UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU Varijabilnost terpena u prirodnim populacijama Pinus nigra Arnold: uticaj ekoloških parametara i načina izolacije MASTER RAD Kandidat: 153 Mentor: Dr Zorica S. Mitić Niš, 2016.
UNIVERSITY OF NIŠ FACULTY OF SCIENCE AND MATHEMATICS DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY Variability of terpenes in native populations of Pinus nigra Arnold: the impact of environmental variables and isolation methods MASTER THESIS Candidate: 153 Mentor: Dr. Zorica S. Mitić Niš, 2016.
BIOGRAFIJA KANDIDATA, rođena je 15. novembra 1992. godine u Nišu. Završava osnovnu školu Dobrila Stambolić i ekonomsku školu Dušan Trivunac Dragoš u Svrljigu. Prirodnomatematički fakultet u Nišu upisuje 2011. godine na Departmanu za biologiju i ekologiju. Osnovne akademske studije završava 2014. godine i iste godine upisuje Master akademske studije, smer biologija, koje u predviđenom roku završava.
ZAHVALNICA Zahvaljujem se svim profesorima Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu koji su mi predavali tokom osnovnih i master studija, na velikom trudu i zalaganju da nam obezbede što veći klavitetet nastave i nivo znanja. Posebno se zahvaljujem svom mentoru dr Zorici Mitić sa Departamana za biologiju i ekologiju, Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu na izboru teme, neizmernoj saradnji, razumevanju, pomoći i usmeravanju tokom izrade rada. Svojom efikasnom korespodencijom i aktivnim učešćem u svim fazama izrade ovog master rada učinila je da rad na ovom problemu bude lak i produktivan. Posebnu zahvalnost dugujem i prof. dr Bojanu Zlatkoviću sa Departamana za biologiju i ekologiju, Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu na dragocenoj pomoći u sakupljanju biljnog materijala i ekstrakciji klimatskih parametara za istarživane lokalitete. Od velikog značaja za izradu ovog master rada je i stručna pomoć prof. dr Gordane Stojanović i dragih kolega Snežane Jovanović i Ivane Zrnzević sa Departmana za hemiju, Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu, kojima se ovom prilikom od sveg srca zahvaljujem. Veliko hvala kolegama i prijateljima Petru, Mileni i Jeleni. Najveću zahvalnost na bezgraničnoj podršci i pomoći bez koje ne bih završila studije dugujem svojim roditeljima, bratu, suprugu i ćerkici Teoni.
SAŽETAK U radu je analizirana varijabilnost sastava etarskog ulja, dobijenog hidrodestilacijom, i headspace isparljivih komponenti (HSV) četina u autohtonim populacijama Pinus nigra Arnold ssp. nigra na području Srbije. U etarskom ulju četina utvrđeno je prisustvo 16 komponenti zastupljenih u koncentraciji većoj od 0.5%, pri čemu ova jedinjenja, u proseku, čine oko 91.5% ulja. Odnos mono- i seskviterpena je 1 : 1.17, a dve dominantne komponente su germakren D (33.2%) i α-pinen (26.3%). Sa druge strane, headspace metodom, utvđeno je prisustvo 22 komponente, od kojih je samo 9 detektovano u koncentraciji većoj od 0.5%. Ova jedinjanja čine 98.7% ukupnih HSV, pri čemu isparljiviji monoterpeni u potpunosti dominiraju (95.3%), a seskviterpeni su detektovani u veoma niskom procentu (3.5%). Dominatna HSV četina u svim ispitivanim populacija crnog bora je α-pinen (80.1%). Klaster analize na osnovu komponenti etarskog ulja i HSV ukazale su na izdvajanje ispitivanih populacija u dve grupe: jednu grupu čine populacije Zlatibor i Mileševka (var. nigra) sa znatno većim sadržajem dominantnih monoterpena α- i β-pinena (populacije u kojima je materijal sakupljen tokom prolećnih meseci), dok se u drugoj grupi izdvajaju populacije Tara, Uvac (var. nigra) i Goč (var. gocensis) u kojima su ova jedninjenja detekovana u znatno nižem procentu (populacije u kojima su analizirane letnje četine). Regresiona analiza pokazala je da geografski i orografski parametri ne pokazuju statistički značajne korelacije ni sa jednom od ispitivanih komponenti etarskog ulja ili HSV. Sa druge strane, za klimatske parametre možemo reći da ispoljavaju snažan uticaj na grupisanje analiziranih populacija, s obzirom da dominantni, lako isparljivi monotepreni četina (α- i β- pinen) pokazuju jake (R>0.9) negativne korelacije sa svim ispitivanim temperaturnim faktorima. Sa druge strane, dominantni seskviterpeni germakren D i β-kariofilen, kao teže isparljive komponente ulja, nisu pokazali značajne korelacije ni sa jednim od klimatskih parametara. Dobijeni rezultati ukazuju na jasno sezonsko variranje terpena u četinama P. nigra ssp. nigra i snažan uticaj klimatskih parametara na dominantne monoterpenske komponente, zbog čega se terpeni kao hemotaksonomski markeri moraju tretirati sa velikom pažnjom. Ključne reči: Pinus nigra, Srbija, terpeni, varijabilnost
ABSTRACT In this study, the variability of the composition of the needle essential oils obtained by hydrodistillation and headspace volatiles (HSV) in native populations of Pinus nigra Arnold ssp. nigra in Serbia was analyzed. The results for needle essential oil revealed presence of 16 components represented in concentration greater than 0.5%, whereas these compounds, on average, accounted for 91.5% of the total oil composition. The ratio of mono- and sesquiterpenes was 1:1.17, and the two dominant components were germacrene D (33.2%) and α-pinene (26.3%). On the other hand, the headspace method revealed presence of 22 components, but only 9 of them were detected at concentration greater than 0.5%. More volatile monoterpenes have shown complete domination (95.3%), while sesquiterpenes were detected at a very low percentage (3.5%). The dominant HSV in all the examined populations of black pine was α-pinene (80.1%). Cluster analysis based on the components of essential oils and HSV indicated separation of the studied populations into two groups: one group consists of the populations Zlatibor and Mileševka (var. nigra) with a significantly higher content of dominant monoterpenes α- and β-pinene (material collected during the spring months), while the second group consists of populations Tara, Uvac (var. nigra) and Goč (var. gocensis) in which these compounds were detected in a much lower percentage (summer needles were analyzed). Regression analysis indicated that the geographic and orographic parameters did not show statistically significant correlations with any of the tested oil components or HSV. On the other hand, the climate parameters may be assumed to show strong influence on grouping of the analyzed populations, given that dominant, highly volatile monoterpenes (α- and β- pinene) show strong (R>0.9) negative correlations with all studied temperature factors. On the other hand, the dominant sesquiterpenes, germacrene D and β-caryophyllene, as less volatile components of the oil, did not show significant correlation with any of the climatic parameters. The results indicate an obvious seasonal variation of needle terpenes in P. nigra ssp. nigra populations and strong influence of climatic parameters on the dominant monoterpene components. As a result, when terpenes are used as chemotaxonomic markers they must be treated with great caution. Keywords: Pinus nigra, Serbia, terpenes, variability
SADRŽAJ 1. UVOD... 1 1.1. Opšte karakterisitke vrste Pinus nigra Arnold... 1 1.1.1. Sistematski položaj... 1 1.1.2. Habitus i strobilusi... 1 1.1.3. Distribucija i infraspecijska taksonomija... 4 1.2. Opšte karakteristike etarskih ulja... 8 1.2.1. Terpeni kao hemijski konstituenti etarskih ulja... 9 1.2.2. Distribucija i biološka uloga etarskih ulja... 14 1.2.3. Varijabilnost sastava i sadržaja etarskih ulja... 16 1.2.4. Metode izolovanja etarskih ulja... 17 1.2.5. Dosadašnja istraživanja etarskih ulja P. nigra... 20 1.2.6. Upotreba i biološke aktivnosti etarskog ulja P. nigra... 21 2. CILJEVI RADA... 22 3. MATERIJAL I METODE... 23 3.1. Biljni materijal... 23 3.2. GC-FID i GC-MS analiza etarskog ulja i headspace isparljivih komponenti... 25 3.3. Statistička analiza... 26 4. REZULTATI I DISKUSIJA... 28 4.1. Sadržaj i sastav etarskog ulja četina P. nigra ssp. nigra... 28 4.1.1. Promenjivost pojedinačnih komponenti etarskog ulja... 31 4.1.2. Sličnost analiziranih populacija na osnovu komponenti etarskog ulja... 34 4.1.3. Uticaj klimatskih parametara na grupisanje analiziranih populacija... 36 4.1.4. Zavisnost između variranja komponenti etarskog ulja i geografskih, orografskih i klimatskih parametara... 37 4.2. Sadržaj i sastav headspace isparljivih komponenti četina P. nigra ssp. nigra... 40 4.2.1. Promenjivost pojedinačnih headspace isparljivih komponenti... 40 4.2.2. Sličnost analiziranih populacija na osnovu headspace isparljivih komponenti... 43 4.2.3. Zavisnost između variranja headspace isparljivih komponenti i geografskih, orografskih i klimatskih parametara... 44 5. ZAKLJUČCI... 47 6. LITERATURA... 50 7. PRILOG... 55
1. UVOD 1.1. Opšte karakterisitke vrste Pinus nigra Arnold 1.1.1. Sistematski položaj Pinus nigra Arnold (crni ili austrijski bor) taksonomski pripada potklasi Pinidae (=Pinophyta, Pinopsida), redu Pinales i familiji Pinaceae (tabela 1.1). Pripadnost je određena prema filogenetskoj klasifikaciji kopnenih biljaka (Embriophyta), koju su predložili Chase i Reveal, 2009. godine. Tabela 1.1. Položaj vrste P. nigra u filogenetskom sistemu kopnenih biljaka. Klasa (classis): Equisetopsida Potklasa (subclassis): Pinidae Red (ordo): Pinales Familija (familia): Pinaceae Podfamilija (subfamilia): Pinoideae Rod (genus): Pinus Podrod (subgenus): Pinus (Diploxylon) (Gernandt, 2005) Sekcija (section) Pinus (Gernandt, 2005) Podsekcija (subsection) Pinus (Gernandt, 2005) 1.1.2. Habitus i strobilusi Pinus nigra je drvenasta zimzelena vrsta koja raste u visinu do 30, ređe 40 (50) m (slike 1.1, 1.2 i 1.5). Poseduje koru koja je kod odraslih stabala debela, tamnosiva, ispucala u vidu nepravilnih, plitkih, kasnije dubokih, uzdužnih i poprečnih brazda. Kora je po boji jednolična u gornjem i donjem delu stabla (razlika od P. sylvestris) (Zlatković i Šarac, 2016). Krošnja mlađih stabala je širokokupasta, a kod starijih kišobranasta, naročito na plitkom zemljištu na stenovitoj podlozi. Vrhovi grana kod mlađih stabala malo povijeni prema gore, dok kod starijih stabala samo grane pri vrhu krošnje imaju povijene vrhove (Vidaković, 1982). Mlade grane gole, sjajne, pokrivene kratkim, sitnim rombičnim ljuspama. Pupoljci cilindrični, zaoštreni, smolasti, oko 2.5 cm dugi, smeđi. Četine po dve, zelene do tamnozelene, duge 8-18 cm, široke 1.5-2.1 mm, prave ili blago uvijene, obično ostaju na 1
biljkama 4-5 godina, pri bazi su obuhvaćene zajedničkim rukavcem. Smoni kanali u četinama medijalno postavljeni; rukavac trajan, dug 10-12 mm, obavija po dve četine (Jovanović, 1992). Slika 1.1. P. nigra var. nigra na platou kanjona Uvac, jugozapadna Srbija (foto: Zlatković, 2013) Muški i ženski strobilusi se pojavljuju IV-V meseca. Muški strobilusi (mikrostrobilusi) podsećaju na rese, zbijeni su pri osnovi mladih grančica, žutozeleni, gotovo sedeći i kožasti. Sastoje se od spiralno raspoređenih mikrosporofila, raspoređenih oko tanke kožaste osovine. Na mikrosporofilima su, sa spoljne strane, smeštene po dve mikrosporangije ispunjene mikrosporama. Mikrospore (polenova zrna) snabdevene su sa dva mehurasta dodatka koji se formiraju od njihovog spoljnog omotača. Ženski strobilusi (makro-, megastrobilusi) su 5-7.5 cm dugi, i 2-3.5 (4) cm široki, skoro sedeći, smešteni pri vrhu mladih izdanaka. Jajastog su do kupastog oblika, smešteni u grupama od 2-4 komada, sjajnosmeđi. Strobilus je građen od snažnije osovine, sa spiralno raspoređenim makrosporofilima (plodnim ljuspama). Pri bazi plodnih ljuspi nalaze se zaštitne ljuspe, a sa unutrašnje strane, pri bazi 2
plodne ljuspe, smeštena su dva semena zametka. Semeni zameci su mikropilama okrenuti ka osovini strobilusa. Razvijen ženski strobilus (šišarka, conus) je izgrađen od kompaktno raspoređenih, odrvenelih plodnih ljuspi koje su, sa donje strane, crnosmeđe, poprečno ispucale, a na vrhu poseduju štitoliki izraštaj, apofizu. Zreli semeni zameci su izduženo jajasti, 4-6 mm dugi, sivi, sa izduženim, krilastim, poluprozirnim dodatkom 3-4 puta dužim od samog semenog zametka. Sazrevanje šišarke i semenih zametaka traje skoro dve sezone nakon oplođenja (Zlatković i Šarac, 2016). Seme sazri do jeseni druge godine (u septembru ili oktobru, 18 meseci nakon oprašivanja). Šišarke se otvaraju narednog proleća (u trećoj godini) kada se krilasta semena rasejavaju vetrom. Slika 1.2. P. nigra var. nigra u kanjonu Mileševke, jugozapadna Srbija (foto: Zlatković, 2013) 3
1.1.3. Distribucija i infraspecijska taksonomija Prirodno rasprostranjenje crnog bora je južna Evropa, severozapadna Afrika i Mala Azija. Prostire se od 5 zapadne geografske dužine u Španiji i Maroku do 40 istočne geografske dužine u Turskoj; i od 35 južne geografske širine u Maroku i Kipru do 51 severne geografske širine u Nemačkoj i 45 na Krimu (slika 1.3). Slika 1.3. Oblast rasprostranjenja vrste P. nigra prema Euro+Med PlantBase (preuzeto sa: http://euromed.luomus.fi/euromed_map.php?taxon=341361&size=medium) 4
Glavna oblast prostiranja crnoborovih šuma u Srbiji nalazi se u njenom zapadnom i jugozapadnom delu, u srednjem toku reke Drine (Maljen, Tara, Zlatibor, Kremna, Šargan, Viogor), odakle se pružaju na jug u Polimlje (Priboj Crni vrh, Zlatar, Ozren kod Sjenice). U centralnoj Srbiji crnoborove šume su rasprostranjenje po ograncima Golije, Zimovnika, Trnave, u Đakovu, Studenici i Bresniku, po Troglavu, na levoj strani Ibra, po Studenoj, Stolovima, Goču i Kopaoniku, na desnoj strani Ibra. Međutim, u istočnoj Srbiji crni bor ima krajnje sužen areal: Zlotska klisura, Sukovska klisura, Golaš na Suvoj planina i Jarešnik na planini Crnook kod Bosilegrada (slika 1.4.). Obično se javlja na nadmorskoj visini od 500-1300 m, optimalno na visinama od 900-1200 m (Šarac, 2014). Slika 1.4. UTM 10x10 karta rasprostranjenja P. nigra u Srbiji: P. nigra ssp. nigra, P. nigra var. gocensis, P. nigra ssp. pallasiana, P. nigra var. banatica Na osnovu pregleda literaturnih podataka, jasno je da postoje velike razlike između pojedinih autora u percepciji vrste P. nigra. Naime, jedna grupa autora (Svoboda, 1953; Fukarek, 1958; Gaussen, 1960) smatra da je reč o nekoliko malih ili geografskih vrsta koje formiraju agregat (kolektivnu vrstu), dok druga grupa (Schwarz, 1938; Delevoy, 1949; Gaussen et al., 1993) crni bor posmatra kao jednu vrstu sa dve ili više podvrsta i većim brojem nižih infraspecijskih taksona. Gaussen i sar. (1993) u Flori Evrope crni bor tretiraju kao jednu vrstu u okviru koje razlikuju na pet alopatričnih podvrsta: ssp. nigra (od Austrije do centralne Italije i Grčke), ssp. dalmatica (Vis.) Franco (priobalni region i ostrva Dalmacije - Hrvatska), ssp. pallasiana (Lamb.) Holmboe (Balkansko poluostrvo, južni Karpati i Krim), ssp. salzmannii (Dun.) Franco (Ceven i Pirineji - Francuska, centralna i istočna Španija), i ssp. laricio (Poir.) Maire (Kalabrija i Sicilija - Italija i Korzika - Francuska). Na osnovu istraživanja crnog bora na teritoriji Srbije, opisano je nekoliko intraspecijskih taksona čiji odnosi još uvek nisu dovoljno razjašnjeni (Šarac, 2014). Iako je teritorija Srbije, kao deo istočnog areala crnog bora, uključena u relativno veliki broj klasifikacija (npr. Schwartz, 1938, Vidaković, 1955; 1957; Fukarek, 1958; Gaussen et al., 1964; 1993), do sada je sprovedeno svega nekoliko taksonomskih istraživanja na ovim 5
prostorima (Vidaković, 1955; 1957; Bojivić et al., 2012; Šarac et al., 2013; 2015). U Flori Srbije, Jovanović (1992) navodi dve podvrste crnog bora za koje možemo reći da su geografski diferencirane (slika 1.4.) Naime, u zapadnim, jugozapadnim i centralnim delovima Srbije široko je rasprostranjena tipska podvrsta (ssp. nigra) u okviru koje su opisana tri varijeteta: var. nigra, var. zlatiborica Adam. i var. gocensis Đorđević. Jovanović (1992) još navodi da je u "Flori Nacionalnog parka Tara" Gajić (1988) opisao posebnu podvrstu crnog bora (ssp. drinana Gaj.). Sa druge strane, u istočnoj, severoistočnoj i jugoisotičnoj Srbiji gde crni bor ima krajnje sužen areal, opisana je ssp. pallasiana, u okviru koje autor izdvaja varijetet banatica (Endl.) Georg. et Jon. Kod tipske podvrste (ssp. nigra) ovogodišnje grančice su sivosmeđe, starije su crvenkastosmeđe. Ljuspe kraće od rukavaca četina. Četine krupne, tamnozelene, vrlo gusto stojeće, pri vrhovima grančica priklonjene grančici, 8-14 cm duge. Snopići hipodermalnih ćelija, na poprečnom preseku četina, polumesečasti, sa 2-3 slojeva ćelija. Smonih kanala u parenhimu obično oko 11. Šišarice duge 4-8 cm, svetlosmeđe; apofize na srednjim i gornjim ljuspama sa oštrim poprečnim rebrom. Slika 1.5. Pinus nigra var. gocensis na planini Goč, centralna Srbija (foto: Zlatković, 2013) 6
Podvrsta je rasprostranjena širom zapadne, jugozapadne i centralne Srbije (slika 1.4.) sa tri varijeteta: var. nigra (četine tamnozelene, kora odraslih stabala pretežno sa podužnim brazadama; tipičan široko rasprostranjeni oblik u arealu podvrste) (slike 1.1. i 1.2.), var. zlatiborica (četine u gornjoj trećini zlatnožute; poznato po jedno stablo na Murtenici i Zlatiboru) i var. gocensis (četine tamnozelene, kora odraslih stabala sa izraženim poprečnim i podužnim brazdama; opisan sa planine Goč) (slika 1.5.). 7
1.2. Opšte karakteristike etarskih ulja Etarska ulja su mirisne smese isparljivih, lipofilnih sastojaka (sekundarnih biljnih metabolita), koje se sintetišu i lokalizuju u specijalnim sekretornim strukturama biljaka i mogu predestilovati vodenom parom (Petrović et al., 2009). Etarska ulja su uglavnom lako pokretljive, mirisne tečnosti; pojedina su na sobnoj temperaturi viskozna ili čvrste konzistencije. Glavni sastojci etarskih ulja su monoterpeni, seskviterpeni i u manjoj meri derivati fenilpropana. To su različiti ugljovodonici (zasićeni ili nezasićeni), alkoholi, fenoli, estri, aldehidi, ketoni, epoksidi ili karboksilne kiseline. Etarska ulja su smese oko 20-200 sastojaka. Ovi sastojci su, na osnovu koncentracije u etarskom ulju, podeljeni na: glavne (20-95%), sporedne (1-20%) i zastupljene u tragovima (ispod 1%). Etarska ulja najčešće sadrže svega nekoliko glavnih komponenti (npr. karvakrol (30%) i timol (27%) u etarskom ulju Origanum compactum, a mentol (59%) i menton (19%) u ulju Mentha x piperita), a nekada je to samo jedan sastojak (npr. 1,8-cineol (50%) u etarskom ulju Cinnamomum camphora ili linalol (68%) u ulju Coriandrum sativum). Generalno, glavne komponente određuju biološke osobine etarskih ulja (Bakkali et al., 2008). Etarska ulja su uglavnom bezbojne, žute ili žutozelene tečnosti; pojedina su specifično obojena (npr. etarsko ulje cimeta i karanfilića smeđecrveno). Droge sa proazulenima daju destilacijom vodenom parom plavo ili zeleno obojena etarska ulja (npr. plava etarska ulja daju Matricariae flos, Absinthii herba i Millefolii herba). Proazuleni su neisparljivi, bezbojni, gorki seskviterpenski laktoni. Tokom destilacije vodenom parom prelaze u obojene isparljive azulene. Miris etarskih ulja potiče od sastojaka sa kiseoničnim funkcionalnim grupama. On je intenzivan čak i kada su ovi sastojci zastupljeni u niskom procentu (etarsko ulje limuna). U koncentrovanom obliku etarska ulja uglavnom imaju oštar, nadražujući ukus, koji pali. Razblaživanjem ukus uglavnom postaje prijatan. Izuzeci su npr. etarsko ulje anisa i morača koja su slatkog ukusa. Etarska ulja su lipofilna: rastvaraju se u nepolarnim organskim rastvaračima (petroletru, etru, heksanu, ksilenu, metilenhloridu i dr.), koncentrovanom etanolu i masnim uljima. U vodi se rastvaraju samo sastojci sa kiseoničnim funkcionalnim grupama, prvenstveno alkoholi i kiseline (to su oni sastojci etarskih ulja koji se nalaze u infuzu aromatičnih droga). Vodeni rastvori hidrosolubilnih sastojaka etarskih ulja koji se dobijaju 8
kao sporedni produkti prilikom izolovanja etarskih ulja destilacijom vodenom parom ili izmućkavanjem etarskih ulja vodom, nazivaju se aromatične vode. Pod uticajem kiseonika, svetlosti i povišene temperature etarska ulja se lako oksidišu i usmoljavaju. Zato se čuvaju u malim, tamnim, do vrha napunjenim bocama, na hladnom mestu. Posebno veliku tendenciju ka autooksidativnom usmoljavanju imaju etarska ulja sa visokim sadržajem nezasićenih terpenskih ugljovodonika (npr. etarsko ulje limuna). Ovakva etarska ulja se najčešće rektifikuju frakcionom destilacijom, tako što se uklanja deo ugljovodonične frakcije. Deterpenizovana etarska ulja imaju povećanu stabilnost, i istovremeno intenzivniji miris (Petrović et al., 2009). 1.2.1. Terpeni kao hemijski konstituenti etarskih ulja Funkcionalna raznovrsnost jedinjenja izolovanih iz biljaka najbolje je ilustrovana na primeru terpena. Ono što čini ove molekule tako jedinstvenim je raznovrsnost strukture koja nastaje usled velikog broja kombinacija prekursora. Izolovano je na desetine hiljada prirodnih proizvoda, a gruba procena ja da blizu ¼ - ½ izolata čine terpeni (Šarac, 2014). Najmanje 30,000 jedinjenja terpenoidne strukture izvedena su uglavnom iz tri biosintetska prekursora (geranil-pirofosfat, farnezil-pirofosfat i geranil-geranil-pirofosfat), koji predstavljaju polimere sastavljene iz dve, tri ili četiri izoprenske jedinice (molekul 2- metil-1,3-butadiena). Naime, čitava grupa ovih jedinjenja nastala je kondenzacijom C5 izoprenskih jedinica povezanih na način glava-rep (asimetrično povezivanje) (slika 1.6.). Treba reći da postoje i izuzeci od ovog načina vezivanja (skvalen C30 i fitoen C40 iako formirani u potpunosti iz izoprenskih jedinica, u centralnom delu molekula pokazuju vezivanje rep-rep modus). Termin terpen (prvi ga je upotrebio Kekulé) nekada je korišćen da bi se definisali ugljovodonični izomeri opšte formule C10H16 iz terpentinskog ulja (Kekulé, 1966). Još u početku je primećeno da izopren (metilbutadien) nastaje pirolizom terpentina (primarnih pinena), a da zagrevanjem izoprena nastaje dipentan (racemski limonen), što je navelo Wallach-a (Wallach, 1914) da predloži tzv. "izoprensko pravilo" kao vid klasifikacije čitave grupe prirodnih proizvoda - terpenoida (koja nastaju povezivanjem izoprenskih jedinica u maniru glava-rep). Ali, pošto su bila poznata i jedinjenja koja se nisu pokoravala ovom pravilu, npr. eremofilon, bilo je neophodno objasniti biogenezu iregularnih terpena što je i 9
učinio Ružička postulirajući opštiju verziju, tzv. "biogenetičko izoprensko pravilo" (Ružička et al., 1953). Ono glasi: "terpeni su jedinjenja nastala kombinacijom izoprenskih jedinica do alifatičnih jedinjenja poput geraniola, farnezola, geranilgeraniola, skvalena i drugih njima sličnih jedinjenja, i koji se mogu izvesti iz ovih alifatičnih prekursora ciklizacijom, a u nekim slučajevima i mehanizmima koji podrazumevaju preuređenje molekula". Oba ova pravila su isključivo empirijska, ali su bila od velikog značaja u tumačenju biosintetskog porekla sekundarnih matabolita (Mihajilov-Krstev, 2009). Slika 1.6. Načini vezivanja C 5 izoprenskih jedinica u terpenskim molekulima (Šarac, 2014) Uzevši sve ove definice u obzir Barton (1957) je istakao da bi najbolja definicija bila ona koja terpene opisuje kao jedinjenja čiji su ugljovodonični skeleti ili a) teoretski konstruisani iz izoprenskih jedinica ili b) su u nekoj od faza biogeneze bili konstruisani iz izoprenskih jedinica. Kod terpena je izvršena klasifikacija prema broju C5 jedinica na monoterpene- C10, seskviterpene- C15, diterpene- C20, sesterpene- C25, triterpene- C30 i tetraterpene- C40. Politerpeni su jedinjenja molekulske mase preko 100,000, koja nastaju povezivanjem veoma velikog broja C5 izoprenskih jedinica, a najvažniji primeri su gutaperka i kaučuk (Kovačević, 2004). S obzirom da izopren predstavlja gradivni blok u terpenskim jedinjenjima termin izopreni predstavlja sinonim za terpene. Takođe, terpeni koji sadrže kiseonik se označavaju kao terpenoidi ili izoprenoidi (Bakkali et al., 2008). Sam molekul izoprena je proizvod koji nastaje razgradnjom cikličnih ugljovodonika koji se javljaju u prirodi. Osim što nastaje razgradnjom, izopren predstavlja prirodni lako iparljiv proizvod koji emituju mnoge drvenaste 10
biljke (Sharkey et al., 2001). Funkcija izoprena je kontraverzna. Ovo jedinjenje učestvuje u povećanju tolerancije biljaka na visoke temperature pri fotosintezi, stabilizovanjem tilakoidne membrane (Sharkey et al., 2001) ili u nekim slučajevima pokazuje antioksidativnu aktivnost (Loreto i Velikova, 2001). Međutim, iako nastaje prirodnim putem, izopren nije direktno uključen u sintezu terpena, a biohemijski aktivne izoprenske jedinice identifikovane su kao difosfatni (pirofosfati) estri: izopentil-difosfat (IPP) i dimetilalil-difosfat (DMAPP). Monoterpeni Najveći broj monoterpena nastaje iz geranil-pirofosfata (GPP) i ima osnovni skelet od deset ugljenikovih atoma (dve izoprenske jedinice). Na osnovu građe ugljeničnog skeleta mogu se podeliti na aciklične, monociklične i biciklične (slika 1.7.). Regularni, isparljivi monoterpeni su glavni sastojci etarskih ulja velikog broja familija golosemenica i nekih skrivenosemenica u kojima se njihov udeo kreće i do 90%. Nekada su ovi sastojci etarskog ulja povezani sa šećerima (kod matičnjaka i izopa). Drugu grupu regularnih monoterpenskih derivata predstavljaju neisparljivi iridoidi (biciklični sistemi) koji se u biljnim tkivima najčešće nalaze vezani za šećere kao glikozidi (Kovačević, 2004). Na osnovu tipa funkcionalne grupe na osnovnom skeletu, monoterpeni se mogu podeliti u nekoliko grupa (Bakkali et al., 2008): Ugljovodonici: Aciklični: mircen, ocimen itd. Monociklični: terpinen, p-cimen, felandren itd. Biciklični: pineni, δ-3-karen, kamfen, sabinen itd. Alkoholi: Aciklični: geraniol, linalol, citronelol, lavandulol, nerol itd. Monociklični: mentol, α-terpineol, karveol itd. Biciklični: borneol, fenhol, hrizantenol, tujan-3-ol itd. Aldehidi: Aciklični: geranial, neral, citronelal itd. Ketoni: Aciklični: tegeton itd. Monociklični: mentoni, karvon, pulegon, piperiton itd. 11
Biciklični: kamfor, fenhon, tujon, ombelulon, pinokamfon, pinokarvon itd. Estri: Aciklični: linalil-acetat ili propionat, citronelil acetat itd. Monociklični: mentil ili α-terpinil acetat itd. Biciklični: izobornil-acetat itd. Etri: 1,8-cineol, mentofuran itd. Peroksidi: askaridol itd. Fenoli: timol, karvakrol itd. Slika 1.7. Formule nekih čestih acikličnih, monocikličnih i bicikličnih monoterpena (Šarac, 2014) 12
Seskviterpeni Prvi seskviterpeni su izolovani još u XIX veku (kadinen i kariofilen), a 1913. god. je određena struktura farnezola. Od tada pa do danas, utvrđen je veliki broj različitih tipova skeleta ove grupe terpena. Svi oni nastaju iz farnezilpirofosfata (FPP) i se sastoje iz tri izoprenske jedinice (ili 1½ monoterpene; sesqui na latinskom znači 1½), odnosno njihov ugljenični skelet sadrži 15 ugljenikovih atoma (C15). Međutim, intramolekularne ciklizacije, reorganizacije i oksidacije stvaraju veliki broj raznovrsnih struktura. Na osnovu građe molekula, kao i monoterpeni, dele se na aciklične, monociklične i biciklične (slika 1.8.). Zadivljujući je broj mogućih ciklizacija i sekundarnih modifikacija među seskviterpenskim molekulima. Utvrđeno je da postoji nešto više od 200 skeletnih tipova unutar ove grupe: dodatnih pet C atoma i dvostruka veza uslovljavaju fleksibilniji sistem. Isparljivi seskviterpeni su najčešće satojci etarskih ulja, dok drugu grupu predstavljaju neisparljivi seskviterpeni koji u svom molekulu sadrže γ laktonski prsten (seskviterpenski laktoni) (Kovačević, 2004). Kao i monoterpeni, i seskviterpeni su grupisani u nekoliko tipova jedinjenja (Bakkali et al., 2008): Ugljovodonici: azulen, β-bisabolen, kadinen, β-kariofilen, longifolen, kurkumeni, elemeni, farnezeni, zingibereni itd. Alkoholi: bisabol, kedrol, β-nerolidol, farnezol, karotol, β-santalol, patulol, viridiflorol itd. Ketoni: germakron, nootkaton, cis-longipinan-2,7-dion, β-vetinon, turmeroni itd. Epoksidi: kariofilen-oksid, humulen epoksidi itd. 13
Slika 1.8. Formule nekih čestih acikličnih, monocikličnih i bicikličnih seskviterpena (Šarac, 2014) 1.2.2. Distribucija i biološka uloga etarskih ulja Terpeni su veoma raširena grupa sekundarnih metabolita u biljnom svetu, a u znatno manjem broju se sreću u animalnim tkivima (npr. feromoni i neki drugi hormoni insekata su seskviterpenske prirode). Neke biljne familije su posebno bogate etarskim uljima, kao što su Pinaceae, Cupressaceae, Lauraceae, Zingiberaceae, Myrtaceae, Rutaceae, Lamiaceae i Asteraceae. Etarska ulja se mogu naći u svim delovima biljke (korenu, rizomu, stablu, kori, semenu, listovima, cvetovima i plodovima), ravnomerno raspoređena u svim biljnim organima ili samo u određenom biljnom organu - najčešće i u najvećem procentu su zastupljena u listu i cvetu. Prinosi etarskih ulja se obično kreću između 0.2 i 2.0%, mada postoje znatna odstupanja. U zavisnosti od sadržaja etarskog ulja koji može da varira (prinos 14
izuzetno cenjenog ružinog ulja često ne prelazi 0.03%, dok prinos nekih drugih ulja može dostizati i do 20%, npr. etarsko ulje karanfilića) biljke su podeljene u red bogatih ili siromašnih uljem (Gašić, 1985). Etarska ulja se najčešće nalaze u slobodnom stanju i to egzogeno: u žlezdama, žlezdanim ljuspama i žlezdanim dlakama, i endogeno: u sekretornim ćelijama, intercelularnim šizogenim šupljinama i intercelularnim šizogenim i lizogenim rezervoarima. Postoje izuzeci kada su ulja vezana u obliku heterozida (seme crne slačice, seme gorkog badema). U vezanom obliku ulja su bez mirisa, a pod uticajem specifičnih enzima i u prisustvu vode, nastaju isparljivi mirisni sastojci (aglikoni). Biosinteza etarskih ulja se odvija u sekretornim ćelijama sa gustom citoplazmom i većim brojem plastida, mitohondrija i diktiozoma (Simić, 2000). U posebnim delovima biljaka dolazi do akumulacije ulja, najčešće u neposrednoj blizini ili na samim mestima gde i nastaju. Postoji više vrsta sekretornih struktura, u zavisnosti od samih biljaka, i to: 1. ulje se sakuplja na mestu nastanka u ćeliji - modifikovane parenhimske ćelije (idioblasti). Ovo je slučaj kod biljaka familija Lauraceae, Piperaceae, Zingiberaceae, Araceae itd.; 2. međućelijski sekretorni prostori - okrugle šupljine ili cilindrični kanalići koji se prema postanku dele na šizogene (Myrtaceae), lizigene (u plodovima Citrus voća) i šizolizigene (kod Rutaceae); kod predstavnika familije Pinaceae unutar mezofila listova često se nalaze smolni kanali šizogenog porekla, okruženi parenhimskim žlezdanim ćelijama koje produkuju smolu i etarska ulja (slika 1.9.) smolni kanali Slika 1.9. Poprečni presek kroz list (četinu) P. nigra 15
3. žlezde i žlezdane dlake (peltatne i kapitatne dlake) koje se nalaze na površini zeljastih delova biljaka (Asteraceae i Lamiaceae). Biološka funkcija etarskih ulja povezana je sa atraktantnim delovanjem na insekte, čime je obezbeđeno je prenošenje polena i oprašivanje biljaka. Sa druge strane, veoma je značajna i uloga etarskih ulja u zaštiti biljaka od napada insekata i životinja, herbivora. Takođe, gotovo sva ulja više ili manje intenzivno sprečavaju razvoj mikroorganizama, i tako suzbijaju širenje infekcija na biljkama u kojima nastaju. Interesantni su i podaci o specifičnim efektima ulja jedne biljke, koje prelazi u podlogu i inhibira klijanje semena drugih biljaka (alelopatija). Neka etarska ulja sprečavaju klijanje sopstvenih semena i obezbuđuju životni prostor svake individue. Stara je teorija, koja samo delimično može biti prihvaćena, da biljke sintezom i odavanjem ovih isparljivih produkata stvaraju specifičnu mikroklimu, koja ih štiti od prekomerne transpiracije u različitim nepovoljnim uslovima (Kovačević, 2004). 1.2.3. Varijabilnost sastava i sadržaja etarskih ulja Kao što je slučaj i sa drugim sekundarnim metabolitima, i produkcija etarskih ulja je genetski definisana. Samo do nekih granica, genetska kontrola je podložna uticajima endogenih i egzogenih faktora (Kovačević, 2004). Najvažniji faktori koji mogu uticati na sastav i sadržaj etarskog ulja neke vrste (pored njenog genotipa) su: 1. faze ontogenetskog razvoja biljke (pupoljak cveta karanfilića najviše ulja sadrži pred otvaranje, a list matičnjaka neposredno pred cvetanje biljke). Proučavanjem ovakvih uticaja, određuje se optimalno vreme prikupljanja biljnog materijala. 2. vrste tkiva ili organa. Ako neka vrsta sadrži etarska ulja u više organa, analize pokazuju da sastav tih ulja može biti jako sličan (cejlonsko cimetno šiblje) ili različit, kako kvantitativno (cvet, list i stabljika nekih Origanum vrsta razlikuju se i sadrže: 8.5 i 0.08% ulja) tako i kvalitativno (cimet i karanfilić). 3. ekoloških faktora (temperatura, vlažnost i aeracija zemljišta, mineralne soli u podlozi, nadmorska visina, dužina izloženosti svetlu, kvalitet svetlosti, vlažnost vazduha i vazdušna strujanja). Ispitivanje uticaja ovakvih faktora na aromatične sirovine interesantno je sa dva aspekta. Kod samoniklih biljaka mogu biti definisana geografska područja i regioni iz kojih se može dobiti najkvalitetnija sirovina ("droga definisanog geografskog porekla"). U 16
odnosu na gajene vrste, proučavanjem uticaja ovih faktora, mogu biti definisani optimalni uslovi gajenja, koji obezbeđuju količinu i kvalitet biljne mase. 4. načina obrade biljne sirovine i načina izolacije etarskog ulja. Svaka obrada aromatične sirovine (sušenje, usitnjavanje, ekstrakcija) uslovljava delimičan gubitak etarskog ulja i promene njegovog sastava. Procesom industrijske ekstrakcije uvek se dobija oko 20% manje ulja nego u laboratorijskim uslovima. Što se tiče sastava, mnogo više se zna o uljima izolovanim iz biljnog tkiva, nego o nativnom ulju koje se nalazi u sekretornim strukturama biljke. Za njihova ispitivanja se koriste mikrotehnike (uzimanje uzorka iz žlezda kapilarom) i za sada se retko izvode (Kovačević, 2004). 1.2.4. Metode izolovanja etarskih ulja Za izolovanje etarskog ulja iz biljnog materijala koriste se (u zavisnosti od prirode i vrste sirovine, ekonomičnosti metode, primene ulja itd.) sledeće metode: 1. presovanje (ekspresija); 2. hidrodestilacija - destilacija vodenom parom; vodom; vodom i vodenom parom; 2. ekstrakcija pomoću neisparljivih rastvarača (ulja i masti); 3. ekstrakcija pomoću lako isparljivih rastvarača; 4. ekstrakcija gasovima u superkritičnim uslovima; 6. headspace metoda (direktno uzorkovanje, postupak po kome se isparljiva jedinjenja iz uzorka direktno usmeravaju u GC-MS bez predhodnog izolovanja) i 7. ekstrakcijom rastvaračima koja je potpomognuta delovanjem mikrotalasa (ESAM) Svaka od navedenih metoda ima svoje prednosti i nedostatke. Presovanje (mehaničko ceđenje sirovog materijala) je veoma stara tehnologija izolacije etarskih ulja. Primenjuje se kod sirovina meke konzistencije, koje sadrže veliku količinu ulja. Najpoznatiji je proces ceđenja etarskog ulja Citrus plodova, jer se njihovi rezervoari ulja nalaze u spoljašnjim sunđerastim slojevima i mogu se lako mehanički otvoriti i isprazniti. Posle presovanja, dobija se mešavina vodene faze, tkiva i etarskog ulja. Ova masa se centrifugira i odvaja od čvrstih ostataka tkiva, zatim se razdvaja od vode i ostavlja da procesom enzimske fermentacije dođe do potpune razgradnje tkiva i uklanjanja vode. Hidrodestilacija najviše korišćena metoda izdvajanja etarskog ulja iz biljne sirovine je hidrodestilacija, odnosno različite modifikacije i savremene varijante ove tehnologije. S 17
obzirom da se etarska ulja ne mešaju sa vodom niti reaguju hemijski sa njom, moguće je primeniti Daltonov zakon parcijalnih pritisaka i razdvojiti ulje od ostatka tkiva. Postoje tri različita postupka hidrodestilacije: Destilacija vodenom parom predstavlja jednu od najprimenjivanijih tehnika u izolovanju etarskih ulja. Ona je podesnija za ulja sa višom tačkom ključanja, ekonomičnija je i koristi se u većim pogonima (Pekić, 1983). Biljni materijal je smešten na perforiranom dnu destilacionog suda ispod koga se nalazi razvijač pare. Vodena para malog nadpritiska se propušta kroz biljni materijal odozdo naviše i ravnomerno širi. Na ovaj način izbegava se problem kondenzacije i sabijanje materijala (Veličković, 2000). Ovim postupkom dobijaju se ulja visokog stepena čistoće koja sadrže isključivo isparljive sastojke. Međutim, u toku ove operacije, usled dejstva toplote i prisustva vode i organskih kiselina, može u izvesnoj meri doći do transformacije sastojaka ulja prvobitno prisutnih u biljci. Iz ovoga sledi da destilacija vodenom parom može biti pogodna samo za relativno stabilna i u vodi slabo rastvorna etarska ulja, koja se mogu dobiti u velikom prinosu. Destilacija vodom obezbeđuje stalni kontakt biljnog materijala i ključale vode i primenjuje se samo u manjem broju slučajeva. Zagrevanjem destilacionog kotla, voda u kojoj je potopljen biljni materijal se dovodi do ključanja a pare etarskog ulja se odvode u kondenzator. B D Najčešće se koristi postupak koji propisuje Ph. Jug. IV (1991), destilacija vodom u aparatu po Clevenger-u (slika 1.10) u trajanju oko 2.5 h. U sud za destilaciju stavlja se samlevena biljka i voda. Intenzitet zagrevanja se podešava prema količini ulja i brzini kondenzacije od 5.36 cm 3 /min (0.089 cm 3 /s). Etarska ulja se, nakon destilacije, iz vodenog sloja ekstrahuju etrom, pri čemu se gornji sloj prihvata u potpuno suv i čist erlermajer. Dobijeni etarski ekstrakt se zatim, u toku noći u frižideru, suši anhidrovanim Mg2SO4. Nakon filtracije kroz rebrasti filter papir, bistri etarski C A Slika 1.10. Aparatura za destilaciju vodom (A sud za destilaciju, B kondenzator, C cev za merenje zapremine predestilovanog ulja, D bočna cev sa čepom i oduškom 18
ekstrakt se prebacuje u balon sa okruglim dnom i uparava u vakum uparivaču. Dobijeno ulje se pomoću mikropipete prebacuje u kivete i čuva u frižderu do analize. Destilacija vodom i vodenom parom ima široku primenu, naročito u manjim pogonima i kod prenosnih destilacionih uređaja. Ovaj tip destilacije se nekad vrši u sudu koji ima poprečno postavljenu rešetku na koju se stavlja biljni material i ispod koje je na određenom rastojanju nivo vode. Para nastala zagrevanjem je zasićena i nosi kapi vode sa sobom, prodirući kroz biljni materijal (Pekić, 1983). Ekstrakcija uljima i mastima podrazumeva ekstrakcije maceracijom i anfleraž postupak. Topli i hladni anfleraž postupak se koristi za dobijanje veoma finih ulja cvetova, koja se koriste u parfimeriji. Neutralne masne podloge se razlivaju na staklene površine i kada očvrsnu, prekrivaju cvetovima. Difuzijom ulje prelazi u podlogu, a posle određenog vremena stavlja se novi sloj cvetova. Topli anfleraž postupak, predstavlja digestiju cvetova u zagrejanoj podlozi (Kovačević, 2004). Ovako dobijena smeša se direktno može upotrebiti za izradu pomada, ali se češće iz nje etarsko ulje ekstrahuje etanolom. Ekstrakcija lako isparljivim rastvaračima primenjuje se u slučajevima kada želimo da povećamo prinos ulja koje ćemo dobiti, ili kada želimo da ekstrahujemo produkte koje je teško dobiti nekim drugim postupkom. Proizvodi dobiveni na ovaj način nazivaju se rezinoidima i konkretima. Procedura se obavlja u različitim tipovima ekstraktora (nepokretnim ili rotirajućim, Sokslet ekstraktorima i sl.). Za ekstrakciju najčešće se koriste petroletar, heksan, benzen, metanol i etanol. Nakon završene ekstrakcije rastvarač se ukloni destilacijom na normalnom ili sniženom pritisku, a dobijena mirisna masa naziva se ''konkretno ulje'' ili ''konkret''. U toku operacije uklanjanja rastvarača postoji rizik da dođe do razlaganja termolabilnih supstanci, kao i do gubitaka lako isparljivih mirisnih sastojaka. Ekstrakcija gasovima u superkritičnim uslovima je metoda koja se koristi u poslednje vreme kao alternativa postojećim klasičnim postupcima. Njome se mogu prevazići nedostaci najčešće korišćenih metoda destilacije vodenom parom (ulja su izložena visokoj temperaturi) i destilacije primenom lako isparljivih rastvarača (otežano uklanjanje rastvarača i neselektivnost razdvajanja zbog čega su u ulju prisutni smole, voskovi, masna ulja i biljne boje). Postupak ekstrakcija gasovima u superkritičnim uslovima se zasniva na činjenici da neki gasovi, kao što su propan, butan, freoni, CO2 i dr., pod pritiskom prelaze u tečno stanje i imaju osobinu rastvarača. Konstatovano je da pri kritičnoj temperaturi i pritisku od 300 bara, gustina komprimovanog gasa odgovara približno gustini tečnosti. Iz ovoga proizilazi velika moć rastvaranja komprimovanih gasova. Selektivnost rastvaranja se može menjati promenom 19
pritiska i temperature. Komprimovani gas se sa sniženjem pritiska približava osobinama normalnih gasova, tako da se vrlo lako udaljava iz ekstrakta. Najznačajniju primenu za ekstrakciju biljnih supstanci i sirovina ima CO2. Sa njim se lako rukuje, fiziološki je neaktivan i ima relativno nisku cenu. Ovakvim postupkom se dobijaju produkti koji su veoma bliski onima koji se nativno nalaze u biljnom tkivu. Metoda ekstrakcije uz pomoć mikrotalasa predstavlja operaciju u kojoj se mikrotalasima tretira čvrsta faza (svež ili suv biljni material u rastvaraču). Mikrotalasi dovode do naglog povećanja temperature unutar same biljne ćelije, što uzrokuje povećanje pritiska u ćeliji, pucanje ćelijskog zida i izlazak ćelijskog sadržaja u rastvarač. Kratko vreme ekstrakcije omogućava da se i termolabilne komponente izoluju bez degradacije strukture nativnog molekula. Difuzija rastvarača i kinetika ekstrakcije su brže, dok je selektivnost ekstrakcije modifikovana. Jednom rečju, prednosti ESAM tehnologije ogledaju se u sledećem: brzina metode: proces, u zavisnosti od količine obrađivanog materijala, traje od nekoliko sekundi do nekoliko minuta; kvalitet ekstrakcije: smanjuje se termička degradacija; selektivnost je veća; ekonomski aspekt: minimalni utrošak energije, mala količina rastvarača i pogodna za industrijsku primenu. 1.2.5. Dosadašnja istraživanja etarskih ulja P. nigra Sastav etarskih ulja u četinama, mladim izdancima ili šišarkama crnog bora ispitivao je veliki broj autora (pregled u Šarac, 2014). Pojedini autori su utvrdili sastav terpena u n- pentanskim ekstraktima mladih izbojaka (Arbez et al., 1974; Gerber et al., 1995) ili četina (Rafii et al., 1996; Bojovic et al., 2005; Šarac et al., 2013) crnog bora iz različitih delova areala. U svim slučajevima, pokazalo se da je α-pinen glavna komponenta. Takođe, postoji veliki broj radova o etarskim uljima crnog bora dobijenih hidrodestilacijom četina (Chalchat i Gorunovic, 1995a; 1995b; Roussis et al., 1995; Vidrich et al., 1996; Bader et al., 2000; Macchioni et al., 2003; Sezik et al., 2010; Politeo et al., 2011; Ustun et al., 2012; Koutsaviti et al., 2015), grana (Vidrich et al., 1996; Bader et al., 2000; Macchioni et al., 2003; Ustun et al., 2012) ili šišarki (Bader et al., 2000; Macchioni et al., 2003). Sve navedene radove odlikuje dominacija α-pinena, koji je generalno više zastupljen u granama i šišarkama (47-89%), nego u četinama (12-53%) (Roussis et al., 1995; Vidrich et al., 1996; Bader et al., 2000; Macchioni et al., 2003; Ustun et al., 2012). Ipak, u literaturi se može naći i nekoliko radova u kojima je 20
utvrđena dominacija neke druge komponente: β-pinena (ulje izdanaka, Koukos et al., 2001), germakrena D (ulje četina, Ioannou et al., 2014; Koutsaviti et al., 2015), epicikloseskvifelandrena (ulje četina, Roussis et al., 2001) ili manoil oksida (diterpen) (ulje četina, Rezzi et al., 2001; Amri et al., 2014). Headspace analiza grančica (Paci et al., 1989) i terpentina dobijenog parnom destilacijom oleorezina iz različitih organa crnog bora (Williams i Bannister, 1962; Iconomou i Valkanas, 1966) su pokazale dominaciju α-pinena (više od 90%). Na teritoriji Srbije, varijabilnost sastava i sadržaja terpena u četinama P. nigra ispitivana je samo na osnovu n-pentanskih ekstrakata (Šarac et al., 2013). Analizirane su jesenje četine iz sedam prirodnih populacija crnog bora i potvrđen je značaj terpena kao hemotaksonomskih markera na nižim nivoima klasifikacije. Komparativna istraživanja sastava etarskog ulja dobijenog hidrodestilacijom i headspace isparljivih komponenti do sada nisu vršena. Takođe, na osnovu pregleda literaturnih podataka, može se reći da ne postoje podaci o uticaju ekoloških faktora (geografskih, orografskih ili klimatskih) na varijabilnost sastava etarskog ulja kod ove vrste. 1.2.6. Upotreba i biološke aktivnosti etarskog ulja P. nigra Prema Dervendzi (1992), etarsko ulje borova (Pini aetheroleum) najviše se koristi u narodnoj medicini za lečenje respiratornih infekcija praćenih kašljem, bronhitisom, bronhijalnom astom, efizemom, traheitisom, sinuzitisom, laringitisom, faringitisom i influencom. Pored toga, etarska ulja borova široko se koriste kao aditivi u prehrambenoj i industriji alkoholnih pića. U mnogim proizvodima namenjenim za čišćenje, ulja borova poznata su kao osvežavajuća i dezinfekciona sredstva. Takođe, ova ulja intenzivno se koriste u farmaceutskoj, kozmetičkoj i parfimerijskoj industriji. Na osnovu pregleda literaturnih podataka, možemo reći da etarsko ulje P. nigra ispoljava čitav niz bioloških aktivnosti: antimikrobnu (antibakterijsku i antifungalnu) (Toroglu, 2007; Politeo et al., 2011; Šarac et al., 2014); slabu antioksidativnu (Ustun et al., 2012; Šarac et al., 2014); larvicidnu i repelentnu aktivnost protiv Aedes albopictus (Koutsaviti et al., 2015) herbicidnu aktivnost protiv Phalaris canariensis, Trifolium campestre i Sinapis arvesis (Amri et al., 2014). 21
2. CILJEVI RADA Osnovni naučni ciljevi ovog istraživanja mogu se predstaviti u nekoliko teza: 1. Upoznavanje varijabilnosti sastava i sadržaja etarskog ulja i headspace isparljivih komponenti četina u prirodnim populacijama P. nigra ssp. nigra sa područja zapadne, jugozapadne i centralne Srbije. 2. Određivanje uticaja klimatskih faktora na varijabilnost pojedinačnih hemijskih karaktera i stepen sličnosti ispitivanih populacija 3. Utvrđivanje zavisnosti između variranja hemijskih karaktera i osnovnih geografskih, orografskih i klimatskih parametara. 4. Utvrđivanje razlika u sastavu terpena četina P. nigra ssp. nigra u zavisnosti od načina izolacije 5. Definisanje potencijalnih hemotipova koji se javljaju u okviru tipske podvrste crnog bora 22
3. MATERIJAL I METODE 3.1. Biljni material Odabirom populacija P. nigra ssp. nigra, sprovedenim tokom kasnog proleća i leta 2013. godine, obuhvaćeno je 5 populacija na teritoriji Srbije: 1. Tara (Zaovinsko jezero), 2. Zlatibor (selo Tornik), 3. Uvac (Zavojci), 4. Prijepolje (kanjon Mileševke) - P. nigra var. nigra i 5. Goč (Borova kosa) P. nigra var. gocensis. Geografski položaj populacija je određen uz pomoć GPS uređaja (GPS Garmin etrex Vista C). Orografske karakteristike staništa pre svega nadmorska visina i ekspozicija su preuzeti iz SRTM (Shuttle Radar Topography Mission) (Reuter et al., 2007) digitalnog elevacionog modela rezolucije 90 x 90 m (Farr al., 2007) pomoću softvera ArcGIS 10 (ESRI, 2011) (tabela 3.1). Herbarski primerci deponovani su u Herbarijumu Departama za biologiju i ekologiju, Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu (HMN). U svakoj od odabranih populacija crnog bora izvršeno je sakupljanje grančica sa dvogodišnjim četinama sa većeg broja odraslih stabala. U ručnom frižideru ili u specijalnim kesama sa ledom uzorci su sa mesta sakupljanja prenošeni do zamrzivača (- 20 C) na skladištenje do momenta upotrebe. 3.2. Izolovanje etarskog ulja Hidrodestilacija. Iz 100 g svežih i iseckanih četina P. nigra (uklonjenih sa grančica 20 različitih individua iz svake ispitivane populacije) destilovano je etarsko ulje u aparatu tipa Clavenger u toku 2,5 h. Ulje je ekstrahovano etrom, a etarski ekstrakt sušen anhidrovanim Mg2SO4 (European Pharmacopoeia, 1983). Posle odvajanja sredstva za sušenje filtracijom, etar je uklonjen destilacijom na rotacionom-vakuum uparivaču bez zagrevanja, a etarsko ulje čuvano u zatvorenim hromatografskim vijalama na 4 C do analize. Prinos etarskog ulja je izražen preko zapreminskih procenata (%) tj. v/w, obračunato u odnosu na 100 g biljnog materijala. 40 µl svakog ulja razblaženo je etrom do 1mL za dalje hromatografske analize.. 23
Tabela 3.1. Geografski položaj i stanišne karakteristike odabranih populacija P. nigra ssp. nigra. Takson var. nigra P. nigra ssp. nigra var. gocensis Lokalitet Tara (Zaovinsko jezero) Zlatibor (Tornik) Uvac (Zavojci) Prijepolje (kanjon Mileševke) Goč (Borova kosa) Geografska širina (N) 43 52'40.30'' 43 39'59.88'' 43 36'43.65'' 43 21'23.72'' 43 32'19.41'' Geografska dužina (E) 19 24'55.56'' 19 37'33.38'' 19 38'39.86'' 19 45'13.62'' 20 41'41.02'' Nadmorska visina (m) 912 1173 1106 853 1162 Ekspozicija SW NW SW S, SW NW Geološka podloga serpentinit serpentinit serpentinit krečnjak serpentinit Datum sakupljanja 26.06.2013. 28.04.2013. 27.06.2013. 18.05.2013. 23.06.2013. Vaučer broj 6939 HMN 6918 HMN 6937 HMN 6920 HMN 7030 HMN 24
Headspace metoda. Za izolovanje headspace isparljivih komponenti, 500 mg fino usitnjenog biljnog marterijala je smešteno u vijalu od 20 ml i dodato 1 ml destilovane vode. Automatizovanim postupkom vijala je smeštena u kupatilo gde je usledilo zagrevanje uzorka na 80 0 C u toku 20 minuta uz smenjivanje postupka mućkanja (u trajanju od 5 sekundi) i pauziranja (od 2 sekunde). Nakon 20 minuta, HSV su uzorkovane HS-semplerom i injektovane u gasni hromatograf. 3.3. GC-FID i GC-MS analiza etarskog ulja i headspace isparljivih komponenti Svaki uzorak etarskog ulja rastvoren u etru je sniman u triplikatu na 7890/7000B gasnom hromatografu (Agilent Technologies, USA) sa Combi PAL auto-semplerom i HP-5 MS kolonom (5% fenil metil siloksan, 30 m x 0.25 mm i.d. i 0.25 µm debljina filma) kuplovan sa plamenim jonizacionim detektorom 7890A (FID) i masenim detektorom 5977A (MS). Temperaturni program: izotermalno prvih 2.25 minuta 50 0 C, zatim linearni porast temperature (gradijent 4 C/min) od 50 do 290 0 C. Temperatura injektora 250 0 C, interfejsa 300 0 C; protok nosećeg gasa helijuma 1.0 ml/min. Injektovana zapremina ulja 1µL, split 40:1; injektovana zapremina HS isparljivih 500 μl, split 10:1. Bekfleš 1.89 min, na 280 0 C, sa helijumom pod pritiskom od 50 psi. MS uslovi (EI): jonizacija -70 ev, opseg masa 35 435 amu (3 skena u sekundi), vreme skenova 0.2 sekunde. GC-FID analiza je izvedena pod istim eksperimentalnim uslovima kao što je već navedeno za GC-MS analizu. Procentni sastav je preračunat na osnovu površine GC-FID pikova sa hromatograma snimljenih pod istim uslovima kao GC-MS, bez korekcionih faktora. Identifikacija komponenti. Komponente etarskih ulja i headspece isparljive komponente identifikovane su pomoću AMDIS softvera (Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System, Ver. 2.1, DTRA/NIST, 2011), na osnovu lineranih retencionih indeksa (RI), koji su određeni na osnovu retencionih vremena standardne serije n- alkana (C8-C40), snimljene na istom aparatu i pod istim uslovima kao i uzorak ulja. RI su upoređivani sa literaturnim vrednostima (Adams, 2007 i NIST Chemistry WebBook). 25
3.4. Statistička analiza Metodama univarijantne i multivarijantne statistike (Quinn i Keough, 2002) obrađene su samo kompontete detektovane u koncentraciji većoj od 0.5% u etarskom ulju kao i kod headspace isparljivih komponenti. Sve komponente koje su pronađene u tragovima (x < 0.5%) (Lieutier et al., 1991) su isključene iz statističke analize. Statistička obrada podataka je rađena u statističkom programu Statistica, version 5.1 (StatSoft Inc., 1996, Tulsa, OK, USA). Deskriptivna statistika. Za izabrane hemijske karaktere urađena je osnovna deskriptivna statistika (srednja vrednost, maksimum, minimum, standardna devijacija i koeficijent varijacije) na osnovu koje je urađena analiza varijabilnosti pojedinačnih hemijskih karaktera. Ovi rezultati su grafički prikazani uz pomoć whisker box plotova gde je za svaki karakter prikazana njegova hemijska varijabilnost na nivou podvrste. Koeficijent varijacije (CV%) je korišćen za opisivanje hemijske varijabilnosti karaktera i u odnosu na njegove vrednosti karakteri su okarakterisani kao nisko varijabilni (CV% < 10), umereno varijabilni (10 < CV% > 30), visoko varijabilni hemijski karakteri (CV% > 30), oni karakteri kod kojih je CV% >50 su okarakterisani kao jako visoko varijabilni. Klaster analiza. Klaster analiza omogućava grupisanje analiziranih varijabli u grupe ili klastere tako se da slični uzorci nalaze u istoj klasi (klasteru). U ovoj analizi je korišćen algomerativni hijerarhijski metod (UPGMA) koji kao krajnji rezultata produkuje fenogram koji u suštini, može da se shvati kao grafički prikaz sličnosti upoređivanih grupa. Kako bi se izračunala distanca analiziranih jedinica posmatranja, korišćena je Euklidova distanca. Ova analiza je korišćena da bi se utvrdila sličnost između prvobitno neklasifikovanih objekata tj. populacijama u ovom slučaju. Uticaj klimatskih faktora na varijabilnost pojedinačnih hemijskih karaktera i grupisanje populacija. Da bi se utvrdilo u kojoj meri klimatski parametri utiču na grupisanje analiziranih populacija urađena je klaster analiza bazirana na matrici klimatskih parametara. Klimatski parametri (minimalna i maksimalna temperatura i ukupna količina padavina u toku meseca koji je prethodio sakupljanju biljnog materijala kao i meseca tokom koga je materijal sakupljen) za lokalitete su preuzeti iz WorldClimove baze globalnih klimatskih podataka pomoću softvera DIVA-GIS 7.5. (Hijmans et al., 2005, 2012). Dobijene grupe su poređene sa grupama koje su dobijene u klaster analizi hemijskih karaktera. 26
Zavisnost između variranja hemijskih karaktera i osnovnih geografskih, orografskih i klimatskih parametara. Regresiona analiza (linearna regresija) je urađena sa ciljem da se utvrdi međusobna zavisnost između variranja hemijskih karaktera i osnovnih geografskih, orografskih i klimatskih parametara. Ekstrakcija klimatskih (maksimalna i minimalna temperatura, ukupna količina padavina za odabrani mesec) parametara rezolucije 1 km 2 urađena je iz WorlClimovog seta globalnih klimatskih podataka pomoću softvera DIVA- GIS 7.5. (Hijmans et al., 2005, 2012). 27
4. REZULTATI I DISKUSIJA 4.1. Sadržaj i sastav etarskog ulja četina P. nigra ssp. nigra Biljni material P. nigra ssp. nigra prikupljen je sa pet lokaliteta na području zapadne, jugozapadne i centralne Srbije, u periodu od aprila do juna meseca 2013. godine. Iz svežih četina, postupkom hidrodestilacije u aparatu po Clevenger-u izolovana su etarska ulja čiji se prinos nalazi u opsegu 0.20-0.30% (v/w) (tabela 4.1). Kombinacijom GC i GC/MS analize u etarskom ulju istraživanih populacija detektovano je 114 jedinjenja, od kojih je 96 identifikovano. Kvalitativni i kvantitativni sastav ulja je dat u tabeli 4.1, pri čemu su prikazana samo jedinjenja prisutna u koncentraciji većoj od 0.5%. Rezultati deskriptivne statistike za izabrane hemijske karaktere na nivou podvrste predstavljeni su u tabeli 4.2 i na slici 4.3. Dobijeni hromatogrami su prikazani u poglavlju 7. PRILOG (slike 7.1 7.5). U etarskom ulju četina P. nigra ssp. nigra utvrđeno je prisustvo 16 komponenti u koncentraciji većoj od 0.5%: 8 monoterpenskih ugljovodonika, 1 oksidovani monoterpen, 6 seskviterpenskih ugljovodonika i 1 oksidovani diterpen. Ukupno ove komponente čine 91.47% etarskog ulja, pri čemu seskviterpeni dominiraju (48.39%), a monotepreni su nešto slabije zastupljeni (41.51%) (tabela 4.2). Dve dominatne komponente u etarskom ulju četina crnog bora čine zajedno 59.5% ulja: seskviterpenski ugljovodnik, germakren D (13) 1 (prosečna obilnost 33.2%) i monoterpenski ugljovodonik, α-pinen (2) (prosečna obilnost 26.3%). Za preostalih 14 prikazanih komponenti možemo reći da imaju srednje visok sadržaj (0.5-10.0%, prema von Rudloff, 1975; Lieutier et al., 1991). 1 Italic brojevi se odnose na redne brojeve u tabeli 4.1. 28
Seskviteprenski ugljovodonici Monoteprenski ugljovodonici Tabela 4.1. Hemijski sastav etarskog ulja četina u ispitivanim populacijama P. nigra ssp. nigra (prikazana su samo jedinjenja detektovana u koncentraciji većoj 0.5%; dve dominantne komponente su boldirane). Klasa terpena R. br. Komponente Sadržaj % (m/m) Tara Zlatibor Uvac Mileševka Goč 1 α-tujen 0.80 0.68 0.54 0.57 0.65 2 α-pinen 22.75 32.04 26.12 29.14 21.64 3 kamfen 0.54 0.76 0.46 0.88 0.55 4 β-pinene 4.82 13.93 4.12 10.85 4.22 5 mircen 0.78 1.01 0.80 1.21 0.84 6 limonen 2.92 2.84 1.51 2.91 2.73 7 (E)-β-ocimen 0.71 0.85 0.46 0.65 0.91 8 terpinolen 1.39 1.42 1.10 1.12 1.56 Oksidovani monoterpen 9 α-terpinil acetat 0.49 0.26 0.79 1.65 0.84 10 β-kariofilen 8.54 6.80 9.75 9.18 8.72 11 α-humulen 1.53 1.12 1.67 1.78 1.56 12 γ-murolen 2.06 0.70 2.58 1.31 0.00 13 germakren D 38.21 30.78 32.89 27.33 36.72 14 γ-kadinen 1.37 0.45 1.55 0.87 0.76 15 δ-kadinen 3.87 1.34 3.99 2.58 1.94 Oksidovani diterpen 16 manoil oksid 0.10 0.03 0.24 0.09 7.16 Ukupno 90.88 95.01 88.57 92.12 90.80 Monoterpeni 35.20 53.79 35.90 48.98 33.94 Seskviterpeni 55.58 41.19 52.43 43.05 49.70 Prinos ulja % (v/w) 0.27% 0.30% 0.26% 0.24% 0.20% 29
Prosečan hemijski profil glavnih terpenskih komponenti (preko 5%) u etarskom ulju četina P. nigra ssp. nigra u Srbiji možemo predstaviti na sledeći (slika 4.1): germakren D >> α-pinen >>> β-kariofilen > β-pinen (gde > označava razliku 1.1-5.0%, >> razliku 5.1-15.0%, >>> razliku veću od 15.1%) (Petrakis et al., 2001). Međutim, ako uporedimo redosled dominantnih terpena između ispitivanih populacija, možemo primetiti određene razlike. Naime, razlike se pre svega odnose na redosled prve dve komponente, s obzirom da populacije Tara, Uvac i Goč odlikuje dominacija germakrena D, dok je u populacijama Zlatibor i Mileševka α-pinen dominantna komponenta (slika 4.2). Slika 4.1. Prosečni sadržaj (%) dominantnih terpenskih komponenti (preko 5%) u etarskom ulju četina Pinus nigra ssp. nigra Slika 4.2. Varijabilnost dominantnih terpena (>5%) etarskog ulja u istraživanim populacijama P. nigra ssp. nigra 30
Takođe, sadržaj β-pinena se značajno razlikuje između isptivanih populacija, s obzirom da je u populacijama u kojima dominira α-pinen (Zlatibor i Mileševka), β-pinen treća dominantna komponenta, odnosno u populacijama u kojim adominira germakren D (Tara, Uvac i Goč) četvrta. Slika 4.2. Varijabilnost dominantnih terpena (>5%) etarskog ulja u istraživanim populacijama P. nigra ssp. nigra 4.1.1. Promenjivost pojedinačnih komponenti etarskog ulja Promenjivost pojedinačnih hemijskih karaktera analizirana je na osnovu rezultata deskriptivne statistike koji su bazirani na statističkoj obradi podataka 16 komponenti etarskih ulja iz 5 različitih populacija P. nigra ssp. nigra. Kao rezultat deskriptivne statistike, izračunate su srednja vrednost, standardna devijacija i koeficijent varijacije (CV). Srednja vrednost je pokazatelj prosečne vrednosti ispitivanih karaktera i omogućava dalje koišćenje statističkih pokazatelja varijabilnosti standardne devijacije i koeficijenta varijacije. Standardna devijacija, kao mera apsolutne varijabilnosti, ukazuje na prosečno odstupanje vrednosti ispitivanog karaktera od srednje vrednosti. Varijabilnost ispitivanih karaktera se ocenjuje pomoću koeficijenta varijacije i izražava u procentima (Bojović i Mitrović, 2010). Koeficijent varijacije (CV%). Vrednosti koeficijenta varijacije kod ispitivanih komponenti ulja P. nigra ssp. nigra variraju u opsegu od 12.89% do 206.80% (tabela 4.2). Jako visok koeficijent varijacije CV% >50 pokazuje manoil oksid, γ-murolen, α-terpinil acetat i β-pinen. Karakteri koji pokazuju visok nivo koeficijenta varijacije (CV% >30) su γ-kadinen i δ-kadinen. Svi ostali hemijski karakteri pokazuju umeren nivo koeficijenta varijacije (10 < CV% > 30) Najniži koeficijent varijabilnosti hemijskih karaktera pokazuje β-kariofilen (tabela 4.2). 31
Tabela 4.2. Rezultati deskriptivne statistike za 16 komponenti etarskog ulja P. nigra ssp. nigra (dve dominantne komponente su boldirane; Avg - srednja vrednost, Min - minimalna vrednost, Max maksimalna vrednost, St.Dev - standardna devijacija, CV koeficijent varijacije). R. br. Karakter Avg Min Max St.Dev. CV% 1 α-tujen 0.65 0.54 0.80 0.10 15.79 2 α-pinen 26.34 21.64 32.04 4.34 16.48 3 kamfen 0.64 0.46 0.88 0.17 27.43 4 β-pinen 7.59 4.12 13.93 4.52 59.63 5 mircen 0.93 0.78 1.21 0.18 19.60 6 limonen 2.58 1.51 2.92 0.60 23.39 7 (E)-β-ocimen 0.72 0.46 0.91 0.18 24.74 8 terpinolen 1.32 1.10 1.56 0.20 15.22 9 α-terpinil acetat 0.81 0.26 1.65 0.53 65.41 10 β-kariofilen 8.60 6.80 9.75 1.11 12.89 11 α-humulen 1.53 1.12 1.78 0.25 16.35 12 γ-murolen 1.33 0.00 2.58 1.03 77.61 13 germakren D 33.19 27.33 38.21 4.41 13.30 14 γ-kadinen 1.00 0.45 1.55 0.45 45.18 15 δ-kadinen 2.74 1.34 3.99 1.17 42.60 16 manoil oksid 1.52 0.03 7.16 3.15 206.80 monotepreni 41.56 33.94 53.79 9.15 22.02 seskviterpeni 48.39 41.19 55.58 6.13 12.66 Germakren D varira u opsegu od 27.33% do 38.21%. Najniže vrednosti ovog karaktera zabeležene su populaciji Mileševka, a najviše u populaciji Tara. Germakren D spada u karaktere sa umerenom varijabilnošću (CV% = 13.30) (tabele 4.1. i 4.2). α-pinen varira u opsegu od 21.64% do 32.04% i takođe pripada umereno varijabilnim karakterima (CV% = 16.5). Najniže vrednosti ovog karaktera zabeleženu su populaciji Goč, a najviše u populaciji Zlatibor. β-kariofilen varira u opsegu 6.80% do 9.75%. Najniže vrednosti ovog karaktera zabeležene su u populaciji Zlatibor, a najviše u populaciji Goč. Iako i β-kariofilen spada u 32
karaktere sa umerenom varijabilnošu, u poređenju sa ostalim komponentama etarskog ulja možemo reći da pokazuje najniži koeficijent varijabilnosti hemijskih karaktera. β-pinen varira u opsegu 4.12% do 13.93%, i za razliku od ostalih dominantnih komponenti etarskog ulja, pokazuje izuzetno visok koeficijent varijacije (CV% = 59.63). Najniže vrednosti ovog karaktera zabeleženu su populaciji Uvac, a najviše u populaciji Zlatibor. Slika 4.3. Whisker plot za 16 komponenti etarskog ulja P. nigra ssp. nigra 33
4.12. Sličnost analiziranih populacija na osnovu komponenti etarskog ulja Klaster analiza omogućava grupisanje analiziranih varijabli u grupe ili klastere tako se da slični uzorci nalaze u istoj klasi (klasteru). U ovoj analizi je korišćen algomerativni hijerarhijski metod (UPGMA) koji kao krajnji rezultata produkuje fenogram koji u suštini, može da se shavati kao grafički prikaz sličnosti upoređivanih grupa. Ova analiza je korišćena da bi se utvrdila sličnost između prvobitno neklasifikovanih objekata tj. populacijama u ovom slučaju. Klaster analiza je pokazala izdvajanje ispitivanih populacija P. nigra ssp. nigra u dve grupe (klastera) (slika 4.4): jednu grupu čine populacije Tara, Uvac i Goč, dok se u drugoj grupi kao par najsličnijih populacija grupišu populacije Zlatibor i Mileševka. Dobijene grupe populacija se pre svega razlikuju na osnovu sadržaja glavnih terpenskih komponenti u etarskom ulju četina, s obzirom da prvu grupu populacija (Tara, Uvac i Goč) odlikuje dominacija germakrena D, dok je u drugoj grupi (populacije Zlatibor i Mileševka) α-pinen dominantna komponenta (slika 4.2, tabela 4.1). Pored toga, sadržaj β-pinena, kao komponente koja pokazuje izuzetno visok koeficijent varijacije (CV% = 59.63), značajno se razlikuje između ispitivanih populacija. U prvoj grupi, koju odlikuje dominacije germakrena D, sadržaj β-pinena je relativno nizak, tako da β-pinen zauzuima četvrto mesto u redosledu dominantnih terpena u etarskom ulju četina. Kao posledica toga, možemo primetiti da je sadržaj ukupnih seskviterpena u prvoj grupi populacija veći, dok su monoterpeni slabije zastupljeni. Sa druge strane, u drugoj grupi, koju odlikuje dominacija α-pinena, sadržaj β-pinen je znatno veći, tako da β-pinen zauzima treće mesto u redosledu dominantnih terpena. Na taj način, drugu grupu odlikuje veći sadržaj ukupnih monoterpena, a sekviterpeni su slabije zastupljeni. Rezultati klaster analize pokazali su da se četiri ispitivane populacije var. nigra, na osnovu satava terpena u etarskom ulja četina, međusobno značajno razlikuju. Naime, populacije Tara i Uvac (var. nigra) sličnije su populaciji Goč iz centralne Srbije, koja je opisana kao var. gocensis, dok se preostale dve populacije var. nigra (Zlatibor i Mileševka) izdvajaju kao najsličniji par populacija u posebnom klasteru. Na ovaj način, možemo zaključiti da utvrđeni terpenski profili nisu saglasni sa tradicionalnom infraspecijskom klasifikacijom P. nigra ssp. nigra. Poznato je da je sadržaj etarskog ulja u aromatičnim biljkama genetski determinisan, ali i da mnogi endogeni (fenofaza ontogenetskog razvoja) i egzogeni faktori (nadmorska visina, sastav zemljišta i klima) imaju veliki uticaj na njegovu produkciju. Prema tome, uočene razlike u sastavu etarskog ulja između ispitivanih populacija 34
crnog bora, su verovatno posledica uticaja određenih ekoloških parametara, a ne razlika u genotipovima između ispitivanih taksona. Slika 4.4. Dendogram na osnovu "Unweighted pair-group average method (Euclidean distances)" 16 terpenskih komponenti etarskog ulja iz 5 populacija P. nigra ssp. nigra Slika 4.5. Dendogram na osnovu "Unweighted pair-group average method (Euclidean distances)" 6 klimatskih faktora za 5 lokaliteta P. nigra ssp. nigra 35
4.1.3. Uticaj klimatskih parametara na grupisanje analiziranih populacija Da bi se utvrdilo u kojoj meri klimatski parametri utiču na grupisanje analiziranih populacija urađena je klaster analiza bazirana na matrici klimatskih parametara. Klimatski parametri (minimalna i maksimalna temperatura i ukupna količina padavina u toku meseca koji je prethodio sakupljanju biljnog materijala kao i meseca tokom koga je materijal sakupljen) za lokalitete su prikazani u tabeli 4.3. Tabela 4.3. Klimatske karakterisitke analiziranih lokaliteta za dati period. Klimatski faktori Tara 26.06.2013. Lokalitet i datum sakupljanja biljnog materijala Zlatibor 28.04.2013. Uvac 27.06.2013. Mileševka 18.05.2013. Goč 23.06.2013. TMIN 1 6.20-0.60 6.50 3.00 7.00 TMAX 1 16.10 8.00 16.20 12.70 16.90 PREC 1 102.00 62.00 104.00 85.00 98.00 TMIN 2 9.40 2.30 9.70 7.30 10.10 TMAX 2 19.5 11.40 19.60 17.70 20.30 PREC 2 105 76.00 101.00 102.00 93.00 TMIN 1 i TMAX 1 minimalna i maskimalna temperatura meseca koji je prethodio sakupljanu materijala; TMIN 2 i TMAX 2 minimalna i maksimalna temperatura meseca sakupljanja; PREC 1 ukupna koločina padavina meseca koji je prethodio sakupljanu materijala; PREC 2 ukupna količina padavina meseca sakupljanja Klaster analiza bazirana na klimatskim faktorima je pokazala grupisanje lokaliteta u tri grupe (slika 4.5): prvu grupu čini populacija Zlatibor u kojoj je materijal sakupljen krajem aprila meseca, drugu grupu populacija Mileševka u kojoj je materijal prikupljen u drugoj polovini maja, i na kraju treću grupu čine populacije Tara, Uvac i Goč u kojima je materijal sakupljen u drugoj polovini juna meseca. Ako pogledamo klimatske karakterisitke analiziranih likaliteta za dati period, jasno je da su na ovakvo grupisanje lokaliteta uticale niske minimalne i maksimalne temperature kao i manja količina padavina u prolećnim mesecima (pre svega aprilu, a zatim i maju) u poređenju sa vrednostima ovih klimatskih faktora u letnjim mesecima. Ako dobijene grupe uporedimo sa grupama koje su dobijene u klaster analizi komponenti etarskog ulja, možemo uočiti da postoji podudarnost između rezultata ove dve analize. Naime, na osnovu sastava etarskog ulja, kao najsličnije izdvojile su se populacije u 36
kojima je materijal sakupljen početkom leta (jun), dok su se u drugoj grupi kao par najsličnijih populacija izdvojile populacije u kojima je materijal sakupljen tokom prolećnih meseci (april i maj). Na ovaj način, možemo pretpostaviti da se uočene razlike u sastavu terpena četina P. nigra ssp. nigra mogu objasniti različitim uticajem klimatskih faktora. 4.1.4. Zavisnost između variranja komponenti etarskog ulja i geografskih, orografskih i klimatskih parametara Regresiona analiza (linearna regresija) je urađena sa ciljem da se utvrdi međusobna zavisnost između variranja komponenti etarskog ulja i osnovnih geografskih, orografskih i klimatskih parametara. Rezultati linearne regresije su predstavljeni u tabeli 4.4. Regresiona analiza je pokazala da geografski i orografski parametri ne pokazuju statistički značajne korelacije ni sa jednom od ispitivanih komponenti etarskog ulja. Sa druge strane, za klimatske parametre možemo reći da ispoljavaju snažan uticaj na hemijsku diferencijaciju analiziranih populacija. Naime, glavne monoteprenske komponente u etarskom ulju P. nigra ssp. nigra, α-pinen i β-pinen, nalaze se pod snažnim uticajem klimatskih parametara, s obzirom da su oba jedinjenja snažno (R>0.9) negativno korelisana sa svim ispitivanim temperaturnim faktorima. Dakle sa porastom temperature (minimalne i maksimalne temperature u toku meseca koji je prethodio sakupljanju biljnog materijala kao i meseca tokom koga je materijal sakupljen) sadržaj α-pinena i β-pinena u etarskom ulju četina se smanjuje, i obrnuto (slika 4.6). Kao posledica ovakvih korelacija, α-pinen je prva, a β- pinen treća dominantna komponeta u etarskom ulju četina sakupljenim u proleće (april i maj) sa nižim minimalnim i maksimalnim temperaturama. Sa druge strane, u etarskom ulju četina koje su sakupljanje tokom početkom leta (jun) sa višim minimalnim i maksimalnim temperaturama α-pinen je druga, a β-pinen četvrta dominantna komponeta. S obzirom da monoteprenski ugljovodonici, α-pinen i β-pinen, spadaju u lako isparljive komponente ulja (Pavićević et al., 2016), ovakve korelcije su u potpunosti i očekivane. Međutim, ako uporedimo ova dva monoterpena međusobno, možemo primetiti da β-pinen ispoljava jače negativne korelacije i to sa svim temperaturnim faktorima. Osim sa temperaturnim, β-pinen je snažno negativno korelisan i sa ukupnom količinom padavina u toku meseca koji je prethodio sakupljanju četina. Sa druge strane, seskviterpenski ugljovodonik α-humulen pokazuje jaku pozitivnu korelaciju sa ukupnom količinom padavina u toku meseca sakupljanja materijala. 37
Za razliku od dominantnih monoteprena, dominantni sekviterpeni germakren D i β- kariofilen, koji predstavljaju teže isparljive komponente etarskog ulja, nisu pokazali značajne korelacije ni sa jednim od ispitivanih klimatskih faktora. Table 4.4. Rezultati linearne regresione analize (R) za analizirane geografske, orografske i klimatske parametre. Statistički značajne korelacije (p<0.05) su boldirane. LON LAT ALT TMIN 1 TMAX 1 TMIN 2 TMAX 2 PREC 1 PREC 2 α-tujen -0.20 0.80-0.12 0.00 0.00-0.07-0.09-0.02-0.06 α-pinen -0.45-0.31 0.04-0.92-0.92-0.88-0.87-0.85-0.57 kamfen -0.13-0.56-0.37-0.77-0.73-0.66-0.59-0.74-0.30 β-pinen -0.29-0.28-0.02-0.98-0.97-0.94-0.91-0.96-0.66 mircen -0.08-0.73-0.39-0.67-0.63-0.54-0.47-0.63-0.19 limonen 0.09 0.02-0.34-0.39-0.36-0.35-0.30-0.44-0.21 (E)-β-ocimen 0.55 0.06 0.36-0.27-0.28-0.33-0.32-0.45-0.60 terpinolen 0.53 0.38 0.47 0.03 0.01-0.08-0.10-0.15-0.47 α-terpinil acetat 0.20-0.83-0.60 0.15 0.20 0.31 0.38 0.20 0.52 β-kariofilen 0.11-0.32-0.38 0.76 0.78 0.83 0.85 0.83 0.85 α-humulen 0.13-0.46-0.59 0.64 0.68 0.76 0.80 0.71 0.88 γ-murolen -0.75 0.33-0.41 0.28 0.28 0.30 0.28 0.46 0.61 germakren D 0.22 0.73 0.21 0.67 0.64 0.56 0.51 0.59 0.22 γ-kadinen -0.38 0.35-0.33 0.71 0.71 0.71 0.69 0.83 0.80 δ-kadinen -0.47 0.36-0.46 0.65 0.66 0.67 0.65 0.79 0.84 manoil oksid 0.77-0.21 0.46 0.47 0.46 0.42 0.41 0.27-0.10 TMIN 1 i TMAX 1 minimalna i maskimalna temperatura meseca koji je prethodio sakupljanu materijala; TMIN 2 i TMAX 2 minimalna i maksimalna temperatura meseca sakupljanja; PREC 1 ukupna koločina padavina meseca koji je prethodio sakupljanu materijala; PREC 2 ukupna količina padavina meseca sakupljanja 38
Slika 4.6. Korelacije između temperaturnih faktora i dominantnih monoterpena u etarskom ulju P. nigra ssp. nigra. Oznake klimatskih faktora se nalaze u tabeli 4.4. 39
4.2. Sadržaj i sastav headspace isparljivih komponenti četina P. nigra ssp. nigra Kvalitativni i kvantitativni sastav headspace isparljivih komponenti (headspace volatiles - HSV) četina P. nigra ssp. nigra dat je u tabeli 4.5, pri čemu su prikazana samo jedinjenja prisutna u koncentraciji većoj od 0.5%. Rezultati deskriptivne statistike za izabrane hemijske karaktere na nivou podvrste predstavljeni su u tabeli 4.6 i na slici 4.9. Dobijeni hromatogrami su prikazani u poglavlju 7. PRILOG (slike 7.1 7.5). Headspace metodom izolacije, utvđeno je prisustvo 22 isparljive komponente (HSV), od kojih je samo 9 detektovano u koncentraciji većoj od 0.5%: 7 monoterpenskih i 2 seskviterpenska ugljovodonika. U proseku ove komponente čine 98.66% ukupnih HSV, pri čemu isparljiviji monoterpeni u potpunosti dominiraju (95.31%), a seskviterpeni su detektovani u veoma niskom procentu (3.53%) (tabela 4.6). Dominatna HSV četina u svim ispitivanim populacija crnog bora je α-pinen (2) 2 (prosečna obilnost 80.11%). Pored α- pinena, samo je još β-pinen (4) detektovan u koncentraciji većoj od 5% (prosečna obilnost 9.43%) (slika 4.7). Ova dva jedinjenja su najzastupljenije komponente, u okviru monoterpenske frakcije, i u etarskom ulju četina (tabela 4.2 i slika 4.1). Slika 4.7. Prosečni sadržaj (%) dominantnih headspace isparljivih komponenti (preko 5%) četina Pinus nigra ssp. nigra 4.2.1. Promenjivost pojedinačnih headspace isparljivih komponenti Koeficijent varijacije (CV%). Vrednosti koeficijenta varijacije kod ispitivanih HSV četina P. nigra ssp. nigra variraju u opsegu od 4.68% do 56.35% (tabela 4.6). Jako visok koeficijent varijacije CV% >50 pokazuje samo β-pinen, koji se pokazao kao visoko varijabilna komponenta i u etarskom ulju četina (poglavlje 4.1.1. Promenjivost pojedinačnih komponenti etarskog ulja). Takođe, samo jedan karakter, limonen, pokazuje visok nivo 2 Italic brojevi se odnose na redne brojeve u tabelama 4.5 i 4.6. 40
koeficijenta varijacije (CV% >30). Većina ostalih HSV pokazuju umeren nivo koeficijenta varijacije (10 < CV% > 30): α-tujen, kamfen, terpinolen, β-kariofilen i germakren D. Dominantnu HSV, α-pinen, i mircen možemo okarakterisati kao nisko varijabilne komponete (CV% > 10%). Tabela 4.5. Headspace isparljive komponente (HSV) četina u ispitivanim populacijama P. nigra ssp. nigra (prikazana su jedinjenja detektovana u koncentraciji većoj 0.5%; dominantna komponenta je boldirana). Klasa terpena R. br. Komponente Sadržaj % (m/m) Monoteprenski ugljovodonici Seskviteprenski ugljovodonici Tara Zlatibor Uvac Mileševka Goč 1 α-tujen 1.79 1.23 1.02 0.97 1.29 2 α-pinen 81.89 73.51 86.87 76.77 81.51 3 kamfen 0.91 0.93 0.81 1.07 1.00 4 β-pinen 5.43 16.55 5.05 13.67 6.43 5 mircen 1.06 1.03 1.05 1.16 1.07 6 limonen 2.86 1.93 1.15 1.53 2.26 7 terpinolen 0.66 0.55 0.42 0.46 0.65 8 β-kariofilen 1.04 0.88 1.01 1.27 1.24 9 germakren D 2.75 2.21 1.70 1.72 2.93 Ukupno 98.39 98.82 99.08 98.62 98.38 Monoterpeni 94.60 95.73 96.37 95.63 94.21 Seskviterpeni 3.79 3.09 2.71 2.99 4.17 Tabela 4.6. Rezultati deskriptivne statistike za 9 HSV P. nigra ssp. nigra (Avg - srednja vrednost, Min - minimalna vrednost, Max maksimalna vrednost, St.Dev - standardna devijacija, CV koeficijent varijacije). R. br. Karakter Avg Min Max St.Dev. CV% 1 α-tujen 1.26 0.97 1.79 0.33 25.85 2 α-pinen 80.11 73.51 86.87 5.14 6.41 3 kamfen 0.94 0.81 1.07 0.10 10.37 4 β-pinen 9.43 5.05 16.55 5.31 56.35 5 mircen 1.07 1.03 1.16 0.05 4.68 6 limonen 1.95 1.15 2.86 0.66 33.90 7 terpinolen 0.55 0.42 0.66 0.11 19.80 8 β-kariofilen 1.09 0.88 1.27 0.16 15.09 9 germakren D 2.26 1.70 2.93 0.57 25.17 monotepreni 95.31 94.21 96.37 0.88 0.93 seskviterpeni 3.35 2.71 4.17 0.61 18.11 41
α-pinen varira u opsegu od 76.77% do 86.87%. Najniže vrednosti ovog karaktera zabeležene su populaciji Mileševka, a najviše u populaciji Uvac. α-pinen spada u nisko varijabilne karaktere (CV%=6.41) (tabele 4.5 i 4.6). β-pinen varira u opsegu 4.12% do 13.93%, i za razliku od najzastupljenije HSV, pokazuje izuzetno visok koeficijent varijacije (CV% = 56.35). Najniže vrednosti ovog karaktera zabeležene su populaciji Uvac, a najviše u populaciji Zlatibor. Slika 4.8. Varijabilnost glavnih headspace isparljivih komponenti četina (>5%) u istraživanim populacijama P. nigra ssp. nigra 42
Slika 4.9. Whisker plot za 9 headspace isparljivih komponenti četina P. nigra ssp. nigra 4.2.2. Sličnost analiziranih populacija na osnovu headspace isparljivih komponenti Klaster analiza na osnovu 9 HSV pokazala je izdvajanje ispitivanih populacija P. nigra ssp. nigra u dve grupe (slika 4.10), koje su veoma slične grupama dobijenim na osnovu klaster analize komponenti etarskog ulja (slika 4.4): jednu grupu čine populacije Tara, Goč i Uvac, dok se u drugoj grupi kao par najsličnijih populacija grupišu populacije Zlatibor i Mileševka. Dobijene grupe se pre svega izdvajaju na osnovu sadržaja jedine HSV koja pokazuje izuzetno visok koeficijent varijacije (CV% = 56.35), odnosno β-pinena. Naime, sadržaj β-pinena je značano veći u populacijama Zlatibor i Mileševka, u kojima je materijal sakupljen tokom prolećnih meseci i obrnuto, sadržaj ovog monoterpena je značajno manji u populacijama Tara, Goč i Uvac, u kojima su analizirane letnje četine. Sa druge strane sadržaj α-pinena, kao komponente koja pokazuje apsolutnu dominaciju među HSV, je izuzetno malo varijabilan između ispitivanih populacija (CV%=6.41), i kao takav verovatno nije imao značajnog uticaja na uočenu diferencijaciju populacija. Rezultati ove analize su, takođe, saglasni i sa klaster analizom baziranom na klimatskim faktorima za date lokalitete (slika 4.5). 43
Slika 4.10. Dendogram na osnovu "Unweighted pair-group average method (Euclidean distances)" 9 headspace isparljivih komponenti četina iz 5 populacija P. nigra ssp. nigra 4.2.3. Zavisnost između variranja headspace isparljivih komponenti i geografskih, orografskih i klimatskih parametara Regresiona analiza (linearna regresija) je urađena sa ciljem da se utvrdi međusobna zavisnost između variranja HSV i osnovnih geografskih, orografskih i klimatskih parametara. Rezultati linearne regresije su predstavljeni u tabeli 4.7. Kao i u slučaju etarskih ulja, regresiona analiza je pokazala da geografski i orografski parametri ne pokazuju statistički značajne korelacije ni sa jednom od ispitivanih HSV. Sa druge strane, za klimatske parametre možemo reći da ispoljavaju snažan uticaj na najzastupljenije monoterpene, i to pre svega na β-pinen. Naime, β-pinen pokazuje jake (R>0.9) negativne korelacije sa svim ispitivanim temperaturnim faktorima (slika 4.11). Prema tome sa porastom temperature (minimalne i maksimalne temperature u toku meseca koji je prethodio sakupljanju biljnog materijala kao i meseca tokom koga je materijal sakupljen) sadržaj β-pinena u četinama se smanjuje, i obrnuto (slika 4.11). Osim sa temperaturnim, β- pinen je snažno negativno korelisanin i sa ukupnom količinom padavina u toku meseca koji je 44
prethodio sakupljanju četina, za razliku od α-pinen koji pokazuje pozitivnu korelaciju sa ovim klimatskim faktorom. Table 4.7. Rezultati linearne regresione analize (R) za analizirane geografske, orografske i klimatske parametre. Statistički značajne korelacije (p<0.05) su boldirane. LON LAT ALT TMIN 1 TMAX 1 TMIN 2 TMAX 2 PREC 1 PREC 2 α-tujen -0.19 0.85-0.15 0.26 0.25 0.18 0.16 0.24 0.15 α-pinen 0.08 0.22 0.04 0.89 0.87 0.85 0.82 0.92 0.65 kamfen 0.41-0.62-0.40-0.24-0.19-0.13-0.06-0.30-0.02 β-pinen -0.18-0.38 0.00-0.96-0.95-0.91-0.88-0.96-0.67 mircen 0.09-0.73-0.74 0.02 0.08 0.19 0.27 0.08 0.49 limonen 0.06 0.65-0.14 0.17 0.17 0.11 0.11 0.11 0.04 terpinolen 0.33 0.54 0.10 0.22 0.22 0.14 0.13 0.10-0.10 β-kariofilen 0.59-0.66-0.43 0.44 0.48 0.55 0.61 0.39 0.52 germakren D 0.47 0.50 0.23 0.34 0.32 0.24 0.23 0.19-0.10 TMIN 1 i TMAX 1 minimalna i maskimalna temperatura meseca koji je prethodio sakupljanu materijala; TMIN 2 i TMAX 2 minimalna i maksimalna temperatura meseca sakupljanja; PREC 1 ukupna koločina padavina meseca koji je prethodio sakupljanu materijala; PREC 2 ukupna količina padavina meseca sakupljanja 45
Slika 4.11. Korelacije između klimatskih faktora i sadržaja β-pinena u okviru headspace isparljivih komponenti. Oznake klimatskih faktora se nalaze u tabeli 4.7 46
5. ZAKLJUČCI 1. U etarskom ulju četina iz pet autohtonih populacija P. nigra ssp. nigra sa područja zapadne, jugozapadne i centralne Srbije (dobijenog postupkom hidrodestilacije), detektovano je 114 jedinjenja, od koji je 96 identifikovano. Od toga je samo 16 jedinjenja zastupljeno u koncentraciji većoj od 0.5%, pri čemu ove komponente, u proseku, čine oko 91.47% ulja. Odnos mono- i seskviterpena je 1 : 1.17, a prosečan hemijski profil glavnih terpenskih komponenti (preko 5%) je sledeći: germakren D >> α-pinen >>> β-kariofilen > β-pinen (gde > označava razliku 1.1-5.0%, >> razliku 5.1-15.0%, >>> razliku veću od 15.1%; Petrakis et al., 2001). 2. Headspace metodom izolacije, utvđeno je prisustvo 22 isparljive komponente (HSV), od kojih je 9 detektovano u koncentraciji većoj od 0.5%. Ove komponente čine 98.66% ukupnih HSV, pri čemu isparljiviji monoterpeni u potpunosti dominiraju (95.31%), a seskviterpeni su detektovani u veoma niskom procentu (3.53%). Dominatna HSV četina u svim ispitivanim populacija crnog bora je α-pinen (80.11%). Pored α-pinena, samo je još β-pinen detektovan u koncentraciji većoj od 5% (9.43%). 3. Klaster analiza na osnovu komponenti etarskog ulja pokazala je izdvajanje ispitivanih populacija u dve grupe: jednu grupu čine populacije Tara, Uvac i Goč, dok se u drugoj grupi kao par najsličnijih populacija grupišu populacije Zlatibor i Mileševka. Izdvojene grupe populacija se pre svega razlikuju na osnovu sadržaja glavnih monoterpenskih komponenti etarskog ulja α- i β-pinena: u populacijama Tara, Uvac i Goč ova jedinjenja su detektovana u značajno nižem procentu (grupa sa većim sadržajem ukupnih seskviterpena), za razliku od populacija Zlatibor i Mileševka (grupa u kojoj dominiraju monoterpeni). Klaster analiza na osnovu HSV, ukazala je na slično grupisanje ispitivanih populacija P. nigra ssp. nigra, stim što su razlike između dve grupa populacija, uglavnom posledica razlika u sadržaju β-pinena, dok se α-pinen se pokazao kao nisko varijabilan karakter. 4. Klaster analiza bazirana na klimatskim faktorima pokazala je grupisanje lokaliteta u tri grupe: prvu grupu čini populacija Zlatibor biljni materijal sakupljenen krajem aprila; drugu grupu populacija Mileševka - druga polovina maja; i na kraju treću grupu čine populacije Tara, Uvac i Goč - druga polovina juna. Na ovakvo grupisanje lokaliteta uticale su niske minimalne i maksimalne temperature kao i manja količina padavina u 47
prolećnim mesecima u poređenju sa vrednostima ovih klimatskih faktora tokom leta. Ako ove grupe uporedimo sa grupama koje su dobijene u klaster analizi komponenti etarskog ulja i HSV, možemo uočiti da postoji podudarnost između rezultata ovih dve analiza. Na ovaj način, možemo pretpostaviti da se uočene razlike u sastavu terpena četina P. nigra ssp. nigra mogu objasniti različitim uticajem klimatskih faktora 5. Regresiona analiza pokazala je da geografski i orografski parametri ne pokazuju statistički značajne korelacije ni sa jednom od ispitivanih komponenti etarskog ulja ili HSV. Sa druge strane, za klimatske parametre možemo reći da ispoljavaju snažan uticaj na hemijsku diferencijaciju analiziranih populacija. Glavne monoteprenske komponente u etarskom ulju četina, α- i β-pinen, nalaze se pod snažnim uticajem klimatskih parametara, s obzirom da su oba jedinjenja jako (R>0.9) negativno korelisana sa svim ispitivanim temperaturnim faktorima. Kao posledica ovakvih korelacija, α-pinen je prva, a β-pinen treća dominantna komponeta u etarskom ulju prolećnih četina, dok je u ulju letnjih četina α-pinen druga, a β-pinen četvrta dominantna komponeta. S obzirom da ova jedinjenja spadaju u lako isparljive komponente etarskog ulja, možemo reći da su ovakve korelacije u potpunosti i očekivane. Međutim, ako uporedimo ove dva monoterpena međusobno, možemo primetiti da β-pinen ispoljava jače negativne korelacije i to sa svim temperaturnim faktorima. Osim sa temperaturnim, β-pinen je snažno negativno korelisan i sa ukupnom količinom padavina u toku meseca koji je prethodio sakupljanju četina. Za razliku od dominantnih monoteprena, dominantni sekviterpeni germakren D i (E)- kariofilen, kao teže isparljive komponente ulja, nisu pokazali značajne korelacije ni sa jednim od ispitivanih klimatskih faktora. 6. Rezultati ovag rada pokazali su da se četiri ispitivane populacije var. nigra, na osnovu satava terpena u četinama, međusobno značajno razlikuju, s obzirom da su populacije Tara i Uvac (var. nigra) sličnije su populaciji Goč iz centralne Srbije, koja je opisana kao var. gocensis, dok se preostale dve populacije var. nigra (Zlatibor i Mileševka) izdvajaju kao najsličniji par populacija u posebnom klasteru. Na ovaj način, možemo zaključiti da utvrđeni terpenski profili nisu saglasni sa tradicionalnom infraspecijskom klasifikacijom tipske podvste crnog bora (P. nigra ssp. nigra) na području Srbije. Poznato je da je sadržaj etarskog ulja u aromatičnim biljkama genetski determinisan, ali i da mnogi endogeni (fenofaza ontogenetskog razvoja) i egzogeni faktori (nadmorska visina, sastav zemljišta i klima) imaju veliki uticaj na njegovu produkciju. 48
Prema tome, uočene razlike u varijabilnosti terpena između ispitivanih populacija crnog bora, su verovatno posledica uticaja određenih klimatskih parametara, a ne razlika u genotipovima između ispitivanih taksona. Stoga se terpeni kao hemotaksonomski markeri moraju tretirati sa velikom pažnjom. 49
6. LITERATURA Adams R. P. 2007. Identification of Essential Oil Component by Gas Chromatography/Quadrupole Mass Spectrometry, Allured Publishing Corporation, Carol Stream, IL. Amri I., Hanana M., Jamoussi B., Hamrouni L. 2014. Essential oils of Pinus nigra J.F. Arnold subsp. laricio Maire: Chemical composition and study of their herbicidal potential. Arabian J. Chem. doi:10.1016/j.arabjc.2014.05.026 Arbez M., Bernard-Dagan C., Fillon C. 1974. Variabilité intraspécifique des mono terpènes de Pinus nigra Arn. Bilan des premiers résultats. Ann. Sci. For. 31, 57-70. Bader A., Flamini G., Cioni P. L., Morelli I. 2000. Composition of the essential oils from leaves, branches and cones of Pinus laricio Poiret collected in Sicily, Italy. J. Essent. Oil Res. 12, 672-674. Bakkali F., Averbeck S., Averbeck D., Idaomar M. 2008. Biological effects of essential oils - a review. Food Chem. Toxicol. 46, 446-475. Barton P. M. 1957. Recent Advances in Sesquiterpenoid Chemistry. Quarterly Review, 11, 189. Bojovic S., Jurc M., Drazic D., Pavlovic P., Mitrovic M., Djurdjevic L., Dodd R. S., Afzal- Raffi Z. A., Barbero M. 2005. Origin identification of Pinus nigra populations in southwestern Europe using terpene composition variations. Trees 19, 531-538. Bojović S., Mitrović S. 2010. Biostatistika. Institut za šumarstvo, Beograd. Bojović S., Šarac Z., Nikolić B., Tešević V., Todosijević M., Veljić M., Marin P. D. (2012) Composition of n-alkanes in natural populations of Pinus nigra from Serbia chemotaxonomic implications. Chem. Biodiversity 9, 2761-2774. Chalchat, J. C., Gorunović, M. S. 1995a. Chemotaxonomy of pines native to the Balkans. Part 2: Illyrian black pine Pinus nigra Arnold ssp. nigra (Arn., Hayek), Pinaceae according to location, plant part and age of specimens. Pharmazie 50, 281-283. Chalchat, J. C., Gorunović, M. S. 1995b. Chemotaxonomy of pines native to the Balkans. Part 3: Variations in the composition of essential oils of the Pinus nigra Arnold ssp. dalmatica according to age of specimens. Pharmazie 50, 575-576. 50
Chase M. W., Reveal J. L. 2009. A phylogenetic classification of the land plants to accompany APG III. Botanical Journal of the Linnean Society 161, 122 127. Delevoy G. 1949. A propos de la systématique de Pinus nigra Arnold. Stn. Rech. Groenendal Trav. Ser. B, 12-41. Dervendzi V. 1992. Sovremeno lekuvanje so lekoviti bilki, Tabernakul, Skopje. European Pharmacopoeia. 1997: Biological tests. 3th ed. Paris: Council of Europe, 123 7. Farr T. G., Rosen P. A., Caro E., Crippen R., Duren R., Hensley S., Kobrick M., Paller M., Rodriguez E., Roth L., Seal D., Shaffer S., Shimada J., Umland J., Werner M.,Oskin M., Burbank D., Alsdorf D. 2007. The shuttle radar topography mission. Rev. Geophys. 45, RG2004. 10.1029/2005RG000183. Fukarek P. 1958. Prilog poznavanju crnog bora. Poljoprivredno-šumarski fakultet, Sarajevo 3, 3-92. Gašić M. J. 1985. Etarska ulja. IHTM, Beograd. Gaussen H., Heywood V. H., Charter A. O. 1964. Pinus L.. In: Tutin T. G., Heywood V. H., Burges N. A., Valentine D. H., Walters S. M., Webb B. A., editors. Flora Europea. Vol. 1, 1st edn. Cambridge University Press, Cambridge, pp. 33-34. Gaussen H., Heywood V. H., Charter A. O. 1993. Pinus L.. In: Tutin T. G., Heywood V. H., Burges N. A., Valentine D. H., Walters S. M., Webb B. A., editors. Flora Europea. Vol. 1, 2nd edn. Cambridge University Press, Cambridge, pp. 40-44. Gerber S., Baradat P., Marpeau A., Arbez M. 1995. Geographic variation in terpene composition of Pinus nigra Arn. For. Genet. 2, 1-10. Gernandt D. S., Geada López G., Ortiz García S., Liston A. 2005. Phylogeny and classification of Pinus. Taxon 54, 29-42. Hijmans R. J., Cameron S. E., Parra J. L., Jones P. G., Jarvis A. 2005. Very high resolution interpolated climate surfaces for global land areas. Int. J. Climatol. 25, 1965-1978. Hijmans R. J., Guarino L., Mathur P. 2012. DIVA-GIS Version 7.5.http://www.diva-gis.org/. Iconomou N., Valkanas G. 1966. On the composition of balsam resin of several pine species of Greece. Pharm. Acta Helv. 41, 59-63. 51
Ioannou E., Koutsaviti A., Tzakou O., Roussis V. 2014. The genus Pinus: a comparative study on the needle essential oil composition of 46 pine species. Phytochem. Rev. DOI 10.1007/s11101-014-9338-4. Jovanović B. 1992. P. nigra Arn. In: Sarić M, editor. Flora Srbije 1. Srpska akademija nauka i umetnosti, Beograd, pp. 200-202. Koukos P. K., Papadopoulou K. I., Papagiannopoulos A. D. 2001. Essential oils of the twigs of some conifers grown in Greece. Holz Roh Werkst. 58, 437-438. Koutsaviti K., Giatropoulos A., Pitarokili D., Papachristos D., Michaelakis A., Tzakou O. 2015. Greek Pinus essential oils: larvicidal activity and repellency against Aedes albopictus (Diptera: Culicidae). Parasitol. Res. 114, 583-592. Kovačević N. 2004. Osnovi farmakognozije. Treće izdanje. Srpaska školska knjiga, Beograd. Lieutier F., Berryman A. A., Millstein J. A. 1991. Preliminary study of the monoterpene response of three pines to Ophiostoma clavigerum (Ascomycetes: Ophiostomatales) and two chemical elicitors. Ann. Sci. For. 48, 377-388. Loreto M., Velikova V. 2001. Isoprene produced by leaves protects the photosynthetic apparatus against ozone damage, quenches ozone products, and reduces lipid peroxidation of cellular membranes. Plant Physiol. 127, 1781-1787. Macchioni F., Cioni P. L., Flamini G., Morelli I., Maccioni S., Ansaldi M. 2003. Chemical composition of essential oils from needles, branches and cones of Pinus pinea, P. halepensis, P. pinaster and P. nigra from central Italy. Flavour Fragr. J. 18, 139-143. Mihajilov Krstev T. 2009. Hemijski sastav i antimikrobna aktivnost etarskih ulja biljnih vrsta roda Satureja L.. Doktorska disertacija. Prirodno-matematički fakultet, Univerzitet u Novom Sadu. Paci M., Michelozzi M., Vidrich V. 1989. Contenuto in monoterpeni di oleoresine corticali in provenienze diverse di Pinus nigra Am. Ann. Acc. Ital. Sci. For. 38, 223-231. Pekić B. 1983. Hemija i tehnologija farmaceutskih proizvoda (alkaloidi i etarska ulja). Tehnološki fakultet, Univerzitet u Novom Sadu. Petrović S., Maksimović Z., Kundaković T. 2009. Analiza sastojaka biljnih droga. Priručnik za teorijsku i praktičnu nastavu iz predmeta Farmakognozija. Farmaceutski fakultet, Beograd. 52
Politeo O., Skocibusic M., Maravic A., Ruscic M., Milos M. 2011. Chemical composition and antimicrobial activity of the essential oil of endemic Dalmatian black pine (Pinus nigra ssp. dalmatica). Chem. Biodiversity 8, 540-547. Quinn G. P., Keough M. J. 2002. Experimental Design and Data Analysis for Biologists. Cambridge Univ. Press., Cambridge. Rafii Z. A., Dodd R. S., Zavarin E. 1996. Genetic diversity in foliar terpenoids among natural populations of European black pine. Biochem. Syst. Ecol. 24, 325-339. Reuter H. I., Nelson A., Jarvis, A. 2007. An evaluation of void filling interpolation methods for SRTM data. Int. J. Geogr. Inf. Sci. 21, 983-1008. Rezzi S., Bighelli A., Mouillot D., Casanova J. 2001. Composition and chemical variability of the needle essential oil of Pinus nigra subsp. laricio from corsica. Flavour Fragr. J. 16, 379-383. Roussis V., Papadogianni K., Vagias C., Harvala C., Petrakis P., Ortiz A. 2001. Volatile constituents of three Pinus species grown in Greece. J. Essent. Oil Res. 13, 118-121. Roussis V., Petrakis P. V., Ortiz A., Mazomenoe B. E. 1995. Volatile constituents of needles of five Pinus species grown in Greece. Phytochemistry 39, 357-361. Šarac Z. 2014. Utvrđivanje varijabilnosti i diferencijacije prirodnih populacija Pinus nigra Arnold u Srbiji korišćenjem fitohemijskih i molekularnih markera. Doktorska disertacija. Biološki fakultet, Univerzitet u Beogradu. Šarac Z., Bojović S., Nikolić B., Tešević V., Đorđević I., Marin P. D. 2013. Chemotaxonomic significance of the terpene composition in natural populations of Pinus nigra J. F. Arnold from Serbia. Chem. Biodiversity 10, 1507-1520. Šarac Z., Dodoš T., Rajčević N., Bojović S., Marin P. D., Aleksić J. M. 2015. Genetic patterns in Pinus nigra from the central Balkans inferred from plastid and mitochondrial data. Silva Fenn. 49, no. 5 article id 1415. 12 p. Šarac Z., Matejić J. S., Stojanović-Radić Z. Z., Veselinović J. B., Džamić A. M., Bojović S., Marin P. D. 2014. Biological activity of Pinus nigra terpenes evaluation of FtsZ inhibition by selected compounds as contribution to their antimicrobial activity. Comput. Biol. Med. 54, 72-78. 53
Schwarz O. 1938. Über die Systematic und Nomenklatur der europaischen Schwarzkiefern. Notizbl. Bot. Gart. Berlin-Dahlem XIII, 117, 226-243. Sezik E., Üstün O., Demirci B., Başer K. H. C. 2010. Composition of the essential oils of Pinus nigra Arnold from Turkey. Turk. J. Chem. 34, 313-325. Sharkey S., Chen X. Y., Yeh S. S. 2001. Isoprene inceases thermotolerance of fosmidomycinfed leaves. Plant Physiol. 125, 2001-2006. Simić N. 2000. Hemijsko i mikrobiološko ispitivanje domaćih vrsta roda Achillea L.. Doktorska disertacija. Prirodno-matematički fakultet, Univerzitet u Nišu. Svoboda P. 1953. Lesni dreviny a jejich porosti. Cast I, Praha (Czech Republic). Toroglu S. 2007. In vitro antimicrobial activity and antagonistic effect of essential oils from plant species. J. Environ. Biol. 28, 551-559. Ustun O., Senol F. S., Kurkcuoglu M., Erdogan Orhan I., Kartal M., Baser K. H. C. 2012. Investigation on chemical composition, anticholinesterase and antioxidant activities of extracts and essential oils of Turkish Pinus species and pycnogenol. Ind. Crops. Prod. 38, 115-123. Vidaković M. 1955. Značenje anatomske građe iglica kod svojta crnog bora u Jugoslaviji. Šumarski list, Zagreb 79, 244-253. Vidaković M. 1957. Oblici crnog bora u Jugoslaviji na temelju anatomije iglica. Glasn. za šumske pokuse, Zagreb 13, 111-248. Vidaković M. 1982. Četinjače. Morfologija i varijabilnost. JAZU i Sveučilišna naklada Liber, Zagreb. Vidrich V., Fusi P., Michelozzi M., Franci M. 1996. Analysis of essential oils from leaves and branches of different Italian provenances of Pinus nigra Arn. J. Essent. Oil Res. 8, 377-381. Wallach O. 1914. Terpene und Campher: Zusammenfassung eigener Untersuchungen auf den Gebeit der alicyclischen Kohlenstoffverbindungen. Veit and Co, Leipzig. Williams A. L., Bannister M. H. 1962. Composition of gum turpentines from 22 species of pines grown in New Zealand. J. Pharm. Sci 51, 970-975. Zlatković B., Šarac Z. 2016. Praktikum iz sistematike biljaka. Prirodno-matematički fakultet, Univerzitet u Nišu. 54
7. PRILOG A B Slika 7.1. TIC hromatogrami A) headspace isparljivih komponenti i B) etarskog ulja četina P. nigra var. nigra (Zlatibor) 55
A B Slika 7.2. TIC hromatogrami A) headspace isparljivih komponenti i B) etarskog ulja četina P. nigra var. nigra (Mileševka) 56
A B Slika 7.3. TIC hromatogrami A) headspace isparljivih komponenti i B) etarskog ulja četina P. nigra var. nigra (Tara) 57
A B Slika 7.4. TIC hromatogrami A) headspace isparljivih komponenti i B) etarskog ulja četina P. nigra var. nigra (Uvac) 58
A B Slika 7.4. TIC hromatogrami A) headspace isparljivih komponenti i B) etarskog ulja četina P. nigra var. gocensis (Goc) 59