Abstract | The list of developmental and degenerative diseases that are caused by

Транскрипт

1 НЕСТАБИЛНОСТ МИКРОСАТЕЛИТА КАО МОЛЕКУЛАРНО- ГЕНЕТИЧКА ОСНОВА НЕУРОЛОШКИХ И ПСИХИЈАТРИЈСКИХ ОБОЉЕЊА Душанка Савић Павићевић, Горан Брајушковић и Станка Ромац Центар за хуману молекуларну генетику, Биолошки факултет, Универзитет у Београду, Београд, Србија Апстракт. Динамичке мутације или нестабилне експанзије поновака у микросателитима доводе до развоја неуролошких болести (неуродегенеративних и неуромишићних), менталних ретардација и развојних поремећаја, док се генетичка варијабилност ових поновљених ДНК секвенци у општој популацији везује за предиспозицију за развој психијатријских поремећаја. Већина болести нестабилних експанзија поновака одликује се генетичком антиципацијом, везаном за нестабилну експанзију поновака кроз генерације, и варијабилном клиничком презентацијом, зависном од величине експанзије. У зависности од своје локације у гену, експанзије поновака на различите начине нарушавају експресију гена водећи до развоја болести доводе до губитка функције протеина, стицања нове функције мутираног протеина или стицања нове функције мутиране РНК. Код неких болести, описано је да се нестабилне експанзије поновака транслатирају у сва три оквира читања независно од старт кодона. Такве болести имају јединствени механизам молекуларне патогенезе независан од локације поновака у гену, у коме једна мутација у молекулу ДНК може дати девет токсичних продуката за ћелију. Откриће динамичких мутација изменило је наше схватање о њиховој функционалности и еволуцији. Данас се сматра да микросателити својом генетичком варијабилношћу на различите начине модулишу експресију гена и структуру и функцију РНК и протеина, као и да су имали важну функцију у еволуцији гена и генома.

2 Више од половине генома човека чине различите класе поновљених секвенци молекула ДНК (енг. repetitive DNA) (1). Једна од њих су микросателити, познати и под називима кратки тандемски поновци (енг. short tandem repeats, STR) или једноставне поновљене секвенце (енг. simple sequence repeats, SSR). Они заузимају око 3% генома човека (2) и представљају мотиве ДНК дуге од 1 до 6 базних парова који се тандемски понављају по принципу глава-реп, обично, мање од 30 пута (3). Почетком деведесетих година прошлога века описан је нови тип мутација карактеристичан само за микросателитске локусе, назван динамичким мутацијама (4). Динамичке мутације се огледају у повећању броја поновака у неким микросателитима и описане су само у геному човека. Оне доводе до развоја наследних болести широког фенотипског спектра неуродегенеративних и неуромишићних болести, менталних ретардација и развојних малформација, једним именом названих болестима нестабилних експанзија поновака (5,6). Типични примери су Хантингтонова болест, фрагилни X синдроми и миотоничне дистрофије, болести код којих је описан необичан и често оспораван феномен генетичке антиципације појаве да се болест у следећеој генерацији јавља раније и има тежи клинички ток (7). Истражвања везана за динамичке мутације и болести нестабилних експанзија поновака константно су доносила изненађујућа открића која су допринела промени схватања неких основних концепата генетике и молекуларне биологије. Јединствена особина динамичких мутација да се број поновака у микросателитима може мењати из генерације у генерацију (4), била је у супротности са централним принципом Менделове генетике, према коме се мутације стабилно преносе са родитеља на потомство. Међутим, управо је нестабилна природа динамичких мутација пружила објашњење за молекуларну основу генетичке антиципације. Изучавање молекуларне патогенезе болести нестабилних експанзија поновака донело је нова неочекивана открића, као што су стицање токсичне функције молекула РНК са умноженим поновцима (8), бидирекциона транскрипција микросателитских локуса (9), и транслација кроз мутиране микросателите у сва три оквира читања независно од старт кодона AUG (10). Чињеница да мутације у микросателитима могу довести до развоја низа наследних болести отворило је и питање функционалности и еволуционог значаја ових поновљених секвенци, које су до тада сматране неутралним. Недавно је постављена хипотеза да су управо експанзије поновака који подлежу динамичким мутацијама имале кључну улогу у еволуцији гена и генома (11).

3 У овом раду дат је преглед особина микросателита, динамичких мутација, болести нестабилних експанзија поновака и молекуларних механизама патогенезе ових болести, затим повезаности варијабилности микросателита са психијатријским поремећајима, као и осврт на функционални и еволуциони значај микросателита који подлежу динамичким мутацијама. Микросателити су извор генетичке варијабилности Микросателити најчешће садрже мање од 10 поновака, а ако су дужи одликују се варијабилношћу у броју поновака (присуством алела са различитим бројем поновака код различитих особа), и хетерозиготношћу, често, већом од 70% (12). Због своје варијабилности у дужини, микросателити се одликују широким и континуираним опсегом могућих генотипова за дати локус, што их чини јединственим извором генетичке варијабилности (13). Изражена генетичка варијабилност микросателита везује се за њихову високу стопу мутација која мења број поновака повећава га (експанзија) или смањењује (контракција) за један или неколико. Просечна стопа мутација микросателита у геному човека износи 10-3 (14), што је неколико редова величина веће од стопе тачкастих мутација ( ) (15). Значај присуства стотина хиљада различитих микросателита у геному човека није сасвим разјашњен, али се сматра да би они нашу врсту могли чинити јединственом (16). Микросателити се налазе у промоторима, нетранлсатирајућим регионима (енг. untranslated regions, UTR), интронима и кодирајућим регионима гена, и изгледа да су еволуирали да би модулисали различите аспекте експресије гена, као и структуру и функцију РНК и протеина (17). На пример, сматра се да су микросателити у кодирајућим регионима гена омогућили еукариотама да компензују дуге периоде потребне за стварање нових протеинских домена (18) и да су за релативно кратак временски период допринели усложњавању регулаторних мрежа и сигналних путева у овим ћелијама (19). Претпоставља се да су микросателити били посебно важни за еволуцију понашања и регулацију развића и функције мозга (20). Динамичке мутације Број поновака у микросателитима је варијабилан у општој популацији и они се стабилно наслеђују кроз генерације. Међутим, када број поновака достигне пражну вредност (приближно 35 поновака, односно око база), алели микросателита постају високонестабилни и мењају се из генерације у генерацију, а број поновака достиже вредности од неколико десетина до неколико хиљада. Управо због јединствене особине нестабилности, која је зависна од броја поновака, овај тип мутација назван је динамичким мутацијама (4, 21).

4 Промена броја поновака је таква да углавном долази до повећања, тако да се као синоним за динамичке мутације употребљава израз експанзије поновака. Структурне особине поновака који подлежу динамичким мутацијама Динамичким мутацијама најчишће подлежу триплетни микросателити, као што су (CGG)n (CCG)n, (CAG)n (CTG)n, (GAA)n (TTC)n и (GCN)n (NGC)n, где N представља један од четири нуклеотида, а n број поновака. Поред њих, експанзијама подележу микросателити са тетрануклеотидним поновцима (CCTG)n (CAGG)n, пентануклеотидним поновцима (ATTCT)n (AGAAT)n и (TGGAA)n (АCCTT)n, хексануклеотидним поновцима (G 4 C 2 )n (C 4 G 2 )n, и додекамерним поновцима (C 4 GC 4 GCG)n (CGCG 4 CG 4 )n. Ове секвенце се налазе у различитим регионима гена (табеле 1, 2 и 3). Триплетни поновци се налазе у нетранслатирајућим регионима гена, али и у кодирајућим регионима, када се преводе се у хомополимерне низове, као што су полиглутамини или полиаланини. Тетра-, пента- и хексануклеотидни поновци идентификовани су у интронима одређених гена, док се додекамерни поновци који подлежу експанзијама налазе у промотрском региону (22). Заједничка особина поновака који подлежу експанзијама је способност формирања необичних секундарних структура у молекулима ДНК и РНК, које представљају основу у молекуларним механизмима настанка динамичких мутација, али и у механизмима молекуларне патогенезе болести. Једноланчани региони нуклеинских киселина са (CNG)n и (CCТG)n поновцима формирају структуре укоснице изграђене из понављајућих делова састављених из два Вотсон-Крикова C-G пара праћена једним паром погрешно спарених база (23, 24). Четвороланчана структура ДНК, G-квадриплекс, формира се од једноланчаних региона са (CGG)n и (G 4 C 2 )n поновцима (25, 26). Четири гуанина из сваког једноланчаног дела повезују се Хугстиновим водоничним везама формирајући планарану G-тетраду, а наслојавањем G-тетрада формира се G- квадриплекс. Дволанчани региони ДНК са (GAA)n (TTC)n формирају интрамолекулске триплекс структуре, H-ДНК и лепљиве ДНК, настале спаривањем дволанчаног региона (GAA)n (TTC)n са савијеним једноланчаним регионом који садржи (GAA)n (27). Поновци (ATTCT)n (AGAAT)n формирају елементе за одмотавање ДНК, односно регионе у којима се секундарна структура молекула ДНК прогресивно нарушава са повећањем суперспирализације (28). Молекуларни механизами настанка динамичких мутација Молекуларни механизами настанка динамичких мутација нису сасвим разјашњени. Необичне структуре ДНК могу се формирати током раздвајања ланаца ДНК или увођењем прекида у

5 молекулу ДНК током процеса репликације, репарације и рекомбинације ДНК, и тако предиспонирати поновке ка нестабилности "збуњујући" ћелијске машинерије одговорне за ове процесе (22, 29). Све више података указује да системи за репарацију погрешно спарених базних парова, кратких једноланчаних петљи или оштећених база имају кључну улогу у експанзијама поновака (30). Изгледа да је функционални систем за поправку погрешно спарених база (енг. mismatch repair system, MMR) пре узрочни фактор у настанку овог типа мутација, него "чувар" интегритета генома. Необичне структуре ДНК и улога система за репарацију ДНК могу објаснити и постојање прага у нестабилности поновака и њихову динамичку природу (29). Праг за експанзију је физички дефинисан кинетиком формирања структура ДНК, која је таква да број поновака већи од пражне вредности пре формира стабилну необичну структуру ДНК него стандардну дволанчану завојницу ДНК. Функционално, праг нестабилности је ограничавајућа дужина која може ефикасно регрутовати протеине репарационих система ДНК. Са повећањем дужине поновака изнад пражне вредности повећава се и вероватноћа следећег догађаја нестабилности. Код одређене наследне болести, нестабилна експанзија поновака ограничена је само на ген узрочник, што указује да су за настанак динамичких мутација важни cis-елементи сами нестабилни поновци али и секвенце ДНК у околини поновака. Улога протеина ћелијских машинерија за метоблизам ДНК у настанку динамичких мутација указује да нестабилности поновака доприносе и trans-фактори. Разлике у дужини поновака описане у различитим ткивима исте индивидуе, на пример болесника са миотоничном дистрофијом типа 1 (31), указују на постојање додатних, ткивно-специфичних trans-фактора који утичу на стабилност поновака. Динамичке мутације су узрок развоја неколико десетина наследних болести човека Болести нестабилних експанзија поновака су хетерогена група моногенских обољења са различитим типовима наслеђивања аутозомно рецесивним, X -рецесивним или аутозомно доминантним. Оне обухватају неуродегенеративне и неуромишићне болести, менталне ретардације и развојне поремећаје. Године 1991., за две болести, спиналну и булбарну мишићну атрофију (SMAX1) (32) и фрагилни X синдром А (FRAXA) (33), показано је да су узроковане динамичким мутацијама. Уследило је откриће да су миотонична дистрофија типа 1 (DM1) и Хантингтонова болест (HD), такође, узроковане овим типом мутација (34, 35). Од тог периода до данас описано је око тридесетак болести узрокованих нестабилним

6 експанзијама поновака. Недавно откриће да су фронтотемпорална деменција и амиотрофична латерална склероза (FTD/ALS1), такође, узроковане динамичким мутацијама (36, 37) привукло je ништа мању пажњу у поређењу са октрићима почетком деведестих година прошлога века. Особине болести нестабилних експанзија поновака Већина болести нестабилних експанзија поновака одликује се генетичком антиципацијом и изузетно варијабилном клиничком презентацијом (21, 38). Феномен генетичке антиципације је још године описан код породица са DM1 као посебан тип наслеђивања са прогресивном експресивношћу болести кроз генерације (39). Сличан начин наслеђивања био је описан и код неких неуролошких болести, укључујући HD, SMAX1 и наследне спиноцеребеларне атаксије. Повећање пенетрабилности болести кроз генерације, познато под називом Шерманов парадокс, било је описано код FRAXA (40). Међутим, непознавање биолошке основе генетичке антиципације био је разлог да се овај феномен често описује као предрасуда лекара (7). Од открића да су ове болести узроковане динамичким мутацијама, постало је јасно да је биолошка основа генетичке антиципације везана за повећање броја поновака кроз сукцесивене генерације. Већина болести нестабилних експанзија поновака одликује се изузтеном фенотипском варијабилношћу у чијој основи лежи карактеристичан однос генотипа и фенотипа - што је број поновака већи болест почиње раније и има тежи клинички ток (21). На пример, DM1 је једна од клинички најваријабилнијих моногенских болести (41). Особе са благом формом DM1 имају од 80 до 200 CTG поновака у гену DMPK, са јувенилно-адултном формом од 200 до 1000 поновака, док оне са конгениталном формом имају неколико хиљада поновака (42). Болести нестабилних експанзија поновака у некодирајућим регионима гена На основу локације поновака у гену, болести нестабилних експанзија поновака деле се на две гупе: болести узроковане експанзијама поновака у некодирајућим регионима гена и болести узроковане експанзијама поновака у кодирајућим регионима гена (5, 38). Болести нестабилних експанзија поновака у некодирајућим регионима гена обухватају неуролошка и неуромишићна обољења, углавном, са мултисистемском клиничком презентацијом и различитим типовима наслеђивања (аутозомно рецесивним, X-рецесивним или аутозомно доминантним). Примери болести из ове групе су FRAXA (најчешћа наследна ментална ретардација код дечака), миотоничне дистрофије (DM, најчешће мишићне дистрофије код одраслих), Фридрајхова атаксија (FRDA, најчешћа наследна атаксија), FTD/ALS (најчешћи наследни тип амиотрофичне латералне склерозе), прогресивна

7 миоклонична епилепсија тип 1, и друге (табела 1). Ова група болести узрокована је експанзијама три-, тетра-, пента-, хекса- и додекануклеотидних поновака, који се налазе у 3 - и 5 -UTR, интронима или промтору. Нестабилни поновци у овој групи болести подлежу драстичним експанзијама, достижући дужину од неколико стотина до неколико хиљада поновака. Највеће до данас описане су експанзије CCTG поновака у првом интрону гена CNBP које доводе до развоја DM2 и достижу дужину од чак поновака (43). Поновци повезани са DM1 прво подлежу умеренијим експанзијама, од 50 до 100 поновака, и представљају премутационе алеле, који не доводе до развоја болести или су асоцирани са благим симптомима (44). Међутим, због високе нестабилности подлежу даљим мутацијама, што за резултат има драстичне експанзије које воде до пуног испољавања болести већ у следећој генерацији. Алели са 60 до 200 поновака у гену FMR1 инцијално су сматрани бенигним премутационим алелима код FRAXA. Нaкнадно је установљено да они доводе до развоја клинички другачијег синдрома названог фрагилни X тремор/атаксија синдром (FXTAS) (45). Интересантно је да су молекуларни механизми патогенезе ова два синдрома, узрокована различитом величином нестабилних поновака у истом гену, потпуно различити. Полиглутаминске и полиаланинске болести Болести нестабилних експанзија поновака у кодирајућим регионима гена обухватају полиглутаминске и полиаланинске болести, назване по типу хомополимерних низова аминокиселина кодираних умноженим поновцима. Полиглутаминске болести су аутозомно доминантне, прогресивне неуродегенеративне болести узроковане експанзијама од неколико десетина CAG кодона у одређеним генима. Оне обухватају HD, SMAX1, спиноцеребеларне атскије типа 1, 2, 3, 6, 7 и 17 (SCA1/2/3/6/7/17) и дентаторубралнопалидолуизијеву атрофију (DRPLA) (46, 47) (табела 2). Гени у којима долази до експанзија CAG поновака експримирани су у многим ткивима укључујући и скоро све делове централног нервног система, али се свака од наведених болести карактерише карактеристичним обрасцем неуродегенерације и скупом клиничких симптома. На пример, код HD најтежој дегенерацији подлежу церебеларни кортекс и стриатум (48). Оштећења у другим деловима централног нервног система, као и у периферним системима, вероватно доприносе психијатријским, когнитивним и моторним симптомима ове фаталне болести (49). Полиаланинске болести обухватају разне развојне малформације, синдромске и несиндромске менталне ретардације, и окулофарингеалну мишићну дистрофију (OPMD) (табела 3) (6). Настају услед експанзија кодона за аланин, углавном, у генима за

8 транскрипционе факторе који регулишу образац ембрионалног развића ткива и органа. Екапанзије два низа полиаланинских кодона у гену ARX повезане су са несиндромским и тешким синдромским X-везаним менталним ретардацијама код дечака (50-52). За разлику од поновака у некодирајућим регионима гена и поновака за глутамине, поновци за аланине имају нижи праг нестабилности (30-60 база) и подлежу малим експанзијама до десетак поновака (6). Сматра се да је механизам њиховог настанка неједнаки кросинг-овер. Мутирани алели се стабилно преносе кроз генерације, тако да код полиаланинских болести није описана генетичка антиципација. Молекуларни механизми патогенезе болести нестабилних експанзија поновака Присуство умножних поновака у молекулу ДНК доводи до промена у експресији гена, водећи до развоја болести. Природа сваке од болести нестабилних експанзија поновака зависи од типа и локације тандемских поновака у узрочном гену. Уопштено, експанзије у некодирајућим регионима гена могу довести до губитка функције протеина или стицања токсичне функције мутиране РНК, док оне у кодирајућим регионима гена доводе до стицања токсичне функције мутираног протеина (5). Новија истраживања указују да једнан тип динамичких мутација може дати већи број токсичних молекула РНК и протеина за чији настанак су одговорне бидерекциона транскрипција кроз умножене поновке (9) и нови тип транслације кроз поновке у сва три оквира читања независан од старт кодона (53). Губитак функције протеина Експанзије поновака у некодирајућим регионима гена узрочника X-рецесивних (FRAXА и FRAXЕ) и аутозомно рецесивних (FRDA) болести интерферирају са транскрипцијом, доводећи до губитка функције одговарајућег протеина. FRAXА и FRDA могу бити узроковане тачкастим мутацијама у гену FMR1 (54), односно тачкастим мутацијама, делецијама егзона или комплетном делецијом гена FXN (55-57), редом, што потврђује да је губитак функције протеина одговоран за молекуларну патогенезу ових болести. Експанзије дуже од 200 CGG поновака у гену FMR1 узрокују недостатак FMR1 протеина што води развоју FRAXА. FMR1 је РНК-везивни протеин високо експримиран у неуронима. Укључен је у процесе сазревања синапси, селективној елиминацији слабих синапси током развића и у синаптичкој пластичности (58). FMR1 локализује у дендритима и аксонима (59) и учествује у селективном транспорту информационих РНК (ирнк) за цитоскелетне и синаптичке протеине и регулаторе транслације до синаптичких места (58). У дендритским завршецима асоциран је са полирибозомима и укључeн је у регулацију локализоване транслације циљних ирнк након стимулације метаботропних рецептора за глутамат (60).

9 Своју функцију у регулацији локализоване транслације остварује регрутовањем утишавајућег комплекса RISC и одговарајућих микрорнк (61). Одсуство FMR1 узрокује прекомерни одговор на глутамат, а ова функционална промена морфолошки резултује у дугим, незрелим дендритским завршецима, описаним код болесника са FRAXА (62). Експанзије од неколико стотина GAA поновака у првом интрону гена FXN инхибирају елонгацију транскрипције, тако да болесници са FRDA имају смањену експресију протеина фратаксина. Фратаксин је високо конзервисан протеин, асоциран са унутрашњом митохондријском мембраном (63). Недостатак његове функције доводи до акумулације гвожђа у митохондријама и повећану осетљивост на оксидативни стрес (64). Стицање токсичне функције мутираног протеина Заједничка молекуларна особина свих полиглутаминских болести је акумулација и агрегација мутираних протеина у нуклеусним и/или цитоплазматичним инклузијама, док је једина заједничка карактеристика протеина асоцираних са овим болестима мутирани полиглутамински низ (5). Наведено указује да полиглутамински низ мутираном протеину додељују нову, токсичну функцију одговорну за неуродегенерацију (65). Инцијациони догађај молекуларне патогенезе већине полиглутаминских болести је протеолитичко сечење мутираног протеина којим се ослобађа токсичан полиглутамински фрагмент (66). Полиглутамински фрагмент заузима конформацију сличну β плочама и може испољити токсичну функцију као солубилни мономер или олигомер. Олигомери асемблирају у агрегате који воде формирању унутарћелијских протеинских инклузија. Самтра се да кључну улогу у патогенези болести имају токсични олигомери, а да су протеинске инклузије крајњи стадијум адаптивног ћелијског одговора на велику количину погрешно савијених протеина са заштитном функцијом (65). Каскада иницираних патолошких протеин-протеин интеракција може утицати на многе процесе у ћелији (транскрипцију, модификацију хроматина, функцију система за контролу и деградацију протеина и митохондрија) водећи ка дисфункцији неурона и на крају до њихове смрти. Неопходност нуклеусне локализације мутираног протеина и чињеница да транскрипционе промене најчешће претходе фенотипским променама код полиглутаминских болести подржавају претпоставку о поремећеној регулацији транскрипције као основи њихове патогенезе (67). Токсични ефекти погрешно савијених полиглутаминских протеина доводе до промена у транскрипцији кроз измењене интеракције са специфичним транскрипционим факторима или кроз регрутовање транскрипционих фактора у протеинске инклузије. Други

10 механизам који вероватно доприноси поремећеној транскрипцију је промена структуре хроматина узроквана полиглутаминским протеинима (68). Сматра се да би репресија транскрипције кроз интеракцију полиглутаминских низова са транскрипционим факторима неопходним за преживљавање специфичних група неурона могла објаснити селективну смрт неурона карактеристичну за сваку полиглутаминску болест. Међутим, експеримнатални докази за ову хипотезу пружени су само за SCA7 (69). Накупљање погрешно савијених протеина доводи до повећане активности механизама за контролу квалитета и деградацију протеина. Сматра се да протеински агрегати, а посебно, солубилни олигомери, могу директно интерферирати са способношћу ћелије да спечи погрешно савијање већег броја протеина. Ово би се могло остварити или кроз заробљавање протеина одговорних за контролу квалитета протеина (70), и/или кроз загушење протеазомског система (71, 72). Занимљиво је да активност протеазомског система опада са старењем, тако да би старосно-зависно засићење протеазомског система могло објаснити појаву ових болести у адултном периоду живота (73). Иако се протеини асоцирани са полиглутаминским болестима експримирају у свим деловима централног нервног система, свака болест има другачију клиничку презентацију услед одумирања специфичих група неурона, што наводи на закључак да је за њихову патогенезу важна и сама функција протеина кодираног геном узрочником (5, 65). Међу полиаланинским болестима, само експанзије у гену PABPN1 повезаним са OPMD, показују механизам патогенезе аналоган полиглутаминским болестима, с тим што полиаланини токсичан ефекат остварују на одређене групе мишићних ћелија (6). Стицање токсичне функције мутиране РНК Молекуларна патогенеза аутозомно доминантних неуромишићних и неуродегенеративних болести узрокованих експанзијама поновака у некодирајућим регионима гена везује се за стицање токсичне функције мутиране РНК (74). Њихова заједничка молекуларна карактеристика је присуство дискретних РНК фокуса, нуклеусних комплекса који садрже транскрипте са умноженим поновцима и различите протеине. РНК фокуси су токсични за ћелију, јер мутирани транскрипти заробљавају РНК-везивне протеине укључене у различите аспекте метаболизама РНК, што доводи до поремећаја општег метаболизама РНК. У овом механизму кључну улогу има специфична секундарна структура умножених поновака у молекулу РНК, која формира везивна места за различите протеине (22). Токсичнa фунцијa мутиране РНK описана је код DM1 (75, 76), DM2 (77), FXTAS (78), Хантингтоновој сличној болести типа 2 (79), SCA8 (80), SCA31 (81), SCA10 (82) и FTD/ALS1 (83). Нуклеусни РНК

11 фокуси код различитих болести разликују се по саставу РНК-везивних протеина, који је одређен типом умножених поновака у молекулима РНК. Резултати истраживања на трансгеним мишевима за DM1 показали су да је РНК са експандованим CUG поновцима неопходна и довољна за развој болести (76). Мутирани DM1 транскрипти остају заробљени у нуклеусу (75), а њихови умножени поновци формирају интраланчане укоснице које везују мастер регулаторе сплајсовања, протеинe MBNL (84, 85). Услед заробљавања протеинa MBNL, ствара се ефекат губитка његове функције, што доводи до измењеног обрасца сплајсовања многих циљних пре-ирнк. Са друге стране, интраланчане укоснице у мутиrаним DM1 транскриптима стимулишу протеинску киназу C, што индукује хиперфосфорилацију и повећану стабилност другог мастер регулатора сплајсовања, протеина CUG-BP (86). Повећана стабилност CUG-BP ствара ефекат добијања нове функције овог протеина, која утиче на поремећај у алтернативном сплајсовању, транслацији и деградацији многих циљних ирнк. Измењени ниво или активност протеина MBNL и CUG-BP ремети развојно регулисано алтернативно сплајсовање одређене групе гена, тако да се у адултним ткивима особа са DM1 експримирају ембрионалне форме алтернативних ирнк (8, 87). До данас је описан велики број гена чији транскрипти подлежу измењеном обрасцу сплајсовања код DМ1 и они могу објаснити појаву скоро свих мултисистемских симптома ове болести. DM2 је клинички веома слична са DM1, мада се одликује блажим клиничким током и нема конгениталну форму. Иако гени DMPK и CNBP немају уопште сличне функције, молекуларна патогенеза ове две болести везана за токсичне РНК и промећај функције исте групе РНКвазивних протеина објашњавају њихову сличну клиничку презентацију (88). Транслација кроз поновке у сва три оквира читања независна од старт кодона Претходно описани механизми молекуларне патогенезе болести нестабилних експанзија поновака били су резултат изучавања очекиваних ефеката мутација полазећи од тога да ли се мутација налази у или ван оквира читања који почиње старт кодоном. Ћелијски и анимални модели за ове болести били су дизајнирани да се тестирају хипотезе засноване на претпоставкама да умножени кодони за глутамин кодирају само полиглутаминске низове у протеину и да мутације у некодирајућим регионима гена немају кодирајући потенцијал. Међутим, године у истраживањима која су требала да раздвоје токсичне ефекте полиглутаминских поновака и мутиране РНК, насталих бидирекционом транскрипциојом локуса SCA8 (9), сасвим неочекивано откривен је нови механизам молекуларне патогенезе. Наиме, показно је да се бидирекционо транскрибовани умножени поновци у SCA8 локусу транслатирају независно од старт кодона и то у сва три оквира читања, водећи до симултане

12 експресије протеина са различитим хомополимерним низовима у једној ћелији (53). Овај нови тип транслације назван је транслација кроз поновке независна од кодона AUG (енг. repeat-associated non-atg translation, RAN транслација). Транскрипт преписан са гена ATXN8 садржи поновке CAG и транслатира се у протеине са низовима полиглутамина, полисерина и полиаланина, док антисенс транскрипт преписан са гена ATXN8OS садржи поновке CUG, који се, такође, транслатира у сва три оквира читања, дајући протеине са низовима полилеуцина, полицистеина и полиаланина (53). Поред SCA8, продукти RAN транслације детектовани су у погођеним ткивима болесника са DM1 (53), FXTAS (89) и FTD/ALS1 (90, 91). RAN транслацијом G 4 C 2 повезаних са FTD/ALS1 настају протеини са дипептидним поновцима. Заједничке особине RAN транслације кроз поновке CAG, CUG, CGG и G 4 C 2 су: а. зависност од броја поновака таква да се RAN транслација чешће дешава кроз дуже експанзије; б. сви поновци који подлежу RAN транслацији формирају необичне секунадрне структуре, за које се сматра да иницирају транслацију слично секвенцама IRES (енг. internal ribosome entry site); б. различити оквири читања имају различите пражне вредности за дужину поновка, тако да је већа вероватноћа да се дуже експанзије транслатирају у сва три оквира читања дајући коктел протеина са различитим хомополимерним низовима; г. протеини са хомополимерним и дипептидним низовима могу се симултано експримирати у једној ћелији; д. све болести код којих је описана RAN транслација имају неуролошке симптоме (10). Даља истраживања RAN транслације треба да одговоре на питања на који начин различити протеини са хомополимерним и дипептидним низовима доприносе патологији болести и да ли је она заступљена и код других болести нестабилних експанзија поновака. Занимљиво је да би RAN транслација могла да узрокује недостатак одређених аминокислеина у укупном pool-у аминокислеина, водећи потенцијално ка глобалном поремећају транслације. Јединствени механизам молекуларне патогенезе болести нестабилних експанзија поновака Откриће RAN транслације (53) заједно са доказима о бидирекционој транскрипцији локуса који подлежу динамичким мутацијама (9) указује на могуће постојање јединственог механизма молекуларне патогенезе једног броја болести нестабилних експанзија поновака, који је независан од локације поновака у гену. Овај механизам укључује симултано стварање до укупно девет токсичних продуката који су резултат бидирекционе транскрипције експанзија (две токсичне РНК), канонске транслације (један токсичан протеин) и РАН транслације (по три протеина са хомополимерним низовима насталих РАН транслацијом

13 транскрипата преписаних са супротених ланаца ДНК) (92). Сваки од девет продуката могао би доприности молекуларној патогенези болести. Генетичка варијабилност микростаелити као предиспозиција за психијатеријска обољења Претходно описане болести узроковане су мутацијама у једном гену и оне су неопходне и довољне да доведу до развоја болести. Супротно њима психијатријски поремећаји, као што су шизофренија, мајор депресија, биполарни поремећај, аутизам и поремећај пажње са хиперактивношћу, узроковани су бројним генетичким и срединским факторима и њиховим међусобним интеракцијама. Ниједан од фактора није нити довољан нити неопходан да доведе до развоја болести, већ представљају само предиспозицију за развој болести. Генетичким студијама на нивоу целог генома идентификовани су неке честе тачкасте веријанте повезане са психајтријским болестима, као и неке ретке структурне генетичке варијанте и неке de novo егзонске мутације (93). С обзиром да до сада идентификовани генетички фактори објашњавају само један мањи део херитабилности описане код психијатријских обољења, за непознати остатак се све чешће користи израз "херитабилност која недостаје" (енг. missing heritability) (94). Сматра се да би значајан део "херитабилности која недостаје" код психијатријских обољења могао бити објашњен генетичким варијацијама у микросателитима, које модулишу читав низ биолошких процеса везаних за функцију мозга и за понашање (13). За неке микросателите показана је асоцијација са шизофренијом, мајор депресијом, биполарним поремећајем и поремећај пажње са хиперактивношћу (95). Процена стварног доприноса варијабилности микросателита генетичкој основи психијатријских обољења захтева нови дизајн студија на нивоу целог генома који ће испитивати асоцијацију са микросателитима, а не са честим тачкастим варијантама. Суштинска улога екпанзије триплета у еволуцији гена и генома Трифонов и сарадници су године поставили нову хипотезу о раној молекуларној еволуцији по коме су управо триплети (CGG)n (CCG)n, (CAG)n (CTG)n, (GAA)n (TTC)n, који подлежу динамичким мутацијама, имали суштинску улогу у еволуцији гена и генома (11, 96). Хипотеза предвиђа да су секвенце у геному еволуирале екпанзијама тандемски поновка, углавном триплета, и накнадном акумулацијом тачкастих мутација у њима. Спонтане експанзије поновака почеле су да се дешавају веома рано, од саме појаве триплетног кода, и наставиле су да се дешавају током еволуције, остављајући своје отиске као приоритетно коришћени кодони у секвенцама које кодирају једноставне низове

14 поновљених амино киселина у данашњим протеинима. Процењено је да преко трећине генома Escherichia coli K12 води порекло од једноставно поновљених секвенци (97). Због инхерентне нестабилности са склоношћу ка експанзијама, Трифонов и сарадници су (CGG)n (CCG)n, (CAG)n (CTG)n, (GAA)n (TTC)n триплете назвали агресивним поновцима, а вишеструко поновљене триплете у модерним геномима молекуларним фосилима (11). Поновљене секвенце су највероватније преживеле из најранијих времена и наставиле су да траже свој простор у геномима због њихове способности да се умножавају, због чега се говори о "вечним" експанзијама триплета. Накнадне тачкасте мутације у овим секвнцама у великом броју случајева избрисале су меморију на њихову првобитну једноставност. Закључак. Откриће динамичких мутација расветлило је генетичку основу бројних неуролошких и развојних поремећаја. То је довело до развоја генетичких тестова који се рутински примењују у клиничкој пракси, омогућавајући постављање недвосмислене клиничке дијагнозе и пренатално тестирање. Упознавање генетичке основе неких болести помогло је у бољем разумевању њихових варијабилних клиничких презентација, до развоја концепта о клиничком континуму ALS и FTD, али и до схватања да експанзије у оквиру једног гена могу резултовати или у неуроразвојном поремећају, FRAXA, или у неуродегенеративном поремећају, FXTAS. Стечена знања о молекуларној патогенези ових болести створила су оквир за развој нових терапијских приступа који ће одложити почетак или успорити прогресију болести, или чак спречити развој болести. На пример, у Америци је започета клиничка евалуација употребе антисенс олигонуклеотида који могу "разбити" токсичне фокусе РНК код DM1 (98). Динамичке мутације и њихова интригантна повезаност са неуролошким болестима, иницирале су изучавања функционалности и еволуционог значаја микросателита. Данас је широко прихваћено да су бројни микросателитски локуси функционални и да значајно доприносе варијабилности квантитативних особина, укључујући и психијатријске поремећаја, а недавно је постављена хипотеза да су "вечне" експанзије поновака имале кључну улогу у еволуцији гена и генома.

15 Табела бр. 1. Болести експанзија поновака у некодирајућим регионима гена Болест Ген* Тип поновака Локација Нормални Мутирани OMIM # алели алели FRAXA FMR1 CGG 5 UTR 6-53 > FXTAS FMR1 CGG 5 UTR FRAXE FMR2 GCC 5 UTR 6-35 > FRDA FRDA GAA Интрон 7-34 > FTD/ALS1 C9ORF72 G 4 C 2 Интрон DM1 DMPK CTG 3 UTR 5-37 > DM2 CNBP CCTG Интрон > EPM1 CSTB C 4 GC 4 GCG 5 UTR HDL2 JPH3 CTG 3 UTR SCA8 ATXN8 CTG 3 UTR SCA10 ATXN10 ATTCT Интрон SCA12 PPP2R2B CAG 5 UTR SCA31 BEAN1 TGGAA Интрон? > *Симболи гена наведени по HUGO (енг. The Human Genome Organisation) номенклатури; # Идентификациони број болести у ОМИМ (енг. Online Mendelian Inheritance in Man) бази података; FRAX, фрагилни X синдром; FXTAS, фрагилни X тремор и атаксија синдром; FRDA, Фридрајхова атаксија; FTD/ALS1, фронтотемпорална деменција/амиотрофична латерална склероза 1; DM, миотонична дистрофија; EPM1, прогресивна миоклонична епилепсија 1; HDL2, Хантингтоновој слична болест 2; SCA, спиноцеребеларна атаксија.

16 Табела бр. 2. Болести нестабилних експанзија кодирајућих (CAG)n поновака Болест Ген* Нормални Мутирани OMIM # алели алели HD HD SMAX1 AR SCA1 ATXN SCA2 ATXN SCA3 ATXN SCA6 ATXN SCA7 ATXN SCA17 TBP DRPLA DRPLA *Симболи гена наведени по HUGO (енг. The Human Genome Organisation) номенклатури; # Идентификациони број болести у ОМИМ (енг. Online Mendelian Inheritance in Man) бази података; HD, Хантингтонова болест; SMAX1, спинална и булбарна мишићна атрофија; SCA, спиноцеребеларна атаксија; DRPLA, дентаторубропалидолуизијева атрофија.

17 Табела бр. 3. Болести експанзија кодона за аланин Болест Ген* Нормални Мутирани OMIM # алели алели BPES FOXL CCD RUNX CCHS PHOX2B HFG HOXA HPE5 ZIC EIEE1 ARX Низ1: PRTS ARX Низ 1: MRXARX ARX Низ 2: MRGH SOX OPMD PABPN SPD II HOXD *Симболи гена наведени по HUGO (eng. The Human Genome Organisation) номенклатури; # Идентификациони број болести у ОМИМ (eng. Online Mendelian Inheritance in Man) бази података; BPES, блефарофимозис, птоза и epicanthus inversus; CCD, клеидокранијална дисплазија; CCHS, конгенитални централни хиповентилациони синдром; HFG, рука-стопало-генитални синдром; HPE5, холопрозенцефалија; EIEE1, рана инфантилна епилептичка енцефалопатија 1; PRTS, Партингтонов синдром; MRXARX, несиндромске X-везане менталне ретардације сродне са ARX; MRGH, ментална ретардација са изолованим недостатком хормона раста; OPMD, окулофарингеална мишићна дистрофија; SPD II, синполидактилија тип II.