Master rad

Транскрипт

1 UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET NIŠ DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU Natalija N. Verović Uticaj konzervanasa na sprečavanje mikrobiološkog kvarenja medovine Master rad Niš, 2018.

2 UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET NIŠ DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU Uticaj konzervanasa na sprečavanje mikrobiološkog kvarenja medovine Master rad Kandidat: Natalija N. Verović Mentor: Dr Nataša Joković Niš, Oktobar, 2018.

3 UNIVERSITY OF NIS FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY Master thesis Effect of preservatives on microbial mead spoilage Candidate: Natalija N. Verović Mentor: Nataša Joković, PhD Niš, 2018.

4 Rad koji je pred vama poslednji je kamenčić u mozaiku mog petogodišnjeg obrazovanja i čini samo jedan delić znanja koje sam stekla na ovom fakultetu. Ovaj master rad, kao i sve ostalo pre njega, sigurno ne bi mogao nastati bez pojedinih ljudi koji su mi tokom studija pružali ogromnu podršku, usmeravali me i činili da iz ovog procesa izađem sa diplomom i osnovama znanja koje ću čitavog života nadograđivati. Neizrečivu zahvalnost najpre dugujem mom mentoru, prof. dr Nataši Joković, zbog iskazanog strpljenja, podrške i volje da uvek odgovori na moja bezbrojna pitanja i ispravi sve moje početničke propuste. Ništa manju zahvalnost želim da iskažem i asistentu Nikoli Stankoviću čiji su dragoceni saveti učinili da iz oblasti koja je predmet ovog rada svakog dana, pa i noći, naučim nešto novo i razjasnim nešto što, bez pravog usmerenja, verovatno nikada ne bih mogla sama. Iako u poslednjim redovima, možda i najveća zahvalnost ide ljudima koji su me trpeli, kritikovali i podržavali, nervirali me i tešili, ali uvek razumeli i voleli, ljudima koji su meni svoj život posvetili, a kojima ja posvećujem ovaj rad kao i sve svoje obrazovanje. Hvala vam što ste uvek bili više od roditelja i što ste mi put ka samostalnosti učinili mnogo lakšim.

5 Biografija kandidata Ime i prezime: Natalija Verović Datum rođenja: 25. novembar godine Mesto rođenja: Knjaževac Osnovna škola: OŠ Učitelj Tasa u Nišu ( god.) Srednja škola: Gimnazija Svetozar Marković u Nišu, društveno-jezički smer ( god.) Fakultet: Prirodno-matematički fakultet u Nišu ( god.) Osnovne akademske studije: smer biologija ( god.) Master akademske studije: smer biologija ( god.)

6 Sažetak Alkoholna fermentacija je biološki proces transformacije šećera u etanol. Medovina je alkoholni napitak sličan vinu koji nastaje fermentacijom medne šire. Konzervansima se smatraju sva jedinjenja koja usporavaju ili sprečavaju mikrobiološko kvarenje hrane. U ovom radu korišćeno je osam uzoraka medovine na kojima je ispitivana antimikrobna aktivnost natrijum benzoata, kalijum metabisulfita i propolisa. Određena je minimalna inhibitorna koncentracija mikrodilucionom metodom. U prvom delu eksperimenta ispitivana je aktivnost konzervanasa na centrifugiranim uzorcima. U drugom delu uzorci nisu bili centrifugirani već samo tretirani konzervansima. Na osnovu dobijenih rezultata može se zaključiti da se centrifugiranje može koristiti za konzervisanje medovine. Natrijum benzoat je pokazao najbolje rezultate u inhibiranju rasta bakterija i kvasaca u uzorcima koji nisu bili centrifugirani. Kalijum metabisulfit je takođe pokazao dobre rezultate, inhibirajući rast bakterija u većini uzoraka. Primenjene koncentracije propolisa imale su najmanji inhibitorni efekat na mikroorganizme u uzorcima. Ključne reči: Medovina, propolis, natrijum benzoat, kalijum metabisulfit

7 Abstract Alcohol fermentation is the biological transformation of sugar into ethanol. Mead is an alcoholic drink similar to wine produced by the fermentation of honey must. Preservatives are chemical substances that slow down or prevent microbiological food spoilage. Antimicrobial activity of sodium benzoate, potassium metabisulfite and propolis was assessed on eight samples of mead. Minimal inhibitory concentration was determined by the microdilution method. In the first part of the experiment, inhibitory activity of preservatives was examined in centrifuged samples. While in the second part the samples were not centrifuged but only treated with preservatives. Based on the results obtained, it can be concluded that centrifugation can be used for preserving mead. Sodium benzoate showed the best results in inhibiting the growth of bacteria and yeast cells. Potassium metabisulfite also showed good results by inhibiting bacterial growth in most samples. The applied concentrations of propolis had the weakest inhibitory effect on the microorganisms in the samples. Key words: Mead, propolis, sodium benzoate, potassium metabisulfite

8 Table of Contents 1. Uvo Vino Medovina Kvasci Mikroorganizmi kvarenja vina Kvarenje kvascima Kvarenje bakterijama mlečne kiseline Kvarenje bakterijama sirćetne kiseline Kvarenje endosporulišućim bakterijama Kvarenje plesnima Kontaminacija pampura Prevencija kvarenja vina Ciljevi rada Materijal i metode Materijal Uzorci medovine Konzervansi Metode Mikrodiluciona metoda Metoda indirektnog brojanja mikroorganizama Određivanje rezidualnih šećera u uzorcima Benediktovim testom Rezultati i diskusija Prvi set eksperimenata Drugi set eksperimenata Minimalna inhibitorna koncentracija Rast mikroorganizama u uzorcima Koncentracija rezidualnih šećera Zaključak Literatura... 31

9 1. Uvod Fermentacija je biotehnološki postupak koji koristi rast i metaboličku aktivnost mikroorganizama za transformaciju i konzervaciju hrane. Tokom fermentacije, rast mikroorganizama kvarenja i patogenih organizama inhibiraju metaboliti organizama koji izvode fermentaciju. Osim konzervacije, fermentacija utiče na aromu, ukus, teksturu i nutritivni sastav hrane (Terefe, 2016). Vino je fermentisano alkoholno piće koje nastaje fermentacijom grožđa ili šire. Iako koncept transformacije šire grožđa u vino nije teško razumeti, proizvodnja ukusnog i stabilnog vina koje se ne kvari tokom stajanja, smatra se posebnom veštinom. Pića slična vinu mogu se proizvoditi fermentacijom drugog voća i cveća (Bartowsky, 2009). Medovina ili vino od meda je alkoholni napitak (8-18% etanola) koji nastaje kao produkt alkoholne fermentacije medne šire. Tradicionalna medovina je fermentisana smeša meda i vode. Poslednjih godina u ovu smešu se dodaju voće i začini (Iglesias et al., 2014). Usled visoke koncentracije šećera, proces fermentacije napreduje polako, zahteva određeni ph, temperaturu, određene sojeve kvasca ienzima (Sroka i Tuszyński, 2007). Postoji nedostatak naučnih informacija o fermentaciji medovine ali su proizvođači ustanovili da poboljšanje kvaliteta medovine uključuje razvoj odgovarajuće formule aditiva i optimizacije uslova fermentacije. Brojna istraživanja sprovedena na drugim fermentisanim napicima mogu biti od pomoći za kontrolu fermentacije medovine (Mendes-Ferreira et al., 2010). Rast mikroorganizama u hrani može rezultirati konzervacijom ili kvarenjem hrane, u zavisnosti od vrste mikroorganizama i uslova koji vladaju u hrani (Prescott et al.,1993). Konzervansi su supstance koje produžavaju trajnost namirnica i štite ih od kvarenja prouzrokovanog mikroorganizmima. Dodaju se namirnicama u količinama koje su (bar prema sadašnjim saznanjima) potpuno neškodljive za čoveka, a sami ili u kombinaciji sa drugim aditivima sprečavaju razvoj mikroorganizama, izazivača kvarenja i propadanja namirnica (Šumić, 2009). 1

10 1.1. Vino Vino je proizvod kompleksne biološke i biohemijske interakcije između šire i raznovrsnih mikroorganizama (gljiva, kvasaca, bakterija mlečne i sirćetne kiseline) i mikovirusa i bakteriofaga koji ih napadaju. Proces počinje u vinogradu, nastavlja se kroz fermentaciju i sazrevanje, a zaključuje flaširanjem. Od svih mikroorganizama, kvasci imaju najznačajniju ulogu, oni sprovode alkoholnu fermentaciju (pretvaraju širu u etanol i CO 2 ). Osim toga, iako je ukus vina direktno određen sortom grožđa, kvasci utiču na ukus i kvalitet vina produkcijom i ekskrecijom metabolita tokom rasta i autolize. U nekim slučajevima, kvasci mogu uticati na kvarenje vina tokom proizvodnje. Kvasci prisutni tokom fermentacije potiču iz grožđa, vinograda, opreme koja se koristi u vinskim podrumima, površina u podrumima i spoljašnjih izvora kao što su selekcionisane kulture dodate kako bi olakšale fermentacije (Jolly et al., 2017). Glavna uloga mikroorganizama u proizvodnji vina je prevođenje šećera iz grožđa u alkohol, smanjenje kiselosti i davanje zanimljivih i poželjnih aroma i ukusa vinu. Iako grožđe ima dobar nutritivni sastav, samo ograničeni broj mikroorganizama može rasti na njemu. Vino koje ima manje nutritivne vrednosti u odnosu na grožđe je nepogodan supstrat za rast većine mikroorganizama. Ograničavajući faktori rasta kvasaca i bakterija u grožđu su visoka koncentracija šećera i nizak ph, a u vinu visoka koncentracija etanola, kiselost, sadržaj SO 2 i oskudna količina nutritijenata. Jedan od ciljeva vinarstva jeste redukcija potencijalnih mikrobnih kvarenja vina (Bartowsky, 2009) Medovina Medovina se smatra najstarijim fermentisanim napitkom, s obzirom da je med, glavni sastojak medovine, bio prvi izvor skoro čistog šećera (Piatz, 2014). Medovina je alkoholno piće, jačine 9%-18% alkohola, koje se dobija fermentacijom medne šire, uz mogućnost dodavanja različitih začina i voća (Slika 1). Iako med sadrži fermentabilne šećere, nema dovoljno azota, minerala i faktora rasta koji stimulišu rast kvasaca i fermentaciju. Voćni sokovi, soli i kiseline koriste se kao aditivi za stimulaciju fermentacije i poboljšanje ukusa. Promenom proporcije meda i vode i tačke prekida fermentacije, dobijaju se različite vrste medovine (Gupta i Sharma, 2009). 2

11 Tradicionalna proizvodnja medovine uključuje zagrevanje ili ključanje medne šire (nefermentisana smeša meda i vode) pre fermentacije u cilju eliminacije proteina i mikroorganizama (Kahoun et al., 2017). Fermentacija medovine zahteva dosta vremena, ponekad i po nekoliko meseci, u zavisnosti od vrste meda, soja kvasca i sastava šire. U većini zemalja koje proizvode medovinu, alkoholna fermentacija je rezultat rasta mikroorganizama koji su prirodno prisutni u medu, a uspevaju da prežive na korišćenim supstratima i opremi. U ovim slučajevima alkoholna fermentacija je dosta nepredvidljiva i često je medovina na kraju fermentacije kontaminirana kvascima i bakterijama, pa se ne može konzumirati. U poslednje vreme koriste se selekcionisani sojevi kvasaca izolovani iz meda/medovine ili komercijalne starter kulture kvasaca kako bi se smanjio rizik od kontaminacije (Mendes-Ferreira et al., 2010). Izbor vrste kvasca za fermentaciju je veoma važan aspekt, s obzirom da utiče na ukus i druge parametre kvaliteta medovine. Medovina sadrži brojne nutritivne elemente koji su neophodni organizmu i ima povoljne efekte na varenje i metabolizam. Korišćenje medovine daje rezultate pri lečenju anemije i hroničnih bolesti gastrointestinalnog trakta (Gupta i Sharma, 2009). Slika 1. Medovina 3

12 1.2. Kvasci Alkoholna fermentacija ili kako se često naziva alkoholno vrenje biohemijski je proces transformacije monosaharida (glukoza, fruktoza) u alkohol i ugljen-dioksid posredstvom kvasaca, uz učešće celog niza enzima (Fleet, 2003). Mnoga istraživanja pokazala su dasu vrste rodova Kloeckera, Metschnikowia, Candida, Hanseniaspora, Rhodotorula, Pichia, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Saccharomyces, Zygosaccharomyces i Debaryomyces predominantne u inicijalnoj fazi spontane fermentacije. Kvasci koji pripadaju rodovima Saccharomyces i Kluyveromyces mogu izvesti fermentaciju do kraja. Kvasci koji ne pripadaju rodu Saccharomyces generalno rastu tokom prve faze fermentacije, kada koncentracija etanola raste, etanol-tolerantniji kvasci roda Saccharomyces završavaju fermentaciju. Rani rast kvasaca u širi smanjuje ili lišava vino nutritijenata, čineći ga manje poželjnim okruženjem za dalji rast mikroorganizama. S druge strane, takav rast stvara niz metabolita, neki od njih mogu biti toksični za druge vrste kvasaca. Inhibitorno dejstvo etanola i kratkih masnih kiselina na neke mikroorganizme dobro je izučeno (Urso et al., 2008) Mikroorganizmi kvarenja vina Veza između mikroorganizama i fermentacije alkoholnih napitaka datira još iz Biblijskih vremena. Prvo zapažanje mikroba u fermentisanom vinu omogućio je Antoni van Levenhuk razvojem mikroskopa sredinom 17. veka, a mikrobiologija vina je objašnjena sredinom 19. veka kada je Luj Paster primetio da kvasci pretvaraju sok od grožđa u vino. Osim toga, primetio je da pojedine bakterije koje utiču na kvarenje vina, mogu rasti u medijumu. Mikroorganizmi su sama srž procesa proizvodnje vina. Bilo da su poželjni ili ne, oni utiču na kvalitet vina i ekonomsko stanje industrije vina. Proces proizvodnje vina je kompleks ekoloških niša gde biohemija i interakcija kvasaca, bakterija, gljiva i njihovih virusa igraju ključnu ulogu u finalnom proizvodu. Zbog toga je od krucijalne važnosti razumevanje uslova pod kojim određeni mikroorganizmi mogu izazvati kvarenje odnosno produkovati nepoželjne ukuse, arome i boje. Sa takvim informacijama moguće je izboriti se sa kvarenjem vina i razviti nove metode prevencije. 4

13 Kvarenje kvascima Samo dvanaest od svih rodova kvasaca povezano je sa grožđem i vinima, ukazujući na stepen specijalizacije koji je neophodan da bi se preživeli nepovoljni uslovi u vinu. Termin vinski kvasci se odnosi na kvasce iz roda Saccharomyces koji mogu izvršiti potpunu fermentaciju sire bez proizvodnje neželjenih ukusa. Ovi kvasci su tolerantni na visoke koncentracije etanola i šećera. Termin divlji kvasci se odnosi na kvasce koji ne pripadaju rodu Saccharomyces, a koji mogu izvesti parcijalnu alkoholnu fermentaciju, često proizvodeći estre. Obe vrste kvasaca mogu uticati na kvarenje. Refermentacija. Saccharomyces može uticati na kvarenje vina ukoliko se u pogrešno vreme nađe na pogrešnom mestu (npr. u boci poluslatkog vina) izazivajući refermentaciju. Saccharomyces ludwigii, pronađena u bocama vina, često se označava kao noćna mora vinara. Ova vrsta kvasca je visoko tolerantna na etanol i otporna na SO 2 i sorbat. Shizosacchamyces pombe izaziva kvarenje vina kada započne rast u flaši i formira talog na dnu. Kvasac Zygosaccharomyces bailii jedan je od najznačajnijih uzročnika kvarenja, refermentišući sok ili vino tokom skladištenja. Formiranje estra. Hansenula anomala (po novoj klasifikaciji Pichia anomala), Kloeckera apiculata i Hanseniaspora uvarum uglavnom se vezuju za kvarenje vina estrima, što je povezano sa velikim količinama sirćetne kiseline. Estri se mogu povezati i sa prisustvom etil acetata i metilbutil acetata koji daju karakterističan ukus pokvarenim vinima. Rast Zygosaccharomyces bailii, takođe može dovesti do povećanja koncentracije sirćetne i ćilibarne kiseline u vinima, a smanjenja L-jabučne kiseline i opštem smanjenju ph i izmenjenoj koncentraciji estara. Hidrogen sulfat i isparljiva sumporna jedinjenja. Sposobnost kvasaca da proizvode H 2 S, varira između različitih sojeva i zavisi od uslova sredine u kojoj se nalaze, npr. sadržaj šire (čvrste materije, vitamini i slobodan amino nitrogen), temperatura fermentacije, ph vina i upotreba fungicida sa elementarnim sumporom. 5

14 Isparljive kiseline. Visoke koncentracije isparljivih kiselina posledica su rasta vinskih kvasaca, divljih kvasaca i bakterija sirćetne kiseline. Sirćetna kiselina formira se kao nusprodukt kvasaca tokom ranih faza alkoholne fermentacije. Saccharomyces sojevi pokazuju variranja u produkciji acetata, a ovaj fenomen zavisi od temperature fermentacije, ph, sadržaja sirovine (koncentracije šećera i azota), koncentracije acetil-coa sintetaze i prisustva drugih mikroorganizama. Kvasci uključeni u preveliku acetifikaciju vina uključuju vrste iz rodova Brettanomyces, Dekkera, kao i vrste Pichia anomala, Kloeckera apiculata i Candida krusei. Formiranje filma. Neke vrste rodova Candida, Metschnikowia i Pichia mogu formirati film na površini vina. Razvoj ovih kvasaca zavisi od prisustva kiseonika, tako da do njihovog rasta dolazi ukoliko je vino izloženo vazduhu i polupraznim buradima. Finalni produkti, sirćetna kiselina, acetalaldehid i estri acetata nastaju od etanola. Deacidifikacija. Kiselost vina je značajna osobina jer direktno utiče na ukus, a indirektno na ph, boju, stabilnost i kvalitet vina. Deacidifikacija može nastati konverzijom jabučne kiseline u mlečnu kiselinu i ugljen dioksid. Ovaj proces se naziva malolaktičkom fermentacijom, a izvode je bakterije mlečne kiseline, pre svega Oenococcus oeni. Saccharomyces cerevisiae slabije koristi jabučnu kiselinu, za razliku od vrsta rodova Candida, Hansenula, Kloeckera i Pichia, dok u najvećoj meri to rade kvasci koji pripadaju vrstama Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces malidevorans i Zygosaccharomyces bailii. 6

15 Kvarenje bakterijama mlečne kiseline Bakterije mlečne kiseline (BMK) igraju ključnu ulogu u sekundarnoj fermentaciji vina izvodeći malolaktičku fermentaciju, ali mogu uticati negativno na kvalitet vina ako se razviju u pogrešnoj fazi proizvodnje vina. Rodovi koji se povezuju sa vinima su Lactobacillus, Leuconostoc, Oenococcus i Pediococcus. Neke vrste ovih rodova izolovane su iz vina i povezuju se sa kvarenjem. Spoljašnji uslovi određuju prirodne populacije BMK i sukcesije vrsta i sojeva, pre, tokom i posle alkoholne fermentacije. BMK su tolerantne na stresne faktore u vinu; adaptirane su na nizak ph, prisustvo alkohola, SO 2, niske temperature i ograničene nutritijente. Tokom alkoholne fermentacije, one ne povećavaju svoj broj zbog interakcije sa kvascima i njihovih masnih kiselina, prisustva povećane koncentracije etanola i bakteriocina koje proizvode određene BMK. Nakon alkoholne fermentacije, ovi oportunisti se mogu razviti i uticati na kvalitet vina, čak i štetno. Kiseline. BMK mogu povećati koncentraciju kiselina u vinu proizvodeći mlečnu i sirćetnu kiselinu. D-mlečna kiselina se vezuje za kvarenje vina, a L-mlečna kiselina je proizvod malolaktičke fermentacije. Homofermentativni laktobacili i pedikoke formiraju D-mlečnu kiselinu redukcijom piruvata. Heterofermetativni laktobacili, Leuconostoc spp. i Oenococcus spp. proizvode D-mlečnu kiselinu i sirćetnu kiselinu preko 6- fosfoglukonatskog puta. Osim organoleptičkog uticaja, sirćetna kiselina može usporiti ili zaustaviti fermentaciju. Ostale organske kiseline, pre svega limunska, vinska i sorbinska koje su proizvodi metabolizma određenih BMK, utiču na kvalitet vina. Najznačajniji metabolit razgradnje limunske kiseline je diacetil, zbog čega vina imaju aromu mlečnih proizvoda. Količina diacetila koju proizvode malolaktičke starter kulture relativno su male u odnosu na produkte laktobacila i pediokoka koje rastu u vinu nakon malolaktičke fermentacije. Sorbinsku kiselinu produkuju vrste iz roda Oenococcus, a nije zabeležena sinteza ove kiseline kod laktobacila i pediokoka. Vina podložna razgradnji vinske kiseline su ozbiljno pokvarena, a za to su odgovorni sojevi vrsta Lactobacillus plantarum i Lactobacillus brevis. Refermentacija poznata i kao malolaktička fermentacija na pogrešnom mestu, može se desiti u flaširanom vinu na ph>3,5 u prisustvu BMK i nutritijenata (malat ili rezidualni 7

16 šećeri) koji pospešuju rast. Nakon sekundarnog rasta BMK, vino je deacidifikovano, a ph raste iznad 3,5. Manitol. Manitol produkuju heterofermentativni laktobacili redukcijom fruktoze ili fruktozo-6-fosfata. Sam manitol nije štetan već problem predstavlja prateća proizvodnja sirćetne kiseline, D-mlečne kiseline, propanola, butanola i diacetila. Viskoznost je posledica prisustva ekstracelularnih polisaharida, pre svega D-glukana, a mikroorganizmi odgovorni za njih pripadaju rodovima Leuconostoc i Pediococcus. Akrolein nastaje prilikom bakterijske razgradnje glicerola i sam po sebi nije štetan. Međutim, reakcijom sa fenolnim grupama antocijanina daje vinima nepoželjnu gorčinu. Akrolein formiraju vrste rodova Lactobacillus, Leuconostoc, Oenococcus i Pediococcus. Metabolizam arginina. Pojedine BMK iz vina mogu metabolisati agrinin, one uključuju sojeve vrsteoenococcus oeni i heterofermentativne BMK (npr. Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus hilgardii). Katabolizam arginina daje prekursore etil karbamata, poznatog humanog i životinjskog kancerogena Kvarenje bakterijama sirćetne kiseline Bakterije sirćetne kiseline pripadaju porodici Acetobacteraceae. One su gram-negativni, aerobni, katalaza-pozivtivni mikroorganizmi, a korišćenjem glukoze daju sirćetnu kiselinu. Rodovi Acetobacter i Gluconobacter značajni su za industriju vina. Mogu oksidovati etanol do sirćetne kiseline (acetifikacija), dok acetobakterije mogu oksidovati sirćetnu i mlečnu kiselinu do CO 2 i H 2 O u Krebsovom ciklusu. Rodu Gluconobacter pripadaju tri vrste, Gluconobacter asaii, Gluconobacter frateurii i Gluconobacter oxydans, od kojih je Gluconobacter oxydans važna u vinarstvu. Rod Acetobacter čine sedam vrsta, a četiri su značajne za vinarstvo: Acetobacter aceti, Acetobacter hansenii, Acetobaceter liquefaciens i Acetobacter pasteurianus. 8

17 Isparljive kiseline. Sirćetna kiselina je značajna komponenta vina povezana sa isparljivim kiselinama. Osim toga, moža izmeniti strukturu drugih jedinjenja u vinu. Dihidroksiaceton. Glicerol, poreklom od kvasaca i plesni, A. aceti i G. oxydans koriste kao izvor ugljenika. Ove dve vrste mogu konvertovati glicerol u dihidroksiaceton pod aerobnim uslovima. Dihidroksiaceton utiče na senzorne karakteristike vina, čineći ih slatkim/eteričnim. Dihidroksiaceton može uticati i na antimikrobna svojstva vina, s obzirom da ima sposobnost vezivanja SO 2. Acetaldehid. Vina sa velikim brojem bakterija sirćetne kiseline sadrže značajne koncentracije acetaldehida, intermedijalne metabolite u produkciji sirćetne kiseline od etanola u uslovima sa smanjenim sadržajem kiseonika. Ovakva vina imaju izmenjena organoleptička svojstva. Acetaldehid vezuje SO 2 i utiče na antimikrobno delovanje SO 2. Acetoin. Sojevi iz rodova Acetobacter i Gluconobacter mogu oksidovati mlečnu kiselinu do acetoina u uslovima niske koncentracije kiselina. Osim što utiče na senzorne karakteristike, acetoin vezuje SO 2 i smanjuje antimikrobno dejsto Kvarenje endosporulišućim bakterijama Zabeleženi su i retki slučajevi mikrobiološkog kvarenja vina vrstama iz rodova Bacillus i Clostridium. Rod Bacillus čine aerobne, gram-pozitivne, katalaza-negativne, endosporulišuće, štapićaste bakterije. Bakterije roda Clostridium su gram-pozitivni, obligatno anaerobni, endosporulišući štapići Kvarenje plesnima Ukoliko rast filamentoznih gljiva (plesni) nije pod kontrolom, može imati katastrofalne posledice po kvalitet vina. Zabeleženo je da vrste plesni iz rodova Alternaria, Aspergillus, Botrytis, Cladosporium, Mucor, Oidium, Penicillium, Plasmopara, Rhizopus i Uncinula mogu ugroziti kvalitet vina. Plesni mogu produkovati i mikotoksine koji mogu biti kancerogeni. Njih produkuju vrste iz dva roda Aspergillus i Penicillium. 9

18 Kontaminacija pampura Mikrobiološka kontaminacija pampura može delovati na kvalitet vina produkovanjem nepoželjnih aroma; pampure kao supstrat koriste mikroorganizmi, izlučujući metabolite u finalni proizvod. Rodovi gljiva koji mogu napasti pampure su Aspergillus, Cladosporium, Monilia, Paecilomyces, Penicillium i Trichoderma. Rodovi kvasaca su Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Saccharomyces i Sporodiobolus, a bakterija Bacillus, Micrococcus, Streptococcus i Streptomyces (Toit and Pretorius, 2000). 10

19 1.4. Prevencija kvarenja vina Konzervansi su jedinjenja koja usporavaju ili u idealnom slučaju sprečavaju mikrobiološko kvarenje hrane. Mikrobiološki kontaminirana hrana je rezultat rasta kvasaca, plesni i bakterija, ali i stvaranja toksina, pogotovo onih koje proizvode bakterije i plesni (Bakočević, 2011). Med. Antimikrobni efekat meda zasniva se na delovanju više supstanci iz meda i zavisi od njegovog botaničkog porekla. Med inhibira rast bakterija i gljiva i može da ima mikrobicidno ili mikrobiostatičko delovanje. Zabeleženo je bakteriostatičko, kao i baktericidno dejstvo meda na brojne sojeve bakterija, od kojih su mnogi patogeni. Antimikrobna aktivnost meda je posledica male količine vode u medu, niske ph vrednosti meda kao i prisustva enzima i drugih hemijskih jedinjenja. Druga osobina meda koja doprinosi njegovoj antimikrobnoj aktivnosti je niska ph vrednost (3,2 do 4,5) pri kojoj se većini mikroorganizama zaustavlja rast. Dejstvom enzima glukozne oksidaze nastaje vodonik peroksid, jedinjenje koje ima najveću ulogu u antimikrobnom dejstvu meda (Molan i Zealand, 1997). Šećer. Najstarije civilizacije koristile su šećer kao konzervans, skladištenjem hrane u šećeru ili medu (Nummer, 2002). Visoka koncentracija šećera prirodni je konzervans protiv mikroorganizama koji mogu prouzrokovati kvarenje hrane. Kada se šećer doda hrani, vezuje vodu i na taj način je čini nedostupnom za mikrooganizme. Slično slanoj vodi, menja osmotski pritisak, npr. kada se ćelija stavi u koncentrisaniji rastvor šećera, voda izlazi iz ćelija mikrooorganizama i oni više ne mogu opstati u toj sredini. Drugi antibimikrobni mehanizam soli i šećera uključuje ometanje enzimske aktivnosti mikroorganizama i slabljenje molekularne strukture njihove DNK. Šećer takođe omogućava posredan način konzervacije ubrzavajući akumulaciju antimikrobnih jedinjenja određenih mikroorganizama. U prilog tome ide primer pretvaranja šećera u etanol od strane kvasaca ili u organske kiseline od strane bakterija mlečne kiseline (Mason, 2013). Alkohol. Ćelijska membrana omogućava toleranciju i zaštitu ćeliji od različitih stresova iz spoljašnje sredine. Etanol je posebno poznat po svojoj sposobnosti da fluidizuje membranu, rezultujući nekontrolisanim transportom rastvorenih supstanci koje mogu smanjiti fluks 11

20 protona kroz membranu i izazvati izlivanje važnih kofaktora, kao što je Mg. Etanol takođe može inaktivisati membranske i citosolne enzime, npr. ATPaze i glikolitičke enzime, onemogućavajući rast. Stoga se predpostavlja da je izmenjena ćelijska membrana odgovorna za smanjenu stopu rasta i ćelijske vijabilnosti kada je mikroorganizam izložen alkoholu (Huffer et al., 2011). Sulfiti i sumpor dioksid. Sumpor-dioksid i njegovi derivati dugo se koriste u konzerviranju namirnica. Dodaju se hrani u svrhu inhibicije i kontrole rasta mikroorganizama, sprečavanja neenzimskog posmeđivanja, inhibicije reakcija katalizovanih enzima, kao antioksidanti. Kalijum metabisulfit ( vinobran ) je najčešće korišćeni oblik sumpornih jedinjenja, posebno u manjim podrumima. Kao produkt tokom njegovog rastvaranja u vodi nastaju tri jedinjenja: sumpor-dioksid, bisulfit i sulfit. Svako od njih vezuje slobodni kiseonik iz vina. Takav kiseonik mikroorganizmi ne mogu koristiti zbog čega ne mogu opstati. Sumpor-dioksid (SO 2 ) i njegovi derivati metabolišu se do sulfata i izlučuju u urin bez vidljivih patoloških efekata. Benzoeva kiselina. Benzoeva kiselina (C 6 H 5 COOH) ima široku primenu kao antimikrobno sredstvo u hrani, a prirodno je prisutna u brusnicama, šljivama, cimetu i klinčiću. Natrijum benzoat se bolje rastvara u vodi od same kiseline i češće se koristi. U proizvodu jedan deo soli prelazi u aktivni kiseli oblik, koji je najdelotvorniji protiv kvasaca i bakterija. Manje je delotvoran na plesni. Mehanizam delovanja počinje apsorpcijom bezoeve kiseline. Ako intracelularni ph padne ispod 5, dolazi do smanjenja anaerobne fermentacije glukoze i inhibicije rasta i preživljavanja mikroorganizama koji mogu prouzrokovati kvarenje hrane. Brzo se izlučuje iz tela prvenstveno nakon konjugacije sa glicinom dajući hipurinsku kiselinu (benzoil glicin). Ovaj korak detoksikacije sprečava akumulaciju benzoeve kiseline u telu (Jašić, 2009). Propolis. Primena prirodnih jedinjenja sa antimikrobnim svojstvima može pružiti alternativu hemijskim konzervansima. Propolis, prirodni proizvod od meda, ima različite biološke aktivnosti. Alkoholni ekstrakt propolisa, forma koja se najčešće koristi, ima veoma komplikovanu strukturu. Sadrži više od 160 jedinjenja, koji se razlikuju u 12

21 zavisnosti od geografskog i botaničkog porekla (Mirzoevaet al., 1997). Flavonoidi su dobro poznati po svom antibakterijskom, antifungalnom i antiviralnom delovanju i veruje se da su odgovorni za delotvornost propolisa. Estri fenolnih kiselina, a posebno kafeati i ferulati takođe doprinose antibakterijskom, antifungalnom i antiviralnom delovanju propolisa (Kujumgieva et al., 1999). 13

22 2. Ciljevi rada Fermentacijom meda nastaje alkoholni napitak sličan vinu koji se naziva medovina. S obzirom na veliku količinu šećera u početnom supstratu, deo šećera ostaje nefermentisan u finalnom proizvodu zbog čega je medovina dobar supstrat za rast različitih mikroorganizama koji mogu izazvati kvarenje. Zato su ciljevi ovog rada bili: Određivanje minimalnih inhibitornih koncentracija propolisa, kalijum metabisulfita i natrijum benzoat na mikroorganizme prisutne u različitim vrstama medovine; Ispitivanje uticaja propolisa, kalijum metabisulfita i natrijum benzoata na rast mikroorganizama u različitim vrstama medovine. 14

23 3. Materijal i metode 3.1. Materijal Uzorci medovine U ovom radu korišćeno je 8 uzoraka medovine koji su pravljeni po recepturama prikazanim u Tabeli 1. Kao starter kulture korišćeni su sojevi Saccharomyces cerevisiae Lalvin ICV K i pekarski "C" kvasac. Šira za dobijanje medovine napravljena je tako što je medu postepeno dodavana voda sobne temperature uz intenzivno mešanje kako bi se med u potpunosti rastvorio. Male količine šire dodavane su rehidriranim kvascima, kako bi se izbegao temperaturni šok koji može ugroziti proces fermentacije. Zatim su postepeno dodavani suplementi kako bi se dobio manji broj vijabilnih ćelija, tolerantnijih na povišenu koncentraciju etanola i veća količina proteina. Šira je mešana nekoliko puta dnevno u toku prvih osam dana fermentacije kako bi se oslobodio ugljen-dioksid koji je toksičan za kvasce, a i može usporiti fermentaciju. Inicijalna fermentacija odvijala se u plastičnoj kaci sa poklopcem, a kada se smanjio stepen fermentacije, šira je prebačena u balon sa spiralnom vrenjačom kako ne bi došlo do oksigenacije. Nakon završetka procesa fermentacije, medovina počinje da se bistri, a ćelije kvasca da flokulišu. Drugi način za određivanje kraja fermentacije jeste merenje specifične težine uzorka u razmaku od nekoliko dana. U prvom delu eksperimentapo 50 ml svakog uzorka (L1, L2, L3, L4 i L5) sipano je u plastične flakone koji su centrifugirani na 4000 g 10 minuta centrifugom Hettich Univerasal 32 R. Zatim je supernatan presipan u nove flakone, u koje su dodati konzervansi (propolis i kalijum metabisulfit u koncentraciji MIK vrednosti), dok u jedan od flakona nisu dodati konzervansi (kontrola). Uzorci su čuvani u aerobnim uslovima na sobnoj temperaturi. Analize uzoraka rađene su prvih mesec dana na 4 dana, a naredna tri meseca na 15 dana. Uzorci L6, K1 i K2 nisu centrifugirani već su samo tretirani konzervansima (propolisom, kalijum metabisulfitom i natrijum benzoatom u koncentraciji MIK vrednosti), dok kontrolni uzorak nije tretiran. Na samom početku eksperimenta izmeren je sadržaj šećera širometrom. Po 30 ml 15

24 svakog uzorka naliveno je u plastične flakone, zatim je dodato po 3 gr šećera i određene količine konzervanasa. Flakoni su čuvani na sobnoj temperaturi u aerobnim uslovima, a uzorci su analizirani na 4 dana. Tabela 1. Recepti medovina Uzorak Vrsta meda Dodato voće Suplemeti Voda Soj kvasca Trajanje Fermentac ije L1 Livadski (0.3 kg) / Fermaid E (0.48 gr) 0.6 l Lalvin ICV K (0.24 gr) 25 dana L2 L3 L4 L5 L6 K1 K2 Livadski (0.3 kg) Livadski (0.3 kg) Livadski (0.3 kg) Livadski (1.5 kg) Livadski (1.5 kg) Kupinov (6 kg) Kupinov (6 kg) / Polen (7.39 gr) Malina (87 gr) Malina (287 gr) Narandža bez kore (1), suvo grožđe (25 zrna), štap cimeta (1), kafanfilić (1), muškatni oraščić Višnja (225 gr) Fermaid E (0.15 gr) Amonijum sulfat (0.04 gr) 0.6 l Lalvin ICV K (0.22 gr) 0.6 l Lalvin ICV K (0.22 gr) Polen (7.39 gr) 0.4 l Lalvin ICV K (0.22 gr) / 0.6 l Pekarski "C" kvasac (7 gr) Fermaid E (1 gr) / Fermaid E (5 gr) Kupina (600 gr) Fermaid E (5 gr) 1.6 l Lalvin ICV K (2 gr) 15.3 l Lalvin ICV K (10 gr) 15.3 l Lalvin ICV K (10 gr) 17 dana 13 dana 17 dana 11 dana 18 dana 14 dana 14 dana 16

25 Konzervansi Za ispitivanje prevencije kvarenja vina korišćeni su natrijum benzoat ( konzervans, C proizvođač), kalijum metabisulfit ( vinobran, C proizvođač) i ekstrakt propolisa (dobijen je rastvaranjem 30 gr propolisa u 100 ml domaće rakije). 17

26 3.2. Metode Mikrodiluciona metoda Mikrodilucionom metodom određuju se minimalne inhibitorne koncentracije (MIK) antimikrobnog agensa. MIK predstavlja onu koncentraciju neke supstance koja zaustavlja vidljiv rast mikroorganizma nakon inkubacije. Ova metoda primenjena je u oba seta eksperimenata. U uzorcima L1, L2, L3, L4 i L5 određivana jemik vrednost propolisa i kalijum metabisulfita u mikrotitar ploči. U bunarčiće prvog reda naliveno je 200 µl prethodno pripremljenog fiziološkog rastvora (0.9% m/v) sa određenim koncentracijama konzervansa, a u sve ostale po 100 µl bujona. Zatim je u sve bunarčiće naliveno po 100 µl uzoraka medovine. Iz svakog reda uzeto je po 100 µl i prebačeno u sledeći, tako da je rastvor deset puta razblaženiji u svakom narednom. Iz svakog bunarića prebačeno je po 10 µl nahranljivi i Sabouraud dekstrozni agar (Torlak, Srbija). Nakon toga su zasejane ploče inkubirane sati na 37 C. Za uzorke L6, K1 i K2, osim propolisa i kalijum metabisulfita, određene su minimalne inhibitorne koncentracije i za natrijum benzoat. Metoda je odrađena na isti način kao i za prethodne uzorke. Aerobne bakterije inkubirane su na hranljivom agru, anaerobne u top agru (0.7%) 24 sati na 37 o C, a kvasci na Sabouraud dekstroznom agru 48 sati na 37 o C Metoda indirektnog brojanja mikroorganizama Kako bi se odredilo da li dodati konzervansi inhibiraju rast mikroorganizama u ispitivanim uzorcima, rađeno je određivanje broja ćelija različitih mikroorganizama u određenom vremenskom periodu. U prvom setu eksperimenta brojanje je rađeno prvo na 4, a zatim na 15 dana, a u drugom setu na 4 dana. Početno razblaženje dobijeno je prebacivanjem 1 ml uzorka medovine u epruvetu sa 9 ml fiziološkog rastvora, a zatim je iz prvog razblaženja prebačen 1 ml u drugu epruvetu sa 9 ml fiziološkog rastvora što predstavlja drugo razređenje. Po 1 ml se dalje prebacivao u naredne epruvete kako bi se dobio što manji broj ćelija (Slika 2). Iz razblaženih uzoraka uzeto je po 10 µl i prebačeno na Petri ploče sa pripremljenim podlogama. Za rast bakterija u aerobnim i anaerobnim uslovima korišćen je hranljivi agar, a za rast gljiva Sabouraud dekstrozni agar. Za ispitivanje anaerobnih bakterija hranljivi agar preliven je top agrom (0.7%). Zasejane podloge su inkubirane 18

27 na 37 o C i nakon inkubacije (24 sati za bakterije, a 48 sati za kvasce) brojane su kolonije na Petri šoljama. Broj mikroorganizama u 1 ml uzorka dobija se množenjem broja izraslih kolonija sa razblaženjem i faktorom korekcije do 1 ml. Stepen preživljavanja (%) dobijen je deljenjem broja kolonija na određenom razređenju uzorka sa brojem kolonija na istom razređenju kontrole i množenjem sa 100. Slika 2. Metoda indirektnog brojanja ćelija 19

28 Određivanje rezidualnih šećera u uzorcima Benediktovim testom Benediktov test se koristi za određivanje koncentracije redukovanih šećera (mohosaharida i nekih disaharida) koji imaju slobodne ketonske ili aldehidne funkcionalne grupe. Neki šećeri poput glukoze nazivaju se redukovanim jer mogu predati vodonike (elektrone) drugim jedinjenjima u procesu redukcije. Kada se redukovani šećeri pomešaju sa Benediktovim reagensom i zagrevaju, dolazi do promene boje usled redukcije jona bakra (Aryal, 2015). Litar Benediktovog reagensa dobija se mešanjem 100 gr natrijum karbonata, 173 gr natrijum citrata i 17.3 gr bakar sulfata. Za ovu metodu iskorišćeni su uzorci L6, K1 i K2 u koje su dodati konzervansi (propolis, natrijum benzoat i kalijum metabisulfit) i uzorci bez konzervansa. U pripremljene epruvete prebačeno je po 1 ml uzorka i 2 ml reagensa. Epruvete su zatim zagrevane 3-5 minuta u ključalom vodenom kupatilu uz praćenje promene boje. Benediktov reagens je plave boje, a promena zavisi od koncentracije šećera (Slika 3). Slika 3. Mogući rezultati Benediktovog testa 20

29 4. Rezultati i diskusija 4.1. Prvi set eksperimenata Kvalitet hrane smanjuje se tokom vremena od proizvodnje do konzumiranja. Gubitak kvaliteta može biti rezultat mikrobioloških, enzimskih, hemijskih i fizičkih promena. Posledice mikrobioloških promena uključuju opasnost po potrošače usled prisustva mikrobijalnih toksina ili patogenih mikroorganizama ili dovode do ekonomskih gubitaka zbog nastanka nepoželjnih aroma i mirisa, tekstura, boja i zamućenja. Konzervansi su hemikalije koje su prisutne u hrani ili se dodaju kako bi se sprečio rast mikroorganizama. Većina prezervativa ima bakteriostatičko ili fungistatičko dejstvo pri primenjenim koncentracijama, a ne bakteriocidno i fungicidno. Zbog toga dejstvo konzervanasa ima ograničeni rok trajanja (Davidson i Taylor, 2007). Centrifugiranje je tehnika kojom se razdvaja čvrsta od tečne faze. Centrifuge male brzine (RCF do g) rutinski se upotrebljavaju u laboratoriji za taloženje: ćelija, organela i precipitata. Ova tehnika se može primeniti kao alternativni vid prevencije kvarenja medovine u cilju izbegavanja upotrebe hemijskih konzervanasa. Zato su uzorci medovine centrifugirani 10 minuta na 4000 g i nakon toga čuvani su na sobnoj temperaturi (oko 20 o C). Takođe, određena je MIK vrednost za delovanje propolisa i kalijum metabisulfita za sve ispitivane uzorke (Slika 4 i Tabela 2). Minimalna inhibitorna koncentracija dobijena je mikrodilucionom metodom u mikrotitar ploči. Zasejavanja su rađena u Petri pločama sa hranljivim i Saubouraud dekstroznim agrom. Ustanovljeno je da su uzorci L3 i L5 osetljiviji na dejstvo propolisa (4 µl/ml) i kalijum metabisulfita (0.1 mg/ml) u odnosu na ostale uzorke. Za uzorak L4 MIK kalijum metabisulfita je takođe 0.1 mg/ml, ali je zato MIK propolisa 8 µl/ml. MIK propolisa i kalijum metabisulfita za ostale uzorke je 8 µl/ml i 0.25 mg/ml. 21

30 Slika 4. Određivanje MIK propolisa i kalijum metabisulfita Table 2. MIK propolisa i kalijum metabisulfita Propolis Kalijum metabisulfit L1 8 µl/ml 0.25 mg/ml L2 8 µl/ml 0.25 mg/ml L3 4 µl/ml 0.1 mg/ml L4 8 µl/ml 0.1 mg/ml L5 4 µl/ml 0.1 mg/ml U prethodno centrifugirane uzorke medovine stavljane su MIK vrednosti konzervanasa. Broj aerobnih i anaerobnih bakterija i kvasaca određivan je u svim uzorcima medovine i kontrolnim uzorcima bez konzervansa. Broj ćelija je određivan prvih mesec dana na 4 dana, a narednih tri meseca na 15 dana. Rasta nije bilo ni u uzorcima medovine sa konzervansima, ni u kontrolnim uzorcima. Taloženje materija je standardna tehnika u vinarstvu s obzirom da je pretakanje jedan od važnih koraka u tehnologiji dobijanja stabilnog vina, kojim se odstranjuju istaložene ćelije kvasaca, proteinske materije, razne nečistoće i nepoželjni mikroorganizmi. S obzirom da ni u kontrolnom uzorku nije došlo do rasta mikroorganizama, može se zaključiti da je obaranje ćelija centrifugiranjem bilo dovoljno za prevenciju kvarenja. 22

31 4.2. Drugi set eksperimenata Minimalna inhibitorna koncentracija Minimalne inhibitorne koncentracije propolisa, natrijum benzoata i kalijum metabisulfita za uzorke L6, K1 i K2 dobijene su mikrodilucionom metodom u mikrotitar ploči serijom razblaženja (Slika 5). Za sva tri uzorka su dobijene iste MIK vrednosti, za propolis to je 0.1 µl/ml, za natrijum benzoat 1 mgr/ml i za kalijum metabisulfit 0.25 mgr/ml (Tabela 3). Tabela 3. MIK propolisa, natrijum bezoata i kalijum metabisulfita Uzorci Propolis Natrijum benzoat Kalijum metabisulfit L6 0.1 µl/ml 1 mgr/ml 0.25 mgr/ml K1 0.1 µl/ml 1 mgr/ml 0.25 mgr/ml K2 0.1 µl/ml 1 mgr/ml 0.25 gr/ml Slika 5. Određivanje vrednosti MIK u mikrotitar ploči Rast mikroorganizama u uzorcima Smatra se da su mikroorganizmi uništeni onda kada se ne mogu razmnožavati, čak ni pošto su prebačeni na odgovarajući medijum za razmnožavanje pod odgovarajućim uslovima okruženja. Smrt se razlikuje od inaktiviranosti, posebno među bakterijama i gljivama koje imaju spore, pošto inaktivirani mikroorganizmi nisu izgubili sposobnost da se razmnožavaju, što je dokazano 23

32 razmnožavanjem nakon produženog perioda inkubacije, prenošenjem u drugi medijum koji pogoduje razvoju (Šumić, 2009). Preživljavanje ćelija pod dejstvom konzervanasa praćeno je brojanjem kolonija nakon inkubiranja ćelija bakterija u aerobnim (Slika 6) i anaerobnim uslovima na hranljivom i top agru 24 sati na 37 o C i kvasaca na Sabouraud dekstroznom agru (Slika 7) 48 sati na 37 o C. U Tabeli 4 prikazani su rezultati za sve uzorke. Pozitivne rezultate u sprečavanju rasta bakterija u uzorku L6 pokazali su kalijum metabisulfit i natrijum benzoat. Nakon dodavanja ovih konzervanasa u potpunosti je zaustavljen rast bakterija (Slika 8). U L6 uzorku prilikom dodavanja konzervanasa rast kvasaca je bio trenutno inhibiran, međutim nakon 16. dana došlo je do naglog rasta ćelija. Natrijum benzoat pokazao se kao najučinkovitiji sa brojem ćelija od , kalijum metabisulfit i propolis dali su slabije rezultate ( i ćelija), dok se u kontroli javio najveći rast od ćelija. Broj ćelija bakterija i kvasaca varira u svim K1 uzorcima (Slika 9). Rast kvasaca u najvećoj meri inhibirao je kalijum metabisulfit ( ćelija) u odnosu na kontrolu ( ćelija). U uzorku sa propolisom broj ćelija bio je , a sa natrijum benzoatom Natrijum benzoat je totalno zaustavio rast aerobnih i anaerobnih bakterija (Slika 8 i 9). Kalijum metabisulfit pokazao je bolji inhibitorni učinak prema aerobnim ( ćelija) i anaerobnim bakterijama ( ćelija) u odnosu na propolis ( i ćelija). U kontroli javio se rast aerobnih bakterija od ćelija, a anaerobnih od U K2 uzorcima, natrijum benzoat i kalijum metabisulfit imali su pozitivno antimikrobne delovanje prema ćelijama bakterija i kvasaca, sprečavajući njihov rast (Slika 10). Broj ćelija u uzorku sa propolisom identičan je sa brojem ćelija u kontroli, Slika 6. Rast ćelija bakterija na hranljivom agru Slika 7. Rast ćelija kvasaca na SDA podlozi 24

33 25 Table 4. Broj ćelija u uzorcima SDA 1 HA 2 TA 3 1.dan 4. dan 8. dan 12. dan 16. dan 1.dan 4. dan 8. dan 12. dan 16. dan 1.dan 4. dan 8. dan 12. dan 16. dan L6 kontrola / / / / L6 propolis / / / / / / / / / / / L6 KMS / / / / / / / / / / / / / L6 NB / / / / / / / / / / / / / K1 kontrola K1 propolis / / K1 KMS / / K1 NB / / / / / K2 kontrola / K2 propolis / / / K2 KMS / / / / / / / / / / / / K2 NB / / / / / / / / / / / / 1 Sabouraud dekstrozni agar 2 Hranljivi agar 3 Top agar

34 Hemijski konzervansi koriste se vekovima za sprečavanje mikrobiološkog kvarenja hrane (Koç et al., 2007). Potpuno su bezbedni za upotrebu ukoliko se dodaju doze propisane zakonom. Natrijum benzoat ima široku primenu u industriji hrane (Stanojevic et al., 2009). S obzirom da količina nedisociranih kiselina opada sa porastom ph, benzoična kiselina i natrijum benzoat koriste se kao konzervansi hrane sa nižim ph (Chipley, 2005). Kalijum metabisulfit se često naziva stabilizatorom jer sprečava kvarenje i dalju fermentaciju uklanjanjem kiseonika (Winemaker's Academy, 2013). Najefektivniji je kada je ph hrane niži od 4 (Davidson i Taylor, 2007). Dokazano je da se propolis može koristiti za efikasno konzerviranje i čvste i tečne hrane (Yang et al., 2017). Propolis ima značajniji uticaj na aktivne ćelije, manje koncentracije od letalne izazivaju trenutnu inhibiciju deobe ćelija ali nakon lag faze, nastavlja se rast istom stopom kao u kontroli. Nastavak rasta na nižim koncentracijama propolisa može se objasniti mehanizmima latentne detoksifikacije, inaktivacije ili isključivanja, nastanka rezistentnih formi ili spontane detoksifikacije aktivnih komponenti propolisa (Mirzoevaet al., 1997) dan 4. dan 8. dan 12. dan 16. dan Propolis SDA Kalijum metabisulfit SDA Na benzoat SDA Propolis HA Kalijum metabisulfit HA Na benzoat HA Propolis TA Kalijum metabisulfit TA Na benzoat TA Slika 8. Stepen preživljavanja (%) bakterija i kvasaca u uzorku L6 26

35 dan 4. dan 8. dan 12. dan 16. dan Propolis SDA Kalijum metabisulfit SDA Na benzoat SDA Propolis HA Kalijum metabisulfit HA Na benzoat HA Propolis TA Kalijum metabisulfit TA Na benzoat TA Slika 9. Stepen preživljavanja (%) bakterija i kvasaca u uzorku K dan 4. dan 8. dan 12. dan 16. dan Propolis SDA Kalijum metabisulfit SDA Na benzoat SDA Propolis HA Kalijum metabisulfit HA Na benzoat HA Propolis TA Kalijum metabisulfit TA Na benzoat TA Slika 10. Stepen preživljavanja (%) bakterija i kvasaca u uzorku K2 27

36 Koncentracija rezidualnih šećera Šećeri koji ne učestvuju u fermentaciji već ostaju u vinu, nazivaju se rezidualnim šećerima. Sadržaj rezidualnih šećera, prvenstveno heksoza (glukoza, fruktoza) i pentoza (arabinoza, ksiloza) važan je parametar jer se na osnovu njega može odrediti nivo alkohola u vinu, a ukazuje i na progres procesa fermentacije. Efikasna kontrola rezidualnih šećera neophodna je radi izbegavanja refermentacije koja može izmeniti fizičko-hemijska svojstva medovine. Na osnovu koncentracije ovih šećera vrši se klasifikacija vina na suva i slatka (Fernández-novales et al., 2009). Benediktov test je standardna tehnika koja se koristi za određivanje rezidualnih šećera na osnovu promene boje reagensa. Koncentracija šećera u uzorcima merena je širometrom pre dodavanja konzervanasa i iznosi približno 4 brix-a (40.6 gr/l). Kontrolna epruveta, u koju je umesto uzorka sipana destilovana voda, nije promenila bolju (ostala je plava), a sve ostale poprimile su narandžastu boju (Slika 11, 12, 13 i 14). Iz ovog sledi da je koncentracija rezidualnih šećera u svim uzorcima u rasponu od 15 gr/l do 20 gr/l. Slika 11. Rezultati Benediktovog testa sa L6, K1 i K2 uzorcima sa propolisom Slika 12. Rezultati Benediktovog testa sa L6, K1 i K2 uzorcima sa kalijum metabisulfitom 28

37 Slika 13. Rezultati Benediktovog testa sal6, K1 i K2 uzorcima sa natrijum benzoatom Slika 14. Rezultati Benediktovog testa sa L6, K1 i K2 kontrolnim uzorcima 29

38 5. Zaključak Na osnovu ovog istraživanja mogu se doneti sledeći zaključci: Metoda centrifugiranja može se koristiti kao vid konzervacije medovine. Natrijum benzoat je u potpunosti zaustavio rast svih bakterija u svim uzorcima. Kalijum metabisulfit je u većini uzoraka zaustavio rast bakterija. Natrijum benzoat je pokazao najbolje inhibitorno delovanje na kvasce. Korišćene koncentracije propolisa su pokazale značajnu antimikrobnu aktivnost samo u medovini napravljenoj od livadskog meda. 30

39 6. Literatura Academy, W. (2013) Using Potassium Metabisulfite to Make Wine. Available at: Aryal, S. (2015) Benedict s Test- Principle, Composition, Preparation, Procedure and Result Interpretation. Available at: Bakočević, I. (2011) Konzervansi, uvod i klasifikacija. Available at: Bartowsky, E. J. (2009) Bacterial spoilage of wine and approaches to minimize it, Letters in Applied Microbiology, 48(2), pp doi: /j X x. Chipley, J. (2005) Sodium Benzoate and Benzoic Acid, in Davidson, P. M., Sofos, J. N., and Branen, A. L. (eds) Antimicrobials in Food. Third, pp Davidson, P. M. and Taylor, T. M. (2007) Chemical Preservatives and Natural Antimicrobial Compounds, in Doyle, M. and Beuchat, L. (eds) Food Microbiology: Fundamentals and Frontiers. Third. ASM Press, Washington, DC, pp Fernández-novales, J. et al. (2009) Shortwave-near infrared spectroscopy for determination of reducing sugar content during grape ripening, winemaking, and aging of white and red wines, Food Research International. Elsevier Ltd, 42(2), pp doi: /j.foodres Fleet, G. H. (2003) Yeast interactions and wine flavour, 86, pp doi: /S (03) Gupta, J. K. and Sharma, R. (2009) Production technology and quality characteristics of mead and fruit-honey wines: A review, Indian Journal of Natural Products and Resources, 8(4), pp Huffer, S. et al. (2011) Role of alcohols in growth, lipid composition, and membrane fluidity of yeasts, bacteria, and archaea, Applied and Environmental Microbiology, 77(18), pp doi: /AEM Iglesias, A. et al. (2014) Developments in the fermentation process and quality improvement strategies for mead production, Molecules, 19(8), pp doi: /molecules Jašić, M. (2009) Konzervansi Tehnologija hrane. Available at: (Accessed: 11 October 2018). Jolly, N. P., Augustyn, O. P. H. and Pretorius, I. S. (2017) The Role and Use of Non- Saccharomyces Yeasts in Wine Production, South African Journal of Enology & Viticulture, 27(1), pp doi: / Kahoun, D., Řezková, S. and Královský, J. (2017) Effect of heat treatment and storage conditions on mead composition, Food Chemistry, 219, pp doi: /j.foodchem