UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU Obrazac varijabilnosti i diferencijacijа prirodnih populacija Pinu

Транскрипт

1 UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU Obrazac varijabilnosti i diferencijacijа prirodnih populacija Pinus mugo srednje Evrope i Balkanskog poluostrva u odnosu na sastav epikutikularnih voskova MASTER RAD Kandidat: 179 Mentor: Dr Zorica S. Mitić Niš, 2017.

2 UNIVERSITY OF NIŠ FACULTY OF SCIENCE AND MATHEMATICS DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY The variability pattern and differentiation of native populations of Pinus mugo in Central Europe and Balkan Peninsula regarding the composition of epicuticular waxes MASTER THESIS Candidate: 179 Mentor: Dr. Zorica S. Mitić Niš, 2017.

3 BIOGRAFIJA KANDIDATA rođena je 13. septembra godine u Vranju, gde godine završava osnovnu, a godine gimnaziju Bora Stanković kao nosilac Vukove diplome. Prirodno-matematički fakultet u Nišu upisuje godine na Departmanu za biologiju i ekologiju. Osnovne akademske studije završava godine sa prosečnom ocenom 9.00 i iste godine upisuje Master akademske studije, smer Biologija, koje u predviđenom roku završava.

4 ZAHVALNICA Zahvalnost na prvom mestu dugujem svom mentoru doc. dr Zorici Mitić na poverenju koje mi je ukazala uključivši me u ovo interesantno istraživanje. Poštovanje za sve ono što je učinila je neizmerno. Hvala joj na stručnim sugestijama i savetima, spremnosti za zajednički rad, uloženom trudu, izdvojenom vremenu kao i nesebičnoj pomoći tokom celokupne izrade ovog master rada. Takođe, najlepše se zahvaljujem i članovima Komisije za ocenu master rada prof. dr Petru Marinu i prof. dr Bojanu Zlatkoviću. Posebnu zahvalnost dugujem prof. dr Bojanu Zlatkoviću i dr Časlavu Stefanoviću na pomoći u sakupljanju biljnog materijala, kao i prof. dr Gordani Stojanović i doc. dr Snežani Jovanović na pomoći u realizaciji hemijskih analiza i interpretaciji dobijenih rezultata. Veliko hvala i prof. dr Vladimiru Ranđeloviću za izradu geografske karte distribucije koja prati ovaj master rad. Na kraju, volela bih da izrazim neizmernu zahvalnost svojim najbližima, majci Svetlani, ocu Slađanu, bratu Dušanu i sestri Ani. Oni su bili i ostali moja bezrezervna podrška i sigurna luka svih ovih godina. Hvala im što su me bodrili čak i onda kada izbor nije bio lak, podsticali da razmišljam široko, gledam daleko, delujem pravovremeno i koračam staloženo i smireno. Uvek uz mene i za mene, oni su ti koji svaki moj uspeh čine kompletnim.

5 SAŽETAK U radu je analizirana fitohemijska varijabilnost i diferencijacija populacija P. mugo poreklom sa različitih planinskih masivа srednje Evrope i Balkanskog poluostrva: Julijski Alpi (Triglav), Skardsko-Pindske (Šar-planina) i Balkansko-Rodopske planine (Pirin). Kombinacijom GC/FID i GC/MS analize epikutikularnih voskova izolovanih sa dvogodišnjih četina 45 jedinki P. mugo utvrđeno je prisustvo četiri diterpena (pimaradien, sandarakopimaradien, 18-norabieta-8,11,13-trien i abietartrien), tri primarna alkohola (1- heksadekanol, cis-9-oktadecen-1-ol i 1-oktadekanol) i 10 n-alkana u seriji od C20 do C29. Multivarijantne statističke analize CDA i CA pokazale su jasno izdvajanje populacije sa Julijskih Alpa u odnosu na populacije sa Balkanskog poluostrva. Dobijena korelacija Mahalanobisovih distanci i geografske udaljenosti ispitivanih populacija ukazuje na njihovu potencijalnu geografsku diferencijaciju, tj. izolaciju putem distance. Takođe, izdvajanje populacije sa Julijskih Alpa u nezavistan klaster u odnosu na balkanske populacije, ide u prilog hipotezi da u navedenim delovima areala P. mugo postoje dva različita vikarijantna genska pool-a. Ipak, s obzirom da u ovom radu nisu analizirane populacije sa Južnih i Istočnih Karpata, osobenost balkanskih populacija P. mugo na nivou epikutikularnih voskova još uvek ne može biti u potpunosti potvrđena. Ključne reči: Pinus mugo, epikutikularni voskovi, geografska diferencijacija, Julijski Alpi, Balkan

6 ABSTRACT This paper includes analysis of the phytochemical variability and differentiation of P. mugo populations from various mountain systems of Central Europe and Balkan Peninsula: Julian Alps (Triglav), Scardo-Pindic (Šara) and Balkan-Rhodope mountains (Pirin). Combination of GC/FID and GC/MS analyses of epicuticular waxes isolated from two-yearold needles from 45 individuals of P. mugo has shown presence of four diterpenes (pimaradiene, sandaracopimaradiene, 18-norabieta-8,11,13-triene and abietatriene), three primary alcohols (1-hexadecanol, cis-9-octadecen-1-ol and 1-octadecanol) and 10 n-alkanes ranging from C20 to C29. The multivariate analyses CDA and CA have shown clear separation of the population from Julian Alps and the populations in Balkan Peninsula. The correlation of Mahalanobis distances and geographic distances of studied populations indicates their potential geographic differentiation, i.e. isolation by distance (IBD). Separation of the Julian Alps population into an independent cluster from the Balkan populations is supporting the hypothesis that in the stated parts of range there are two different vicariant gene pools of P. mugo. However, as this paper did not include analysis of populations from Southern and Eastern Carpathians, the distinctiveness of Balkan populations of P. mugo at the level of epicuticular waxes cannot be completely supported in the present day. Keywords: Pinus mugo, epicuticular waxes, geographic differentiation, Julian Alps, the Balkans

7 SADRŽAJ 1. UVOD Opšte karakteristike vrste Pinus mugo Sistematski položaj Habitus i anatomija Stanište i distribucija Privredni značaj Opšte karakteristike biljne kutikule Epikutikularni vosak kao hemotaksonomski kriterijum Opšte karakteristike, distribucija i taksonomski značaj alkana CILJEVI RADA MATERIJAL I METODE Biljni materijal Ekstrakcija epikutikularnih voskova GC-FID i GC-MS analiza epikutikularnih voskova Statistička analiza REZULTATI Hemijski sastav epikutikularnog voska četina P. mugo sa područja srednje Evrope i Balkana Promenjivost pojedinačnih komponenti epikutikularnih voskova Analiza varijanse (ANOVA) Analiza glavnih komponenti (PCA) Kanonijska diskriminantna analiza (CDA) Klaster analiza (CA) DISKUSIJA Varijabilnost ispitivanih P. mugo populacija Diferencijacija populacija... 37

8 6. ZAKLJUČCI LITERATURA... 42

9 1. UVOD Opšte karakteristike vrste Pinus mugo Sistematski položaj Pinus mugo Turra (krivulj, planinski bor, klekovina) pripada najvećoj (više od 230 vrsta), ekonomski najznačajnijoj i filogenetski bazičnoj familiji četinara Pinaceae (Stefanović et al., 1998). Prema filogenetskoj klasifikaciji kopnenih biljaka (Embryophyta), koju su predložili Chase i Reveal godine, ova vrsta pripada potklasi Pinidae (=Pinophyta, Pinopsida), redu Pinales i familiji Pinaceae (tabela 1.1). Tabela 1.1. Položaj vrste P. mugo u filogenetskom sistemu kopnenih biljaka. Klasa (classis): Potklasa (subclassis): Red (ordo): Familija (familia): Podfamilija (subfamilia): Rod (genus): Podrod (subgenus): Sekcija (section) Podsekcija (subsection) Equisetopsida Pinidae Pinales Pinaceae Pinoideae Pinus Pinus (Diploxylon) Pinus Pinus Habitus i anatomija Pinus mugo sensu stricto (subsp. mugo, var. mugo) je žbun retko viši od 3 (-4) m, sa krivim, ukošenim deblom, jednim ili više (slike ). Kora je sivosmeđa, sa nepravilnim ljuspama. Mlade grančice gole, svetlozelene, kasnije smeđe do crnkastosive. Pupoljci su jako smolasti, dugi do 6 mm, sa kratkim vrhom. Četine po dve, traju 3-6 godina, gusto stojeće, povijene na grani, malo uvrnute, tamnozelene, duge 3-8 cm, široke 2 mm. Smoni kanali subepidermalno, 2-6 na preseku. Epidermalne ćelije palisadnog oblika, dva puta više nego što su široke. Muške resolike šišarke (mikrostrobilusi) duge do 15 mm, na prošlogodišnjem izbojku. Ženske šišarke (makro-, megastrobilusi) su jajolike do jajoliko-konične, duge 2-6 cm, široke cm. Apofize rombične do kvadratne, piramidalne ili ravne. Grbica (umbo) 1

10 izrazita, uokvirena tamnim prstenom. Zreli semeni zameci dugi do 5 mm, sa 2-3 puta dužim krilastim dodatkom. Oprašivanje je anemofilno, muški i ženski strobilusi se pojavljuju VI-VII meseca, semeni zameci sazrevaju krajem druge godine (Jovanović, 1992). Slika 1.1. P. mugo sa Julijskih Alpa (Slovenija, Triglav; foto: Stefanović, 2016). 2

11 Slika 1.2. P. mugo sa Skardsko-Pindskih planina (Kosovo i Metohija, Šar-planina; foto: Zlatković, 2016). 3

12 Slika 1.3. P. mugo sa Balkansko-Rodopskih planina (Bugarska, Pirin; foto: Zlatković, 2016). 4

13 Stanište i distribucija Habitus krivulja odražava teške, u prvom redu klimatske, uslove pod kojima on živi; to su granični uslovi za život šumskog drveća, sa kratkim vegetacionim periodom (3-4 meseca) (slike ). Na Suvoj planini se javlja u fitocenozi Sorbo-Pinetum mugo B. Jov., Na Prokletijama (Koprivnik, Streočke planine) krivulj raste u fitocenozi Wulfenio- Pinetum mugo M. Jank. et Bog., na kiselom humusno-silikatnom zemljištu, Pinetum mugo serpentinicum M. Jank., i nekim drugim (Jovanović, 1992). Prema Flori Evope (Gaussen et al., 1993) i Atlasu Flore Evrope (Jalas i Suominen, 1972), P. mugo je endemičan za Evropski kontinent i može se naći na planinama srednje Evrope, Balkanskog poluostrva, i centralnog dela Apeninskog poluostrva. Pripadnost flornom elementu: Srednjo-južnoevropski planinski (temp-submerid) subalp-alp (Jovanović, 1992). Na slici 1.4 je prikazana distribucija žbunastih taksona P. mugo kompleksa prema Hamerník i Musil (2007): P. mugo sensu stricto (=var. mugo) i P. x pseudopumilio (=var. pumilio). Slika 1.4. Distribucija žbunastih taksona P. mugo kompleksa: mu (tamno zelena površina) P. mugo Turra (sensu stricto); pp (ljubičasta površina) Pinus x pseudopumilio; svetlo zelena površina predstavlja nesigurni deo areala (Hamerník i Musil, 2007). Za područje Srbije, Jovanović (1992) navodi sledeće lokalitete: istočna Srbija - Suva planina (Trem), Stara planina (Tri čuke, Tri kladenca); Metohija Prokletije (Koprivnik, Lumbardska planina, Nedžinat, Derviš kom, Đaravica, Juničke planine), Žljeb, Hajla, Maja Rusolija, Mokra planina, Paštrik, Koritnik, Ošljak, Kodža Balkan; Kosovo Šar-planina (ispod Jažinačkog jezera, Jelovarnik), Ostrovica. 5

14 Sandoz (1983) navodi da su trenutne fragmentisane populacije P. mugo samo mali ostaci nekadašnjeg većeg areala krivulja koji je postojao u kasnom Tercijaru i tokom intergalcijalnih perioda Kvartara. Smatra se da je ovakav biogeografski obrazac rezultat zagrevanja Holocena i klimatskih fluktuacija tokom Pleistocena. Naime, trenutni areal P. mugo je izrazito disjunktan, podeljen na nekoliko desetina delova koji su izolovani jedan od drugog od trenutka kada je klima u Holocenu počela da se zagreva. Takođe, tokom Pleistocenskih klimatskih fluktuacija areal P. mugo se više puta širio tokom glacijacija kada se krivulj spuštao na niže nadmorske visine i formirao velike i kontinuirane populacije i skupljao - tokom interglacijalnih perioda kada su veće nadmorske visine postajale dostupne i kolonizovane od strane P. mugo individua, dok su se sastojine na nižim nadmorskim visinama skupljale pod pritiskom jačih kompetitora. Redukovani protok gena između odsečenih regiona tokom toplijih perioda, genetički drift i/ili mogući efekat osnovača su procesi koji su značajno uticali na prostornu genetičku i morfološku strukturu populacija P. mugo. Takođe, uticaj pojedinih genetičkih i demografskih procesa je značajno modifikovan hladnim vs. toplim periodima Pleistocena (Boratyńska et al., 2014) Privredni značaj S obzirom na to da raste i na staništima gde druge drvenaste vrste ne uspevaju, veoma je značajan kao pionirska vrsta i čuvar zemljišta na starim, visokim planinskim terenima. Kao "armatura" snežnih masa služi kao zaštita od lavina (zaštitne šume). Drvo sa crvenkastosmeđom srčevinom i žućkastom beljikom, tvrdo i teško pogodno je za rezbarstvo i gorivo (na planinskim pašnjacima). Iz četina se dobija etarsko ulje, koje se koristi u kozmetičkoj industriji. Krivulj je korišćen u protiverozionim radovima i hortikulturi (Jovanović, 1992). 6

15 1.2. Opšte karakteristike biljne kutikule Različiti nepovoljni abiotički i biotički faktori uslovili su pojavu efikasnih mehanizama zaštite kod biljaka kao sesilnih organizama. U odbrani od nepovoljnih uslova spoljašnje sredine bitnu funkciju ima zaštitni lipidni sloj na površini nadzemnih zeljastih delova koji se naziva kutikula. Biljka ostvaruje kontakt sa svojom okolinom preko kutikule. Njome su najčešće obavijeni listovi, plodovi, zeljasti delovi stabla, ređe cvetovi i drške, dok koren nije prekriven kutikulom (Barthlott i Neinhuis, 1997). Iako je kutikula karakteristična za evolutivno razvijenije grupe biljaka, ona se može javiti i kod jetrenjača, pravih mahovina i paprati. Na osnovu rastvorljivosti u organskim rastvaračima razlikuju se dva osnovna tipa komponenti biljne kutikule: lipofilna jedinjenja koje se oslobađaju ekstrakcijom u organskim rastvaračima kolektivno su označena kao kutikularni vosak, dok je lipofilna komponenta koja se ne može ekstrahovati zbog polimerne strukture označena kao kutin (Šarac et al., 2014). Najčešća i najzastupljenija grupa jedinjenja u kutikularnim voskovima su alifatični, acikični, negranati, zasićeni ugljovodonici, koji sadrže najmanje 20 ugljenikovih atoma. Ovakva "dugolančana jedinjenja" nastaju elongacijom masnih kiselina sa više od 18 ugljenikovih atoma i daljom modifikacijom u odgovarajuće alkane, aldehide, ketone, primarne i sekundarne alkohole, kao i estre koji se formiraju između masnih kiselina i alkohola (Samuels et al., 2008). Manje zastupljena grupa jedinjenja u kutikularnim voskovima mnogih biljnih vrsta su pentaciklični triterpenoidi. U kutikularnom vosku pojedinih biljnih vrsta mogu se naći i aromatična jedinjenja, ali u manjim količinama (Jetter et al., 2007). Vosak prožima kutikulu celom debljinom, pri čemu je jedan deo voska ugrađen u kutinski polimerni matriks (intrakutikularni vosak), a drugi nataložen na spoljašnjoj površini kutina (epikutikularni vosak) (Jeffree, 1996). Naime, intrakutikularni vosak je amorfna smeša lipida uronjenih u kutin, koja povezuje kutikulu sa ćelijskim zidom, dok se epikutikularnim voskom smatraju površinski lipidi (u kontaktu sa atmosferom) nataloženi na spoljašnjoj površini kutina. Kutikula je za epidermis vezana pomoću pektinskog sloja (polisaharid). Strukturna razlika u hemijskom sastavu između dva voštana sloja se može napraviti nakon selektivnog izolovanja i analize najpre epikutikularnog, a potom i intrakutikularnog voska: mehanički, pomoću guma arabike ili krio-adhezinom tehnikom sa vodom (Taylor, 2011, Riederer, 2006; Kunst i Samuels, 2003; Riedel, et al. 2003; van 7

16 Maarseeven i Jetter, 2009). Istraživanja pomoću skenirajuće elektronske mikroskopije (SEM) otkrila su da epikutikularni vosak formira površinski voštani film sa posebnim trodimenzionalnim strukturama (kristaloidima) koje štrče u atmosferu i čiji oblik, veličina, i orjentacija u odnosu na površinu izuzetno variraju kod različitih biljnih vrsta (Barthlott et al., 1998; Jeffree, 2006). Prema Koch i sar. (2008), najčešći mikromorfološki tipovi epikutikularnih voštanih kristaloida koji se sreću u biljnom svetu su: korice, pločice, štapići, tubule (cevčice), končaste strukture itd. Slika 1.5. SEM mikrografija epikutikularnog voska na licu četine P. nigra (Mitić et al., 2017). Kod golosemenica voštani kristaloidi uglavnom imaju izgled tubula i odlikuje ih dominacija sekundarnog alkohola nonakozan-10-ola (tzv. nonakozanol-tubule, Barthlott et al., 1998). Nonakozan-10-ol je dominantna komponenta kutikularnih voskova većine golosemenica (Ginkgo, Pinus, Abies, Picea, Wollemia, Taxus itd.) kao i nekih skrivenosemenica, i smatra se odgovoranim za tubularnu mikrostrukturu epikutikulanog voštanog sloja kod ovih biljaka (Jeffree, 2006). Iako se hemijski sastav različitih tipova kristaloida odnosi na dominantnu komponentu ukupnog ekstrahovanog voska, nekoliko 8

17 istraživanja potvrdilo je sposobnost nonakozan-10-ola da rekristališe in vitro u formi tubula (Jetter i Riederer, 1994; Ensikat et al., 2006). Kod Pinus spp., voštane tubule su vrlo guste, sa mrežastim izgledom, i koncentrisane uglavnom u stominim komorama, dok najveću površinu četina prekriva glatki voštani sloj, tj. amorfni vosak, sa uočljivim granulama na pojedinim mestima (slika 1.5). Fizičke i hemijske osobine kutikularnih voskova određuju neke od vitalnih funkcija biljaka (Šarac, 2014). Pre svega, vosak značajno redukuje nestomaternu transpiraciju, a veza između kserofitnog karaktera pojedinih biljaka i količine lisnih kutikularnih voskova je potvrđena u velikom broju radova. Vosak, takođe, štiti biljku od raznih spoljašnih uticaja: vetra, snega, mraza i ultravioletnog zračenja (Reicosky i Hanover, 1978; Barnes et al., 1996); redukuje zadržavanje vode na površini biljaka, smanjuje apsorpciju prašine, polena i ostalih zagađujućih materija iz vazduha (Kerstiens, 1996; Barthlott i Neinhaus, 1997) pri čemu pokazuje osobinu "samo-čišćenja" (lotus efekat Barthlott i Neinhaus, 1997). Takođe, pokazano je da kutikularni vosak ima značajnu ulogu u zaštiti biljaka od mnogih bakterijskih i fungalnih infekcija (Jenks et al., 1994) i da učestvuje u različitim interakcijama između biljaka i insekata (Eigenbrode i Espelie, 1995). Štiteći biljku od štetnih uticaja sredine/staništa, njegova struktura i sastav se menjaju. Među mnogobrojnim faktorima sredine koji mogu uticati na produkciju i strukturu voska, najprimetnije promene izazivaju temperatura i intezitet svetlosti. Interesantno je da se promene u strukturi voska pod uticajem faktora sredine češće dešavaju kod epikutikularnih voskova sačinjenih od predstavnika različitih klasa jedinjenja u odnosu na voskove u kojima dominira samo jedna klasa jedinjenja. Pojedine studije su pokazale da je veliki broj gena uključen u produkciju voskova, kao i to da su epikutikularni voskovi uglavnom inertni u pogledu biološke aktivnosti (Lemieux, 1996; Seigler, 1998; prema Jovanović, 2016). Kutin kao gradivna komponenta čini između 40 i 80% mase kutikularne membrane. Detaljnije, polimer čine C16 i C18 oksigenovane masne kiseline umrežene estarskim vezama koje vode poreklo od oleinske i linoleinske kiseline, dobijene ω-hidroksilacijom ili epoksidacijom dvostruke veze koja je praćena hidroksilacijom epoksida uz učešće enzima kao katalizatora. U sastav polimernog matriksa takođe ulazi i glicerol. Sastav kutina se utvrđuje nakon izolovanja i depolimerizacije, raskidanja estarskih veza i dobijanja monomernih jedinica i njihovih derivata (Heredia, 2003; Heredia i Dominguez, 2009; Kunst i Samuels, 2009; prema Jovanović, 2016). 9

18 Epikutikularni vosak kao hemotaksonomski kriterijum Fina struktura voska predstavlja konstantnu ili relativno nepromenljivu karakteristiku date biljne vrste, pa se stoga može koristiti kao veoma pouzdan parametar u taksonomiji biljaka. Drugim rečima, jedinke iste vrste koje se razvijaju pod uticajem istih sredinskih faktora karakterišu se sličnom mikromorfološkom strukturom i hemijskim sastavom voska. Do odstupanja, odnosno varijabilnosti u mikromorfološkim i hemijskim karakteristikama voska kod biljaka najčešće dolazi usled promene intenziteta različitih ekoloških faktora (klimatski, edafski i orografski faktori; Jefree, et al. 1976). Takođe, hemijski sastav epikutikularnog voska može i da varira u zavisnosti od biljne vrste, organa biljke, kao i u zavisnosti od ontogenetske faze u kojoj se nalazi jedinka (Koch, et al. 2008). Značaj epikutikularnih voskova ogleda se u praćenju i merenju mikromorfoloških i hemijskih karaktera u okviru date taksonomske kategorije. Obzirom da voštani depoziti mogu varirati u pogledu veličine, oblika i frekvenciji/brojnosti, mikromorfologija epikutikularnog voska predstavlja izvor mnoštva, za taksonomiju korisnih, karaktera. Dodatno, razmatranje karakteristika voska zajedno sa drugim karakteristikama biljaka omogućava razjašnjavanje i razumevanje evolutivnih odnosa između taksona. Veliki broj hemotaksonomskih istraživanja je ukazao na značaj metabolita iz epikutikularnog voska u diferenciranju i sistematici taksona na nivou različitih taksonomskih kategorija. Varijabilnost u sastavu i strukturni diverzitet komponenti epikutikularnog voska predstavlja važnu osnovu u taksonomiji biljaka na osnovu koje se može razmatrati grupisanje taksona u okviru različitih taksonomskih kategorija. Moguće je izvršiti diferenciranje taksona, razlikovanje grupa u okviru sekcija, ili čak identifikaciju vrsta, čime se stiče uvid u evolutivne i filogenetske odnose u biljnom svetu (Jovanović et al., 2015) Opšte karakteristike, distribucija i taksonomski značaj alkana Alkani su zasićeni ugljovodonici, poznati pod nazivom parafini. Sastoje se od dva elementa: ugljenika (C) i vodonika (H), povezanih kovalentnim vezama. Veličinu alkana određuje broj međusobno vezanih C atoma. Alkani sa više od tri C atoma mogu formirati različite strukturne izomere. Na taj način možemo razlikovati linearne, normalne alkane (nalkane), sa ugljenikovim skeletom cik-cak strukture i opštom formulom: CnH2n+2 i račvaste (iso-alkane) sa opštom formulom CnH2n+2, n>3 (Nikolić, 2008). 10

19 Dugolančani n-alkani sa neparnim brojem C atoma su jedna od najzastupljenijih komponenti kutikularnih voskova. Zbog svoje velike nepolarnosti, oni znatno doprinose hidrofobnim osobinama voskova, smanjujući nestomaterni gubitak vode sa površine listova i drugih delova biljke. n-alkani (C21-C37) iz epikutikularnog voska su najčešće korišćeni biomarkeri. Kod većine terestričnih biljaka najzastupljeniji su n-alkani C27, C29 i C31, koji ponekad čine i do 90% ukupnog sastava voska (Nikolić, 2008). Akvatične biljke karakteriše dominacija n-alkana C23 i C25, dok je dominacija n-alkana relativno kratkih nizova ugljenikovih atoma (C15, C17, i C19) utvrđena kod nekih algi i cijanobakterija (Chikaraishi i Naraoka, 2003). U kutikularnim voskovima četinara najčešće dominira n-alkan C31, a zatim C27, C29 i C25 (Maffei et al., 2004). Kao jedna od najzastupljenijih komponenti kutikularnih voskova, čiji je biosinteza pod strogom genetičkom kontrolom, n-alkani su najčešće korišćeni kao hetmotaskonomski markeri različitih biljnih familija (Maffei et al., 1996; 2004). Obzirom da ne sadrže funkcionalne grupe, karakteriše ih izuzetna stabilnost, pa ih je moguće detektovati u svežem biljnom materijalu, ali i u fosilnom materijalu, zemljištu, sedimentima i slično. Pored hemijske stabilnosti, n-alkani su favorizovani markeri jer se lako izoluju i identifikuju (Marin, 2003; Bush i Mclnerney, 2013). Sadržaj n-alkana u voskovima varira u zavisnosti od biljne vrste, roda, familije, pa se identifikovanje, kvantifikovanje i predstavljanje distribucije alkana u voskovima vrlo često koristi u hemotaksonomskim studijama (Jovanović, 2016). Međutim, i pored neosporne činjenice da su sastav i produkcija n-alkana u kutikularnim voskovima genetički determinisani, kod n-alkana (kao i kod drugih sekundarnih metabolita biljaka) uočava se određena varijabilnost, kao posledica uticaja različitih ekoloških faktora. Zbog toga je pre analize taksonomskog značaja neophodno istražiti intra- i interpopulacionu varijabilnost n-alkana određenog taksona. Takođe, pravilno uzorkovanje i doslednost u postupcima branja, skladištenja i izolacije n-alkana su preduslovi validne interpretacije dobijenih rezultata (Marin, 2003). Generalno, n-alkani se mogu okarakterisati kao dobri markeri na nižim nivoima klasifikacije (do nivoa roda), osim u slučajevima njihove velike varijabilnosti u uzorcima. Kada se taksoni na nivou vrste morfološki teško razlikuju, karakterističan sadržaj pojedinih n-alkanskih nizova može da bude od koristi u njihovom diferenciranju. Mnoge studije su pokazale da se n-alkani mogu koristiti i kao veoma informativni markeri u proučavanjima geografske varijabilnosti i/ili identifikaciji infraspecijskih taksona Pinus (Nikolić et al., 2012a; 2012b; Bojović et al., 2012; Šarac et al., 2016), Picea (Nikolić et al., 2013) i 11

20 Juniperus (Rajčević et al., 2014) vrsta. Tokom protekle dve decenije, Massimo Maffei je u seriji radova publikovao veliku količinu rezultata istraživanja koja se bave taksonomskim značajem alkana iz kutikularnih voskova različitih biljnih familija. Prema Maffei et al. (1996a; 1996b; 1996c; 1997; 2004) n-alkani mogu se koristiti kao pouzdani hemotaksonomski markeri na višim nivoima klasifikacije, kao što su tribusi, potfamilije i familije. 12

21 2. CILJEVI RADA Osnovni naučni ciljevi ovog istraživanja mogu se predstaviti u nekoliko teza: 1. Određivanje hemijskog sastava epikutikularnog voska četina P. mugo sensu stricto poreklom sa različitih planinskih masivа srednje Evrope i Balkanskog poluоstrva: Julijski Alpi (Triglav), Skardsko-Pindske (Šar-planina) i Balkansko-Rodopske planine (Pirin). 2. Uvrđivanje diverziteta i diferencijacije autohtonih populacija P. mugo sa područja srednje Evrope i centralnog Balkana na nivou epikutikularnih voskova. 3. Definisanje potencijalnih hemotipova istraživanih populacija P. mugo. 4. Poređenje dobijenih rezultata sa morfološkim, biohemijskim i molekularnim karakterima koji su korišćeni u dosadašnjim istraživanjima P. mugo. 13

22 3. MATERIJAL I METODE 3.1. Biljni materijal Biljni materijal (dvogodišnje četine) P. mugo sensu stricto sakupljen je sa tri planinska masiva srednje Evrope i Balkanskog poluostrva: Julijski Alpi (Triglav), Skardsko-Pindske (Šar-planina) i Balkansko-Rodopske planine (Pirin). Prilikom odabira pojedinačnih stabala, nije se rukovodio superiornim morfološkim karakteristikama (npr. visinski i debljinski prirast, dužina četina i šišarki, oblik krune), već prostornom pokrivanju celokupne populacije, odabirajući stabla na što većoj horizontalnoj i vertikalnoj razdaljini, u zavisnosti od veličine odabrane populacije. U svakoj od odabranih populacija krivulja, tokom leta godine, izvršeno je sakupljanje grančica sa dvogodišnjim četinama sa 15 odraslih stabala. Grančice su brane po celokupnom obimu donje trećine krune. Uzorci svakog pojedinačnog stabla stavljani su u zasebnu polietilensku kesu, zajedno sa oznakom lokaliteta, datumom sakupljanja i rednim brojem stabla, kako ne bi došlo do mešanja uzoraka. Geografski položaj populacija je određen uz pomoć GPS uređaja (GPS Garmin etrex Vista C). Orografske karakteristike staništa, pre svega nadmorska visina i ekspozicija su preuzeti iz SRTM (Shuttle Radar Topography Mission) (Reuter et al., 2007) digitalnog elevacionog modela rezolucije 90 x 90 m (Farr al., 2007) pomoću softvera ArcGIS 10 (ESRI, 2011) (tabela 3.1). Herbarski primerci su deponovani u Herbarijumu Departama za biologiju i ekologiju, Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu ( Herbarijum Moesiacum Niš - HMN). U ručnom frižideru uzorci su sa mesta sakupljanja prenošeni do zamrzivača (- 20 C) na skladištenje do momenta upotrebe. 14

23 Tabela 3.1. Geografski položaj i stanišne karakteristike odabranih populacija P. mugo. Takson P. mugo sensu stricto Regija Evrope srednja Evropa južna Evropa (Balkansko poluostrvo) Planinski masiv Lokalitet Broj analiziranih jedinki (n) Skardsko-Pindske Balkansko- Alpi planine Rodopske planine Slovenija, Kosovo i Metohija, Bugarska, Pirin, Julijski Alpi, Šar-planina, Vihren Triglav Ostrovica Geografska širina (N) 46 21'56.7" 42 14'12.80" 41 45'31.95" Geografska dužina (E) 13 52'27.8" 20 55'13.53" 23 25'0.13" Nadmorska visina (m a.s.l.) Geološka podloga Krečnjak Serpentinit Silikat Datum sakupljanja Vaučer broj HMN HMN HMN 3.2. Ekstrakcija epikutikularnih voskova Epikutikularni voskovi ekstrahovani su potapanjem 5 g iglica u 10 ml n-heksana u trajanju od 60 sekundi. Nakon toga ekstrakti su filtrirani, upareni do suvog stanja i rastvoreni u 1 ml n-heksana. Koncentrovani ekstrakti su frakcionisani na mini koloni korišćenjem Paster pipete napunjene florisilom ( mesh). Voskovi su dobijeni eluiranjem sa 5 ml n- heksana, nakon čega su upareni do suvog, ponovo rastvoreni u 1 ml n-heksana i čuvani na 4-6 C do dalje analize. Ekstarkcija voskova izvršena je posebno za svaku jedinku (45 uzoraka) GC-FID i GC-MS analiza epikutikularnih voskova Hemijski sastav heksanskih ekstrakata je određen pomoću GC-FID (gasna hromatografija sa plameno jonizacionim detektorom) i GC-MS (gasna hromatografijamasena spektrometrija) tehnika analize. Svi uzorci su snimani u triplikatu, na 7890/7000B 15

24 GC/MS/MS tripl-kvadripol sistemu (Agilent Technologies, USA) sa Combi PAL autosemplerom i HP-5 MS kolonom (5% fenil metil siloksan, 30 m x 0.25 mm i.d. i 0.25 µm debljina filma). Temperaturni program: prvih 2.25 minuta izotermalno na 70 0 C, zatim linearni porast temperature, od 70 do C (5 C min -1 ), potom izotermalno na C, zadnjih 10 minuta programa. Injektovana zapremina uzorka 5 µl (split 2:1). Bekfleš (nakon završetka analize) 1.89 min, na C, sa helijumom pod pritiskom od 50 psi. MS uslovi: jonizacija - 70 ev, opseg masa amu, vreme skenova 0.32 sekunde. GC-FID analiza je izvedena pod istim eksperimentalnim uslovima kao što je već navedeno za GC-MS analizu. Procentni sastav je preračunat na osnovu površine GC-FID pikova, bez korekcionih faktora. Identifikacija komponenti. Komponente voskova su identifikovane pomoću AMDIS softvera (Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System, Ver. 2.1, DTRA/NIST, 2011), na osnovu lineranih retencionih indeksa (RI), koji su određeni na osnovu retencionih vremena standardne serije alkana (C8-C40), snimljene na istom aparatu i pod istim uslovima kao i uzorci. RI su upoređivani sa literaturnim vrednostima (Van Den Dool i Kratz, 1963; Stein, 1990; Adams, 2007; NIST Chemistry WebBook); identifikacija je izvršena na osnovu upoređivanja masenih spektara komponenata voska sa literaturnim/bibliotečkim masenim spektrima Wiley 6, NIST02, MassFinder 2.3 (Stein, 1990) i MS bibliotekama dobijenih na osnovu snimanja čistih supstanci Statistička analiza Sve identifikovane komponente epikutikularnih voskova P. mugo obrađene su metodama univarijantne i multivarijantne statistike (Quinn i Keough, 2002) uz pomoć programskog paketa Statistica, version 5.1 (StatSoft Inc., 1996, Tulsa, OK, USA). Deskriptivna statistika. Za sve identifikovane komponente urađena je osnovna deskriptivna statistika (srednja vrednost, maksimum, minimum, standardna devijacija i koeficijent varijacije) na osnovu koje je urađena analiza varijabilnosti ispitivanih karaktera u okviru istraživanih populacija. Ovi rezultati su grafički prikazani uz pomoć whisker box plota gde je za svaki karakter prikazana njegova varijabilnost na nivou ispitivane populacije. Koeficijent varijacije (CV%) je korišćen za opisivanje hemijske varijabilnosti karaktera i u odnosu na njegove vrednosti karakteri su okarakterisani kao nisko varijabilni (CV% < 50), 16

25 umereno varijabilni (50 < CV% < 100), visoko varijabilni hemijski karakteri (100 < CV% < 150), oni karakteri kod kojih je CV% >150 su okarakterisani kao jako visoko varijabilni. Jednofaktorska analiza varijanse (ANOVA) je urađena da bi se utvrdilo da li postoji statistički značajna razlika u prosečnim vrednostima analiziranih karaktera između ispitivanih populacija. Osnovni postupak na kome se zasniva ova tehnika jeste izvođenje dve različite ocene varijanse populacija iz podataka, za koje se zatim računa količnik. Jedna od ovih ocena (varijansa između grupa) predstavlja meru efekata nezavisne promenljive udružene sa varijansom greške. Druga ocena (varijansa unutar grupa) je mera samo varijanse greške. Količnik varijansi između i unutar grupa označava se kao F-vrednost ili F-količnik. Statistički značajnan F-količnik ukazuje da su prosečne vrednosti posmatranog karaktera za date populacije veoma različite. Da bi se utvrdilo između kojih konkretnih populacija su ispoljene statistički značajne razlike, izvršena je i post-hoc provera rezultata dobijenih ANOVA testom, korišćenjem Tukey HSD (honest significant difference) testa. Analiza glavnih komponenti (PCA) je urađena na kompletnom uzorku, odnosno korelacionoj matrici individualnih vrednosti svih hemijskih karaktera (45 individua, 17 karaktera). Ova tehnika je primenjena da bi se utvrdilo koliko koji hemijski karakter doprinosi ukupnoj varijabilnosti uzorka kao i da bi se utvrdio odnos između pojedinih grupa jedinki, odnosno populacija u multidimenzionalnom hemijskom prostoru. PCA ima za cilj da smanji dimenzionalnost izvornih podataka prevodeći ih u skup novih promenljivih koje se nazivaju glavne komponente. Glavne komponetne nisu korelisane među sobom i sukcesivno opisuju najveći moguć procenat varijabilnosti. Rezultati su prikazani grafički scatterplotovima u prostoru koji je definisan prvom i drugom glavnom komponentom koje opisuju najveći procenat varijabilnosti uzorka. Kanonijska diskriminantna analiza (CDA). Da bi se utvrdilo da li postoji diferencijacija populacija na osnovu analiziranih karaktera urađena je kanonijska diskriminantna analiza sa populacijama koje su uzete kao a priori grupna varijabla. Ova analiza ima za cilj da utvrdi koliko se prethodno definisane grupe (populacije) međusobno razlikuju i koji karakteri najviše doprinose diskriminaciji populacija. Klaster analiza (CA). Klaster analiza omogućava grupisanje analiziranih varijabli u grupe ili klastere tako se da slični uzorci nalaze u istog klasi (klasteru). Klaster analiza bazirana na matrici Mahalanobisovih distanci koje su izračunate u CDA, a za koju je korišćen Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean (UPGMA) metod hijerarhijskog 17

26 klasterovanja urađena je na osnovu svih identifikovanih komponenti voskova i rezultati su prikazani grafički uz pomoć dendrograma. Ova analiza je korišćena da bi se utvrdila sličnost između prvobitno neklasifikovanih objekata tj. populacijama u ovom slučaju. 18

27 4. REZULTATI 4.1. Hemijski sastav epikutikularnog voska četina P. mugo sa područja srednje Evrope i Balkana Dvogodišnje četine sa 45 odraslih stabala P. mugo sakupljene su sa tri planinska masiva srednje Evrope i centralnog dela Balkanskog poluostrva: Julijski Alpi (Triglav), Skardsko-Pindske planine (Šar-planina) i Balkansko-Rodopske planine (Pirin). Kombinacijom GC/FID i GC/MS analize u epikutikularnom vosku četina identifikovano je 17 komponenti čije su relativne koncentracije date u tabeli 4.1, a nekoliko odabranih hromatograma prikazano je na slikama 4.1 i 4.2. Utvrđeno je prisustvo četiri diterpena (dva pimaranskog - pimaradien i sandarakopimaradien i dva abietanskog tipa - 18-norabieta- 8,11,13-trien i abietartrien), tri primarna alkohola (1-heksadekanol, cis-9-oktadecen-1-ol i 1- oktadekanol) i 10 n-alkana u seriji od C20 do C29. U populaciji Triglav, diterpeni i n-alkani predstavljaju dve dominantne grupe jedinjenja sa približno istom zastupljenošću (27.8 i 25.5%, resp.). U populaciji sa Šar-planine, n-alkani i diterpeni, takođe, imaju sličnu zastupljenost (34.4 i 32.7%%, resp.), dok je u populaciji Pirin, sadržaj n-alkana dosta veći u odnosu na diterpene (31.9 vs. 19.9%). U sve tri ispitivane populacije primarni alkoholi predstavljaju najslabije zastupljenu grupu jedinjenja u epikutikularnim voskovima, pri čemu njihov sadržaj varira od 8.1% u populaciji sa Šar-planine do 17.5% u populaciji sa Pirina (tabela 4.1). Najzastupljenije komponente voskova u populaciji Triglav su tri diterpena - sandarakopimaradien, 18-norabieta-8,11,13-trien i abietartrien (10.0, 7.4 i 6.7%, resp.) i primarni alkohol cis-9-oktadecen-1-ol (6.0%). U populacijama sa Balkanskog poluostrva (Šar-planina i Pirin), dve najzastupljenije komponente su diterpen 18-norabieta-8,11,13-trien (22.4% i 9.7%, resp.) i n-alkan C21 (10.1% i 8.2%, resp.). Pored njih u populaciji Šar-planina visoko su zastupljeni diterpen abietartrien i n-alkan C25 (6.6 i 5.4%, resp.), a u populaciji Pirin primarni alkohol cis-9-oktadecen-1-ol i n-alkan C20 (7.8 i 6.4%, resp.) (tabela 4.1). 19

28 Tabela 4.1. Rezultati deskriptivne statistike za 17 komponenti epikutikularnih voskova P. mugo populacija sa područja srednje Evrope i Balkanskog poluostrva (četiri najzastupjenije komponente u svakoj od populacija su boldirane; Avg - srednja vrednost, Min - minimalna vrednost, Max maksimalna vrednost, SD - standardna devijacija, CV koeficijent varijacije). Takson P. mugo sensu stricto Populacija Triglav Šar-planina Pirin Broj analiziranih jedinki (N) R. br. Komponenta Avg Min Max SD CV% Avg Min Max SD CV% Avg Min Max SD CV% 1. 1-Heksadekanol Pimaradien C Sandarakopimaradien Norabieta-8,11,13-trien cis-9-oktadecen-1-ol Abietatrien Oktadekanol C C C C C C C C C Diterpeni Primarni alkoholi n-alkani

29 U literaturi postoji samo jedan rad u kome se navode podaci o n-alkanima iz epikutikularnih voskova četina P. mugo i P. mugo var. pumilio (Maffei et al., 2004), prema kome se n-alkani nalaze u seriji C18-C34, a dominira C31 (6.2 i 22.4%, resp.). Uzorkovanje biljnog materijala je izvršeno tokom leta, izvan autohtonih populacija u rasadnicima severozapadne Italije (Turinska regija), a hemijska analiza je sprovedena na jako malom broju uzoraka (tri jedinke; Maffei et al., 2004) Promenjivost pojedinačnih komponenti epikutikularnih voskova Promenjivost pojedinačnih hemijskih karaktera analizirana je na osnovu rezultata deskriptivne statistike koji su bazirani na statističkoj obradi podataka svih identifikovanih komponenti voskova izolovanih sa četina 45 jedinki P. mugo. Kao rezultat deskriptivne statistike, izračunate su srednja vrednost, standardna devijacija i koeficijent varijacije (CV%). Srednja vrednost je pokazatelj prosečne vrednosti ispitivanih karaktera i omogućava dalje korišćenje statističkih pokazatelja varijabilnosti standardne devijacije i koeficijenta varijacije. Standardna devijacija, kao mera apsolutne varijabilnosti, ukazuje na prosečno odstupanje vrednosti ispitivanog karaktera od srednje vrednosti. Varijabilnost ispitivanih karaktera se ocenjuje pomoću koeficijenta varijacije i izražava u procentima (Bojović i Mitrović, 2010). Koeficijent varijacije (CV%). Vrednosti koeficijenta varijacije za identifikovane komponente epikutikularnih voskova P. mugo variraju u opsegu od 22.5 do 209.0% (tabela 4.1). Jako visok (CV%>150) i visok nivo koeficijenta varijacije (100<CV%<150) pokazuje pet komponenti u populaciji Triglav (pimaradien i n-alkani C25, C26, C27 i C29), samo jedna u populaciji sa Šar-planine (n-alkan C28) i tri u populaciji sa Pirina (n-alkani C26, C28 i C29). U svakoj od ispitivanih populacija najveći broj komponenti pokazuje umeren nivo koeficijenta varijacije (50<CV%<100). Nizak nivo koeficijenta varijacije (10<CV%<50) pokazuju po tri komponente u populacijama Triglav (1-heksadekanol i n-alkani C20 i C21) i Šar-planina (abietatrien, 18-norabieta-8,11,13-trien i n-alkani C20), dok u populaciji Pirin pet komponenti (abietartrien i n-alkani C20-C23) odlikuje nizak nivo koeficijenta varijacije. 21

30 Pimaradien A Sandarakopimaradien C20 18-Norabieta-8,11,13-trien B Abietatrien C21 C23 C25 Slika 4.1. Hromatogram epikutikularnog voska četina P. mugo: A) populacija Triglav (uzoark T3) B) populacija Šar-planina (uzorak S4). 22

31 18-Norabieta-8,11,13-trien A Abietatrien C21 C21 B Abietatrien 18-Norabieta-8,11,13-trien C23 Slika 4.2. Hromatogram epikutikularnog voska četina P. mugo: A) populacija Šar-planina (uzoark S15) B) populacija Pirin (uzorak P13). 23

32 A B Slika 4.3. Whisker plot za 17 komponenti epikutikularnih voskova P. mugo: A) populacija Triglav B) populacija Šar-planina. 24

33 Slika 4.4. Whisker plot za 17 komponenti epikutikularnih voskova P. mugo - populacija Pirin. Sadržaj n-alkana C20 varira od 3.0% u populaciji Šar-planina do 6.4% u populaciji Pirin. U svim ispitivanim populacijama spada u karaktere sa niskom varijabilnošću (tabela 4.1 i slike ). Sadržaj sandarakopimaradiena varira od 2.8% u populaciji Šar-planina do 10.0% u populaciji Triglav. U svim ispitivanim populacijama pokazuje umeren nivo koeficijenta varijacije. Sadržaj 18-norabieta-8,11,13-triena varira od 7.4% u populaciji Triglav do 22.4% u populaciji Šar-planina u kojoj spada u karaktere sa niskom varijabilnošću. U preostale dve populacije 18-norabieta-8,11,13-triena pokazuje umeren nivo varijacije. Sadržaj najzastupljenijeg primarnog alkohola, cis-9-oktadecen-1-ola, varira od 2.7% u populaciji Šar-planina do 7.8% u populaciji Pirin. U svim ispitivanim populacijama spada u karaktere sa umerenom varijabilnošću. 25

34 Sadržaj abietartriena varira od 5.6% u populaciji Pirin do 6.7% u populaciji Triglav u kojoj pokazuje umeren nivo varijacije. U preostale dve populacije spada u karaktere sa niskom varijabilnošću. Sadržaj n-alkana C21 varira od 5.3% u populaciji Triglav, u kojoj pokazuje nizak nivo varijacije, do 10.1% u populaciji Šar-planina, gde spada u karaktere sa umerenom varijabilnošću. Sadržaj n-alkana C25 varira od 3.9% u populaciji Pirin, gde spada u karaktere sa umerenom varijabilnošću, do 5.5% u populaciji Triglav, u kojoj pokazuje visok nivo koeficijenta varijacije. Slika 4.5. Varijabilnost dominantnih komponenti epikutikularnih voskova P. mugo u ispitivanim populacijama Analiza varijanse (ANOVA) U cilju utvrđivanja da li postoji statistički značajna razlika u prosečnim vrednostima hemijskih karaktera (komponenti epikutikularnog voska) između analiziranih populacija (Triglav, Šar-planina i Pirin) urađena je analiza varijnse (ANOVA). ANOVA ili disperziona analiza, predstavlja analitički model za testiranje značajnosti razlika između srednjih vrednosti ispitivanih grupa, koji omogućava izdvajanje karaktera koji su statistički značajni za diferencijaciju ispitivanih grupa (Bojović i Mitrović, 2010). 26

35 Tabela 4.2. Rezultati analize varijanse ANOVA (sa Tukey HSD post-hoc testom) za 17 komponenti epikutikularnih voskova u istraživanim populacijama P. mugo. R. br. Karakter F 1 ) P 2 ) Prosečni sadržaj (%) 3 ) Triglav Šar-planina Pirin N=15 4 ) N=15 N= Heksadekanol 3.14 ns Pimaradien 2.81 ns C *** 5.48 b 3.01 a 6.40 b 4. Sandarakopimaradien 6.74 ** 9.97 b 2.82 a 3.14 a Norabieta-8,11,13- trien *** 7.35 a b 9.71 a 6. cis-9-oktadecen-1-ol 4.88 * 5.96 ab 2.69 a 7.84 b 7. Abietatrien 0.74 ns Oktadekanol 3.64 * 4.10 a 1.72 a 4.23 a 9. C ns C *** 0.96 a 0.95 a 1.88 b 11. C * 2.57 a 5.03 b 4.82 b 12. C ns C ns C ns C ns C ** 0.00 a 0.28 b 0.06 a 17. C ** 0.27 a 2.39 b 2.00 b 1 ) F: ANOVA F-test. 2 ) P: nivoi statističke značajnosti (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ns: nema značajnosti). 3 ) Prosečni sadržaji sa različitim superskript slovima u istom redu (a, b) se značajno razlikuju (Tukey HSD post-hoc test). 4 ) Broj analiziranih jedinki za datu populaciju. ANOVA je ukazala na postojanje značajnih razlika između ispitivanih populacija P. mugo za 9 komponenti epikutikularnih voskova (sandarakopimaradien, 18-norabieta-8,11,13- trien, cis-9-oktadecen-1-ol, 1-oktadekanol i n-alkane C20, C22, C23, C28 i C29) (tabela 4.2). Post-hoc provera rezultata dobijenih ANOVA testom, korišćenjem Tukey HSD testa, potvrdila je značajnost svih karaktera, osim za n-alkan C22. Tri komponente epikutikularnih voskova (sandarakopimaradien i n-alkani C23 i C29) ukazale su na izdvajanje populacije Triglav u odnosu na preostale dve ispitivane populacije. Populacija Šar-planina se, takođe, 27

36 značajno razlikuje od preostale dve ispitivane populacije na osnovu sadržaja tri komponente (18-norabieta-8,11,13-triena i n-alkana C20 i C28), dok je na izdvajanje populacije Pirin ukazao samo jedan karakter (n-alkan C22). Sadržaj cis-9-oktadecen-1-ola se značajno razlikuje samo između populacija Šar-planina i Pirin, a nijedan od testiranih karaktera nije pokazao statistički značajne razlike između sve tri ispitivane populacije P. mugo Analiza glavnih komponenti (PCA) Analiza glavnih komponenti (PCA) 17 komponenti epikutikularnih voskova, koja je bazirana na korelacionoj matrici individualnih vrednosti, pokazala je da prve tri glavne komponente opisuju 65.4% ukupne varijabilnosti uzorka (tabela 4.3). Prva glavna komponenta (PC1) opisuje 33.2% ukupne varijabilnosti, druga (PC2) 21.5%, a treća (PC3) 10.7%. Karakteri koji najviše doprinose ukupnoj varijabilnosti na prvoj glavnoj komponenti su n-alkani C22-C29. Na drugoj glavnoj komponenti varijabilnosti najviše doprinose tri primarna alkohola (1-heksadekanol, cis-9-oktadecen-1-ol i 1-oktadekanol), diterpen 18- norabieta-8,11,13-trien i n-alkan C20. Rezultati ove analize pokazuju totalno preklapanje ispitivanih populacija što ukazuje da je varijabilnost epikutikularnih voskova P. mugo složena (slika 4.5A). Naime, na osnovu disperzije jedinki u koordinantnom sistemu definisanom osama PC1 i PC2, može se uočiti tendencija formiranja tri grupe jedinki. Prva grupa, koja pokazuje negativne vrednosti za PC1, uključuje jedinke iz sve tri ispitivane populacije, iako najmanje jedinki iz populacije Triglav. Ovu grupu odlikuju epikutikularni voskovi sa većim sadržajem n-alkana C22-C29 u poređenju sa ostalim grupama (slika 4.5B). Pretežno u pozitivnom delu PC1 nalaze se druga i treća grupa jedinki, međusobno odvojene po PC2. Druga grupa, koja se nalazi u pozitivnom delu PC2, uključuje samo jedinke iz populacija Triglav i Pirin čiji voskovi sadrže veći primarnih alkohola (1-heksadekanola, cis-9-oktadecen-1-ola i 1-oktadekanola) i najkraćeg n- alkana C20, Treća grupa, koja se nalazi u negativnom delu PC2, uključuje jedinke iz sve tri populacije čiji voskovi sadrže veći procenat diterpena (pimaradiena, sandarakopimaradiena, 18-norabieta-8,11,13-triena i abietatriena) i n-alkana C21. 28

37 A B Slika 4.5. A) Analiza glavnih komponenti (PCA) 45 P. mugo individua iz tri autohtone populacije sa područja srednje Evrope i Balkanskog poluostrva (Triglav, Šar-planina i Pirin) B) Prikaz 17 komponenti epikutikularnih voskova u projekciji prve dve PC ose. 29

38 Tabela 4.3. Opterećenje hemijskih karaktera na prve tri ose analize glavnih komponenti (PCA). Boldirane vrednosti su statistički značajne >0.5. R. br. Karakter Faktor 1 Faktor 2 Faktor 1. 1-Heksadekanol Pimaradien C Sandarakopimaradien Norabieta-8,11,13- trien cis-9-oktadecen-1-ol Abietatrien Oktadekanol C C C C C C C C C Prp.Totl U populaciji Pirin utvrđeno je prisutvo sva tri tipa epikutikularnih voskova sa pribižnom istom zastupljenoću, što nam ukazuje da se ova populacija odlikuje i najvećim nivoom varijabilnosti komponenti epikutikularnih voskova. U populaciji Triglav je, takođe, utvrđeno prisustvo sva tri hemotipa, iako su jedinke čiji voskovi sadrže veći procenat n- alkana C22-C29 najslabije zastupljene. Na kraju, populacija Šar-planina se odlikuje najnižim nivoom varijabilnosti voskova, s obzirom na prisustvo samo dva hemotipa. 30

39 Kanonijska diskriminantna analiza (CDA) Kanonijska diskriminantna analiza (CDA) na osnovu 45 jedinki iz tri a priori grupe (ispitivane populacije P. mugo) pokazala je da prve dve diskriminantne ose (CA1 i CA2) učestvuju u 100% ukupne diskriminacije, od čega CA1 sa 65.7% (tabela 4.4). CA1 je najviše određena sadržajem diterpena 18-norabieta-8,11,13-triena i n-alkana C23, C24, C25, C27 i C28 dok je CA2 najviše određena sadržajem n-alkana C22, C24 i C27. Scatterplot, dobijen na osnovu CDA (slika 4.6A), pokazao je da se populacija Triglav po CA1, koja opisuje najveći procenat diskriminacije, jasno radvaja od populacija sa Balkanskog poloustrva (Pirin i Šar-planina). Naime, sve jedinke iz ove populacije nalaze se u negativnom delu CA1, dok su se individue iz populacija sa Balkana koncentrisale kao dve susedne grupe pretežno na pozitnom delu CA1. Međutim, populacija Šar-planina je dodatno odvojena i po CA2, s obzirom da se jedino individue iz ove populacije nalaze u njenom pozitivnom delu. CDA sa 3 a priori grupe u proseku je korektno klasifikovala čak 95.5% ispitivanih individua (tabela 4.5): 100% u populacijama Triglav i Šar-planina i 85.7% u populaciji Pirin. Na opisanu diferencijaciju populacija P. mugo utiče nekoliko komponenti epikutikularnih voskova (tabela 4.4). Populacija Triglav može biti opisana kao hemotip 1 čiji voskovi sadrže najmanji procenat diterpena 18-norabieta-8,11,13-triena i n-alkana C23 i C24 (7.4, 2.6 i 2.4%, resp.). Populacija Pirin pripada hemotipu 2 čiji voskovi sadrže najmanji procenat n-alkana C25 i C27 (3.9 i 1.6%, resp.), a najveći procenat C22 (1.9%). Na kraju, populacija Šar-planina može biti okarakterisana kao hemotip 3 čiji voskovi sadrže najveći procenat diterpena 18-norabieta-8,11,13-triena i n-alkana C23, C24, C27 i C28 (22.4, 5.0, 2.9, 2.9 i 0.3%, resp.) u poređenju sa ostalim grupama. 31