UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU Sandra Stanimirov Antimikrobna aktivnost bakterija mlečne kiseline

UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU Sandra Stanimirov Antimikrobna aktivnost bakterija mlečne kiseline izolovanih iz peglane kobasice Master rad Niš, 2018

UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO MATEMATIČKI FAKULTET DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU Antimikrobna aktivnost bakterija mlečne kiseline izolovanih iz peglane kobasice Master rad Kandidat: Sandra Stanimirov 227 Mentor: Dr Nataša Joković Niš, 2018

UNIVERSITY OF NIŠ FACULTY OF SCIENCE AND MATHEMATICS DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY Antimicrobial activity of lactic acid bacteria isolated from peglana kobasica Master thesis Candidate: Sandra Stanimirov 227 Mentor: Dr Nataša Joković Niš, 2018

Zahvalnica Mentorki, dr. Nataši Joković, Na saradnji, ukazanom poverenju, idejama, usmeravanju, motivaciji i uloženom trudu tokom izrade ovog master rada. Saradniku, Nikoli Stankoviću, Na satima dnevno izdvojenih tokom više meseci rada, posvećenosti, pomoći i savetima u svrhu što bolje realizacije celog toka istraživanja. Porodici, Na neizmernoj podršci, ljubavi i razumevanju tokom svih godina studiranja. Moj uspeh ne bi bio postignut bez vas. Iskreno Vam hvala!

Biografija Sandra Stanimirov rođena je 07. februara 1994. godine u Pirotu. Osnovnu školu završila je u Dimitrovgradu 2009. godine, a potom i gimnaziju Sveti Kirilo i Metodije 2013. godine, kao nosilac diplome Vuk Karadžić. Nakon završetka srednje škole upisuje osnovne akademske studije na Prirodnomatematičkom fakultetu u Nišu, na Departmanu za biologiju i ekologiju. Osnovne akademske studije završava 2016. godine sa zvanjem Biolog. Iste godine upisuje master akademske studije na Departmanu za biologiju i ekologiju Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu, smer Biologija. Master akademske studije završava 2018. godine sa zvanjem Master biolog.

Sažetak U ovom radu ispitivana je antimikrobna aktivnost jedanaest izolata BMK, izolovanih iz peglane kobasice, na potencijalno patogene bakterije, agar difuzionom metodom, mikrodilucionom metodom, kristal violet metodom, Bradfordovom metodom i Time-kill analizom. Ispitivani izolati pripadaju vrstama Lactobacillus sakei (M16, PF3, PF6, PF18, PF19), Lactobacillus curvatus PK4, Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum (PK15, PK16A), Carnobacterium divergens PK3, Carnobacterium maltaromaticum M2 i Weissella viridescens M1. Kao indikator sojevi korišćene su vrste Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium i Bacillus cereus. Na osnovu dobijenih rezultata može se zaključiti da supernatanti testiranih izolata BMK imaju inhibitorni efekat na sve indikator sojeve. Supernatanti BMK imaju veću efikasnost protiv Gram-pozitivnih (L. monocytogenes, St. aureus i B. cereus) nego protiv Gram-negativnih bakterija (E. coli i S. typhimurium) i veće zone inhibicije u odnosu na neutralisane supernatante. Supernatanti BMK narušavaju strukturu membrane što dovodi do oslobađanja ćelijskih proteina u supernatant. Permeabilnost membrane većine indikator sojeva raste tokom vremena. Najjači baktericidni efekat zabeležen je na vrstu B. cereus, a najslabiji na vrstu E. coli. Ključne reči: bakterije mlečne kiseline, antimikrobna aktivnost, mehanizam delovanja

Abstract In this paper work, the antimicrobial activity of eleven isolates of LAB isolated from peglana kobasica, against potentially pathogenic bacteria, was investigated by agar diffusion method, microdilution method, crystal violet assay, Bradford method and Time-Kill analysis. Isolates belong to the species Lactobacillus sakei (M16, PF3, PF6, PF18, PF19), Lactobacillus curvatus PK4, Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum (PK15, PK16A), Carnobacterium divergens PK3, Carnobacterium maltaromaticum M2 and Weissella viridescens M1. Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium and Bacillus cereus were used as indicator strains. According to the results, the cell free supernatants (CFS) from the tested LAB isolates have an inhibitory effect on all indicator strains. CFS from the LAB isolates had higher efficacy against Gram-positive (L. monocytogenes, St. aureus and B. cereus) than against Gram-negative bacteria (E. coli and S. typhimurium) and higher inhibition zones compared to neutralized supernatants. CFS disrupted the structure of the membrane which led to the release of cellular proteins into the supernatant. Membrane permeability of the most indicator strains increased over time. The strongest bactericidal effect was observed for B. cereus, and the weakest for E. coli. Key words: lactic acid bacteria, antimicrobial activity, mechanisms of action

Sadržaj 1. Uvod... 2 1.1. Bakterije mlečne kiseline... 3 1.1.1. Rod Lactobacillus... 5 1.1.2. Rod Leuconostoc... 7 1.1.3. Rod Carnobacterium... 8 1.1.4. Rod Weisella... 9 1.2. Antimikrobne supstance... 9 1.2.1. Antimikrobne supstance BMK... 10 2. Ciljevi rada... 14 3. Materijal i metode... 15 3.1. Materijal... 15 3.1.1. Bakterijski sojevi... 15 3.2. Metode... 15 3.2.1. Agar difuziona metoda... 15 3.2.2. Mikrodiluciona metoda... 16 3.2.3. Kvantitativno određivanje vodonik peroksida... 17 3.2.4. Kristal violet metoda... 17 3.2.5. Bradfordova metoda... 18 3.2.6. Time-kill analiza... 19 4. Rezultati i diskusija... 20 4.1. Antimikrobna aktivnost BMK... 20 4.2. Određivanje minimalne inhibitorne koncentracije (MIK)... 26 4.3. Ispitivanje mehanizama antimikrobne aktivnosti BMK... 27 5. Zaključci... 36 6. Literatura... 37

1. Uvod Bakterije mlečne kiseline (BMK) predstavljaju veoma heterogenu grupu bakterija, a objedinjene su zajedničkom osobinom da proizvode mlečnu kiselinu kao krajnji produkt fermentacije laktoze. BMK su među prvim mikroorganizmima upotrebljenim u industriji hrane, a posebno važnu ulogu imaju u proizvodnji fermentisanih mlečnih proizvoda i proizvoda od mesa. Svojom metaboličkom aktivnošću doprinose poboljšanju ukusa, arome i teksture krajnjeg proizvoda. Snižavanjem ph vrednosti usled sinteze mlečne kiseline, produkcijom vodonik-peroksida ugljen-dioksida i diacetila, kao i produkcijom bakteriocina koje sintetišu neke BMK, sprečava se razvoj patogenih mikroorganizama u fermentisanoj hrani. Ova osobina bakterija mlečne kiseline omogućava njihovu implementaciji u proizvodnji hrane kao dodatnih zaštitnih faktora protiv nepoželjnih mikroorganizama. Druga mogućnost primene BMK je u ishrani i terapeutici kao probiotika, zbog njihovih različitih mehanizama delovanja prema patogenim mikroorganizmima u intestinalnom traktu. 2

1.1. Bakterije mlečne kiseline Bakterije mlečne kiseline pripadaju grupi Gram-pozitivnih bakterija koje u morfološkom smislu ne predstavljaju jedinstvenu grupu. To su asporogeni štapići raznih dužina i kokoidni oblici. Tipične BMK koje rastu pod standardnim uslovima su fakultativno anaerobne, mezofilne, acidotolerantne, hemoorganotrofne. Ćelije su obično nepokretne. Nemaju mogućnost sinteze katalaze, citohroma i porfirina. Nedostatak citohroma onemogućava elektron-transportni lanac te je nakon glikolize favorizovana mlečna fermentacija. Grupa BMK pripada razdelu Firmicutes sa niskim procentom GC parova ( 55 mol%) i redu Lactobacillales (Holzapfel i Wood, 2014). U okviru šest familija, kao najvažniji rodovi izdvajaju se: Lactobacillus, Leuconostoc, Lactococcus, Carnobacterium, Aerococcus, Oenococcus, Enterococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus i Weissella. Kao izvor energije BMK koriste ugljene hidrate i alkohole. Imaju specifičan odnos prema ugljenim hidratima- jedne koriste laktozu, druge maltozu. Laktozu koriste bakterije koje rastu u mleku i mlečnim produktima, maltozu-one koje fermentišu biljni materijal (Petrović i sar., 2007). Na osnovu krajnjih produkata metabolizma glukoze dele se na homofermentativne i heterofermentativne BMK. Homofermentativne bakterije putem glikolize i mlečne fermentacije produkuju mlečnu kiselinu-laktat (oko 90%) i vrlo malu količinu ostalih međuprodukata. Heterofermentativne glukozu razgrađuju 6-fosfoglukonat/fosfoketolaznim (6-PG/PK) putem i proizvode manje ili veće količine mlečne kiseline (oko 50%), a znatniji je udeo ostalih proizvoda: ugljen dioksid, sirćetna kiselina i etanol (Slika 1). U homofermentativne BMK spadaju rodovi Streptococcus, Lactococcus, Pediococcus i neki rodovi Lactobacillus, a u heterofermentativne rod Leuconostoc i podgrupa roda Lactobacillus, Betabacteria. 3

Slika 1. Putevi fermentacije glukoze kod: A Homofermentativnih BMK i B: Heterofermentativnih BMK. a- glikoliza, b- mlečna fermentacija. BMK su široko rasprostranjeni organizmi, ali su izbirljive prema hranljivoj sredini i zahtevaju sredine bogate ugljenim hidratima. Osim ugljenih hidrata, BMK imaju složene nutritivne zahteve za aminokiselinama, peptidima, estrima masnih kiselina, solima, derivatima nukleinskih kiselina i vitaminima (Tannock, 2004). S druge strane, zahvaljujući dobroj sposobnosti prilagođavanja, BMK podnose širok spektar životnih uslova i prisutne su u brojnim staništima. Mogu se naći na raspadnutom biljnom materijalu i voću, u mlečnim proizvodima, fermentisanom mesu i ribi, na repi, krompiru, kiselom kupusu, kiselom testu, ukiseljenom povrću, silaži, biljkama, u vodi i drugim napicima, kanalizaciji i šupljinama (usta, genitalije, creva i respiratorni trakt). One su deo zdrave mikrobne flore u ljudskim crevima. Osim onih koji izazivaju karijes, BMK su generalno nepatogene (Konig i sar., 2017). Mnoge BMK su stekle GRASstatus (Generally Recognized As Safe), a neke od njih spadaju i u grupu probiotika, zbog pozitivnog delovanja na zdravlje ljudi i životinja. Mnogi sojevi BMK su među najvažnijim grupama mikroorganizama koji se koriste u prehrambenoj industriji, iako neke vrste iz roda Pediococcus uzrokuju kvarenje hrane (Johnson- Green, 2002). Tokom procesa fermentacije, BMK utiču na organoleptička svojstva proizvoda. Zbog posedovanja antimikrobne aktivnosti BMK su prepoznate i kao komponente koje imaju 4

ulogu u očuvanju i mikrobiološkoj sigurnosti fermentisanih namirnica. Iz ovih razloga se mnoge BMK koriste kao starter-kulture u industriji, ali su se vekovima unazad koristile i u proizvodnji tradicionalnih proizvoda zahvaljujući spontanoj fermentaciji prirodno prisutnih BMK. Različiti sojevi BMK se mogu naći u mlečnim proizvodima (jogurt, sirevi), fermentisanom mesu (salame, kobasice), povrću (masline, kiseo kupus), hlebu od kiselog testa i vinu. 1.1.1. Rod Lactobacillus Rod Lactobacillus predstavlja veoma raznovrsnu grupu bakterija koja obuhvata 236 opisanih vrsta i 29 podvrsta (http://www.bacterio.net/lactobacillus.html, 2018). Članovi roda Lactobacillus su nesporulišući, uglavnom nepokretni Gram-pozitivni štapici, ređe bacili sa sadržajem GC parova koji varira od 32 do 53 mol% (Slika 2). Obično formiraju lance raznih dužina. Mogu da podnose kiseonik, ali obično rastu pod anaerobnim uslovima. Laktobacili su acidofilni i acidotolerantni. Maksimalna vrednost ph koju mogu da podnesu je 7,2. Neke vrste poseduju pseudokatalazu i neki sojevi mogu usvajati porfirine, a zatim pokazati katalaznu, nitrit reduktaznu i citohromnu aktivnost. Laktobacili su striktno fermentativne bakterije. Imaju kompleksne nutritivne zahteve za ugljenim hidratima, aminokiselinama, peptidima, masnim kiselinama, derivatima nukleinskih kiselina, vitaminima i mineralima (Konig i sar., 2017). Mogu se naći u najrazličitijim staništima, od usne duplje, gastrointestinalnog i urogenitalnog trakta čoveka i životinja, preko biljnog materijala, žitarica i voća, sve do đubriva i kanalizacije. Slika 2. Lactobacillus. delbrueckii ssp. bulgaricus 5

Laktobacili se koriste kao starter kulture u prehrambenoj industriji, npr. u fermentaciji i zrenju mlečnih proizvoda, povrća, voća, vina i piva, mesa, ribe, čaja itd. (Holzapfel i Wood, 2014). Pokazuju veliku raznovrsnost kataboličke aktivnosti, a dokazano je i da su bezbedni za primenu u prehrambenoj industriji. Iako je tehnološki najvažniji krajnji proizvod fermentacije laktobacila mlečna kiselina, druge metaboličke osobine, kao što su njihova proteolitička i lipolitička aktivnost i sinteza aromatičnih jedinjenja poput diacetila i acetaldehida rezultuju u velikoj raznovrsnosti krajnjih proizvoda. Neki sojevi produkuju bakteriocine, netoksične proteine koji sprečavaju rast drugih bakterija. Osim toga, tokom fermentacije snižava se ph hrane te se ona konzerviše na prirodan način. Određeni selektovani sojevi laktobacila iz mlečnih proizvoda pokazuju probiotska svojstva poput kontrole intestinalnih infekcija, alergijskih oboljenja i dijareja izazvanih antibioticima, tretmana infekcija tokom trudnoće, prevencije infekcija urinarnog trakta i dr. čime se utiče na poboljšanje zdravlja ljudi. Neki laktobacili, međutim, mogu imati negativni efekat na kvalitet hrane izazivajući kvarenje vina, piva, kobasica, sira i dr. Povećano znanje o metabolizmu laktobacila omogućava korišćenje bionformatike u predviđanju metaboličkog potencijala sojeva i pomaže u izboru bolje starter kulture (Diaz-Muniz i sar., 2006). Rod Lactobacillus je najbrojniji u okviru BMK i podeljen je u tri grupe: 1) Obligatni homofermentativni laktobacili koji poseduju enzim aldolazu i gotovo isključivo (>85%) fermentišu heksoze do mlečne kiseline glikolitičkim putem, a ne fermentišu pentoze i glukonat zbog nedostatka fosfoketolaze. Grupa obuhvata 17 vrsta, a najpoznatije su Lactobacillus delbrueckii (ssp. bulgaricus, delbrueckii, lactis), Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus koje ulaze u sastav starter kultura u mlečnim proizvodima i probiotskim preparatima. 2) Fakultativni heterofermentativni laktobacili poseduju aldolazu i fosfoketolazu tako da fermentišu heksoze i pentoze, a često i glukonat. Najznačajniji predstavnici su vrste Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus plantarum Lactobacillus sakei i Lactobacillus rhamnosus i one se takođe koriste kao probiotici i starter kulture u proizvodnji sireva, kobasica i drugih proizvoda. 3) Obligatni heterofermentativni laktobacili fermentišu heksoze pentoza fosfatnim putem do mlečne kiseline, etanola i/ili sirćetne kiseline i CO2. Pentoze takođe mogu da fermentišu 6

ovim putem. Vrste Lactobacillus brevis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus kefir i Lactobacillus sanfranciscensis koriste se za prezervaciju hrane, kao probiotici i kao starter kulture za proizvodnju kefira i kiselog testa. Ove grupe laktobacila nisu u saglasnosti sa filogenetskim odnosima u okviru roda. Collins i sar. (1991) su na osnovu srodnosti među vrstama, rod Lactobacillus podelili u tri grupe: Lb. delbrueckii grupa, Lb. casei-pediococcus grupa (danas sa manjim podgrupama: Lb. buchneri, Lb. casei, Lb. plantarum, Lb. reuteri i Lb. salivarius grupa) i Leuconostoc grupa. 1.1.2. Rod Leuconostoc Vrste roda Leuconostoc su Gram-pozitivni, nepokretni, asporogeni i katalaza negativni kokoidni oblici bakterija. To su oblikatno heterofermentativne BMK koje metabolišu glukozu putem pentoza fosfata, gde se pored D(-) oblika mlečne kiseline oslobađa i etanol, CO2 i sirćetna kiselina (Endo i Okada, 2008). Neke vrste mogu da rastu na niskim vrednostima ph i temperature. Poznati su uzročnici kvarenja proizvoda od mesa. U prirodi se mogu naći na biljkama, a prisutni su i u mleku i mlečnim proizvodima, mesnim proizvodima (kobasice), u vinu i fermentisanom povrću (krastavac, kupus, masline), gde učestvuju u spontanoj fermentaciji ili se koriste kao starter kulture. U industrijskoj proizvodnji od značaja je metabolizam citrata u prisustvu fermentabilnih ugljenih hidrata i produkcija mlečne kiseline, sirćetne kiseline, diacetila i acetoina koji daju karakterističnu aromu i teksturu krajnjeg proizvoda. Diacetil je važno aromatično jedinjenje (aroma maslaca) u mlečnim proizvodima i ima antimikrobnu aktivnost protiv nekoliko Gram-pozitivnih i Gram-negativnih bakterija i kvasaca (Ray i Daeschel, 1992). Dokazano je i da nekoliko vrsta roda Leuconostoc produkuje bakteriocine koji su aktivni protiv patogena koji se prenose hranom, uključujući vrstu Listeria monocytogenes i zato su korisni za prirodnu zaštitu protiv kvarenja hrane (Trias i sar., 2008). Rod Leuconostoc obuhvata 12 vrsta. Najpoznatije su vrste Leuconostoc lactis, Leuconostoc carnosum, Leuconostoc citreum, Leuconostoc kimchii i Leuconostoc mesenteroides (Slika 3), sa tri podvrste. Ove podvrste su ujedno najpoznatije: Lc. mesenteroides ssp. cremoris učestvuje u fermentaciji mlečnih proizvoda i vina, Lc. mesenteroides ssp. dextranicum u 7

fermentisanim biljnim proizvodima, mesu, mleku i mlečnim proizvodima i vinu i L.mesenteroides ssp. mesenteroides spontano fermentiše u svežim biljnim sirovinama (vanila, kafa i kakao) ili se dodaje kao starter kultura pri proizvodnji voća, povrća, mesa, mleka i vina. Poslednje dve podvrste produkuju dekstrane, polimere glukoze koji se upotrebljavaju kao dodaci i zamena za krvnu plazmu. Slika 3. Leuconostoc mesenteroides 1.1.3. Rod Carnobacterium Ćelije bakterija roda Carnobacterium su Gram-pozitivni, nesporulišući, kratki i tanki štapići koji se obično pojavljuju pojedinačno ili u parovima, retko u kratkim lancima. Vrste ovog roda su fakultativno anaerobne i heterofermentativne BMK, katalaza i oksidaza negativne. To su mezofilne i psihrotolerantne bakterije, koje rastu na temperaturi od 0 C i na neutalnoj ph vrednosti. Vrste roda Carnobacterium su do sada izolovane iz četiri staništa: meso (i mesni proizvodi), živina, riba i morska voda. Neobrađeno meso kao i neki mesni proizvodi predstavljaju jedno od glavnih staništa vrsta Carnobacterium divergens i Carnobacterium piscicola. Ove vrste dominiraju tokom prve dve nedelje u vakumiranom goveđem i svinjskom mesu koje se čuva na niskim temperaturama. Smatra se da je produkcija antimikrobnih supstanci, u prvom redu bakteriocina, važan faktor koji doprinosi ranoj dominaciji ovih vrsta u mesu koje sadrži mešovitu prirodnu populaciju BMK. S obzirom na to da vrste iz roda Carnobacterium u manjem stepenu smanjuju ph vrednost proizvoda u odnosu na druge BMK, predlaže se njihova upotreba u razvoju konzervanasa. 8

1.1.4. Rod Weisella Vrste roda Weisella su Gram-pozitivni, katalaza-negativni, asporogeni kratki štapići sa zaobljenim konusnim krajevima ili ovoidne ćelije (Collins i sar., 1993; Bjorkroth i sar., 2009). Pojavljuju se u parovima ili u kratkim lancima i neke vrste imaju tendenciju prema pleomorfizmu. To su fakultativno anaerobne, hemoorganotrofne, heterofermentativne bakterije, koje fermentišu glukozu putem pentoza fosfata i 6-fosfoglukonat/fosfoketolaznim putem. Krajnji proizvodi fermentacije su mlečna kiselina, CO2, etanol i/ili acetat. Vrste iz ovog roda se mogu pronaći u prehrambenim proizvodima od povrća, ribe i mesa. Vrste Weissella viridescens, Weissella halotolerans i Weissella hellenica imaju korisne uloge u fermentisanim kobasicama (Samelis i sar., 1994), ali su takođe povezane i sa kvarenjem mesa (Borch i sar., 1996). Zabeleženo je da vrsta (W. viridescens), koja je za razliku od ostalih BMK otporna na toplotu, može izazvati kvarenje suhomesnatih proizvoda. Produkcija bakteriocina zabeležena je kod sojeva Weissella cibaria i Weissella. paramesenteroides (Papathanasopoulos i sar., 1997; Srionnual i sar., 2007). Vrsta W. cibaria proizvodi velike količine H2O2 pod anaerobnim uslovima. 1.2. Antimikrobne supstance Većina organizama proizvodi antimikrobne komponente koje predstavljaju deo prirodnog imunog sistema u cilju zaštite od drugih mikroorganizama. Termin antimikrobne supstance obuhvata različite klase lekova koji sprečavaju rast i razmnožavanje ili ubijaju mikroorganizme (Musumeci i Puglisi, 2013). Većina antimikrobnih supstanci je aktivna samo protiv bakterija (antibakterijski agensi), a manji broj deluje na gljive (antifungalni agensi), viruse (antiviralni agensi), protozoe (antiprotozoalni agensi, protozoici) i crevne parazite (antihelmintici). Antimikrobni agensi koji se koriste u kliničkoj medicini ne deluju na spore bakterija i gljiva, kao ni na proviruse (Greenwood i sar., 2012). U terapiji se koriste prirodni produkti mikroorganizama-antibiotici, hemijski obrađene prirodne supstance-polusintetički antibiotici i sintetske supstancehemoterapeutici. Zajednička karakteristika ovih supstanci je da ubijaju bakterije (baktericidni efekat), inhibiraju rast i razmnožavanje (bakteriostatski) ili liziraju bakterijske ćelije (bakteriolitski). 9

One su toksične za bakterije, ali ne i za ćelije domaćina i deluju u veoma malim koncentracijama (1-10 µm/ml) (Petrović i sar., 2007). Antimikrobni agensi se ne koriste samo u medicini i veterini već i kao aditivi u hrani. Zloupotreba antibiotika u humanoj terapiji dovodi do rezistencije na antibiotike, odnosno može imati toksične efekte na kopnene i vodene organizme koji se nađu u okolini tretirane životinje (Musumeci i Puglisi, 2013). 1.2.1. Antimikrobne supstance BMK Bakterije mlečne kiseline produkuju veliki broj antimikrobnih jedinjenja niske molekulske mase uključujući, kiseline, alkohole, ugljen-dioksid, diacetil, acetaldehid, acetoin, vodonik-peroksid, kao i jedinjenja visoke molekulske mase, bakteriocine. Mnogi od ovih metabolita imaju širok spektar aktivnosti na druge vrste i njihova produkcija u velikoj meri zavisi od sastava hranljive podloge (Helander i sar., 1997). Upoznavanje sinergističkih efekata između različitih antimikrobnih supstaci BMK proširilo je njihovu potencijalnu upotrebu. Međutim, osim snižavanja ph, drugi pristupi kontrole patogena za sada nisu uspešni. Jedino kombinacija različitih starter kultura i kombinacija različitih antimikrobnih faktora prirodnog porekla mogu rezultovati optimalnim produktom. Slabe organske kiseline koje produkuju BMK-mlečna, sirćetna, limunska, mravlja, propionska, buterna, važna su jedinjenja koja inhibiraju širok spektar mikroorganizama. Najbitnije i najbolje okarakterisane su mlečna i sirćetna kiselina. Ove kiseline dovode do snižavanja ph vrednosti sredine što predstavlja primarnu inhibitornu aktivnost BMK. Tip i količina kiseline koja se produkuje tokom fermentacije zavisi od osobina vrste, celokupne mikrobne populacije i uslova sredine. Inhibitorni efekat nedisociranih organiskih kiselina je 10-600 puta jači od njihovih disociranih oblika, a stepen disocijacije je direktno određen ph vrednošću. Nedisocirani oblici mlečne, limunske i sirćetne kiseline imaju jaku antimikrobnu aktivnost. Smanjenje ekstracelularne ph vrednosti dovodi do acidifikacije citoplazme jer nedisocirani oblici kiselina kao lipofilni molekuli pasivno difunduju preko membrane u citoplazmu (Kashket, 1987). Kiseline generalno ostvaruju svoj antimikrobni efekat ometanjem potencijala ćelijske membrane, sprečavanjem aktivnog transporta i 10

inhibiranjem raznih metaboličkih funkcija (Ross i sar., 2002). Acidifikacija, kao metoda prezervacije hrane, se široko koristi u proizvodnji fermentisanog mleka, povrća i kobasica. Ugljen-dioksid produkuju uglavnom heterofermentativne BMK. Svoju antimikrobnu aktivnost ostvaruje zamenom molekularnog kiseonika i stvaranjem anaerobnih uslova. Ovakva sredina onemogućava reakcije dekarboksilacije i remeti permeabilnost membrane akumulacijom ugljen-dioksida između lipidnog dvosloja. Ugljen-dioksid sprečava rast mnogih uzročnika kvarenja hrane, posebno Gram-negativnih psihotrofnih bakterija. Stepen inhibicije znatno varira između različitih organizama. Heterofermentativne BMK produkuju acetaldehid dekarboksilacijom piruvata. Ovaj produkt, u reakciji sa piruvatom daje α-acetolaktat koji se konvertuje u diacetil. S druge strane, produkt dekarboksilacije α-acetolaktata i redukcije diacetila je acetoin. Diacetil ima širok spektar antimikrobne aktivnosti u koncentracijama 300-1000 µg/m³, ali ograničavajući faktor njegove upotrebe je činjenica da produkuje karakteristični ukus maslaca samo u koncentracijama 2-4 µg/m³. Shodno tome, nivo diacetila koji je prirodno pronađen u fermentisanoj hrani (0,2-1,5 µg/m³) je previše nizak da bi bio efikasan, a njegov ukus maslaca sprečava upotrebu u čistoj formi (Helander i sar., 1997). Gram-negativne bakterije pokazuju veću osetljivost na delovanje diacetila od Gram-pozitivnih bakterija. U odgovarajućoj koncentraciji, diacetil inhibira rast vrsta iz rodova Listeria, Salmonella, Yersinia, Aeromonas, kao i vrste Escherichia coli. Slično diacetilu, acetaldehid, koji je obično prisutan u fermentisanim mlečnim proizvodima u koncentracijama nižim od inhibitorne, takođe igra ulogu u kontroli kontaminenata, zajedno sa drugim antimikrobnim metabolitima BMK. U koncentracijama 10-100 µg/m³ inhibira rast vrsta Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium i E. coli u mlečnim proizvodima (Piard i Desmazeaud, 1991). Vodonik-peroksid se produkuje tokom aerobnog rasta bakterija redukcijom molekula kiseonika sa dva elektrona pri čemu je reakcija katalizovana brojnim oksidazama. Većina heterofermentativnih vrsta poseduje flavoprotein oksidazu, koja katalizuje redukciju kiseonika, što dovodi do nagomilavanja vodonik-peroksida (Šušković i sar., 2010). Veliki broj laktobacila može da produkuje vodonik-peroksid oksidacijom laktata. Količina vodonik-peroksida koju produkuju BMK je promenljiva i zavisi od soja i dostupnosti kiseonika. Kao vrlo reaktivan i toksičan nusprodukt oksidativnih procesa, može imati jak oksidativni efekat na membranske lipide i ćelijske proteine. 11

Denaturacijom membranskih proteina povećava se permeabilnost membrane i remeti funkcionisanje ćeije. Vodonik-peroksid može biti i prekursor za produkciju slobodnih radikala kao što su superoksid (O2 - ) i hidroksil (OH - ) radikal koji oštećuju DNK. Baktericidni efekat vodonikperoksida zavisi od primenjenih koncentracija i od faktora sredine kao što su ph vrednost i temperatura. Sporicidni efekat takođe zavisi od temperature i jači je na višim vrednostima. Dokazano je da vrste rodova Lactobacillus i Lactococcus produkuju vodonik-peroksid koji inhibira rast vrste St. aureus, vrsta iz roda Pseudomonas sp. i drugih psihotrofnih mikroorganizama u hrani. Produkcija vodonik-peroksida od strane BMK ima potencijalnu primenu u zaštiti od urogenitalnih infekcija. Bakteriocini su antimikrobne supstance proteinske prirode koje pokazuju uzak spektar delovanja uglavnom na blisko srodne bakterijske vrste, a prema kojima soj proizvođač ima specifičan mehanizam samozaštite. Međutim, oni mogu promeniti svoju formu i imati baktericidni efekat izvan vrsta koje su blisko povezane ili ograničene istom ekološkom nišom. Primarni oblik bakteriocina je po definiciji protein, ali postoje i proteinski kompleksi sa lipidima, ugljenim hidratima ili kombinacije različitih proteina. Bakteriocini svoje antimikrobno delovanje ispoljavaju pre svega permeabilizacijom plazma membrane (Cotter et al., 2013), iako mnogi od njih imaju indirektno delovanje na membranu tako što se vezuju za različite membranske receptore (Gabrielsen et al., 2012). Mehanizam delovanja bakteriocina zavisi od primarne strukture njihovih peptida, tako bakteriocini koji pripadaju istoj klasi imaju i slične mehanizme delovanja. S obzirom na to, primarna struktura peptida je, pored biohemijske i genetičke karakterizacije, uzeta kao osnov klasifikacije bakteriocina. Oni se generalno mogu podeliti na postranslaciono modifikovane bakteriocine klase I (lantibiotici) i nemodifikovane ili minimalno modifikovane termostabilne bakteriocine klase II, velike termolabilne proteine klase III (bakteriolizini) i kompleksne bakteriocine koji sadrže hemijske grupe poput lipida i ugljenih hidrata klase IV. Neki od karakterističnih predstavnika su nizin, pediocin i helveticin. Do danas nisu uočena nikakva neželjena dejstva bakteriocina na ljudske ćelije, a ovo se može objasniti niskim koncentracija kojima deluju na senzitivne ćeliju (u piko- i nano-molarnim koncentracijama) i proteinskom prirodom bakteriocina zbog čega su podložni degradaciji u organizmu čoveka, kao i u drugim ekološkim sredinama, a time je i sticanje rezistencija kod bakterija svedeno na minimum. Upravo iz tog razloga su mnoga 12

istraživanja usmerena na definisanje komponenti koje bi bile adekvatna zamena antibiotika ili koje bi bar imale sinergistički efekat sa njima (Uzelac, 2014). Bakteriocini koje proizvode BMK su od velikog interesa u industriji fermentisane hrane kao prirodni konzervansi zbog njihove sposobnosti da inhibiraju rast mnogih uzročnika kvarenja hrane i patogenih bakterija, uključujući vrste L. monocytogenes, St. aureus, Bacillus cereus i Clostridium botulinum (Bredholt i sar., 2001). Iako je u poslednje dve do tri decenije otkriveno na stotine bakteriocina, nizin A i pediocin PA-1 su do sada jedini bakteriocini čije je korišćenje dozvoljeno u prehrambenoj industriji u većem broju zemalja (Chen and Hoover, 2003). Nizin, bakteriocin klase I koji proizvode određeni sojevi bakterije Lc. lactis, efikasan je u mnogim prehrambenim proizvodima inhibirajući rast širokog spektra Grampozitivnih bakterija. 13

2. Ciljevi rada Uzimajući u obzir značaj sinteze antimikrobnih jedinjenja BMK u industriji hrane, odnosno uticaj na kvalitet i rok trajanja proizvoda, ciljevi ovog istraživanja su: 1. Ispitivanje antimikrobne aktivnosti suspenzija, supernatanata i neutralisanih supernatanata BMK izolovanih iz peglane kobasice na odabrane indikator sojeve; 2. Određivanje minimalne inhibitorne koncentracije (MIK) supernatanata BMK; 3. Ispitivanje mehanizama antimikrobne aktivnosti BMK. 14

3. Materijal i metode 3.1. Materijal 3.1.1. Bakterijski sojevi U ovom radu su korišćeni bakterijski sojevi BMK izolovani iz peglane kobasice i identifikovani do nivoa vrsta: Lactobacillus sakei (M16, PF3, PF6, PF18, PF19), Lactobacillus curvatus PK4, Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum (PK15, PK16A), Weissella viridescens M1, Carnobacterium divergens PK3 i Carnobacterium maltaromaticum M2. Antimikrobna aktivnost BMK je ispitivana na osnovu dejstva na odabrane indikator sojeve: Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium i Bacillus cereus. Svi sojevi su aktivirani iz stokova čuvanih na -20 C presejavanjem na odgovarajuću podlogu. Sojevi BMK gajeni su na čvrstoj MRS hranljivoj podlozi (Torlak, Srbija), sa dodatkom 1,5% agara. Indikator sojevi gajeni su na MH podlozi (Himedia, India), koncentracije 0,7%. Kao radne kulture sojeva korišćene su prekonoćne kulture zasejane na odgovarajućoj tečnoj podlozi i inkubirane na određenoj temperaturi. Petri ploče sa sojevima BMK inkubirane su na temperaturi od 30 C, a indikator sojevi na 37 C. 3.2. Metode 3.2.1. Agar difuziona metoda MRS hranljiva podloga razlivena je u Petri ploče i formirani su bunarići prečnika 0,5 cm uz pomoć plastičnih kalupova. Za svaki indikator soj korišćene su po dve Petri ploče sa po pet i šest bunarića (za jedanaest sojeva BMK). Nakon što se podloga stegla, kalupi su izvađeni sterilnom pincetom. U bunariće je dodato po 50 μl prekonoćnih kultura BMK. Nakon zasejavanja, ploče su ostavljene jedan sat na sobnoj temperaturi. Po 200 μl prekonoćnih kultura indikator sojeva je inokulisano u 8 ml rastopljene MH podloge. Inokulumi su snažno vorteksovani i razliveni u Petri 15

ploče sa BMK. Petri ploče su inkubirane 24 h na temperaturi od 30 C, nakon čega su lenjirom očitavane zone inhibicije (Slika 4). Bakterije koje su najosetljive na dejstvo BMK pokazuju najveće zone inhibicije, dok kod rezistentnih bakterija ne postoje zone inhibicije. Na isti način je određena antimikrobna aktivnost čistog i neutralisanog supernatanta BMK, kao i međusobno dejstvo BMK. Supernatanti BMK su dobijeni centrifugiranjem prekonoćnih kultura na 3500 g, 10 min. Neutralisani supernatanti su dobijeni dodavanjem 10 NaOH, a merenje je vršeno ph metrom. Slika 4. Zone inhibicije vrste B. cereus u prisustvu suspenzija BMK 3.2.2. Mikrodiluciona metoda Za određivanje minimalne inhibitorne koncentracije (MIK) korišćena je mikrodiluciona metoda. MIK je najniža koncentracija antimikrobnog agensa koja inhibira rast bakterija nakon prekonoćne inkubacije. U ovom radu određena je minimalna inhibitorna koncentracija supernatanata BMK na indikator sojeve. Supernatanti BMK dobijeni su centrifugiranjem prekonoćnih kultura na 3500 g, 10 min. Od prekonoćnih kultura ispitivanih indikator sojeva napravljene su bakterijske suspenzije u sterilnom fiziološkom rastvoru i turbidimetrijskom metodom je broj mikroorganizama standardizovan na 0,5 McFarlanda. Nakon toga je u mikrotitar ploči sa 96 bunarića napravljena serija duplih razblaženja supernatanta BMK. U prvu kolonu naliveno je po 200 μl supernatanata 16

BMK, a u ostale kolone po 100 μl fiziološkog rastvora. Razređenja su pravljena prebacivanjem po 100 μl iz prve u drugu kolonu, zatim iz druge u treću, sve do poslednje kolone, iz koje je izbačeno 100 μl rastvora. U bunariće je dodato po 10 μl suspenzija indikator sojeva bakterija i 90 μl MH bujona, tako da je finalni volumen bio 200 µl i finalna koncentracija bakterija 5x10 6 CFU/ml, a koncentracija supernatanta od 100 do 0 %. Mikrotitarske ploče su zatim inkubirane 24h na 37 C. Najniža koncentracija pri kojoj nije bilo vidljivog rasta uzeta je za minimalnu inhibitornu koncentraciju (MIK). 3.2.3. Kvantitativno određivanje vodonik peroksida Testirani sojevi BMK Lc. mesenteroides ssp. dextranicum PK15, Lb. curvatus PK4, Lb. sakei PF18 gajeni su 72 h u MRS bujonu, a zatim centrifugirani na 3000 g, 15 min. 5 mg/ml 0,1 N NaOH i proteaza su dodati da neutrališu uticaj mlečne kiseline i bakteriocina. Dobijeno je 10 ml supernatantna i dodato 8 ml razblažene sumporne kiseline. Titracija je izvršena sa 0.1 M kalijum permanganatom. Svaki mililitar 0,1 M kalijum permanganata je ekvivalentan 1,79 mg vodonik peroksida. Prvi trenutak obezbojavanja uzorka uziman je kao krajnja tačka titracije. 3.2.4. Kristal violet metoda Promena u permeabilnosti ćelijske membrane detektovana je kristal violet metodom, gde veći procenat usvajanja boje ukazuje na veću permeabilnost membrane (Devi i sar., 2010). Supernatanti Lc. mesenteroides ssp. dextranicum PK15 i Lb. sakei PF18, čiji je uticaj na membranu indikator sojeva ispitivan, dobijeni su centrifugiranjem prekonoćnih kultura na 3500 g, 10 min. Prekonoćne kulture indikator sojeva (E. coli, L. monocytogenes i B. cereus) centrifugirane su na 6700 g 5 min na 21 C. Talozi su isprani dva puta i resuspendovani u 10 mm PBS-u (Phosphate Buffered Saline), ph 7,4. Ćelije su opet centrifugirane i napravljene su suspenzije u sterilnom fiziološkom rastvoru podešene na 1 McFarland. Po 1 ml svake suspenzije je prebačen u dve Eppendorf epruvete (ukupno šest), centrifugirano i resuspendovano u 6 ml supernatanata BMK. Kao negativna kontrola korišćene su ćelije bez tretmana. Kao pozitivna 17

kontrola za izolat Lc. mesenteroides ssp. dextranicum PK15 korišćen je hloramfenikol u koncentraciji od 10 µg/ml. Epruvete su inkubirane na 37 C. Na 0, 2 i 4 h uzimano je po 1 ml svake suspenzije, centrifugirano na 6700 g 5 min i resuspendovano u PBS-u (10 mm, ph 7,4) koji sadrži 10 µg/ml kristal violet boje (Slika 5). Nakon inkubacije od 15 min na 37 C, suspenzije su centrifugirane na 13 000 g 15 min i merena je apsorbanca supernatanta na 595 nm spektrofotometrijski. Procenat usvajanja kristal violet boje od strane indikator sojeva iz uzoraka izračunat je uz pomoć jednačine: Usvajanje boje ( ) = (1 Vrednost apsorbance uzorka Vrednost apsorbance kristal violet boje ) 100, pri čemu vrednost apsorbance kristal violet boje iznosi A=2,533. Slika 5. Uzorci vrste L. monocytogenes u kristal violet boji 3.2.5. Bradfordova metoda Integritet ćelije je ispitan određivanjem oslobađanja ćelijskih proteina u supernatant metodom koju su opisali Lv, Liang, Yuan i Li (2010), i Diao, Hu, Zhang i Xu (2014) sa nekim modifikacijama. Ćelije indikator sojeva (E. coli, L. monocytogenes i B. cereus) iz radne kulture su sakupljene centrifugiranjem na 5000 g 10 min, isprane tri puta 0,1 M PBS-om ph 7,2 i resuspendovane u istom puferu. Zatim su ćelije resuspendovane u fiziološkom rastvoru tako da je koncentracija podešena na 1 McFarland (10 10 ćelija). U tri epruvete je naliveno po 8 ml supernatanta BMK (10, 17 i 55) u MIK koncentraciji (ukupno devet epruveta). Po 80 µl suspenzije indikator sojeva je dodato u svaki supernatant tako da je konačna koncentracija bila 18

10 8 ćelija/ml. Epruvete su inkubirane na 37 C i po 1 ml uzorka je uzimano na 0, 4 i 8 h. Uzorci su centrifugirani na 10 000 g 5 min. Po 0,1 ml svakog uzorka je pomešan sa po 5 ml Coomasie brilliant blue G-250 bojom i merena je apsorbanca na 595 nm. Koncentracija oslobođenih proteina je određena kalibracionom krivom uz pomoć albumina. 3.2.6. Time-kill analiza Baktericidni efekat supernatanata BMK ispitan je Time-kill analizom koju su opisali Joray i saradnici (2011) sa određenim modifikacijama. Ovom metodom se prati smanjenje broja ćelija indikator sojeva tokom vremena pod uticajem određene koncentracije (MIK) inhibitornog agensa. Suspenzije E. coli, L. monocytogenes i B. cereus koncentracije 5x10 6 ćelija/ml u MH bujonu inkubirane su sa supernatantima BMK Lc. mesenteroides ssp. dextranicum PK15, Lb. curvatus PK4, Lb. sakei PF18 MIK koncentracije. Suspenzije indikator sojeva u MH bujonu pomešane sa sterilnim fiziološkim rastvorom korišćene su kao kontrola. Analiza je vršena na svaka tri sata (0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 h). U miktoritar ploči sa 96 bunarića napravljena je serija od šest razređenja uzoraka. Određivanje broja bakterija vršeno je drop-count tehnikom zasejavanja na hranljive podloge. Po 10 µl od drugog do šestog razređenja zasejano je na Petri ploče sa hranljivim agrom. Nakon inkubacije 24 h na 37 C, određen je ukupni broj kolonija na pločama. 19

4. Rezultati i diskusija U konceptu sigurnosti hrane stalna su nastojanja za što trajnijim rešenjima radi zaštite zdravlja potrošača od štetnih mikroorganizama. Istraživanja i razvoj zaštitnih tehnologija u prehrambenoj industriji sve su intenzivnija, a posebni interes pridaje se primeni zaštitnih kultura mikroorganizama i njihovih antimikrobnih metabolita (Zdolec i sar., 2007). U tom pogledu proučavanje principa mikrobnih interakcija prirodne mikroflore fermentisanih proizvoda može imati praktičnu primenu u proizvodnji sigurnije hrane. Grupa BMK sadrži veliki broj vrsta koje se izoluju iz različitih fermentisanih proizvoda i pokazuju širok spektar antimikrobne aktivnosti na patogene vrste i uzročnike kvarenja hrane. U ovom radu ispitivana je antimikrobna aktivnost jedanaest izolata BMK izolovanih iz peglane kobasice. Do sada nije proučavana mikrobna flora peglane kobasice tako da se u literaturi ne mogu pronaći podaci o antimikrobnoj aktivnosti izolata BMK izolovanih iz peglane kobasice. Međutim, postoje brojna istraživanja inhibitornog delovanja BMK izolovanih iz drugih fermentisanih namirnica. 4.1. Antimikrobna aktivnost BMK Za ispitivanje osetljivosti indikator sojeva agar difuzionom metodom korišćene su suspenzije BMK, supernatanti prekonoćnih kultura niske ph vrednosti i neutralisani supernatanti. Suspenzije BMK sadrže žive ćelije koje u kompeticiji sa indikator sojevima mogu osloboditi različite produkte metabolizma i dati im kompetitivnu prednost. Osim toga, antimikrobni agensi mogu biti neki od krajnjih produkata fermentacije BMK koji se oslobađaju u spoljašnju sredinu. Ovi produkti nastaju prilikom rasta bakterija u hranljivoj podlozi i nalaze se u supernatantu centrifugirane bakterijske kulture. Supernatant BMK je kisele reakcije zbog prisustva organskih kiselina u velikom procentu. Ove kiseline mogu da budu ključni faktor koji uništava ćelije indikator sojeva. Da bi se ispitalo da li postoji i drugi faktor osim kiseline, koji ubija ćelije indikator sojeva, supernatant se neutrališe i na taj način se uklanja njen efekat. 20

Agar difuzionom metodom merene su zone inhibicije oko bunarića u kojima su bile suspenzije BMK. Na osnovu izmerenih zona inhibicije (Tabela 1), može se zaključiti da suspenzije testiranih izolata BMK inhibiraju rast indikator sojeva, sa izuzetkom izolata Lb. sakei PF3 i Lc. mesenteroides ssp. dextranicum PK15 koji nisu pokazali inhibitorno dejstvo na vrstu E. coli i izolata Lb. sakei PF6 i Lb. curvatus PK4 koji nisu inhibirali rast vrste B. cereus. Generalno, najveću rezistentnost pokazala je vrsta E. coli sa srednjom vrednošću zona inhibicije 12,8 mm, a najveću osetljivost vrsta L. monocytogenes, čija je srednja vrednost zona inhibicije 17,2 mm. Suspenzija izolata C. divergens PK3 pokazala je najveću antimikrobnu aktivnost sa srednjom vrednošću zona inhibicije od 17,4 mm, a suspenzije izolata Lc. mesenteroides ssp. dextranicum PK15 najmanju srednju vrednost zona inhibicije koja iznosi 9,2 mm. Supernatanti BMK pokazali su najjaču inhibitornu aktivnost s obzirom na to da su svi ispitivani indikator sojevi pokazali osetljivost (Tabela 2). Gram-pozitivne bakterije St. aureus, L. monocytogenes i B. cereus imaju jednaku srednju vrednost zona inhibicije (15 mm) i najosetljivije su na dejstvo supernatanata. Najveća vrednost zona od 20 mm javila se kod vrste B. cereus, kao najosetljivije na supernatante izolata C. divergens PK3 i Lb. sakei PF3. Srednja vrednost zona inhibicije kod vrste S. typhimurium iznosi 14 mm, dok je vrsta E. coli pokazala najveću rezistentnost na supernatante, sa srednjom vrednošću zona inhibicije od 12 mm. Pored toga, najveću antimikrobnu aktivnost na ispitivane supernatante imaju izolati C. divergens PK3 i Lc. mesenteroides ssp. dextranicum PK15, a najmanji efekat pokazali su izolati W. viridescens M1 i Lb. sakei PF18. 21

Tabela 1. Zone inhibicije rasta indikator sojeva u prisustvu suspenzija BMK izražene u mm Izolat E. coli St. aureus L. monocytogenes B. cereus S. typhimurium Lb. sakei M16 17 17 17 15 15 PF3 / 19 18 17 18 PF6 15 20 20 / 16 PF18 13 18 17 16 16 PF19 15 16 18 17 17 Lb. curvatus PK4 18 14 19 / 18 Lc. mesenteroides PK15 / 9 15 14 8 PK16A 17 16 18 13 17 W. viridescens M1 12 18 16 20 14 C. divergens PK3 19 16 18 16 18 C. maltaromaticum M2 15 18 14 18 18 22

Tabela 2. Zone inhibicije rasta indikator sojeva u prisustvu supernatanata BMK izražene u mm Izolat E. coli St. aureus L. monocytogenes B. cereus S. typhimurium Lb. sakei M16 12 15 14 19 14 PF3 10 16 16 20 14 PF6 12 14 18 15 13 PF18 10 14 11 13 13 PF19 12 15 16 14 12 Lb. curvatus PK4 11 15 14 17 16 Lc. mesenteroides PK15 13 17 16 18 16 PK16A 15 16 14 18 16 W. viridescens M1 12 12 14 12 12 C. divergens PK3 16 16 16 20 14 C. maltaromaticum M2 14 16 16 15 14 Indikator sojevi pokazali su najveću rezistentnost na neutralisane supernatante BMK (Tabela 3). Svi sojevi su rezistentni bar na jedan supernatant, a kod vrste St. aureus nije bilo zona inhibicije za šest od jedanaest ispitivanih supernatanata. Vrsta St. aureus pokazala je najveću rezistentnost sa srednjom vrednošću zona inhibicije od 6 mm, a vrsta B. cereus je najosetljivija, pri čemu je srednja vrednost zona inhibicije bila 12,6 mm. Najveću antimikrobnu aktivnost pokazao je neutralisani supernatant izolata C. divergens PK3, a najmanje vrednosti zabeležene su kod izolata W. viridescens M1 i Lb. sakei PF6. 23

Tabela 3. Zone inhibicije rasta indikator sojeva u prisustvu neutralisanih supernatanata BMK izražene u mm L. S. Izolat E. coli St. aureus B. cereus monocytogenes typhimurium Lb. sakei M16 14 14 11 10 14 PF3 10 / / 12 / PF6 16 / 12 14 12 PF18 / / 14 12 10 PF19 Lb. curvatus 14 / 14 12 14 PK4 / 14 12 12 13 Lc. mesenteroides PK15 16 / 12 / / PK16A 12 10 15 14 15 W. viridescens M1 C. divergens 10 / / 12 / PK3 / 14 16 14 16 C. maltaromaticum M2 12 14 13 15 / U mnogim istraživanjima dokazana je antimikrobna aktivnost supernatanata BMK u kojima je dominantni antimikrobni agens bila mlečna kiselina. Inhibitorni efekat supernatanata devetnaest sojeva roda Lactobacillus sp,. izolovanih iz turskih mlečnih proizvoda, na bakterije E. coli i St. aureus pripisan je mlečnoj kiselini u kombinaciji ili bez delovanja H2O2 (Aslim i sar., 2004). Kod tri izolata čiji su supernatanti neutralisani i tretirani katalazom zabeležena je slaba inhibitorna aktivnost na vrstu E. coli i srednja inhibitorna aktivnost na vrstu St. aureus tako da se njihovo dejstvo pripisuje bakteriocinima. 24

U ovom radu su supernatanti svih izolata pokazali antimikrobnu aktivnost na ispitivane indikator sojeve i veće zone inhibicije u odnosu na neutralisane supernatante. Neutralisani supernatanti izolata Lc. mesenteroides ssp. dextranicum PK16A i Lb. sakei M16 pokazali su antimikrobnu aktivnost na sve indikator sojeve te se može predpostaviti da njihovo dejstvo može biti i posledica delovanja drugih supstanci kao što su bakteriocini, tako da je dalja analiza ovih izolata neophodna kako bi se utvrdilo poreklo aktivnosti. Različite koncentracije prečišćene mlečne kiseline pokazale su antimikrobnu aktivnost na vrste E. coli, St. aureus, L. monocytogenes i B. cereus (Stanojević-Nikolić, 2015). S druge strane, Ibrahim i sar. (2008) otkrili su da mlečna kiselina u niskoj koncentraciji (2 mg/ml) inhibira rast Salmonella spp. i E. coli O157:H7. Slično tome, Yesillik i sar. (2011) pokazali su da mlečna kiselina u koncentraciji od 9 mg/ml inhibira rast S. typhimurium (sa zonom inhibije od 22,6 mm), dok na vrste E. coli i St. aureus nije pokazala efekat. Dobijeni rezultati pokazuju da supernatanti BMK pokazuje veću efikasnost protiv Gram-pozitivnih (L. monocytogenes, St. aureus i B. cereus) nego protiv Gram-negativnih bakterija (E. coli i S. typhimurium), što je u saglasnosti sa rezultatima drugih autora (Savadogo i sar., 2004; Mezaini i sar., 2009). Razlog tome je drugačija strukturna i hemijska kompozicija spoljašnjih ćelijskih omotača i razlika u toleranciji pojedinačnih mikroorganizama. Mehanizmi rezistencije Gram-negativnih bakterija su složeniji zbog toga što su njihove ćelije obavijene spoljašnjom hidrofobnom membranom koja blokira ulazak hidrofilnih molekula male molekulske mase kao što su kiseline, alkoholi, vodonik-peroksid, ugljen-dioksid koji mogu proći jedino kroz hidrofilne kanale (porine) u lipidnom dvosloju. S druge strane, činjenica da Gram-pozitivne bakterije poseduju samo debeo peptidoglikanski omotač i lipidni dvosloj može objasniti veću osetljivost ovih bakterija na mlečnu kiselinu. Osim uticaja BMK na indikator sojeve, agar difuziona metoda je korišćena i za ispitivanje međusobnog dejstva odabranih izolata BMK. Od svih izolata BMK, jedino je izolat Lb. sakei PF6 pokazao osetljivost na druge izolate. Zone inhibicije izolata Lb. sakei PF6 date su u Tabeli 4. Izolat Lb. sakei PF6 pokazao je najveću osetljivost na rast izolata C. divergens PK3, sa zonom inhibicije od 17 mm. Rezistentnost je zapažena jedino pri rastu izolata Lc. mesenteroides ssp. dextranicum PK16A. 25

Tabela 4. Zone inhibicije izolata Lb. sakei PF6 u prisustvu izolata BMK izražene u mm Izolat Izolat Lb. sakei PF6 Lb. sakei M16 13 PF3 13 PF18 14 PF19 14 Lb. curvatus PK4 13 Lc. mesenteroides PK15 13 PK16A / W. viridescens M1 14 C. divergens PK3 17 C. maltaromaticum M2 14 4.2. Određivanje minimalne inhibitorne koncentracije (MIK) Metodom mikrodilucije određene su vrednosti MIK na indikator sojeve za supernatante svih jedanaest izolata BMK. Rezultati su prikazani u Tabeli 5. Većina dobijenih vrednosti MIK ispitivanih supernatanta bila je 50% početne koncentracije supernatanta. Vrsta St. aureus pokazala je najveću rezistentnost na supernatante BMK sa tri MIK vrednosti (za izolate Lb. sakei M16, Lb. sakei PF3 i Lb. sakei PF6) od 100% (koncentrovan supernatant). Najveću osetljivost pokazale su vrste L. monocytogenes i S. typhimurium, sa srednjom MIK vrednošću od 37,5%. Vrste St. aureus i S. typhimurium nisu pokazale rast ni na jednoj koncentraciji supernatanta soja Lb. sakei PF19 što ukazuje na veliku osetljivost. 26

Tabela 5. MIK vrednosti supernatanata MKB za indikator sojeve izražene u procentima Izolat E. coli St. aureus L. monocytogenes B. cereus S. typhimurium Lb. sakei M16 50 100 50 50 50 PF3 25 100 25 50 25 PF6 50 100 50 50 50 PF18 25 50 50 50 50 PF19 50 0 50 50 0 Lb. curvatus PK4 25 50 25 25 25 Lc. mesenteroides PK15 50 50 25 50 50 PK16A 50 50 25 50 50 4.3. Ispitivanje mehanizama antimikrobne aktivnosti BMK Da bi se detaljnije proučili mehanizmi pomoću kojih BMK ubijaju ćelije indikator sojeva, odabrana su tri izolata (Lc. mesenteroides ssp. dextranicum PK15, Lb. curvatus PK4 i Lb. sakei PF18). Ispitana je produkcija vodonik-peroksida kao i oštećenje membrane indikator sojeva E. coli, L. monocytogenes i B.cereus. Brojne vrste BMK produkuju vodonik-peroksid u malim koncentracijama. Od 87 ispitivanih izolata, pre svega iz roda Lactobacillus sp., kod svih je zabeležena produkcija u koncentracijama između 0,003 mg/ml i 0,007 mg/ml (Hor i Liang, 2013). U radu objavljenom od strane Adesokana i saradnika (2010), navodi se da sojevi BMK iz rodova Leuconostoc sp. i Lactobacillus sp. produkuju vodonik-peroksid, pri čemu je najveća koncentracija zabeležena kod vrste Leuconostoc mesenteroides, a najmanja kod Lactobacillus plantarum. U ovom radu, kvantitativno određivanje vodonik peroksida izvršeno je titracijom sa 0.1 M kalijum permanganatom. Kod sva tri izolata BMK potvrđena je produkcija vodonik-peroksida, pri čemu 27

je najveća koncentracija vodonik peroksida zabeležena kod soja Lb. sakei PF18, zatim kod soja Ln. mesenteroides ssp. dextranicum PK15, a najmanja kod soja Lb. curvatus PK4 (Tabela 6). Tabela 6. Produkcija vodonik-peroksida Izolat KMnO 4 (ml) H 2O 2 (mg) PF18 2,05 3,67 PK4 0,85 1,52 PK15 1,65 2,95 Kristal violet metoda je korišćena za ispitivanje promene permeabilnosti membrane indikator sojeva pod dejstvom supernatanata BMK. Sve veće usvajanje boje od strane ćelije, odnosno smanjenje vrednosti apsorbance uzorka tokom vremena označava povećanje permeabilnosti kao posledica oštećenja na membrani. Na osnovu dobijenih rezultata (Tabela 7) može se zaključiti da permeabilnost membrane raste tokom vremena za većinu indikator sojeva, a drastičan porast beleži se nakon 20 h inkubacije za izolat Lc. mesenteroides ssp. dextranicum PK15. Mala odstupanja zabeležena su kod vrste L. monocytogenes za delovanje supernatanta izolata Lc. mesenteroides ssp. dextranicum PK15 i kod vrsta L. monocytogenes i B.cereus za delovanje supernatanta izolata Lb. sakei PF18. Kod kontrola se takođe uočava povećanje permeabilnosti tokom vremena i značajna razlika u odnosu na uzorke. 28