УНИВЕРЗИТЕТ У НИШУ ПРИРОДНО- МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ ДЕПАРТМАН ЗА БИОЛОГИЈУ И ЕКОЛОГИЈУ Невена Ђорђевић Хемијски састав и антимикробна активност етарског

УНИВЕРЗИТЕТ У НИШУ ПРИРОДНО- МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ ДЕПАРТМАН ЗА БИОЛОГИЈУ И ЕКОЛОГИЈУ Невена Ђорђевић Хемијски састав и антимикробна активност етарског уља Оtanthus maritimus Мастер рад Ментор: др Зорица Стојановић- Радић Кандидат: Невена Ђорђевић Ниш, 2019

UNIVERSITY OF NIŠ FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY Nevena Đorđević Chemical composition and antimicrobial activity of the Otanthus maritimus essential oil Master thesis Mentor: Zorica Stojanović- Radić Candidate: Nevena Đorđević Niš, 2019

Захвалница Најсрдачније се захваљујем свом ментору др Зорици Стојановић-Радић на несебичној помоћи и стрпљењу при изради овог мастер рада. Посебну захвалност исказала бих својој породици на неизмерној подршци и разумевању коју су ми пружили током студирања. Хвала и проф. др Нику Радуловићу и др Марку Младеновићу на помоћи у реализацији хемијских анализа. Хвала!

БИОГРАФИЈА КАНДИДАТА Невена Ђорђевић рођена је 11. 01. 1993. године у Врању, где 2008. године завршава основну, а 2012. године гимназију Бора Станковић. Природно математички факултет у Нишу уписује 2013. године на Департману за биологију и екологију. Основне академске студије завршава 2016. године и исте године уписује Мастер академске студије, смер Биологија, које у предвиђеном року завршава.

САЖЕТАК Otanthus maritimus L. припада монотипском роду Otanthus и фамилији Asteraceae. Фамилија Asteraceae (Главочикe) укључује око 25000 врста, од којих се многе користе у медицинске сврхе широм света. Етарско уље ове биљке показало је антимикробну активност у многим ранијим истраживањима. Циљ овог мастер рада био је испитивање хемијског састава етарског уља O. maritimus и његовог антимикробног деловања на бактерије из респираторних узорака хуманог порекла. Биљни материјал сакупљен је у Грчкој. Из свежег биљног материјала поступком хидро-дестилације у апарату по Clevenger-у изоловано је етарско уље плаве боје. Принос етарског уља из цвасти био је 0,54±0,08 g, принос уља из листова и стабљика био је 0,07±0,01 g. Процесом гасно-масене хроматографије утврђен је хемијски састав етарског уља а хроматографијом уља издвојено је 14 фракција различитог хемијског састава. Установљено је да у уљу има 26 компоненти које чине 93,2% укупног хемијског састава овог уља. Главне компоненте овог уља биле су: камфор (23,5%), јомогиалкохол (22,9%) и артемизијаалкохол (18,6%). Антимикробна активност испитана је одређивањем минималне инхибиторне концентрације (МИК) микродилуционом методом. Минималне инхибиторне концентрације кретaле су се у распону од 2,5 до 10,0 mg/ml. Тестирање антимикробне активности фракција показало је да артемизија алкохол у комбинацији са камфором (у случају његовог већег процентуалног учешћа), cis-хризантенил ацетатом и артемизил ацетатом представљају носиоце антимикробне активности етарског уља Otanthus maritimus. Кључне речи: етарско уље, Otanthus maritimus, антимикробна активност, респираторни изолати

ABSTRACT Otanthus maritimus L. belongs to the monotype genus Otanthus and the Asteraceae family. The Asteraceae family (Glavocike) includes about 25.000 species, many of which are used for medical purposes all over the world. The essential oil of this plant has shown antimicrobial activity in many previous studies. The aim of this study was to examine the chemical composition of essential oil O. maritimus and its antimicrobial action on bacteria obtained from respiratory swabs of human origin. The plant material was collected in Greece. From fresh plant material, blue essential oil has been obtained by hydro-distillation in the Clevenger apparatus. The yield of essential oil from the flowers was 0.54 ± 0.08 g, while distillation of the leaves and stems yielded 0.07 ± 0.01 g. By the process of gas-mass chromatography, the chemical composition of the essential oil was determined, and the chromatography of the oil separated 14 fractions of different chemical composition. It has been found that 26 components make up 93.2% of the total chemical content of this oil. The main components of this oil were: camphor (23.5%), jomogi alcohol (22.9%) and artemisia alcohol (18.6%). Antimicrobial activity was tested by determining the minimum inhibitory concentration (MIK) using the microdilution method. Minimal inhibitory concentrations ranged from 2.5 to 10.0 mg/ml. Testing the antimicrobial activities of the obtained fractions showed that artemisia alcohol in combination with camphor (in case of its higher percentage participation), cis-chrysantenyl acetate and artemisyl acetate are the carriers of the antimicrobial activity of the Otanthus maritimus essential oil. Key words: essential oil, Otanthus maritimus, antimicrobial activity, respiratory isolates

САДРЖАЈ 1. УВОД... 1 Опште карактеристике етарских уља... 2 Физичке и xемијске особине... 5 Варијабилност састава и садржаја етарског уља... 6 Примена етарских уља... 7 Етарска уља као антимикробни агенси... 7 Опште карактеристике биљке Otanthus maritimus... 8 Етарско уље Otanthus maritimus- преглед досадашњих истраживања... 2 2. ЦИЉЕВИ ИСТРАЖИВАЊА... 1 3. МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДЕ... 2 Биљни материјал... 2 Бактеријски сојеви... 2 Изолација етарског уља (хидро-дестилација)... 2 Хемијска анализа етарског уља... 4 Dry flash хроматографија... 4 Хроматографија на танком слоју (TLC)... 4 Гасна хроматографија-масена спектрометрија (GC- MS)... 4 Идентификација састојака... 5 Потврда антимикробне активности (микродилуциона метода)... 6 4. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА... 7 Хемијски састав етарског уља О. maritimus... 7 Антимикробна активност етарског уља Otanthus maritimus... 10 5. ЗАКЉУЧАК... 30

6. Литература... 31

1. УВОД Последњих година у свету је тренд повратак природи, природној исхрани и лечењу. Модерна медицина у великој мери користи природне производе добијене из лековитих биљака, од којих су веома важне оне које припадају ароматичним врстама. Поред употребе у медицини, оне се користе и за исхрану и као зачини за побољшање укуса хране, који су богати бројним биоактивним састојцима (витаминима, минералима, етеричним уљима, алкалоидима...). Ароматичне биљке се традиционално користе у народној медицини, али и да би се продужио рок трајања хране, пошто њихови одређени секундарни метаболити имају инхибиторну активност на раст бактерија, гљива и квасаца (Hulin et al., 1998). Вековима се употребљавају због своје ефикасности у лечењу великог броја инфекција и болести (Nikolić et al., 2013). Њихова примена у етномедицини може бити важна полазна тачка за проналажење нових биоактивних једињења, која представљају једну значајну алтернативу синтетичким лековима. Оваква једињења су од великог значаја за фармацеутску, козметичку и прехрамбену индустрију. Иако се многе од њих синтетички производе, потражња за природним производима се повећава (Guillénet et al., 1996). Већина својстава лековитих биљака потиче од етарских уља, које оне стварају секундарним метаболизмом. Етарска уља и екстракти из неких биљних врста имају могућности да контролишу микроорганизме повезане са кожом (Adam et al., 1998), зубним каријесом (Cecanho et al., 1999) и кварењем хране, укључујући Грам-негативне и Грам-позитивне бактерије. Од средњег века, она се широко користе у медицинске сврхе као бактерициди, вируциди, фунгициди, анти-паразити и инсектициди. У последњих неколико десетина година испитује се способност биолошки активних једињења добијених из природних производа да елеминишу патогене МО, на тај начин превазилазећи проблем резистенције МО. Пошто су етарска уља обично комплексне мешавине бројних молекула и њихов биолошки ефекат је у најчешћем броју случајева резултат синергизма између њих. Међу многим другим познатим породицама као што су Pinaceae, Rutaceae, Apiaceae, Lamiaceae које су богате 1

врстама са етарским уљима истиче се породица Asteraceae као и врста Otanthus maritimus (Cabral et al., 2013). Фамилија Asteraceae, у народу позната као фамилија главочика, представља најобимнију фамилију у класи дикотиледоних скривеносеменица. Обухвата око 1500 родова са око 25000 врста. Ова фамилија има космополитско распрострањење, али на отвореним и делимично отвореним сувљим стаништима. То су најчешће једногодишње, двогодишње или вишегодишње биљке, али се срећу и полужбунови, жбунови и дрвеће. Њихово стабло може бити негранато или гранато, листови прости цели или дељени, увек без залистака, спирално, наспрамно или најчешће пршљенасто распоређени. Цветови су обично ситни и скупљени у карактеристичну цваст-главицу (capitulum). Главице могу бити појединачне или се даље групишу у различите типове сложених цвасти. Цветови су петочлани, а могу бити једнополни, двополни или стерилни. Чашица код неких представника не постоји, док је код других метаморфозирала у папус. Круницу увек изграђују пет сраслих листића. Плод је орашица, често са папусом. Otanthus sp. је род цветница који припада фамилији Asteraceae. Име рода потиче од грчке речи 'Otos' (уво) и 'Anthos' (цвет) што је последица тога што круница подсећа на унутрашњост људског уха. Једина позната врста овог рода је биљка Otanthus maritimus. То је мала, пионирска, вишегодишња врста која расте широм Медитерана и врши стабилизацију на пешчаним земљиштима. Циљ нашег истраживања је утврђивање хемијског састава етарског уља O. maritimus, издвајање хроматографских фракција овог уља и одређивање њиховог састава, као и утврђивање антимикробне активности уља и добијених фракција у односу на респираторне изолате хуманог порекла. 1.1 Опште карактеристике етарских уља Данас је познато око 60000 лековитих и 18000 ароматичних биљака. Ароматичне биљке јесу извор етарских уља, која се користе вековима. Етарска уља су коришћена и пре 2

нове ере у Египту, Грчкој, Риму, као и широм Далеког и Средњег Истока у медицини, козметици, као зачини, за пречишћавање ваздуха и у процесу балсамовања. Светска годишња производња се процењује на отприлике 50000 тона, од којих 50% чине цитрусна уља (лимун, наранџа, грејпфрут, мандарина) а 20% уља биљних врста рода Mentha. Остатак се, махом добија из ароматичних биљака фамилија Rutaceae, Lamiaceae, Apiaceae, Asteraceae и Myrtaceae (Kitić, 2010). Приноси етарских уља се обично крећу између 0,2 и 2,0%, мада постоје знатна одступања. У зависности од садржаја етарског уља који може да варира (принос изузетно цењеног ружиног уља често не прелази 0,03%, док принос неких других уља може достизати и до 20%, нпр. етарско уље каранфилића), биљке су подељене у ред богатих или сиромашних уљем (Gašić, 1985). Етарска уља биљкама дају карактеристичан мирис и арому. Мирис етарских уља потиче од састојака са кисеоничним функционалним групама и он је интензиван када су они присутни и у јако малим количинама (етарско уље лимуна). Боја етарских уља је углавном безбојна, жута или зеленожута. Међутим нека су специфично обојена (нпр. етарскa уљa цимета и каранфилића су смеђецрвене боје), док су етарска уља са азуленима плаве, зелене или љубичасте боје. Етарска уља представљају специфичне, најчешће течне продукте биљних ткива. То су више или мање сложене смеше испарљивих монотерпена, сесквитерпена и фенилпропанских једињења. То су различити угљоводоници (засићени или незасићени), алкохоли, феноли, естри, алдехиди, кетони, епоксиди или карбоксилне киселине. Етарска уља су смеше око 20-200 састојака. Ови састојци су, на основу концентрације у етарском уљу, подељени на: главне (20-95%), споредне (1-20%) и заступљене у траговима (испод 1%). Етарска уља су углавном лако покретљиве, мирисне течности; поједина су на собној температури вискозна или чврсте конзистенције. Етарска уља су углавном продукти копнених биљака (Embryophyta). Локализована су у различитим деловима биљака (корену, ризому, стаблу, кори, семену, листовима, цветовима и плодовима). Као што је случај и с другим секундарним метаболитима биљака, и продукција етарских уља је генетски дефинисана. Само до неких граница, генетска контрола је подложна утицајима ендогених и егзогених фактора. Не постоје општа правила, тако да неке биљне врсте у различитим климатским условима и различитим деловима света 3

производе приближне количине етарског уља, готово идентичног састава. С друге стране, јединке у оквиру исте популације биљака могу синтетисати међусобно различита етарска уља. Оваква варијабилност биљног генома, омогућава појаву различитих хемијских раса (хемотипова биљака), као и могућност издвајања високопродуктивних линија, и њихово вегетативно клонирање. Интересантно је да за једну исту врсту састав етарских уља може бити варијабилан и за различите органе. Ове мирисне течности настају у биљкама активношћу ендогених и егзогених секреторних ткива, која се могу јавити у облику појединачних ћелија у паренхимским ткивима, жлезданог епитела, шупљина или канала. Секреторне ћелије некада могу бити организоване и у специјалне структуре, жлезде и жлездане длаке. Биолошка функција етарских уља повезана је са атрактантним деловањем на инсекте, чиме је обезбеђено преношење полена и опрашивање биљака. Са друге стране, веома је значајна и улога етарских уља у заштити биљака од напада инсеката и животиња, хербивора. Такође, готово сва уља више или мање интензивно спречавају развој микроорганизама, и тако сузбијају ширење инфекција на биљкама у којима настају. Интересантни су и подаци о специфичним ефектима уља једне биљке, које прелази у подлогу и инхибира клијање семена других биљака (алелопатија). Нека етарска уља спречавају клијање сопствених семена и обезбуђују животни простор сваке индивидуе. Стара је теорија, која само делимично може бити прихваћена, да биљке синтезом и одавањем ових испарљивих продуката стварају специфичну микроклиму, која их штити од прекомерне транспирације у различитим неповољним условима (Kovačević, 2004). Примена етарских уља потиче још из старог Египта, где су Египћани поклањали велику пажњу здрављу и хигијени. Познавали су деловање ароматичних једињења на психу и тело људи. Етарским уљима лечили су нервне болести и депресију. Данас се етарска уља у Европској Унији најчешће употребљавају у исхрани (као зачин), као парфеми и у фармацији. Употреба етарских уља у ароматерапији је мала и сачињава нешто мање од 2% укупног тржишта. Појединачни састојци етарских уља се такође користе за давање укуса храни, било као синтетски произведена једињења или компоненте екстраховане из биљака. 4

Антибактеријско својство етарских уља и њихових састојака је искоришћено за справљање различитих комерцијалних производа као што су маса за попуњавање пломби, антисептици, или се користе као додатак храни (Ratajac, 2013). Физичке и xемијске особине Етарска уља су липофилна, растварају се у неполарним органским растварачима, етанолу, мастима и масним уљима. Генерално, етарска уља се не растварају у води. У ствари, само мали број састојака уља је растворљив; овакви производи називају се ароматичне воде. Специфичност ове групе биљних производа је да немају тачно дефинисану температуру кључања. Пошто су то смеше различитих једињења, свако од њих испарава на својој температури кључања. Тако, етарска уља фракционо кључају у интервалу од 150-350 C. Етарска уља су сложене мешавине две различите класе једињења: терпена и фенилпропанских деривата. У оквиру терпенске фракције, заступљени су испарљиви монои сесквитерпени. Монотерпени се јављају у облику ацикличних (линеарних), моно- и бицикличних, алифатичних и ароматичних структура. На основу уведених функционалних група, састојци уља могу бити угљоводоници, алкохоли, алдехиди, кетони, киселине, естри, феноли, етри, оксиди, пероксиди, епоксиди. У оквиру фракције сесквитерпена, формиране су још разноврсније структуре основног скелета; због дужине ланаца угљеникових атома већа је могућност различитих циклизација. И ова група терпена јавља се у облику угљоводоника, оксида, алкохола, кетона и естара. У етарским уљима су ароматични, фенилпропански састојци (C6-C3) заступљени у мањим количинама. Као састојци етарских уља срећу се и C6-C1 једињења, као што је ванилин и деривати антранилне киселине. Током дестилације, из биљне сировине могу предестилисати и различита алифатична једињења мање молекулске масе (засићени и незасићени угљоводоници, алкохоли, алдехиди, естри, лактони) који се растварају у етарском уљу и постају његов саставни део (Kovačević, 2004). 5

Варијабилност састава и садржаја етарског уља Као што је случај и с другим секундарним метаболитима биљака, и продукција етарских уља је генетски дефинисана. Само до неких граница, генетска контрола је подложна утицајима ендогених и егзогених фактора. Не постоје општа правила, тако да неке биљне врсте у различитим климатским условима и различитим деловима света производе приближне количине етарског уља, готово идентичног састава. С друге стране, појединачне јединке у оквиру исте популације биљака могу синтетисати међусобно различита етарска уља. Оваква варијабилност биљног генома, омогућава појаву различитих хемијских раса (хемотипова биљака), као и могућност издвајања високопродуктивних линија и њихово вегетативно клонирање. Најважнији фактори који могу утицати на састав етарског уља неке јединке су: генотип, фенофаза онтогенетског развоја, што је веома значајно за дефинисање оптималног времена прикупљања биљног материјала, еколошки фактори (фактори средине), начин обраде биљне сировине, начин изолације етарског уља. Температура, влажност и аерација земљишта, минералне соли у подлози, надморска висина, дужина изложености светлу и квалитет светлости, влажност ваздуха и ваздушна струјања, могу да утичу на променљивост количине етарског уља у биљном материјалу. Свака обрада ароматичне сировине (сушење, уситњавање, екстракција) условљава делимичан губитак етарског уља и промене његовог састава. Процесом индустријске екстракције увек се добија око 20% мање уља него у лабораторијским условима. 6

Примена етарских уља Природни антимикробни агенси добијени из биљних уља су вековима коришћени у конзервацији хране у различитим државама Азије (Кина, Азија). Етарска уља и зачине су користили и стари Египћани (Tajkarimi et al., 2010). Примена етарских уља може бити разноврсна. Користе се у козметичкој индустрији, додају се као састојци парфемима, у прехрамбеној индустрији се апликују као ароматични састојци који храни дају посебан укус. Примењују се и у фармацеутској индустрији у виду активних компоненти лекова, као антибактеријска и антимикробна једињења и у ароматерапији (Chamoro et al., 2012). Нашла су примену и у индустрији цигарета, а у последње време се користе и као биоциди и репелентне супстанце против инсеката (Baser & Buchbauer, 2009). Све већу улогу имају у спречавању заразних болести. Екстракт биљке Solanum nigrescens и нистатин су примењивани код жена код којих је потвђено присуство C. albicans, где је екстракт ове биљке показао добро дејство против овог микроорганизма (Giron et al., 1988). Сирови ектракт кактуса Opuntia streptacantha је био ефикасан у in vitro условима на вирус HIV-а (Ahmad et al., 1996). Хлороформни екстракт биљке Milletia thonningii примењен локално на кожу мишева спречава инфекцију узроковану паразитом Schistosoma mansoni (Perrett et al., 1995). Етарска уља имају све већу примену у инхибицији раста и смањењу броја микроорганизама који учествују у кварењу хране и изазивају различите болести. Етарска уља као антимикробни агенси Због свог специфичног хемијског састава, етарска уља често испољавају антимикробни ефекат. Поред наведене активности, етарска уља испољавају и антивирусну, антифунгалну и разне физиолошке ефекте попут имунопротективне, антиоксидативне, регенеративне, као и антиканцерогене, хепатопротективне и многих других биолошких активности (Beatović et al., 2013). Последњих година, учесталост резистенције на поједине антибиотике, постојање остатака антимикробних агенаса у намирницама после неадекватних процеса обраде, појава преосетљивости на лекове, поремећај нормалне микробне заједнице као и бројни негативни ефекти настали употребом лекова узрокују велике проблеме у области хумане медицине. 7

Антимикробна, антифунгална, антивирална и антипаразитска активност етарских уља биљака из породице Asteraceae потврђена је у многим истраживањима. У истраживању које су спровели Candan и сарадници (2003), етарско уље Achillea millefolium показало је антимикробну активност против бактерија Streptococcus pneumoniae, Clostridium perfringens, Candida albicans, Mycobacterium smegmatis, Acinetobacter lwoffii и Candida krusei. Етарско уље цвета биљке Calendulla officinalis показало је високу активност против гљива родова Candida и Rhodotorulla (Gazim et al., 2008). Такође је у раду који су спровели Binns и сарадници (2002) доказана антивирална активност етарског уља рода Echinacea против вируса Herpes simplex Тype 1. Антипаразитска активност етарског уља Ambrosia tenuifolia потврђена је у истраживању Sülsen и сарадника (2008) против врсте Trypanosoma cruzi и рода Leishmania sp. 1.2 Опште карактеристике биљке Otanthus maritimus Otanthus maritimus L. припада монотипском роду Otanthus и фамилији Asteraceae. Фамилија Asteraceae, позната као фамилија Главочика укључује око 25000 врста од којих се многе користе у медицинске сврхе широм света (Muselli et al., 2007). Ова врста живи на плажама дуж обале јужне и западне Европе, на северу се простире до југоистока Ирске (Cabral et al., 2013; Tsoukatou et al., 2000). To je eгипатска биљка која се прво код Бедуина користи као врло ефикасан антиастматичан лек (Sabri et al., 1983). Такође се користи у трaдиционалној медицини у лечењу зубобоље, астматичног бронхитиса, дизентерије и упале мокраћне бешике (Cabral et al., 2013; Tsoukatou et al., 2000). Otanthus maritimus је вишегодишња биљка, са усправним стабљикама до 50 cm које су чврсте и дрвенасте. Листови су овални или ланцетасти дужине од 5-17 cm, цели или урезани, меснати. Цваст је главичаста. Главица је округла са инволукралним брактејама дужине од 4-5 mm (Tutin, 1976), има двополне, тубуларне и жуте цветове, плодови су обложени са 3 или 4 танкослојна гландуларна ребра (Romeo et al., 2014). 8

Табелa 1. Систематика Otanthus maritimus (L.) Hoffmanns & Link Царство Раздео Класа Ред Фамилија Род Врста Plantae Tracheophyta Magnoliopsida Asterales Asteraceae Otanthus Otanthus maritimus Слика 1. Otanthus maritimus (L.) Hoffmanns Суви примерци ове биљке се традиционално користе као декорација и истовремено као средство за одбијањe летећих инсеката из домаћинства (Reutter, 1923). 1

1.2.1 Етарско уље Otanthus maritimus- преглед досадашњих истраживања Различите студије извештавају о изолацији неколико компоненти из надземних делова O. maritimus: флавоноида, сесквитерпена, монотерпена, лигнана и амида. Корени садрже киселине амида, ацетиленске деривате и сесквитерпене. Преко 30 компоненти је идентификовано у етеричним уљима са примарним нагласком на хризантенону, филифолону, cis-хризантенил ацетату, ɑ-пинену, камфору, артемизијском алкохолу, сантолина триену, артемисил ацетату и јомоги алкохолу који имају антифунгалну и антимикробну активност. Хризантенон, једна од заступљенијих компоненти етарског уља O. maritimus je ретки биоциклични монотерпенски кетон са благо масно-цветном аромом одговарајућом за ароматичну индустрију (Cabral et al., 2013; Muselli et al., 2007; Ruju et al., 2013). Табела 2. Преглед најзаступљенијих компоненти етарског уља Otanthus maritimus Истраживање Компоненте (%) Tsoukatou et al., (2000) Muselli et al., (2007) Cabral et al., (2013) Basile et al., (2013) Хризантенон / / 40,4-57,2 / Филифолон / / 12,2-15,5 / cis-хризантенил ацетат 30,4 0,3-3,9 10,1-12,2 0,9 ɑ- Пинен 0,2 1,5-3,8 6,7-7,2 0,2 Камфор 12,9 7,0-20,4 / 15,8 Артемизијски алкохол 12,6 11,5-19,2 / 13,7 Сантолина триен / t- 0,4 / 0,4 Артемизил ацетат 10,5 4,9-12,6 / 15,3 Јомоги алкохол / 24,4-34,7 / 20,8 Етарско уље корена O. maritimus садржи амиде масних киселина (Bohlman et al., 1974), ацетиленске деривате (Bohlman et al., 1974), хидрокарбонске сесквитерпене (Pascual Teresa et al., 1981). 2

Pascual Teresa је са сарадницима (1981) истраживала етарско уље корена O. maritimus са подручја Шпаније. Идентификовали су сесквитерпене а хроматографском сепарацијом изоловали ɑ-хумулен и β-кариофилен и четири друга сесквитерпена са трипентагоналнимтрицикличним скелетом, и то су били изокомнен, модефен, β-изокомнен и силфинен. Из свежег лишћа и цветова O. maritimus из Александрије (Египат), које је екстраховано етром и хлороформом идентификована су три сесквитерпенска лактонска естра, који су добијени хроматографском сепарацијом. Различити квалитативни и спектрални подаци су показали да су они били структурно повезани, али им се естарски део разликовао (Sabri et al., 1983). Из етарског уља O. maritimus први пут су изолована два пиперидин амида-n-[(2e, 4E, 8Z)-тетрадекатриеноил] пиперидин (Tutun, 1976) и N-[(2E, 4E, 8Z, 11Z)- тетрадекатетреноил] пиперидин (Jahn i Schönfelder, 1995), као и пиноресинол (Khfagy et al., 1981) и еспелетан (Jаkupović et al., 1988). У истраживању које су спровели Tsoukatou и сарадници (2000) етарско уље О. maritimus из надземних делова биљке са подручја Крита, добијено хидродестилацијом анализирано је помоћу GC и GC/MS (Гасна хроматографија и Гасна хроматографија са масеном спектрометријом). Главне компоненте уља биле су cis-хризантенил ацетат (30,4%), камфор (12,9%) и артемизијски алкохол (12,6%). Уље је показало велику активност против мрава Monomorium pharaonsis. У радовима пре овог из етарског уља надземних делова биљке изоловани су ацацетин 7-О-неоесперидозид и сезамину слична једињења (Khfagy et al., 1981), затим фенолни метаболити, и то акацетин-7-о-глукозид, винцелин 11, шафтозид и изовитексин (Мabry et al., 1970). Етарско уље надземних делова O. maritimus са територије Грчке (Крф и Лемнонска острва) показало је значајну активност против мрава Crematogaster scutellaris и термита Reticuliterms balkanensis. Ово је јако значајно с обзиром да C. scutellaris представља озбиљну штеточину у Грчкој (Christodoulopoulou et al., 2005). Најобилније компоненте уља надземног дела O. maritimus добијеног HS-SPME техником са територије Сицилије биле су сантолина триен (24,35%), камфор (17,91%) и артемизил ацетат (13,19%). Монотерпени и сесквитерпени чине 90.28% испарљивих 3

компоненти надземних делова биљке са ацикличним монотерпеном сантолина триеном. Иначе су по Теixeria da Silva (2004) артемизија алкохол, артемизил ацетат, хризантенил ацетат и сантолина триен типична једињења фамилије Asteraceae са типичном антимикробном активношћу. Између испарљивих супстанци била је и велика количина карвил ацетата, cis- и trans-карвеола, као и карвона. По Ashurst (1999) камфор, карвил ацетат, карвеол, карвон и борнеал имају минт ноту, која даје освежавајући, сладак и опуштајући мирис уљу (Romeo et al., 2007). Главни састојци уља O. maritimus са острва Корзике били су јомоги алкохол (24,4-34,7%), артемизија алкохол (11,5-19,2%) и артемизил ацетат (4,9-12,6%). Антибактеријска активност етарског уља против бактерије Staphylococcus aureus и Campylobacter jejuni су истраживани и публиковани по први пут у овој студији. Она је тестирана in vitro уз помоћ методе диск дифузије на микроорганизмима изазивачима болничких инфекција (Escherichia coli, Staphylococcus aureus и Pseudomonasaeruginosa) и болести које се преносе храном (Campylobacter jejuni и Listeria innocua). За разлику од осталих истраживаних сојева, P. аeruginosa није показао осетљивост на уље. Раст E. coli и L. innocua је био слабо инхибиран, док је раст S. аureus и нарочито C. jejuni био инхибиран. Недостатак активности уља против E. coli и P. аeruginosa може бити објашњена малом количином камфора у уљу и одсуством других ефикасних једињења против ове бактерије. Да би се одредио антибактеријски потенцијал главних једињења уља O. maritimus, фракције и подфракције добијене након поновљене хроматографије су тестиране на S. аureus и C. jejuni. У случају S. аureus, неполарне фракције су показале слабу активност. Интересантно је да иако је познато да хамазулен, који је био у великим количинама присутан у овим фракцијама (80,9%), није показао антибактеријску активност против S. аureus, иако је познато да инхибира цитохром P450. На основу ових резултата, главна антибактеријска активност против S. аureus је била последица присуства оксигенованих једињења. Најмању антибактеријску активност имала је фракција са артемизил ацетатом, где је он износио 52,7%. Максимална инхибиција била је од стране фракција које су богате алкохолима. Артемизија алкохол је био мање активан него јомоги алкохол. Хамазулен је такође показао слабу активност према бактерији C. jejuni. Артемизијски алкохол, јомоги алкохол и камфор су показали велику активност против C. јejuni. На основу овога, закључује се да су ова једињења потенцијална база за производе 4

против ових бактерија, али се пре тога мора испитати њихова токсичност (Muselli et al., 2007). Pavela (2007) је истраживао ларвицидни ефекат уља O. maritimus са територије Русије. Утврдио је да уље има висок ларвицидни ефекат против 4. ларвалног стадијума комарца Culex quinquefasciatus. Из гљиве Chaetomium која је први пут изолована из биљке O. maritimus добијен је нови тетрахидрофурански дериват - ауреонитолична киселина, за коју је утврђено да нема цитотоксичну активност (Aly et al., 2008a, b). Cabral и сарадници (2013) су одредили хемијски састав етарског уља добијеног хидродестилацијом из надземних делова O. maritimus са територије Португала и антифунгалну и антиинфламаторну активност уља у концентрацијама безбедним за ћелије сисара. У истраживању је утврђено да етарско уље O. maritimus има значајну антифунгалну активност против сојева дерматофита (Candida, Aspergillus, Microsporum, Trichophytom, Epidermophyton) и значајно инхибира продукцију NO. Показало се да је уље безбедно за ћелије сисара макрофаге и кератиноците у концентрацијама од 0,16 µl/ml до 0,32 µl/ml. Главнe компонентe етарског уља O. maritimus биле су хризантенон (40,4-57,2%), филифолон (12,2-15,5%), cis- хризантенил ацетат (10,1-12,2%) и ɑ-пинен (6,7-7,2%). Basile и сарадници (2013) су утврдили да етарско уље цвета Otanthus maritimus са подручја Палерма (Италија) садржи велику количину монотерпена, нарочито са кисеоником којих је било 73,1%. Најприсутније компоненте су биле јомоги алкохол (20,8%), камфор (15,8%), артемизил ацетат (15,3%) и артемизија алкохол (13,7%). Уље је тестирано против два Грам (+) и шест Грам (-) бактеријска соја, стандардних сојева и клиничких изолата и једног потенцијално патогеног соја квасца (клинички изолат Candida albicans) и два фитопатогена (Botrytis cinerea и Rhizoctonia solani). Резултати су показали да уље из O. maritimus има снажна антибактеријска и антифунгална дејства. Активност уља против тестираних бактерија је била генерално висока са минималном инхибиторном концентрацијом (MIC) између 7,8 и 250 µg/ml за ATCC и 7,8 и 500 µg/ml за клинички изолат (КИ). Најосетљивија бактерија била је Salmonella typhi (MIC=7,8 µg/ml за оба ATCC и КИ) као и Enterobacter cloacae (MIК=15,7 µg/ml за ATCC и 31,3 µg/ml за КИ). Proteus mirabilis је био најмање осетљив на уље, док је једина врста на коју је био остварен микробицидни ефекат била Pseudomonas aeruginosa. Oд наведених компоненти познато је да камфор 5

показује антибактеријску активност против E. coli, P. aeruginosa и делимично против S. aureus (Santoyo et al., 2005). Као што су Muselli и сарадници (2007) демонстрирали, артемизија алкохол и јомоги алкохол показали су добру антибактеријску активност, док је хамазулен био слаб. Дакле ова једињења су вероватно одговорна за антимикробну активност етарског уља O. maritimus. Basile и сарадници (2013) су испитивали и антифунгалну активност овог уља на чврстој подлози у односу на три соја гљива: C. albicans КИ, B. cinereal и R. solani. Етарско уље у три тестиране концентрације у разблаженом медијуму инхибирало је 3 гљиве, нарочито R. solani од 0% до 50% и C. albicans и B. cinereal од 0% до 25%. У течној подлози уље је имало ефекта на све тестиране гљиве, са MIК-овима од 63 до 250 µg/ml. Rhizoctonia solani je била најосетљивији сој (MIC=62,5 µg/ml), док су C. albicans и B. cinerea биле мање осетљиве (MIC=125 µg/ml). 6

2. ЦИЉЕВИ ИСТРАЖИВАЊА 1. Сакупити биљни материјал врсте Оtanthus maritimus 2. Изоловати етарско уље из биљног материјала методом хидродестилације 3. Хроматографисати етарско уље 4. Испитати хемијски састав етарског уља и фракција коришћењем GC/GC-МS методе 5. Испитати антимикробни ефекат етарског уља и хроматографских фракција у односу на респираторне изолате 6. Доношење закључака о биактивном потенцијалу етарског уља и компоненти врсте Otanthus maritimus 1

3. МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДЕ Биљни материјал Биљни материјал O. maritimus сакупљен је на плажи Loca у близини Солуна (Грчка), јула 2017. Хербарски примерак је депонован у Хербаријуму Департмана за биологију и екологију, Природно- математичког факултета у Нишу ( Herbarijum Moesiacum Niš - HMN) под ваучерским бројем 13486. Бактеријски сојеви Синтетисана једињења су тестирана против бактеријских сојева изолованих из клиничких узорака. Тестирање је вршено против Грам (+) бактерија (Staphylococcus aureus- 5 изолата из носа, Streptococcus pneumoniae 2 изолата из носа) и Грам (-) бактерија (Klebsiella spp 1 изолат из грла, Еscherichia coli 1 изолат из спутума и 3 из грла, Moraxella catarrhalis 3 изолата из носа, Pseudomonas aeruginosa 1 изолат из грла). Сојеви су гајени на Крвном агару (BA) на 37 C у Микробиолошкој лабораторији (Департман за биологију, Природно-математички факултет, Универзитет у Нишу). Изолација етарског уља (хидро-дестилација) За изоловање етарског уља коришћена је метода хидродестилације апаратуром по Клевенџеру. Ова апаратура се састоји из кондензора, бочне цеви са чепом и одушком и цеви која служи за мерење волумена дестилата. 2

кондензор бочна цев са чепом и одушком градуисани део апаратуре за мерење волумена до 1mL биљни материјал Слика 4. Апаратура по Clevenger- у. Процес тече тако што се балон, у коме се налази вода и биљни материјал, загреје до тачке кључања те воде, затим долази до издвајања водене паре у кондензор заједно са етарским уљем. Ту се водена пара преводи у течно стање и враћа се у балон за дестилацију, а уље остаје у цеви, на површини воденог стуба. Из 3167 g (3,2 kg) свежег биљног материјала Otanthus maritimus који је уситњен и преливен водом, изоловано је етарско уље. Биљни материјал је стављен у балон од 5 L и урађено је 7 дестилација у апаратури по Клевенџеру. За сваку дестилацију урађена је посебно масена спектрометрија и гасна хроматографија да би се утврдило да ли се етарска уља из различитих делова (цвасти и надземни део) међусобно разликују по саставу. Свака је трајала 2,5 h. Цвасти и надземни део дестиловани су засебно да бисмо утврдили где је већи принос уља. Добијено уље је екстраховано диетил етром и сушено анхидрованим MgSO4, а затим упарено на вакум упаривачу и чувано у фрижидеру до даљих анализа. Oдмах након обраде, уље је анализирано коришћењем метода GC и GC-MS. 3

Хемијска анализа етарског уља Dry flash хроматографија Апаратура за dry flash хроматографију, за препаративно раздвајање састојака етарског уља (маса хроматографисаног уља била је 4,0 g), се од колоне силика гела 60 (>230 mesh-а, произвођач Меrck, Darmštat, Nemačka), напаковане на синтерованом стакленом левку средње порозности и величине, и стандардне боце за вакуум филтрацију. Као елуент је коришћена смеша хексана и диетил-етра под градијентним условима полазећи од чистог хексана па до чистог диетил-етра. Добијено је укупно 14 различитих фракција. Фракције су спајане на основу резултата хроматографије на танком слоју (ТЛЦ). Масе добијених фракција су: Фр1 (61 mg), Фр2 (24 mg), Фр3 (8 mg), Фр4 (20 mg), Фр5 (10 mg), Фр6 (712 mg), Фр7 (192 mg), Фр8 (20 mg), Фр9 (283 mg), Фр10 (288 mg), Фр11 (540 mg), Фр12 (600 mg), Фр13 (326 mg), Фр14 (862 mg). Хроматографија на танком слоју (TLC) Аналитичка TLC хроматографија је вршена на алуминијумским плочама са слојем силика-гела 60 F254 (Merck, Nemačka). Као елуент коришћене су различите смеше хексана и диетил-етра. Визуализација мрља је вршена помоћу УВ светлости (254 nm), односно 30%- тним (v/v) раствором сумпорне киселине или 10%-тним етанолним (w/w) раствором фосфомолибденске киселине, а затим загревањем. Гасна хроматографија-масена спектрометрија (GC- MS) Гасно-хроматографска анализа (GC-MS) етарског уља и dry flash фракција етарског уља је извршена на гасном хроматографу типа HP 6890N, са DB-5MS капиларном колоном (5% фенилметилсилоксан, димензије 30 m 0,25 mm, дебљина филма 0,25 μm, Agilent Technologies, SAD). Гасни хроматограф је био директно повезан са масеним детектором MSD 5975B исте компаније. Услови анализе: радна температура ињектора 250 C, односно детектора 320 C; линеарни температурни програм загревања колоне у опсегу од 70 C до 290 C са брзином повећања температуре од 5 C/min, након чега је постојао изотермални период на 290 C у трајању од 10 минута. Ињектиран је раствор узорка у етру 4

(1 μl раствора концентрације 1 mg у 1 ml диетил-етра), у пулсном сплит моду (40:1), при протоку од 1,5 ml/min хелијума за првих 30 секунди, а затим је проток одржаван на 1,0 ml/min до краја анализе. Јонизација је вршена електронима енергије 70 ev, са аквизицијом m/z вредности опсегу од 35 до 650 и брзином скенирања на 0,32 s по скену. Процентуални састав појединих састојака је одређен на основу односа површина пикова, без коришћења корекционих фактора. Идентификација састојака Обрада резултата је вршена помоћу MCD ChemStation софтвера (ver. D.03.00.611, Аgilent Теchnologies, SAD) у комбинацији са АМDIS (ver. 2.68) и NIST МS Search програмским пакетима (ver. 2.0d, Национални институт за стандарде и технологију (NIST), SAD). АМDIS је коришћен за деконволуцију масеног скена, тј. екстракцију масених спектара из скенова преклопљених пикова, док је NIST MS Search обезбедио алгоритам за претрагу библиотека масених спектара. Линеарни ретенциони индекси свих састојака анализираних узорака су одређени коињекцијом узорка са хомологом серијом n-алкана од C9-C29 (Den Dool & Kratz, 1963). Хемијски састав узорака уља и фракција уља је одређен упоређивањем линеарних ретенционих индекса састојака са литературним вредностима (Аdams, 2007), као и на основу поређења масених спектара једињења са спектрима једињења из библиотека Wiley Registry of Mass Spectral Data 11th Еdition, NIST/EPA/NIH Маss Spectral Library 07, МаssFinder 2.3, Аdams (Аdams, 2007) и библиотеке масених спектара лабораторије за органску анализу и синтезу ПМФ-а у Нишу. Где год је било могуће, вршена је и анализа узорка са коињектираним одговарајућим стандардом. Резултати GC и GC-MS анализа етарског уља и фракција уља сумирани су у Табели 3 и 4. 5

Анализа антимикробне активности (микродилуциона метода) Антибактеријска активност је oдређена коришћењем методе микродилуције у микротитарским плочама како је описано раније (Radulović et al., 2015). Слика 5. Микротитарска плоча са инокулисаном хранљивом подлогом, третирана серијом разблажења етарских уља Ћелијска суспензија је направљена коришћењем преконоћне културе (18 h) одговарајућег соја и стандардизована на 0.5 McFarland јединица (DEN-1, Biosan). Раствор етарског уља и фракција је направљен у чистом DMSO-у (диметил-сулфоксид) и додатно разблажен са стерилном течном подлогом (Mueller Hinton бујон) да би се добио раствор у коме концентрација DMSО-a не утиче на бактеријски раст (10%). Ови раствори су даље серијски разређени, након чега је инокулум додат у све бунаре, и инокулиране плоче су инкубиране на 37 C током 24 h. Бактеријски раст је одређен додавањем 20 µl воденог раствора, 0,5% трифенил-тетразолиjум-хлорида (TTC). MИК је дефинисана као најнижа концентрација тестираних једињења која су инхибирала видљив раст (црвено обојен талог на дну бунара након додавања TTC-а). Сви експерименти су урађени у трипликату. 6

4. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА Хемијски састав етарског уља О. maritimus Из свежег биљног материјала поступком хидро-дестилације у апарату по Clevengerу изоловано је етарско уље плаве боје. Принос етарског уља из цвасти био је 0,54±0,08 g, принос уља из листова и стабљика био је 0,07±0,01 g. Процесом гасно-масене хроматографије утврђен је хемијски састав етарског уља Otanthus maritimus који је дат у Табели 3. Установљено је да у уљу има 26 компоненти које чине 93,2% укупног хемијског састава овог уља. Главне компоненте овог уља су: камфор (23,5%), јомоги алкохол (22,9%) и артемизија алкохол (18,6%). Након упоређивања хемијског састава етарског уља са претходним радовима може се уочити различит процентуални састав главних компоненти (Табела 4). У истраживању које су спровели Tsoukatou и сарадници (2000), утврђено је са су главне компоненте етарског уља исте биљке сакупљане у Грчкој (острво Крит) биле cis-хризантенил ацетат, 1,8-синеол, камфор и артемизија алкохол (30,4; 19,1; 12,9 и 12,6% садржаја уља, респективно). При томе, садржај камфора у етарском уљу O. maritimus био је за 10,6% мањи него у нашем истраживању, а садржај артемисија алкохола мањи за 6%. У биљном материјалу O. maritimus сакупљаном на Корзици, утврђено је хемијском анализом да су главне компоненте биле јомоги алкохол, артемизија алкохол, камфор и артемизил ацетат (24-34%; 11,5-19,2%; 7-20,4 и 4,9-12,6%, респективно) (Muselli et al., 2007). Нешто савременије истраживање које су недавно урадили Cabral et al. (2013), утврдило је да су главне компоненте етарског уља биљног материјала O. maritimus сакупљаном у Португалији биле хризантенон, филифолон и cis-хризантенил ацетат (40,4-57,2%; 12,2-15,5% и 10,1-12,2%, респективно). Basile et al. (2013) су у етарском уљу материјала са Сицилије идентификовали јомоги алкохол, камфор, артемизија алкохол и артемизил ацетат као главне компоненте (29,8%; 15,4%; 14,7%и 7,3%, респективно). Садржај уља испитиваног у овом раду најсличније је по саставу саставу уља добијених из биљног материјала сакупљаног на Корзици и Сицилији (Tsokatou et al., 2000; Basile et al., 2013). 7

Taбела 3. Хемијски састав етарског уља врсте Otanthus maritimus (L.) Hoffmanns & Link. RI 1 Састојци [%] ID 2 906 Сантолинатриен 0,2 MS, RI 923 Артемизијатриен 0,3 MS, RI 925 α-тујен 0,2 MS, RI, CoI 935 α-пинен 0,3 MS, RI, CoI 951 Камфен 3,3 MS, RI, CoI 976 Сабинен tr 3 MS, RI, CoI 981 β-пинен 0,1 MS, RI, CoI 1002 Јомоги алкохол 22,9 MS, RI, CoI 1059 Артемизија кетон tr MS, RI 1087 Артемизија алкохол 18,6 MS, RI, CoI 1128 Хризантенон 0,2 MS, RI 1152 Камфор 23,5 MS, RI, CoI 1164 cis-хризантенол 1,5 MS, RI 1167 Пинокарвон 0,6 MS, RI 1173 Артемизил-ацетат 7,6 MS, RI 1246 Карвон 0,3 MS, RI 1265 cis-хризантенил-ацетат 11,6 MS, RI 1290 Нерил-формијат 0,4 MS, RI, CoI 1338 Миртенил-ацетат 0,3 MS, RI, CoI 1392 α-изокомен 0,6 MS, RI 1417 trans-кариофилен tr MS, RI, CoI 1485 Бициклосесквифеландрен tr MS, RI 1735 Хамазулен 0,7 MS, RI 2500 Пентакозан tr MS, RI, CoI 2700 Хептакозан tr MS, RI, CoI 2900 Нонакозан tr MS, RI, CoI Укупно (%) 93.2 1- ретенциони индекс 2- начин (метода) идентификације 3- траг (једињење је присутно у траговима) Интересантна чињеница је да у уљу које је сакупљано такође у Грчкој (Tsokatou et al., 2000), није утврђено присуство јомоги алкохола који је значајна компонента у саставу нашег уља. Садржај камфора у истраживању Romea и његових сарадника (2013) био је мaњи за 5,6%. У истраживању Basile и његових сарадника (2013) садржај јомоги алкохола био је за 2,1% мањи него у нашем случају, садржај камфора мањи за 7,7%, а садржај артемизија алкохола мањи за 4,9%. 8

Табела 4. Процентуално учешће најзаступљенијих идентификованих компоненти етарског уља биљне врсте Otanthus maritimus (%) и њихово поређење са досадашњим истраживањима. Назив једињења Локација сакупљања Камфор Јомоги алкохол Артемизија алкохол Наше истраживање Грчка (Солун) 23.5 22.9 18.6 Tsoukatou et al. (2000) Грчка (Крит) 12.9 / 12.6 Romeo et al. (2007) Италија (Сицилија) 17.91 / 7.82 Muselli et al. (2007) Француска (Корзика) 9.8-15.6 24.4-34.7 11.5-19.2 Basile et al. (2013) Италија (Палермо) 15.8 20.8 13.7 У Табели 5. дати су главни састојци фракција етарског уља. Највећа количина камфора је у фракцији 10 (85,3%), јомогиалкохола има највише у фракцији 14 (77,7%), док је у фракцији 12 била највећа количина артемизијаалкохола (58,7%). Табела 5. Главни састојци фракција етарског уља изолованог из биљне врсте O. maritimus Шифра Главни састојци фракције (%) Маса(mg) фракције Фракција 1 ɑ- изокомен (19,8), пентакозан (17,6), хептакозан (17,3), 56,0 нонакозан (20,4) Фракција 2 артемизијатриен (8,2), камфен (10,9), транс-кариофилен 24,0 (25,1) Фракција 3 trans-кариофилен (20,9), бициклосесквифеландрен (43,7) 8,0 Фракција 4 trans-кариофилен (30,6), бициклосесквифеландрен (39,3) 20,0 Фракција 5 xамазулен (98,3) 10,0 Фракција 6 aртемизија алкохол (11,1), камфор (18,1), артемизил-ацетат 52,8 (22,9), cis-хризантенил ацетат (33,1) Фракција 7 aртемизија алкохол (8,4), камфор (24,0), артемизил-ацетат 55,8 (18,5),cis-хризантенил ацетат (37,5) Фракција 8 артемизил- ацетат (30,7), cis-хризантенил ацетат (58,8) 20,0 Фракција 9 камфор (38,8), артемизил-ацетат (18,1), 55,1 cis-хризантенилацетат (32,8) Фракција 10 aртемизија алкохол (6,3), камфор (85,3) 55,3 Фракција 11 aртемизија алкохол (47,9), камфор (46,9) 46,9 Фракција 12 jомоги алкохол (19,6), артемизија алкохол (58,7), 49,3 cis- хризантенол (7,3) Фракција 13 jомоги алкохол (72,8), артемизија алкохол (7,3) 49,4 Фракција 14 jомоги алкохол (77,7) 53,2 9

Антимикробна активност етарског уља Otanthus maritimus Резултати добијени испитивањем антимикробне активности етарскох уља Otanthus maritimus указали су на умерен антимикробни потенцијал и уља и његових фракција (Фр1- Фр14), где се инхибиторни ефекат кретао у опсегу концентрација од 0,31 до 10,0 mg/ml (Табеле 6 и 7). Етарско уље показало је широк спектар антимикробне активности делујући на све изолате, осим на два соја E. coli изолованих из грла. Средња МИК вредност етарског уља била је 5,9 mg/ml, док је његова највећа забележена активност утврђена у односу на изолате P. aeruginosa, где су МИК вредности биле мање од 2,5 mg/ml. Специфична селективност, попут оне усмерене на одређене бактеријске врсте и/или групе (Грам- позитивне или Грам негативне бактерије) није утврђена за испитивано етарско уље. Taбела 6. Минималне инхибиторне концентрације (МИК) етарског уља O. maritimus Место изолације MИК/mg СТР (µg/ml) Staphylococcus aureus нос 10.0 6.25 Staphylococcus aureus нос 5.0 6.25 Staphylococcus aureus нос 10.0 50.00 Staphylococcus aureus нос 5.0 12.50 Staphylococcus aureus нос 5.0 12.50 Staphylococcus aureus нос 2.5 3.12 Staphylococcus aureus нос 5.0 12.50 Staphylococcus aureus нос 10.0 3.12 Кlebsiella spp. грло 10.0 25.00 Escherichia coli грло 5.0 3.12 Escherichia coli грло 6.25 12.50 Escherichia coli грло 5.0 0.78 Escherichia coli спутум 5.0 6.25 Streptococcus pneumoniae нос 5.0 12.50 Streptococcus pneumoniae нос 5.0 12.50 Moraxella catarrhalis нос 5.0 12.50 Moraxella catarrhalis нос 5.0 50.00 Moraxella catarrhalis нос 5.0 6.25 Pseudomonas aeruginosa грло 2.5 0.39 Pseudomonas aeruginosa грло 2.5 12.50 СТР-стрептомицин 10

Табела 7. Антимикробна активност фракција добијених Хемијски хроматографском састав и антимикробна сепарацијом етарског активност уља етарског O. maritimus уља Оtanthus maritimus Бактерија МИ Фр1 Фр2 Фр3 Фр4 Фр5 Фр6 Фр7 Фр8 Фр9 Фр10 Фр11 Фр12 Фр13 Фр14 Staphylococcus aureus нос 10,0 5,00 2,50 >5,0 2,50 10,0 0,31 5,00 5,00 5,00 2,50 2,50 10,0 10,0 Staphylococcus aureus нос >10,0 5,00 1,25 5,00 1,25 10,0 10,0 2,50 10,0 5,00 >10,0 >10,0 10,0 10,0 Staphylococcus нос 10,0 0,62 0,62 2,50 1,25 5,00 10,0 5,00 10,0 5,00 2,50 1,25 >10,0 >10,0 aureus Staphylococcus aureus нос 10,0 5,00 2,50 5,00 2,50 10,0 10,0 5,00 5,00 5,00 2,50 2,50 10,0 10,0 Staphylococcus нос >10,0 >5,00 >2,50 5,00 2,50 10,0 10,0 5,00 10,0 10,0 10,0 10,0 >10,0 >10,0 aureus Staphylococcus нос >10,0 >5,00 >2,50 5,00 >2,50 10,0 10,0 5,00 10,0 5,00 5,00 10,0 >10,0 10,0 aureus Staphylococcus aureus нос >10,0 >5,00 >2,50 5,00 2,50 10,0 10,0 >5,00 5,00 5,00 2,50 2,50 >10,0 >10,0 Staphylococcus нос 10,0 2,50 2,50 5,00 2,50 10,0 10,0 >5,00 10,0 5,00 1,25 2,50 10,0 10,0 aureus Klebsiella spp. грло 10,0 5,00 2,50 5,00 >2,50 10,0 10,0 2,50 10,0 5,00 2,50 2,50 10,0 10,0 Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumoniae Moraxella catarrhalis грло 10,0 2,50 1,25 5,00 2,50 5,00 10,0 5,00 10,0 5,00 5,00 2,50 10,0 10,0 грло >10,0 >5,00 >2,50 5,00 2,50 10,0 10,0 >5,00 10,0 5,00 10,0 10,0 >10,0 >10,0 грло >10,0 5,00 >2,50 >5,00 2,50 5,00 5,00 1,25 2,50 1,25 1,25 1,25 >10,0 >10,0 спутум 10,0 >5,00 >2,50 5,00 2,50 10,0 10,0 2,50 10,0 5,00 5,00 2,50 >10,0 >10,0 нос 10,0 >5,00 >2,50 >5,00 >2,50 10,0 10,0 >5,00 >10,0 10,0 2,50 2,50 10,0 10,0 нос >10,0 >5,00 >2,50 >5,00 >2,50 10,0 10,0 >5,00 10,0 5,00 5,00 2,50 >10,0 10,0 нос >10,0 >5,00 >2,50 5,00 2,50 10,0 10,0 5,00 10,00 2,50 2,50 10,0 10,0 >10,0 25

Moraxella нос >10,0 >5,00 >2,50 >5,00 2,50 10,0 10,0 10,00 10,00 5,00 10,0 10,0 >10,0 >10,0 catarrhalis Moraxella catarrhalis нос >10,0 >5,00 >2,50 >5,00 2,50 10,0 10,0 5,00 5,00 5,00 2,50 2,50 >10,0 >10,0 Pseudomonas aeruginosa грло >10,0 >5,00 >2,50 >5,00 >2,50 10,0 10,0 5,00 10,0 5,00 5,00 5,00 >10,00 >10,0 Pseudomonas aeruginosa грло 10,0 5,00 2,50 >5,00 2,50 10,0 10,0 5,00 10,0 10,0 10,0 10,0 >10,00 10,0 МИ-место изолације 26

Тестиране фракције показале су већу ефикасност у поређењу са етарским уљем, при чему су неке од њих испољиле шири спектар активности (Фр6, Фр7 и Фр10) од етарског уља, постижући инхибиторни ефекат у тестираном опсегу концентрација. Посматрајући ове три фракције, уочљива заједничка карактеристика је присуство камфора (као главне компоненте) и артемизија алкохола у различитим процентуалним односима (Табела 5). Имајући на уму да Фр11, која је показала сличан широк спектар активности (Табела 7), садржи обе ове компоненте, може се спекулисати да је управо комбинација ова два једињења одговорна за добијену антимикробну активност. Ова врста активности може се приписати синергизму ових компоненти, што је претходно утврђено за више природних једињења. Такође, оно што се може закључити јесте да иако имају широк спектар деловања (скоро сви или сви сојеви), ове фракције деловале су при нешто вишим концентрацијама, при чему је најактивнија била Фр10 (просечна МИК вредност износила је 5,44 mg/ml). Ово је вероватно последица највећег садржаја камфора (85,3%), познатог антимикробног једињења, у овој фракцији у поређењу са осталима из ове групе. Неке друге фракције показале су активност при нижим концентрацијама, али у односу на ограничен број различитих изолата. Међу њима, она са најнижом МИК вредношћу (и самим тим најактивнија) била је Фр5 (просечна МИК=2,33 mg/ml), која је, упркос оваквој активности била неактивна на један S. aureus, један P. aeruginosa, оба S. pneumoniae и Klebsiella spp изолате. Ова фракција је састављена скоро искључиво од хамазулена (98,3%), који је и раније забележен као једињење коме је приписивана антимикробна ефикасност етарског уља (Božin et al., 2008; Msaada et al., 2015), иако није обезбеђен реалан доказ за такве тврдње у виду тестирања антимикробне активности чистог хамазулена. Након Фр5, најниже вредности инхибиторних концентрација имале су Фр3 (активна на 9 изолата), Фр2 (9 изолата), Фр8 (15 изолата), Фр11 (19 изолата), Фр4 (12 изолата) и Фр12 (19 изолата) са просечним МИК вредностима од 2,73, 3,96, 4,58, 4,61, 4,79 и 4,87 mg/ml, респективно. Међу преосталим фракцијама, оне које се истичу нижим антимикробним потенцијалом биле су Фр13, Фр14 и Фр1, а биле су активне само при највишим тестираним концентрацијама и то на лимитиран број сојева (8, 9 и 10 сојева, респективно). Анализа њиховог садржаја води закључку да присуство артемизија алкохола високо доприноси антимикробној ефикасности а да присуство јомоги алкохола има мали утицај на исту, јер су фракције богате овим 27

једињењем имале ниску активност у односу на све тестиране бактерије (Табела 7). Фракција Фр8, у којој је нађен висок садржај cis-хризантенил ацетата и артемизил ацетата, које су такође компоненте неселективних фракција Фр6 и Фр7, такође је показала антимикробни потенцијал. Као закључак, јасно је да артемизија алкохол у комбинацији са камфором (у случају његовог већег процентуалног учешћа), cis-хризантенил ацетатом и артемизил ацетатом представљају носиоце антимикробне активности етарског уља Otanthus maritimus. Са друге стране, хамазулен и trans-кариофилен, присутни у осталим активним фракцијама, не могу бити повезане са активношћу етарског уља због њиховог ниског процентуалног учешћа у саставу уља у односу на њихово учешће у тим фракцијама. Посматрајући осетљивост тестираних изолата, нема оних који се јасно истичу својом отпорношћу, али се може рећи да су сојеви S. aureus показали нешто већу осетљивост у односу на друге бактеријске врсте. Иако је у случају једног соја E. coli утврђена инхибиција при нижим концентрацијама, јасно је да је то постигнуто од стране само неколико смеши једињења (фракција), па се овај изолат не може сматрати изузетно осетљивим. Досадашња истраживања на тему антимикробне активности етарског уља O. maritimus показала су његов висок антимикробни потенцијал (Muselli et al., 2007; Basile et al., 2013; Cabral et al., 2013). У истраживању Muselli и сар. (2007), етарско уље које је као доминантне компоненте садржало јомоги алкохол, камфор, артемизија алкохол и артемизија ацетат показало је јаку антимикробну активност Campylobacter jejuni и S. aureus, слабу активност на Listeria innocua и E. coli, док је P. aeruginosa била резистентна на његово дејство. Међутим, пошто је ово истраживање рађено диск дифузионом методом, поређење активних концентрација са онима добијеним у овом истраживању није могуће. Горе поменуто истраживање испитало је и фракције овог уља, где је утврђено да су две фракције које су садржале артемизија алкохол (85%) и камфор (64,7%) имале највећи потенцијал у односу на врсту C. jejuni, док је фракција богата камфором имала најбољи ефекат на S. aureus. Иста студија демонстрирала је већу ефикасност јомоги алкохола у поређењу са артемизија алкохолом у односу на S. aureus, што није био случај у нашим резултатима. Такође, ови аутори су утврдили одсуство активности фракције која је била богата хамазуленом (80,9%) у односу на исту бактерију. Имајући у виду да је наша студија користила клиничке изолате 28

за тестирање, док је поменуто истраживање користило стандардни лабораторијски сој S. aureus (ATCC 6538), уочене разлике у активностима могу бити последица разлика у резистенцијама два соја стафилокока коришћених у овим истраживањима. У истраживању Basile et al. (2013) етарско уље је тестирано у односу на осам бактеријских врста, које су биле уређене у парове стандардних сојева и клиничких изолата истих врста (познатих по већој резистенцији у поређењу са стандардним сојевима). Антибактеријска активност обог уља утврђена је у опсегу концентрација од 0,007-0,250 mg/ml, што је знатно већа активност од оне утврђене за овде тестирано уље. Уље је испољило активност при 0,125 и 0,250 mg/ml на стандардни сој S. aureus и 0,031 и 0,062 mg/ml на клиничке изолате, што потврђује претходну тврдњу о већој резистенцији клиничких изолата. У конкретној студији, уље је садржало јомоги алкохол (29,8%), камфор (15,4%), артемизија алкохол (14,7%) и артемизија ацетат (7,3%) као главне компоненте (Basile et al., 2013). Такође, ово уље показало је и антифунгалну активност (0,063-0,250 mg/ml), што је за етарско уље исте врсте потврђено и у истраживању Cabral et al. (2013) на сојеве дерматофита. Посматрањем односа хемијски састав-антимикробна активност, нису утврђене никакве значајне разлике у саставу етарских уља овде проучаваног биљног материјала и претходно истраживаних етарских уља исте биљне врсте, осим нешто вишег садржаја камфора и нижег садржаја јомоги алкохола у нашем уљу. У нашим експериментима је утврђено да јомоги алкохол, који је очигледно био значајан као носилац активности у претходним студијама, није био тако ефикасан и у нашем истраживању, иако је на основу претходних резултата очекивано управо супротно. Још једно од могућих објашњења је резистенција клиничких изолата коришћених у нашем истраживању, а потврда ове отпорности су утврђене МИК вредности за стрептомицин, које су прилично високе за овај антибиотик и кретале су се у опсегу од 3,12-50,0 µg/ml. 29

5. ЗАКЉУЧАК На основу добијених резултата у овом истраживању можемо извести следеће закључке: 1. Етарско уље биљке O. maritimus добијено из свежег материјала методом хидродестилације имало је принос из цвасти 0,54±0,08 g, а принос уља из листова и стабљика био је 0,07±0,01 g. Било је плаве боје услед присуства хамазулена. 2. Минимална инхибиторна концентрација (МИК) етарског уља биљке O. maritimus на бактерије из респираторних изолата кретала се у опсегу од 2,5 до 10,0 mg/ml. Етарско уље показало је широк спектар антимикробне активности делујући на све изолате, осим на два соја E. coli, док је најбољи ефекат уље испољило на изолате P. aeruginosa. 3. У поређењу са контролним антибиотиком стрептомицином, етарско уље показало је слабију антимикробну активност, што је у складу са очекивањима. 4. Тестирање антимикробног потенцијала издвојених фракција уља показало је да артемизија алкохол у комбинацији са камфором (у случају његовог већег процентуалног учешћа), cis-хризантенил ацетатом и артемизил ацетатом представљају носиоце антимикробне активности етарског уља Otanthus maritimus. 30

6. Литература Adam, K., Sivropoulou, A., Kokkini, S., Lanaras, T., Arsenakis, M., 1998: Antifungal activities of Origanum vulgaresubsp. hirtum, Mentha spicata, Lavandula angustifolia, and Salvia Фрuticosa Essential Oils against Human Pathogenic Fungi.Јоurnal of agricultural and food chemistry,46:1739-1745. Adams, R.P., 2007: Identification of Essential Oil Components by Gas Chromatography- Mass Spectrometry, Allured Publishing Corporation, Carol Stream, IL, USA. Ahmad, A., Davies, J., Randall, J., Skinner, G., 1996: Antiviral properties of extract of Opuntia streptacantha. Antiviral Research, 30: 75-80. Aly A., H., Edrada-Ebel R., A., Indriani I., D., Wray V., Müller W., E., G., Totzke F., Zirrgiebel U., Schächtele C., Kubbutat M., H., G., Lin W., H., Proksch P., and Ebel R. 2008a: Cytotoxic metabolites from the fungal endophyte Alternaria sp. and their subsequent detection in its host plant Polygonum senegalense.journal of Natural Products,71:972 980. Aly A., H., Edrada-Ebel R., A., Wray V., Müller W., E., G., Kozitskaya S., Hentschel U., Proksch P., and Ebel R. 2008b: Bioactive metabolites from the endophytic fungus Ampelomyces sp. isolated Фрom the medicinal plant Urospermum picroides. Phytochemistry,69:1716 1725. Aricola, C., R., Campoccia, D., Speziale, P., Montanaro, L., Costerton, J., W. 2012: Biofilm formation in Staphylococcus implant infections. A review of molecular mechanisms i implications for biofilm-resistant materials. Biomaterials, 33: 5967-82. Ashurst, P., R. 1999: Food flavorings. Ashurst, P.R. (eds) Chapman and Hall, New York. Balunas, M.J., Kinghorn, A.D., 2005: Drug discovery from medicinal plants. Life Science, 78:431 441. Baser, K., H., C., Buchbauer, G., (Eds.). 2009: Handbook of esential oils: science, technology, and applications. CRC Press. Beatović, D., Jelačić, S., Oparnica, Č., Krstić- Milošević, D., Glamočlija, Ј., Ristić, М., Šiljegović, Ј. 2013: Hemijski sastav, antioksidativna i antimikrobna aktivnost еtarskog ulja Оcimum sanctum L. Chemical Industry/Hemijska Industrija, 67:3. 31

Binns S., E., Hudson J., Merali S., Arnason J., T. 2002: Antiviral Activity of Characterized Extracts Фрom Echinacea spp. (Heliantheae: Asteraceae) against Herpes simplex Virus (HSV-I). Planta Medica,68:780-783 Bohlmann. F., Suwrta, A. 1974: Weitere amide aus der tribus Anthemideae. Chemische Berichte, 107:1038-1043. Cabral C., Cavaleiro C., Gonçalves M., J., Cruz M., T., Lopes M., C., Salgueiro, L. 2013: Otanthus maritimus (L.) Hoffmanns. & link as a source of bioactive and fragrant oil. Industrial Crops and Products, 43:484 489. Christodoulopoulou, L., Tsoukatou, M., Tziveleka, L., A., Vagias, C., Petrakis, P., V., Roussis, V.J. 2005: Piperidinyl amides with insecticidal activity fрom the maritime plant Otanthus maritimus. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53:1435-1439. Cecanho, R., Koo, H., Rosalen, P., L.J., A., Park, Y., K., Cury J.Á. 1999. Efeito do extrato hidroetanólico de Mikania laevigata sobre o crescimento bacteriano e a produção de glucamos por estreptococcus do grupo mutans. Anais da XIV Reunião Anual da FESBE, 14:290. Candan F., Unlu M., Tepe B., Daferera D., Polissiou M., Sökmen A., H. 2003: Aşkin akpulat, Antioxidant and antimicrobial activity of the essential oil and methanol extracts of Achillea millefolium subsp. millefolium Afan. (Asteraceae), Science Direct, 87:215-220. Chamorro, E., R., Zambón, S., N., Morales, W., G., Sequeira, A., F., Velasco, G., A.. 2012: Study of the chemical composition of essential oils by Gas Chromatography. National Technical University, Argentina, 15:307-324. de Pascual Teresa, J., San Feliciano, A., Barrero, A., F., Medarde, M., Tomé, F. 1981. Sesquiterpene hydrocarbons from the roots of Otanthus maritimus. Phytochemistry, 20:166-167. Faran, C., E., Sekar, A., Balakrishnan, A., Shanmugam, S., Arumugam, P., Gopalswamy, J. 2013: Prevalence of biofilm- producing Staphylococcus epidermidis in the healthy skin of individuals in Tamil Nadu, India. Indian Journal of Medical Microbiology, 31:19-23. Фрank, L., A., Kania, S., A., Hnilica, K., A., Wilkes, R., P., Bemis, D., A. 2003: Isolation of Staphylococcus schleiferi from dogs with pyoderma. Journal of the American Veterinary Medical Association, 222:451-454. 32

Gazim Z., C., Rezende, C., M., Фрaga S., R., Svidzinski T., I., E., Cortez D., A., G.2008: Antifungal activity of the essential oil from Calendula officinalis L. (Asteraceae) growing in Brazil. Brazilian Journal of Microbiology, 39:61-63. Giron, L., Aguilar, G., Caceres, A., Arroyo, G. 1988: Anticandidal activity of plants use for the treatment of vaginitis in Guatemala and clinical trial of a 50 Solanum nigrescens preparation. Journal of Ethnopharmacology,22:307-313. Gordon, R., J., Lowy, F., D. 2008: Pathogenesis of methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection. Clinical infectious diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America, 46:350-359. Götz, F., Bannerman, T., Schleifer, K., H. 2006: The Genera Staphylococcus i Macrococcus. In: DWORKIN (ed.) The Prokaryots. Guillén, M., D., Cabo, N., Burillo, J. 1996: Characterization of the essential oils of some cultivated aromatic Plants of industrial interest. Journal of the Science Food and Agriculture, 70:359-363, Hermans, K., Devriese, L., A., Haesebrouck, F. 2004: Staphylococcus. In: Gyles, C., L., Prescott, J., F., Songer, J., G., Thoen, C., O. (eds.) Pathogenesis of Bacterial Infection in Animals. Ames: Blackwell Publishing. Hulin, V., Mathot, A., G., Mafart, P., Dufossé, L. 1998: Les proprietés anti-microbiennes des huiles essentielles et composés d'arômes. Sciences des Aliments., 18:563-582. Jahn, R.; Schönfelder, P. 1995: Exkursionsflora für Kreta. Verlag Eugen Ulmer: Stuttgart, Germany, p 315. Jakupovic, J., Boeker, R., Grenz, M., Paredes, L., Bohlmann, F., Seif El-Din, A. 1988: Highly oxygenated guaianolides from Otanthus maritimus. Phytochemistry,27:1135-1140. Jones, W., P., Chin, Y., W., Kinghorn, A., D. 2007: The role of pharmacognosy in modern medicine and pharmacy. Current Drug Targets, 7:247 264. Kenny, O., Smyth, T., J., Walsh, D., Kelleher, C., T., Hewage, C., M., Brunton, N., P. 2014: Investigating the potential of under-utilized plants from the Asteraceae family as a source of natural antimicrobial and antioxidant extracts. Food Chemistry, 161:79 86. Khafagy, S.M., Sabri, N.N., Salam N., A.A., Seif El-Din, A.A. 1979: Isolation of sesaminlike compound and acacetin 7-0 neohespendoside from Otanthus maritimus. Planta Medica, 35:186-187. 33

Khafagy, S., M., Sabri, N., N., Salam, N., A., A., Seif El-Din, A., A. 1981: On the constituents of Otanthus maritimus Hoffmanns et Link (Compositae). Pharmazie, 36:507-508. Kitić, D. 2010: Etarska ulja. Studentski Medicinski Glasnik,1:149-156. Koehn, F.E., Carter, G.T. 2005: The evolving role of natural products in drug discovery. Nature Reviews. Drug Discovery,4:206 220. Kovačević N. 2004: Osnovi farmakognozije. Treće izdanje. Srpska školska knjiga, Beograd. Mabry, J.T., Markham K.R., Thomas, M.B., 1970: The Systematic Identification of Flavonoids. Heidelberg, New York. Manian, F.A. 2003: Asymptomatic nasal carriage of mupirocin-resistant, methicillinresistant Staphylococcus aureus (MRSA) in a pet dog associated with MRSA infection in household contacts. Clinical infectious diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America,36: e26-28. Muselli, A., Rossi, P., G., Desjobert, J., M., Bernardini, A., F., Berti, L., Costa, J. 2007: Chemical composition and antibacterial activity of Otanthus maritimus (L.) Hoffmanns. & link essential oils from Corsica. Flavour and Fragrance Journal,22:217 223. Newman, D., J., Cragg, G., M., Snader, K., M. 2003: Natural products as sources of new drugs over the period 1981 2002. Journal of Natural Products, 66:1022 1037. Nikolić, М., Glamočlija, Ј., Ćirić, А., Мarković, Т., Мarković, D., Perić, Т., Soković, М. 2013: Chemical composition and antimicrobial activity of peppermint essential oil (Mentha piperita L.) Lekovite sirovine, 33:63-72. Okesola, A., O. 2011: Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus-- a review of literature. African journal of medicine and medical sciences,40:97-107. Paterson, I., Anderson, E., A. 2005: The renaissance of natural products as drug candidates. Science, 310:451 453. Perrett, S., Whitfield, P., Sanderson, L., Bartlett, A. 1995: The plant molluscidae Millettia thonningii (Leguminosae) as a tropical antischistomal agent. Journal of Ethnopharmacology, 47:49-54. 34

Quinn, P., J., Markey, B., K., Leonard, F., C., Fitzpatrick, E., S., Fanning, S., Hartigan, P., J. 2011: Staphylococcus species. Veterinary microbiology and microbial disease. Chichester West Sussex UK: Wiley-Blackwell. Reutter, L. 1923: Traité de matiére médicale et de chimie végétale. Librairie J.B. Baillière et Fils: Paris. p 829. Ruiu, S., Anzani, N., Orrù, A., Floris, C., Caboni, P., Maccioni, E., Distinto, S., Alcaro, S., Cottiglia, F. 2013: N-Alkyl dien- and trienamides from the roots of Otanthus maritimus with binding affinity for opioid and cannabinoid receptors. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 21:7074 7082. Rosenbach F.J. 1884: Microorganizmen bei den Wundinfektionskrankheiten des Menschen (a) p. 22; (b) p. 19. Sabrt, N., N., El-Saldm, N., A., A., Self Ei-Dtn, A., Khafagy, S., M. 1983: Sesquiterpene lactones of Otanthus maritimus. Phytochemistry, 22:201-202. Santoyo, S., Cavero, S., Jaime, L., Ibañez, E., Señoráns, F., J., Reglero, G. 2005: Chemical composition and antimicrobial activity of Rosmarinus officinalis L. essential oil obtained via supercritical fluid extraction. Journal of Food Protection, 68:790 795. Sülsen V., P., Фрank F., M., Cazorla S., I., Anesini C., A., Malchiodi E., L., Фрeixa B., at al. 2008: Trypanocidal and Leishmanicidal Activities of Sesquiterpene Lactones from Ambrosia tenuifolia Sprengel (Asteraceae). Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 52:2415-2419. Sasaki, T., Kikuchi, K., Tanaka, Y., Takahashi, N., Kamata, S., Hiramatsu, K. 2007: Reclassification of phenotypically identified Staphylococcus intermedius strains. Journal of Clinical Microbiology, 45:2770-2778. Sasaki, T., Tsubakishita, S., Tanaka, Y., Sakusabe, A., Ohtsuka, M., Hirotaki, S., Kawakami, T., Fukata, T., Hiramatsu, K. 2010: Multiplex-PCR method for species identification of coagulase-positive staphylococci. Journal of clinical microbiology, 48: 765-769. Tajkarimi, M., M., Ibrahim, S., A., Cliver, D., O. 2010: Antimicrobial herb and spice compounds in food. Food control,21:1199-1218. Teixeira da Silva, J., A. 2004: Mining the essential oils of the Anthemideae. African Journal of Biotechnology, 3:706-720. 35

Tsoukatou, M., Vagias, C., Harvala, C., Roussis, V. 2000: Essential oil and headspace analysis of the maritime Bombycilaena erecta and Otanthus maritimus species growing wild in Greece. Journal of essential oil research, 12:360 364. Tutin, T., G. 1976: Otanthus Hoffmanns. & Link. In: Tutin, T., G., et, al. (Eds.), Flora Europaea 4. Cambridge University Press, Cambridge, UK, p. 168. Van den Dool, H., Dec Kratz P. 1963: A generalization of the retention index system including linear temperature programmed gas- liquid partition chromatography. Journal of Chromatography, 11:463-471. Van Der Zee, A., Hendriks, W., D., Roorda, L., Ossewaarde, J., M., Buitenwerf, J. 2013: Review of a major epidemic of methicillin-resistant Staphylococcus aureus: the costs of screening and consequences of outbreak management. American journal of infection control, 41:204-209. Winslow, C., E., A., Rogers, Anne F. 1905: A revision of the Coccaceae. Science News, 21:669-672. Zaidan, M., R., Noor Rain, A., Badrul, A., R., Adlin, A., Norazah, A., Zakiah, I. 2005: In vitro screening of five local medicinal plants for antibacterial activity using disc diffusion method. Tropical Biomedicine, 22:165-170. 36

Редни број, РБР: Идентификациони број, ИБР: Тип документације, ТД: Тип записа, ТЗ: Врста рада, ВР: Аутор, АУ: Ментор, МН: Наслов рада, НР: ПРИРОДНO-MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА Монографска текстуални / графички мастер рад Невена Ђорђевић Зорица Стојановић- Радић Језик публикације, ЈП: Српски Језик извода, ЈИ: Енглески Земља публиковања, ЗП: Р. Србија Уже географско подручје, УГП: Р. Србија Година, ГО: 2018. Издавач, ИЗ: ауторски репринт Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33. Физички опис рада, ФО: 40 страна; 5 слика; 6 табела (поглавља/страна/цитата/табела/слика /графика/прилога) Научна област, НО: Биологија Научна дисциплина, НД: Микробиологија Предметна одредница/кључне речи,по: УДК етарско уље, Otanthus maritimus, aнтимикробна активност, респираторни изолати 581.192+615.322:582.998.16 Чува се, ЧУ: Библиотека Важна напомена, ВН: Извод, ИЗ: Циљ овог мастер рада био је испитивање хемијског састава етарског уља O. maritimus и његовог антимикробног деловања на бактерије из респираторних изолата. Процесом гасно- масене хроматографије утврђен је хемијски састав етарског уља, док је хроматографијом издвојено 14 фракција различитог хемијског састава. Установљено је да у уљу има 26 компоненти које чине 93,2% укупног хемијског састава овог уља. Главне компоненте овог уља биле су: камфор (23,5%), јомоги алкохол (22,9%) и артемизија алкохол (18,6%). Антимикробна активност испитана је одређивањем минималне инхибиторне концентрације (МИК) микродилуционом методом. Минималне инхибиторне концентрације кретеле су се у распону од 2,5 до 10 mg/ml. Тестирање антимикробне активности фракција показало је да артемизија алкохол у комбинацији са камфором (у случају његовог већег процентуалног учешћа), cisхризантенил ацетатом и артемизил ацетатом представљају носиоце антимикробне активности етарског уља Otanthus maritimus Датум прихватања теме, ДП: Датум одбране, ДО: Чланови Председник: Др Члан: Др Члан, Ментор: Др 37

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ KEY WORDS DOCUMENTATION Accession number, ANO: Identification number, INO: Document type, DT: Type of record, TR: Contents code, CC: Author, AU: Mentor, MN: Title, TI: Monograph textual / graphic master thesis Nevena Đorđević Zorica Stojanović- Radić Language of text, LT: Serbian Language of abstract, LA: English Country of publication, CP: Republic of Serbia Locality of publication, LP: Serbia Publication year, PY: 2018. Publisher, PB: author s reprint Publication place, PP: Niš, Višegradska 33. Physical description, PD: 40 p.; 5 pictures; 6 tables Scientific field, SF: Scientific discipline, SD: Subject/Key words, S/KW: UC Holding data, HD: Biology Microbiology essential oil, Otanthus maritimus, antimicrobial activity, respiratory isolates Note, N: Abstract, AB: The aim of this study was to examine the chemical composition of essential oil O. maritimus and its antimicrobial action on bacteria obtained from respiratory swabs of human origin. By the process of gas-mass chromatography, the chemical composition of the essential oil was determined, and the chromatography of the oil separated 14 fractions of different chemical composition. It has been found that 26 components make up 93.2% of the total chemical content of this oil. The main components of this oil were: camphor (23.5%), jomogi alcohol (22.9%) and artemisia alcohol (18.6%). Antimicrobial activity was tested by determining the minimum inhibitory concentration (MIK) using the microdilution method. Minimal inhibitory concentrations ranged from 2.5 to 10.0 mg/ml. Testing the antimicrobial activities of the obtained fractions showed that artemisia alcohol in combination with camphor (in case of its higher percentage participation), cis-chrysantenyl acetate and artemisyl acetate are the carriers of the antimicrobial activity of the Otanthus maritimus essential oil. Accepted by the Scientific Board on, Defended on, DE: Defended President: Dr. Member: Dr. Member, Dr. 38