termofilnog bakterijskog soja Thermus aquaticus, i poznat je kao Taq polimeraza. (Sambrook i sar., 1989.) U prvom koraku PCR reakcije vrši se denaturacija uzorka DNK na temperaturi od C. U drugoj fazi - fazi annealing-a ili hibridizacije, par prajmera se specifično vezuje za komplementarne regione DNK, ograničavajuci segment koji treba da bude amplifikovan. Povezivanje prajmera se odvija na temperaturi koja zavisi od njihove sekvence tj redosleda nukleotida, a iznosi C. Izbor optimalne temperature u ovoj fazi je od ključnog značaja za specifičnost PCR reakcije. Treća faza je faza ekstenzije prajmera. Enzim Taq DNK polimeraza vrši sintezu novih (komplementarnih) lanaca nukleotida, koji se nastavljaju na ( produžuju ) prajmere u 5-3 smeru. Prekursorski molekuli za sintezu su slobodni nukleotidi u obliku dezoksinukleozid- trifosfata (dntp), a reakciju katalizuju joni Mg++. Taq polimeraza ostvaruje optimalno dejstvo na 72 0 C, pa je to uobičajena temperatura na kojoj se odvija faza ekstenzije; vreme trajanja je odredjeno dužinom (veličinom) regiona koji se umnožava. Na završetku ove faze dobijaju se dve kopije segmenta DNK koji je ograničen prajmerima. Reakcija se zatim ciklično ponavlja, a u svakom novom ciklusu kao matrice služe i novosintetisani molekuli DNK. Nakon 30 ciklusa željeni segment DNK je umnožen 10 6 puta, što omogućava njegovu vizuelizaciju i analizu nakon gel-elektroforeze i bojenja. METODE MOLEKULARNE BIOLOGIJE U DIREKTNOJ I INDIREKTNOJ DIJAGNOSTICI MONOGENSKIH BOLESTI Kao što je napomenuto, molekularnogenetičke metode imaju primenu pre svega u detekciji monogenskih bolesti, gde je jedan gen (par gena) odgovoran za bolest. U analizi genske mutacije mogu da se koriste dva pristupa: a) direktno otkrivanje i identifikacija genske mutacije i b) indirektno utvrdjivanje postojanja mutiranog gena, na osnovu analize nasledjivanja blisko vezanog geneti~kog markera. Način direktnog otkrivanja genske mutacije zavisi od vrste muatcije. Navešćemo osnovne tipove mutacija i metode za njihovo otkrivanje: - delecije: gubitak gena ili dela gena; detektuju se testom hibridizacije ili PCR metodom (npr. parcijalna delecija gena za distrofin kod Dišenove i Bekerove mišićne distrofije) - duplikacije: dupliranje dela gena; detektuju se testom hibridizacije ili PCR metodom - tačkaste (point) mutacije ili bazne supstitucije: najsuptilnije promene u strukturi gena, pri čemu dolazi samo do zamene jednog para drugim parom baza; postoji više metoda za njihovo otkrivanje: npr. ako mutacija kreira novo retrikciono mesto ili ukida već postojeće, ona može da se otkrije nakon digestije gena sa odgovarajućim restrikcionim enzimom (npr. kod srpaste anemije u 6. kodonu gena za beta -globinski lanac hemoglobina postoji

5 5 zamena A sa T, čime se ukida restrikciono mesto za enzim Mst II); u većini slučajeva mutacija ne utiče na promenu restrikcionog mesta, pa se moraju primeniti druge metode za skrining tačkastih mutacija (SSCP, D heterodupleks analiza, PTT) koje se većinom zasnivaju na promeni migracije mutirane sekvence gena u odnosu na normalnu, pri elektroforezi u poliakrilamidnom (PAA) gelu; bez obzira na primenjenu metodu, u cilju definisanja preciznog mesta i prirode mutacije, analiza se nastavlja sekvenciranjem regiona od interesa. - višestruko umnožavanje tripleta nukleotida tj. ekspanzija trinukleotidnih ponovaka: ovaj tip mutacije se sreće samo kod ljudske vrste (!); u okviru pojedinih gena nalaze se nizovi od po tri nukleotida u većem broju uzastopnih kopija; broj kopija varira i kod zdravih ljudi, a kada on predje odredjenu kritičnu vrednost nastaje muatcija; ovaj tip promene u strukturi gena sreće se kod različitih neuroloških bolesti (npr. ekspanzija CAG ponovaka kod Hantingtonove horeje). Kod indirektne detekcije genskih mutacija ne analizira se sama mutacija, već se u porodici obolelog prati nasledjivanje polimorfnog genskog markera koji je blisko vezan sa odgovornim genom (nalazi se u okviru gena ili u njegovoj blizini). To je tzv. linkage analiza. Kao DNK markeri se koriste polimorfni tj. varijabilni regioni koji se nalaze u naslednoj osnovi i kod zdravih ljudi, a javljaju se u dve ili više različitih formi. Ranije su kao markeri korišćeni varijeteti koji utiču na promenu restrikcionih mesta i dovode do različite dužine restrikcionih fragmenata, a poznati su kao RFLPs (restriction fragments lenght polymorphism). Njih su u velikoj meri zamenili mikrosatelitni markeri, koji predstavljaju različit broj dinukleotidnih ponovaka (najčešće CA) a rasuti su po čitavom genomu. Najaktuelniji tip markera su tzv. SNPs (single nucle otide polymorphisms). Navedeni genski ili DNK markeri su izraz činjenice da je u naslednoj osnovi čoveka svaki nukleotid polimorfan, tj. može da se razlikuje kod različitih osoba, ili na dva homologa hromozoma iste osobe. U okviru indirektne dijagnostike monogenske bolesti najpre se utvrdjuje koju formu odabranog DNK markera poseduje obolela osoba, a zatim se analiziraju varijante markera kod članova porodice i na osnovu toga posredno zaključuje ko od njih poseduje mutirani gen. Prednost indirektnog pristupa je u tome što nije neophodno da se poznaje molekularna priroda mutacije, već samo odgovorni lokus, a nedostatak je što analiza mora da obuhvati više članova porodice. Pored toga, moguće je da u procesu rekombinacije (crossing-over) dodje do razdvajanja izmedju markera i gena sa kojim je blisko vezan. Ds bi se ova mogućnost svela na minimum poželjno je da se koriste unutargenski markeri, ili markeri na rastojanju manjem od 2cM (centi Morgana). Genetičku osnovu i dijagnostiku monogenskih bolesti ilustrovaćemo sa nekoliko tipičnih primera. U grupi autizomno dominantnih poremećaja posebno mesto pripada familijarnoj hiperholesterolemiji (FH), koja je značajna ne samo sa praktičnog stanovišta, kao bolest koja je ozbiljna i podložna lečenju, već i kao izvanredna ilustracija dinamične povezanosti medicine i genetike. FH je autozomno dominantno nasledan poremećaj, od koga boluje 1 od 500 osoba, a sreće se kod oko 5% bolesnika sa IM mladjih od 60 godina. Za bolest su karakteristične visoke vrednosti holesterola i lipoproteina male gustine (LDL, low-density lipoprotein), a najznačajnije manifestacije su rani početak

6 6 ateroskleroze i koronarne bolesti. Najčešće su obolele osobe heterozigoti, tj. poseduju jedan mutirani i jedan normalan alel odgovornog gena (genotip Aa). U tom slučaju potomci obolelog imaju 50% rizik da naslede mutaciju, pa time i oboljenje, i treba da budu ispitani u tom smislu. Kako se hiperholesterolemija javlja još u detinjstvu, rano otkrivanje poremećaja omogućava primenu adekvatne terapije i načina ishrane u najranijoj fazi. Homozigoti za mutaciju (genotip AA) imaju vrlo visoke vrednosti holesterola, kod njih se često kardiovaskularni poremećaji javljaju još u periodu detinjstva, i najčešće umiru od infarkta miokarda u drugoj ili trećoj deceniji života.obzirom da bolest nije retka, može se očekivati relativno često sklapanje braka izmedju heterozigota (1/500x1/500 = 1/ ), dok je frekvenca homozigota oko 1/ Gen za LDL receptor se nalazi na hromozomu #19, zauzima 45 kb (kilo baza = hiljada baznih parova) i sastoji se od 18 kodirajućih regiona, egzona. Funkcionalni prepis gena je irnk od 5,3 kb. Gen za LDL receptor može da bude pogodjen različitim tipovima mutacija, koje dovode do poremećaja funkcije proteina. Do sada je opisano vrsta mutacija ovog gena, što ukazuje na veliku alelsku heterogenost FH. Većinom su u pitanju mutacije tipične samo za jednu porodicu, koje se stoga nazivaju»privatne mutacije«. I osobe koje imaju mutaciju na oba alela, označene klasično kao homozigoti, najčešće nose dve različite mutacije pa su zapravo tzv. kompleksni heterozigoti. Zanimljivo je da u pojedinim populacijama postoje predominantni tipovi mutacija, što ukazuje na zajedničkog pretka odnosno»efekat osnivača«. Tako se velika delecija proksimalnog (5 ) kraja gena nalazi kod 60% obolelih iz francuskog dela Kanade, dok 35% finskih bolesnika ima deleciju od 9,5 kb u distalnom - 3 regionu. Nonsens (besmislena) mutacija u egzonu 14 karakteristična je za libanske hrišćane, a delecija od 3 bazna para u egzonu 4 za Aškenazi Jevreje litvanskog porekla. Podela genskih mutacija na pet klasa ima direktne veze sa tipom oštećenja funkcije LDL receptora, pa samim tim i sa ćelijskim i kliničkim fenotipom. U načelu, bolesnici kod kojih je receptor prisutan, ali je smanjene funkcije, imaće niže vrednosti LDL-holesterola, blažu kliničku sliku i bolji odgovor na terapiju, u poredjenju sa bolesnicima kod kojih je receptor potpuno nefunkcionalan ili odsutan. Ipak, zapaženo je da u jednoj porodici, u kojoj svi oboleli nose isti tip mutacije, mogu da postoje značajne varijacije u kliničkom toku bolesti. To se može objasniti efektima koje imaju drugi geni modifikatori, ili faktori sredine. Ilustrativan je slučaj porodice u kojoj jedna trećina heterozigota sa dokazanom nutacijom ima normalne vrdenosti LDL. Primenom savremenih metoda molekularne genetike moguće je izvršiti direktnu ili indirektnu detekciju mutacija u genu za LDL receptor. Direktna analiza omogućava identifikaciju mutacije, samim tim potvrdu dijagnoze kod obolelih i skrining medju ostalim članovima porodice, kao i prenatalnu dijagnostiku FH. Medjutim, zbog veličine gena za LDL receptor, kao i zbog velike alelske heterogenosti mutacija, direktna analiza nije jednostavna. Indirektna dijagnostika ili linkage analiza podrazumeva praćenje nasledjivanja polimorfnih DNK markera, koji se nalaze u okviru ili u blizini gena odgovornog za bolest. Ovaj tip studije je uvek porodični. Najpre se utvrdi koju formu markera poseduje obolela osoba ili osobe, a zatim se praćenjem nasledjivanja tog markera u porodici posredno indirektno zaključuje da li je

7 7 pojedini član porodice nasledio mutaciju ili nije. Ova analiza se može primeniti i u svrhu prenatalne dijagnostike. U razvijenim zemljama se kod FH primenjuje ciljani skrining medju rodjacima obolelog, što omogućava vrlo ranu primenu terapije i preventivnih mera. Kod oboljenja koja su posledica recesivnih mutacija vezanih za X hromozom oboleli su gotovo isključivo osobe muškog pola, dok su žene uglavnom zdravi prenosioci bolesti na potomstvo. Molekularno - genetički testovi imaju svoje mesto u postavljanju dijagnoze bolesti, prenatalnoj dijagnostici i otkrivanju žena - prenosilaca mutacije. Princip primene ovih testova objasnićemo na primeru Dišenove i Bekerove mišićne distrofije. Obe bolesti su posledica recesivne mutacije gena koji kodira citoskeletni protein distrofin, a nalazi se na kratkom kraku X hromozoma (Xp21). Mutacije koje dovod e do prestanka sinteze distrofina leže u osnovi DMD, dok su kod BMD mutacije takve prirode da je sinteza proteina očuvana, ali je on kvalitativno i/ili kvantitativno izmenjen. Gen za distrofin može biti pogodjen različitim vrstama mutacija, a najčešće su intragenske (parcijalne) delecije, koje predstavljaju gubitak odredjenog segmenta gena i čine % svih otkrivenih mutacija. Kod 6-14% slučajeva nalaze se duplikacije odredjenog regiona, a preostalo su tačkaste (point) mutacije ili mikro delecije. Zbog postojanja hemizigotnosti kod osoba muškog pola delecije gena za distrofin mogu jednostavno da se otkriju. Primenjuje se metoda multiplog PCR, kojom se omogućava analiza egzona koji leže u regionima podložnim deleciji. Egzoni koji leže u deletiranom regionu neće se umnožiti, a njihovo odsustvo se jednostavno otkriva analizom PCR produkata nakon gelelektroforeze. Što je veći broj egzona koji su obuhvaćeni analizom, moguće je preciznije odredjivanje veličine i lokacije delecije. Tačno utvrdjivanje tačaka prekida, uz poznavanje tipa egzon/intron granice, omogućava procenu oštećenja genetičke šifre. Otkrivanje delecije znači ujedno i postavljanje tj. potvrdu dijagnoze DMD/BMD. Pored toga kod BMD, koja se odlikuje velikom fenotipskom varijabilnošću, lokalizacija i obim delecije mogu da doprinesu prognozi toka i težine bolesti. Otkrivanje duplikacija gena za distrofin je složenije, jer je neophodna primena Southern analize ili modifikovane PCR tehnike (kvantitativni PCR sa upotrebom radioaktivno obeleženih nukleotida). Analiza je dodatno otežana podacima o slučajnom rasporedu duplikacija duž gena za distrofin. Kvantitativni PCR omogućava i otkrivanje žena koje duplikacije gena. su heterozigotni nosioci delecije ili Za malim mutacijama treba da se traga ukoliko se ne otkrije ni jedan od velikih rearanžmana u genu. Za sistematsku pretragu gena razvijeno je nekoliko metoda, čiji je cilj utvrdjivanje regiona u kome se mutacija nalazi. U analizu se najčešće koriste amplifikovani segmenti gena tj. PCR produkti. Izvor može biti ne samo genomska DNK, već i cdnk dobijena reverznom transkripcijom odgovarajuće irnk.

8 8 Imajući u vidu sve navedeno, primena genske analize u cilju otkrivanja delecija gena za distrofin se preporučuje kao jedan od prvih koraka u obradi bolesnika sa sumnjom na DMD/BMD, pre sprovodjenja invazivnih i složenih postupaka poput biopsije mišića. Jednom utvrdjena delecija omogućava postavljanje pravilne dijagnoze i davanje adekvatnog genetičkog saveta obolelom i njegovoj porodici. Sa stanovišta davanja adekvatnog genetičkog saveta i prevencije pojave bolesti u potomstvu veoma je značajna primena molekularno-genetičkih testova u otkrivanju žena koje su fenotipski zdravi prenosioci mutacije vezane za X hromozom. U prenatalnoj dijagnostici XVR bolesti neophodno je da se najpre utvrdi pol deteta, za šta je najpouzdanija klasična citogenetička analiza, a moguća je i primena FISH ili PCR metode. Ako je u pitanju plod muškog pola, pristupa se direktnoj ili indirektnoj detekciji mutacije. Indirektna detekcija mutiranog gena se zasniva na analizi nasledjivanja genetičkog markera koji leži u okviru gena ili je blisko vezan za njega. U analizi gena za distrofin najpre je kao genetički marker korišćen polimorfizam dužine restrikcionih fragmenta (RFLPs) u regionu Xp21. Otkrivanje ovog jednostavnog polimorfizma zasniva se na Southern analizi. Danas su u upotrebi mnogo informativniji i pouzdaniji genetički markeri, tzv. mikrosateliti. To su nizovi dinukleotida (najčešće CA) koji se odlikuju izrazitom polimorfnošću dužine, a raspršeni su širom genoma. U okviru samog gena za distrofin kao i u njegovoj blizini otkriveno je više CA mikrosatelitnih polimorfnih regiona, koji se mogu analizirati PCR metodom. Imajući u vidu česte intragenske rekombinacije gena za distrofin, neophodna je njihova kombinovana upotreba da bi se povećala pouzdanost zaključka. Ovaj pristup u analizi gena za distrofin značajan je pre svega radi davanja genetičkog saveta u slučajevima bez velikih genskih mutacija. Takodje se mogu otkriti žene - prenosioci delecije, na osnovu gubitka heterozigotnosti u deletiranom regionu. MOLEKULARNO GENETIČKA ANALIZA POLIGENSKIH BOLESTI Najrasprostranjenije bolesti savremenog čoveka imaju poligensku tj. multifaktorsku osnovu, koja uključuje genetičke faktore predispozicije i činioce iz spoljne sredine. Takav je slučaj sa kardiovaskularnim bolestima, malignitetom, dijabetesom itd. Treba imati na umu da faktori rizika obično obuhvataju poremećeje koji su sami po sebi takodje multifaktorski, što dodatno ukazuje na kompleksnost patofizioloških mehanizama. Zbog sadejstva većeg broja faktora, kod poligenskih poremećaja nije moguća jednostavna primena mendelovih pravila nasledjivanja. Pri davanju genetičkog saveta kod multifaktorskih bolesti uopšte moramo usvojiti nekoliko opštih principa. 1. Rizik od obolevanja je znatno veći za srodnike prvog stepena obolelog nego za dalje rodjake. 2. Najbolji način procene rizika za oboljevanje je empirijski rizik, koji je zapravo rizik oboljevanja zapažen u sličnim porodicama, kod rodjaka u istom stepenu srodstva.

9 9 Empirijski rizik se bazira na prethodnom iskustvu i nije u vezi sa razumevanjem interakcije genetičkih i sredinskih faktora u patogenezi poremećaja. Empirijski rizik predstavlja izračunati prosek na nivou populacije i nije uvek potpuno adekvatan za neku odredjenu konkretnu porodicu. 3. Rizik za oboljevanje se povećava u sledećim slučajevima: kada postoji više od jednog obolelog člana porodice, kada su u pitanju teške forme ili rani početak bolesti, kada je obolela osoba onog pola koji inače redje oboljeva i kada postoji konsangvinitet u porodici. U okviru istraživanja genetičkih činilaca kod poligenskih bolesti pristupa se studijama asocijacije sa odredjenim genima kandidatima. U studijama asocijacije se ispituje povezanost odredjenih genskih varijanti tj. genskih polimorfizama sa pojavom bolesti, i uporedjuje sa podacima u zdravoj populaciji. Genski ili DNK polimorfizmi su izraz normalne raznolikosti u naslednoj osnovi čoveka tj. humanom genomu. Humani genom se sastoji od tri milijarde parova nukleotida (3x10 9 bp), a smatra se da je svaki hiljaditi nukleotid polimorfan, odnosno da se razlikuje izmedju dva lokusa na homologim hromozomima u opštoj populaciji tj. medju zdravim ljudima. Postoje tri osnovna tipa DNK polimorfizma: polimorfizam pojedinačnih nukleotida (SNP, single nucleotide polymorphism), polimorfizam broja uzastopnih ponovaka (VNTR, various number of tandem repeets ili SNTR, small number of tandem repeets) i deleciono/insercioni polimorfizam. DNK polimorfizmi se danas široko proučavaju i ispituje se njihova uloga kao markera eventuale genetičke predispozicije za razvoj odredjenih, pre svega poligenskih, bolesti. Rezultati proučavanja značaja genskih polimorfizama kod poligenskih bolesti su često protivrečni, pa je još uvek mali broj polimorfizama sa jasno potvrdjenom ulogom. Tako je jasno utvrdjeno da varijanta faktora koagulacije V, označena kao faktor V Leiden, u osnovi ima genski polimorfizam. Reč je o SNP polimorfizmu u 506. kodonu, kojim se triplet CGA za arginin zamenjuje tripletom CAA za glutamin. Prevalenca faktora V Leiden varira:iznosi oko 1-5% u Severnoj Americi, viša je u Severnoj i Srednjoj Evropi, dok je u afričkoj i azijskoj populaciji ovaj polimorfizam gotovo odsutan. Faktor V Leiden značajno povećava rizik za trombofiliju i bolesti udružene sa njom, kao što su flebotromboza, plućna embolija itd. Rizik se dodatno višestruko povećava kod žena koje koriste oralne kontraceptive. U vezi sa trombofilijom ističe se značaj još nekih polimorfizama, kao što je 20210A varijanta protrombina. Što se tiče ateroskleroze kao poligenskog poremećaja, identifikovan je veliki broj gena i genskih produkata koji imaju verovatan ili jasan udeo. Prema funkciji proteina koje kodiraju ovi geni, može se izvršiti podela na tri osnovne grupe: 1. faktori koji kontrolišu transport i metabolizam lipida (apoe, C-III, LDL receptor, lipoprotein (a)), kao i nivo ukupnog holesterola koji je, sam za sebe, kvantitativno svojstvo sa izraženom naslednom komponentom; 2. vazoaktivni faktori, kao što je enzim angiotenzin konvertaza (ACE); 3. faktori koagulacije, adhezije trombocita i fibrinolize, kao što su inhibitor aktivatora plazminogena-1 i trombocitni glikoproteini Ib i IIIa. Dokazana je povezanost genetički uslovljenih varijacija hepatičke lipaze i nivoa HDL, varijacija apoe i nivoa LDL, apociii/apoav i nivoa triglicerida kao i paraoksonaze 1 i infarkta miokarda. Jedan od najviše proučavanih je inserciono/delecioni (I/D) polimorfizam u genu za angiotenzin konvertazu (ACE). Reč je o postojanju (I) odnosno ne postojanju (D)

10 10 segmenta od 287bp u intronu 16 gena. Brojne studije ukazuju da osobe koje na oba lokusa imaju delecionu varijantu, homozigoti DD, imaju značajno veći rizik za razvoj ateroskleroze, hipertenzije i infarkta miokarda, ali ima i rezultata koji negiraju tu povezanost. Kod mladih osoba bez drugih faktora rizika ukazuje se na značaj homocisteina kao aterogenog faktora, i sa tim u vezi polimorfizama u genima koji kontrolišu njegov metabolizam (MTHFR, CBS itd.). Tabela : Genski polimorfizmi koji imaju mogući ili dokazan uticaj na metabolizam lipida gen polimorfizam lipidni parametri metabolizam lipida APOE APOB APOC3 CETP PON LPL kodoni (112 i 158) Thr7Ile -482C/T, -455T/C, 3206T/G, 3175C/G, 1100C/T Ile405Val Gln192Arg Ser447Ter UH, LDL, apob LDL, apob TG TG TG, apoc-iii HDL, apoa-i, CETP PON aktivnost TG, HDL sistem reninangiotenzin AT1R AGT 1166A/C Met235Thr Ins/Del - TG, UH LDL ACE agregacija trombocita GpIIIa fibrinogen GpIIIa p1 A1/A2-455G/A TG, VLDL-TG UH, HDL, LDL, TG metabol. homocisteina MTHFR 677C/T UH, TG adhezija molekula SELE 98G/T LDL Homocistein i hiperhomocisteinemija kao faktor rizika ispituje se i kod niza drugih poremećaja, pri čemu se uvek analizira i uloga genskih polimorfizama. Studije govore o udruženosti MTHFR677 polimorfizma sa pojavom tromboembolija, defekata nervne cevi, spontanih abortusa, neurodegenerativnih bolesti itd., ali i ovde ima mnogo oprečnih rezultat koje treba kritički razmotriti.

11 11 PRINCIPI GENSKE TERAPIJE U širem smislu reči, genska terapija bi podrazumevala svaki egzogeni spoljašnji uticaj na aktivnost odredjenih gena, kao npr. tireoidnih hormona korišćenih u lečenju hipotiroidizma ili steroidnih hormona u lečenju astme, što je već godinama u primeni. U užem smislu genska terapija podrazumeva tretman bolesti unošenjem genetičkog materijala u ciljno tkivo pacijenta. Ova definicija uključuje brojne genetičke manipulacije kao što su ubacivanje kloniranih gena ili delova gena, gena iz drugih genoma, veštačkih gena kao što su antisens geni, oligonukleotida idr. Najčešće genetička modifikacija cilja obolelu ćeliju, ali mete genske terapije mogu da budu i zdrave ćelije, npr. ćelije imunog sistema, što bi predstavljalo oblik vakcinacije. Treba napomenuti da su u ovom trenutku genske treapije ograničene isključivo na telesne tj. somatske ćelije. Postavlja se pitanje svrsishodnosti i racionalnosti primene genske terapije u slučajevima gde su dostupne i konvencionalne terapije, tako da su neki bitni kriterijumi za izbor bolesti za gensku terapiju sledeći : -ne postoji drugi efikasan način lečenja; -zahvaćen (prvenstveno) jedan organ; -postoji animalni model i uspeh terapije na humanim ćelijama in vitro; -sigurna procedura i -monogenska bolest sa identifikovanim genom (kada je reč o naslednim poremećajima). Preovladava mišljenje da najbolju perspektivu za primenu genske terapije imaju maligna oboljenja. Treba podsetiti da se u osnovi maligne transformacije nalazi nekontrolisana ćelijska proliferacija koja je posledica genskih promena: aktivacije onkogena ili inaktivacije tumor supresorskog gena ili gena uključenog u apoptozu. Čak oko 70% ispitivanih protokola za gensku terapiju kod ljudi odnosi se upravo na pokušaje lečenje maligniteta. Na drugom mestu su recesivno nasledne monogenske bolesti. Svakako da visok prioritet u istraživanjima na ovom planu imaju smrtonosna oboljenja kod kojih je odgovorni gen poznat, posebno ako je ciljni organ relativno dostupan primeni genske terapije, a postojeći tretmani su neadekvatni. Primeri za ovu vrstu oboljenja su cistična fibroza, sindrom teške kongenitalne imunodeficijencije (SCID), familijarna hiperhol esterolemija. Tako je moguć transfer gena za adenozin dezaminazu u limfocite pacijenta sa SCID, i opstanak genetskog materijala egzogenog porekla u cirkulišućim T-limfocitima i nakon nekoliko godina. Prvi uspešan primer primene genske terapije (1991.g.) vezan je upravo za ovo oboljenje. Na trećem mestu po broju ponudjenih protokola za gensku terapiju proteklih godina nalazi se SIDA. Očekuje se da će u skoroj budućnosti manipulisanje naslednom osnovom čoveka, posebno nakon njenog dešifrovanja, naći primenu u većini oblasti medicine i stomatologije. Postoji nekoliko osnovnih pristupa tj. strategija u genskoj terapiji. Genska augmentacija ili suplementacija podrazumeva unošenje dodatnih kopija normalnog gena, u onim slučajevima u kojima gen

12 12 postoji ali je mutiran, čime gubi svoju funkciju (npr. kod hemofilije, mišićne distrofije idr.). Genska supresija je unošenje gena koji su u stanju da blokiraju ili inhibiraju štetne gene. Tako npr. hiperekspresija onkogena vodi kanceru, a način da se ti geni inhibiraju je je ubacivanje u ciljno tkivo tumor-supresornih gena, kao što je tumor-supresornih gen za retinoblastom. Ciljano ubijanje specifičnih ćelija, uz pomoć monoklonskih antitela, se takodje primenjuje u genskoj terapiji kancera. Sastoji se u usmeravanju gena»samoubica«, kao što su geni za letalne toksine, ili gena za inaktivni terapijski agens koji će ostvariti svoje dejstvo tek naknadnim ubacivanjem drugog farmaka ka ćelijama koje treba eliminisati, pri čemu se poštedjuju okolne zdrave ćelije. Ovaj pristup predstavlja direktno ubijanje, a postoji i indirektno koje se sastoji u ubacivanju imunostimulatornih gena koji izazivaju ili pojačavaju imuni odgovor protiv ciljne ćelije. U budućnosti se očekuje mogućnost zamene gena, odnosno genska reparacija, isecanjem defektnih gena i ugradnjom na isto mesto normalnih kopija. Za samo izvodjenje realizaciju genske terapije postoji nekoliko načina. Ex vivo terapija podrazumeva da se ciljane ćelije pacijenta izoluju, genetski modifikuju, i potom vrate pacijentu. Kod in situ pristupa terapijski gen se zajedno sa vektorom ubacuje u lokalizovan i pristupačan deo tela (npr. u melanom kože). In vivo terapija znači da se terapijski gen ubacuje direktno u organizam (u cirkulaciju, u jetru, mišiće, pluća...). Postupak unošenja gena u tretirano tkivo može takodje da bude različit. Jedan od najefikasnijih vektora za transfer gena u ciljnu ćeliju su virusi, kod kojih se genetskim inžinjeringom uklone sekvence koje mogu da budu štetne za domaćina, a na upražnjeno mesto se ubace korektivni geni. Pojedini tipovi viralnih vektora se razlikuju u odnosu na veličinu gena koji mogu da ponesu, afinitet za odredjena tkiva, mogućnost ugradnje u genom domaćina itd. Najčešće se koriste retro virusi, adeno i adenoasocirani, herpes virusi. Postoje i nevirusni vektori, kao što su npr. lipozomi, male lipidne sfere u kojima je zarobljena terapijska DNK, a koje se lako fuzionišu sa ćelijskom membranom izručujući svoj sadržaj u citoplazmu ćelije. U kliničkim ispitivanjima lipozomi su najviše korišćeni kao vektori u terapiji cistične fibroze. Njihova velika prednost je što ne izazivaju nikakve imunološke reakcije, ali se najčešće ne postiže visok nivo genske ekspresije. Najjednostavniji pristup u genskom transferu je ubacivanje gole DNK lokalno u odredjena tkiva ili sistemsku cirkulaciju, a uspeh postupka je veoma varijabilan. Pokazalo se da npr. u mišićima DNK bez ikakvog vektora, jednostavnim injektiranjem, može da prodre u ćelije i tu se zadrži više meseci. Postoje i tzv. biolističke tehnike, bombardovanja tkiva česticama različite hemijske prirode (zlato, titanijum) za koje je vezan željeni genetički materijal. Uredjaj kojim se to postiže naziva se genski pištolj (gene gun). Pored još uvek brojnih tehničkih ograničenja, genska terapija nosi sa sobom probleme vezane za neželjene efekte, koji mogu da nastanu usled manipulacije naslednim materijalom. Tako je moguće da virusni vektor izazove tešku pa i smrtonosnu infekciju kod pacijenta, kao što je to bio slučaj kod mladića koji primio gensku terapiju zbog deficita ornitin transkarbamilaze. Takodje ugradnja strane DNK može da pokrene procese kancerogeneze, što je u praksi zabeleženo pojavom malignih bolesti u nekoliko slučajeva.

13 13 U zaključku možemo reći da je za relativno kratko vreme genska terapija prevalila dugačak put od naučne fantastike do realnosti. Nema sumnje da će, i pored problema, selektivno manipulisanje genima, zamena defektnih gena, inhibicija štetnih i neželjenih gena kao npr. u tumorima ili aktivacija gena koji će dovesti do reparacije ili regeneracije oštećenih tkiva, u skorijoj budućnosti postati deo lekarske rutine. Definicija: tretman (lečenje) bolesti unošenjem genetičkog materijala (DNK ili RNK) Vektori za unošenje genetičkog materijala: 1. Virusi (retro, adeno, herpes); 2. ne-viralni (npr. Lipozomi) Tipovi genske terapije: a) somatska, b) genska terapija germinativnih ćelija. Strategije genske terapije: 1. GENE AUGMENTATION (GAT): Uvodjenje ekstra kopije gena da bi se obezbedio produkt (kod AR oboljenja) 2. CILJANO UBIJANJE SPECIFIČNIH ĆELIJA: Kod maligniteta. Direktno: gen kodira letalni toksin ili pro-supstancu ; indirektno: imuno-stimulatorni gen. 3. KOREKCIJA CILJNE MUTACIJE: Na nivou DNK ili RNK (kod dominantno-negativnih mutacija). 4. CILJNA INHIBICIJA GENSKE EKSPRESIJE: Kod maligniteta, infektivnih bolesti (postoji nov ili neadekvatan genski produkt). Na nivou: DNK, RNK ili proteina. * 1+2 = klasična genska terapija Klasična genska terapija: TRANSFER kloniranog gena: a) Ex vivo: kultura tkiva (problem selekcije transformisanih ćelija); b)in vivo: preko vektora (problem efikasnosti ugradnje genetičkog materijala) Problem veličine gena: rešava se npr. kreiranjem funkcionalnih mini-geni (cdnk). Odnos unetog gena i nasledne osnove domaćina: 1.Integracija u genom (stabilna duža ekspresija); 2. Ne-integrisana forma -epizom (kratkotrajna ekspresija). Kriterijumi izbora bolesti za gensku terapiju: Monogenska bolest, identifikovan gen. Ne postoji drugi efikasan način lečenja. Zahvaćen (prvenstveno) jedan organ. Postoji terapijski prozor u razvoju bolesti.

14 14 Postoji animalni model i uspeh terapije na humanim ćelijama in vitro. Sigurna procedura. Mogući rizici i komplikacije kod genske terapije: Razvoj virusne infekcije kod viralnih vektora (npr.: smrtni slučaj kod lečenja deficita OTK rekombinovanim adeno virusom (1999.) Integrisani gen dovodi do: a) razvoja maligniteta (aktivacija protoonkogena, inaktivacija tumor supresorskih gena); b) gubitka funkcije važnog ćelijskog gena Od svih do sada testiranih protokola genske terapije kod ljudi, najveći broj se odnosi na lečenje malignih bolesti (oko 69%), potom na terapiju monogenskih bolesti kao što su cistična fibroza, Dišenova mišićna distrofija, ADA deficit, hemofilija (17%) i na lečenje infektivnih bolesti, pre svega SID-e (12%). Primeri razvoja genske terapije: Deficit adenozin-deaminaze (SCID): 1. Transplantacija kosne srži; 2. Nadoknada enzima (animalni,+peg), 3. Genska terapija: T limfociti iz krvi (1990.), stem ćelije iz pupčane vrpce (1993.) Hemofilija A: 1. Nadoknada faktora koagulacije: humani a potom rekombinantni (1990.); 2. Genska terapija: virusni vektor unet in vivo, i.v. (1999.), virusni vektor unet u kulturu fibroblasta kože koji su potom preneti u trbušni zid (2001.).