Struktura i funkcija nukleinskih kiselina

Struktura i funkcija nukleinskih kiselina

MOLEKULARNA OSNOVA NASLJEDNOSTI Vaša boja kose, visina, krvna grupa i sposobnost da metabolizirate hranjive materije su sve nasljedne osobine. Ove karakteristike su rezultat određenih gena koje ste naslijedili od vaših roditelja.

Godine 1958, Francis Crick je predložio odnos između DNA, RNA i proteina koji je on nazvao»centralna dogma (načelo) molekularne biologije«. On kaže da DNA određuje, diriguje formiranje svoje vlastite kopije (replikacija) i prenos genetske informacije sa DNA na RNA (transkripcija). RNA upravlja prenosom ove genetske informacije na aminokiselinski lanac proteina (translacija). Ovo načelo važi za sve ćelije, ali najnovija istraživanja otkrivaju izuzetke od ovog pravila.

Nukleinske kiseline DNA deoksiribonukleinska kiselina, ima jedinstvenu ulogu kao genetička tvar, smještena u jezgru kod eukariotskih stanica. RNA ribonukleinska kiselina, ima nekoliko tipova mrna glasnička nosi informaciju od DNA do ribosoma gdje služi kao kalup za sintezu proteina Ribosomna RNA i transportna RNA učestvuju u sintezi proteina Ostali tipovi RNA su uključeni u doradu i prenos ribonukleinskih kiselina i proteina. Osim što djeluje kao informacijska molekula, može katalizirati neke reakcije. 4

DNA i RNA su nukleotidni polimeri koji sadrže pirimidinske i purinske baze vezane za fosforilirane šećere. pirimidin purin

Baze koje se javljaju kod DNA i RNA su izvedene iz heterocikličnih spojeva; purina i pirimidina.

Nukleinske kiseline DNA sadrži dva purina (adenin i gvanin) i dva pirimidina (citozin i timin), RNA umjesto timina sadrži uracil. 7

Nukleinske kiseline Purinske i pirimidinske baze vezane su za fosforilirane šećere, ribozu u RNA i 2 -deoksiribozu u DNA. 8

Nukleinske kiseline Baza nukleinske kiseline vezana samo na šećer je nukleozid. Nukleotidi dodatno sadrže jednu ili više fosfatnih skupina vezanih na 5 -ugljik nukleozidnog šećera. 9

Nukleinske kiseline Polimerizacija nukleotida podrazumjeva stvaranje fosfodiestarskih veza između 5 -fosfata jednog nukleotida i 3 -hidroksila drugog nukleotida. Nastali lanac je usmjerena molekula: jedan kraj završava 5 -fosfatnom skupinom (5 -kraj), a drugi 3 -hidroksilnom skupinom (3 -kraj). 10

Nukleinske kiseline Polinukleotidi se uvijek sintetiziraju u smjeru od 5 ka 3, tako da se slobodni nukleotid dodaje na 3 -OH skupinu rastućeg lanca, pa se dogovorno smjer baza u DNA i RNA ispisuje u smjeru 5 prema 3. Informacija u DNA i RNA opisuje se slijedom baza u polinukleotidu 11

Nukleinske kiseline DNA je dvostruka molekula koja se sastoji od dva suprotno usmjerena polinukleotidna lanca. Baze se nalaze na unutrašnjoj strani, pa vodikove veze između komplementarnih parova baza povezuju dva lanca. 12

Nukleinske kiseline Adenin se sparuje s timinom, a gvanin s citozinom. Jedan lanac može djelovati kao kalup koji usmjerava sintezu komplementarnog lanca Nukleinske kiseline imaju jedinstvenu sposobnost samoreplikacije 13

Nukleinske kiseline Informacijski sadržaj u DNA i RNA usmjerava sintezu specifičnih proteina koji nadziru većinu staničnih aktivnosti. Nukleotidi imaju i druge uloge u staničnim procesima, npr: Adenozin-5 -trifosfat ATP, je glavni oblik hemijske energiju u stanicama. Ciklički adenozin monofosfat camp, predstavlja važnu signalnu molekulu 14

Nukleinske kiseline otkrio je Miescher 1869. godine u različitom biološkom materijalu. Nukleinske kiseline imaju značajnu ulogu u formiranju, čuvanju i prenošenju genetskih informacija. Javljaju se prvenstveno u jezgri stanice, ali ih ima i u staničnoj citoplazmi. Pri fiziološkom ph predstavljaju polianione.

Nukleinska kiselina Parcijalna hidroliza Hidrolitička razgradnja nukleinskih kiseina Nukleotid Nukleozid + fosfatna kiselina Parcijalna hidroliza Potpuna hidroliza D-riboza i baza

Pri fiziološkom ph, na sobnoj temperaturi, veoma su viskoznih karakteristika; povećanjem temperature i promjenom ph dolazi do denaturacije. Pod denaturacijom se podrazumeva narušavanje sekundarne strukture tako da se dvolančani DNA molekul razdvaja na dva polinukleotidna lanca. Denaturacijom DNA raskidaju se H-veze i hidrofobne veze, razmotava se dvostruki heliks, a polinukleotidni lanci se potpuno razdvajaju. Temperatura denaturacije različita je za svaku DNA i zavisi od sastava baza; (DNA bogate guaninom i citozinom imaju višu temperaturu denaturacije i veću stabilnost, od onih sa timinom i adeninom). tri H-veze dvije H-veze

Najpovoljniji način za praćenje stanja DNA je UV spektroskopija. Nakon denaturacije UV apsorpcija, koja potiče od aromatičnih baza raste za oko 40% pri svim talasnim dužinama. Ovaj fenomen poznat je kao hiperhromni efekat i rezultat je narušavanja elektronskih interakcija između naspramnih baza, prati se na određenoj talasnoj dužini obično oko 260 nm i javlja se u uskom intervalu. Ako se rastvor denaturirane DNA ubrzano hladi nastala DNA će biti samo sa djelimično uparenim bazama, a ako se temperatura postepeno snižava, moguće je da se ponovo uspostavi gotovo prirodna struktura. Pod odgovarajućim uslovima može doći do renaturacije, tj. do ponovnog spajanja komplementarnih lanaca DNA. Procesi denaturacije i renaturacije odigravaju se i u stanici pod kontrolisanim uslovima i u ograničenom obimu. Ti procesi predstavljaju neophodan preduslov za normalno funkcionisanje DNA.

Utvrđeno je postojanje i kružnih DNA i to da neke od njih imaju poseban izgled koji se naziva superspirala. Nastajanje superspirale je posljedica biološki važnih topoloških svojstava kovalentno zatvorenih duplih DNA. Nizovi su vezani tako da grade kružni molekul.

Uloga DNA Prenos i čuvanje genetskih informacija i kontrola sinteze proteina. Gen je segment molekula DNA koji sadrži informaciju potrebnu za upravljanje sintezom jednog polipeptida ili proteina.

Poznavanje trodimenzionalne strukture DNA koju su 1953. godine otkrili James Watson i Francis Crick temelj je savremene molekularne biologije. Analiza tih podataka otkrila je da je molekula DNA uzvojnica koja čini zavoje od 3,4 nm. Podaci su pokazali i da je razmak iz među susjednih baza 0,34 nm, prema tome se jedan zavoj uzvojnice sastoji od 10 parova baza. Važno je otkriće bilo da je promjer uzvojnice približno 2 nm, što je upućivalo na to da se molekula DNA sastoji od dva, a ne od jednoga lanca DNA.

Na osnovu kristalografskih podataka, Watson i Crick su izgradili svoj model DNA.

Baze su smještene u unutrašnjosti molekule i orjentirane tako da se vodikove veze stvaraju između nasuprotnih baza. Sparivanje baza je uvijek specifično. Analizom sastava baza u različitim molekulama DNA utvrđeno je da količina adenina uvijek jednaka količini timina, a količina gvanina jednaka količini citozina. Zbog specifičnog su sparivanja baza dva lanca molekule DNA komplementarna i svaki lanac sadržava cjelokupnu informaciju potrebnu za određivanje slijeda baza u drugom lancu.

Najznačajnija uloga nukleotida u organizmu je što predstavljaju gradivnu jedinicu nukleinskih kiselina i na taj način učestvuju u molekularnim mehanizmina kojima se genetičke infomacije čuvaju i prenose pri procesima replikacije i transkripcije. Imaju značajne funkcije u održavanju vitalnih karakteristika ćelije u intermedijarnom metabolizmu i reakcijama energetske transformacije. Neki služe kao koenzimi, pri čemu učestvuju u prenošenju acetata, šećera, amina i drugih molekula.

Nukleinske kiseline sintetiziraju se iz nukleotida pri čemu DNA-polimeraza katalizira sintezu DNA, RNA polimeraza sintezu RNA. RNA i DNA su polimeri nukleozidnih monofosfata. Kao i za druge makro molekule, direktna polimerizacija nukleozidnih monofosfata energetski je nepovoljna, pa sinteza polinukleotida umjesto njih koristi nukleozidne trifosfate kao aktivirane preteče.

Dva se lanca roditeljske DNA razdvajaju i svaki od njih služi kao kalup za sintezu po jednoga novoga lanca. Na taj način nastaju dvije nove, potpuno identične molekule DNA. Slijed nukleotida u novonastalim lancima DNA određen je komplementarnim sparivanjem baza.

Replikacija DNA Otkriće komplementarnog sparivanja baza između dvaju lanaca u molekuli DNA dalo je odgovor na pitanje kako genetički materijal može upravljati svojom vlastitom replikacijom. Dva razdvojena lanca mogu poslužiti kao kao kalup za sintezu novog komplementarnog lanca čiji bi slijed bio određen specifičnim sparivanjem baza, semikonzervativna replikacija.

Bakterije uzgajane u mediju koji je sadržavao izotop dušika (14N) prenesene su u medij koji sadržava teški izotop dušika (15N) te su tu uzgajane tokom nekoliko generacija. Zatim su prenesene ponovo u medij s 14N dušikom i uzgajane tokom jedne dodatne generacije. DNA izolirana iz tih bakterija analizirana je ravnotežnim ultracentrifugiranjem u otopini CsCl. Izložen velikom gravitacijskom polju CsCl sedimentira i tvori gradijent gustoće, a molekule DNA tvore vrpcu na položaju gdje je njihova gustoća jednaka gustoći otopine CsCl. DNA bakterija prenesenih iz 15N medija u 14N medij tokom vremena koje je omogućilo samo jednu dodatnu replikaciju tvori vrpcu čija je gustoća između gustoća 15N DNA i 14N DNA, što upućuje na to da se radi o hibridnoj molekuli koja se sastoji od jednoga teškog i jednoga lakog lanca.

Iako slijed nukleotida u DNA određuje slijed aminokiselina u proteinu, za samu sintezu je potreban je posrednik. DNA se nalazi u jezgri, a sinteza proteina se dešava u citoplazmi. RNA igra ulogu ovog posrednika, jer se RNA sintetizira na osnovu DNA kalupa. RNA je jednočlana, šećerna komponenta je riboza, i sadrži uracil umjesto timina.

RNA se sintetizira na osnovu DNA- kalupa = prepisivanje ili transkripcija Transkripcija je proces prepisivanja i prenošenja genetskih informacija, koji započinje u jedru, sintezom mrna, a završava u citoplazmi, na ribosomima na kojima se odvija sinteza proteina.

Proteini se sintetiziraju na osnovu RNA-kalupa = prevođenje ili translacija Osim mrna, za sintezu proteina važna su dva druga tipa RNA- ribosomna (rrna), koja je sastavni dio ribosoma i transportna RNA (trna), koja djeluje kao adaptor koji donosi aminokiseline na RNA-kalup.

Mogućnost reprodukcije osnovna je osobina svih živih bića. Svi organizmi genetičku informaciju, koja određuje njihovu strukturu i funkciju, nasljeđuju od svojih roditelja. Sve stanice nastaju iz prethodno postojećih stanica i nužno je da se genetički materijal umnoži i podijeli pri svakoj podjeli stanice.

GENETIČKA UPUTA (genetički kod) - informacija o rasporedu baza u molekulama DNA. Tri nukleotida koje nazivamo trojka ili triplet čine osnovu takve upute, a svaki triplet prepisan s DNA na mrna naziva se kodon ili kod. Tok genetičke informacije prepoznajemo kao središnju dogmu molekularne biologije DNA RNA protein Svaki kodon odgovara pojedinoj aminokiselini, te na taj način DNA preko mrna određuje ugradnju pojedinih aminokiselina u specifičnu vrstu proteina. Pri tome je važno napomenuti da isti kodon (triplet) kodira istu aminokiselinu bez obzira događa li se to kod virusa, bakterija, biljaka ili čovjeka.

Na koji je način moguće informaciju sadržanu u slijedu četiri različita nukleotida prevesti u slijed 20 različitih amino kiselina u proteinima? 20 različitih amino kiselina potrebno je odrediti pomoću svega četiri nukleotida, bilo je nužno da najmanje tri nukleotida budu uključena u kodiranje svake amino kiseline. Korišteni pojedinačno, četiri nukleotida mogli bi kodirati svega četiri amino kiseline, a korišteni u parovima, svega šesnaest (4 2 ) amino kiselina. Korišteni u obliku tripleta četiri nukleotida mogu kodirati 64 (4 3 ) različite amino kiseline, što je više nego dovoljno za 20 različitih aminokiselina koje izgrađuju proteine.

U sastav čovječijeg organizma ulazi ukupno 20 aminokiselina. 10 od njih se mogu izgraditi u samom organizmu, dok je preostalih 10 neophodno unijeti kroz ishranu. Aminokiseline koje čovjekov organizam nije u stanju napraviti, a neophodne su za njegovo funkcioniranje se nazivaju esencijalne aminokiseline Mnoge biljke i bakterije mogu sintetizirati svih 20 aminokiselina. Ljudi i drugi sisari mogu sintetizirati 10 aminokiselina, a ostale moraju unositi hranom.

Proces traskripcije i translacije. RNA se fromira kao linearan slijed aminokiselina, koji se naknadno savija u trodimenzionalnu formu proteina. Tokom transkripcije četiri nukleotida DNA (adenina, citozina, gvanina i timina) se prepisuju u formu mrna, koja se sastoji od adenina, citozina, gvanina i uracila.

Razlike između sinteze proteina kod prokariota i eukariota

Genetički kod se čita u nizu 5` ka 3`, što predstavlja kodon ili triplet. Antikodon na trna formira parove komplementarnih baza sa kodonom na mrna.

Rekombinantna DNA osnove

Ljudi su od davnina još prije razvoja moderne nauke, nakon što su prestali prvenstveno biti lovci i sakupljači, provodili genetičko inženjerstvo - stalnim probirom i mješanjem odabranih jedinki. Tako su nastale razne pasmine domaćih životinja i poljoprivredne sorte. 1970-ih prvi eksperimenti stvaranja i manipulacije rekombinantne DNA u svrhu kloniranja DNA u laboratorijima Paula Berga, Herberta Boyera i Stanleya Cohena (Stanford University i University of California u San Francisco-u); time je započela revolucija rekombinatne DNA. 41

Tehnike rekombinantne DNA proizašle su iz mnogobrojnih otkrića u području genetike, biohemije, stanične biologije i fizikalne hemije. Uticaj tehnologije rekombinantne DNA na medicinu: bolje razumijevanje nastanka bolesti, razvoj dijagnostike, otkriće novih lijekova, novih vrsta liječenja i vakcina 42

Uvod Prije više oko 40 godina je objavljen prvi rad o spajanju in vitro dviju molekula DNA, koje su poticale od različitih organizama, u jednu jedinstvenu molekulu. Tehnike koje su omogućile spajanje dijelova DNA iz različitih organizama i njihovo unošenje u različite domaćine nazvane su tehnologija rekombinantne DNA ili genetičko inženjerstvo. 43

Definicije i pojmovi Genetičko inženjerstvo (tehnologija rekombinantne DNA) predstavlja dobivanje novih hibridnih nasljednih materijala izvan stanice i njihovo spajanje s prenositeljem (virusom, plazmidom ili drugim), čime se omogućava njegovo unošenje u organizam domaćina u kojem one prirodno ne postoje, ali u kojem se mogu umnožavati. Prenositelj se često naziva i vektor, a umnožavanje kombinirane (hibridne) molekule DNA unesene u domaćina kloniranje. 44

Definicije i pojmovi Transgena biljka ili životinja je organizam koji u svom genomu ima ugrađenu rekombinantnu molekulu DNA, a koja se nasljeđuje u tom organizmu prema Mendelovim zakonitostima kao dominantna. Transgeneza je metoda i postupak kojom se postiže transgena jedinka. Organizam s ugrađenim stranim genom u svom genomu naziva se genetski modificirani organizam (GMO). 45

Definicije i pojmovi Klon (grčki klon, grana, ogranak, kalem, podmladak) označava skupinu jedinki ili pojedinih organizama, nastalih aseksualnim razmnožavanjem, iz jedne seksualnim načinom dobivene jedinke. Kloniranje je postupak dobivanja populacije klonskih jedinki. 46

Vegetativno razmnožavanje kod biljaka je razmnožavanje pomoću vegetativnih organa koji se odvajaju od roditeljske biljke i iz njih se razvije nova biljka. Npr. jagode se nespolno razmnožavaju vriježama Iz pojedinih dijelova biljke (stabljika, korijen, list) mogu se razvititi (regenerirati) čitave biljke. Npr. Tako se razmnožavaju ukrasne biljke (afrička ljubičica) Potomci vegetativnog razmnožavanja su genetički identični (klonovi). 47

Tehnologija rekombinantne DNA predstavlja niz molekularnogenetičkih metoda uz pomoć kojih je moguće mijenjati nasljednu tvar stanice. Razdoblje rekombinantne DNA tehnologije započelo je otkrićem restrikcijskih enzima, 1978. dodijeljena je Nobelova nagrada za fiziologiju i medicinu W. Arberu, H. Smithu i D. Nathansu za njihov rad na otkriću restrikcijskih enzima (endonukleaza). 48

Restrikcijske endonukleaze su enzimi koje bakterija koristi za razgradnju strane DNA (virusne). Enzim prepoznaje određenu nukleotidnu sekvencu (restrikcijsko mjesto) od 4 do 8 nukleotidnih parova, te cijepa na tom mjestu (ili u neposrednoj blizini) dvolančanu DNA. Rekombinantna DNA bilo koja umjetno stvorena molekula DNA koja nastaje povezivanjem sljedova DNA koji se obično ne nalaze zajedno u prirodi 49

Poznata su tri tipa restrikcijskih endonukleaza (prema vrsti sekvence koju prepoznaju, prirodi cijepanja DNA i strukturi enzima). Restrikcijske endonukleaze tipa I i III nisu pogodne za kloniranje gena, jer cijepaju DNA na mjestima koja nisu restrikcijska. Tip II endonukleaze prepoznaje tačno određena restrikcijska mjesta. Radi se o obrnuto ponavljajućim sekvencama ili palindromima 50

Saznanja o enzimima koji mogu cijepati, sintetizirati i međusobno povezati DNA kao i rezultati molekulskogenetskog istraživanja bakterija, bakterijskih virusa, životinjskih i biljnih virusa, omogućili su razvoj postupaka kojima se mogu dijelovi DNA, izolirani in vitro, ugrađivati u strani genom i tamo razmožavati. Postupak se sastoji od izolacije strane DNA te izrezivanja željenog fragmenta (gena) pomoću restrikcijskih enzima, njihove ugradnje u vektorsku DNA (uz pomoć enzima ligaze). 51

Cirkularna DNA plazmida, pomoću restrikcijskog enzima se otvara tako da na krajevima nastaju privjesci od jednostrukih niti sposobnih za sparivanje baza. Kada se strana DNA, cijepanjem pomoću istog restrikcijskog enzima otvori tako da nastaju krajevi koji su sposobni da sparuju baze s krajeva plazmidne DNA, tada se obje vrste mogu kombinirati. Djelovanjem ligaza krajevi se međusobno povežu, pa se plazmid može razmnožiti u bakteriji. 52

Kao stanica domaćin najčešće se koristi bakterija E. coli u koju se unose vektori sa željenim genima čijom ekspresijom nastaju velike količine proteinskih produkata. Takve genetički promijenjene bakterije koriste se za proizvodnju lijekova (antibiotici), cjepiva i drugih supstanci za liječenje te laboratorijska istraživanja. Također se mogu koristiti za čišćenje okoliša od zagađivača, za obogaćivanje tla, za ubijanje kukaca, nametnika, itd. 53

Ubacivanje ljudskog gena u plazmidnu DNA; rekombinantni plazmid umnožava se u bakterijskoj stanici te se u određenom trenutku strani gen prepisuje i prevodi u polipeptidni produkt. 54

Da bi se konstruisala DNA biblioteka potrebno je izolirati bakterijsku DNA i razbiti je na fragmente, koji se trebaju ugraditi u plazmide. 55

Bakterijska DNA mora biti izrezana na manje fragmente. To se postiže pomoću restrikcionih endonukleaza, a i plazmidi moraju biti otvoreni na identičan način, kako bi bili sposobni prihvatiti bakterijsku DNA. Restrikcioni enzimi režu bakterijsku DNA na mnogo fragmenta, dok plazmid režu samo na jednom mjestu. 56

Nakon ugrađivanja DNA u plazmid ovaj novonastali plazmid se ubacuje u bakterijsku stanicu. Potrebno je stanicu izložiti električnom šoku kako bi se plazmid ubacio u stanicu gdje nastupa njegova replikacija. Nakon izolacije rekombinantnog bakterijskog klona on se provjerava na podlozi sa odgovarajućim antibiotikom gdje se stavaraju kolonije 57

Primjena rekombinantne DNA u medicni Proizvodnja velikih količina različitih supstanci za liječenje različitih bolesti (inzulin, hormon rasta, faktori rasta, faktori zgrušavanja te cjepiva protiv hepatitisa B, herpesa,bjesnoće). Dijagnostika (proizvodnja različitih protutijela). Sekvenciranje humanog genoma identifikacija gena za različite bolesti. Genska terapija 58

Primjena rekombinantne DNA u poljoprivredi Proizvodnja biljaka otpornih na herbicide, sušu, hladnoću, visoku temperaturu, preveliku količinu soli, loše uvjete skladištenja i transporta; biljke bolje prehrambene vrijednosti. Trenutno su na tržištu dostupne različite vrste genetički preinačenih biljaka poput soje, riže, kukuruza, krompira, duhana, pamuka, dinje i dr. 59

Primjena rekombinantne DNA u industriji Genetički modificirane bakterije koje razgrađuju toksični otpad. Genetički modificirani kvasci koji koriste celulozu za proizvodnju glukoze i alkohola za gorivo. Uzgoj algi u marikulturi. Poboljšanje metoda u prehrambenoj industriji. 60

KLONIRANJE Danas rutinska procedura Važno za istraživanje razvojnih procesa u organizmu stvaranje transgeničnih organizama istraživanje ekspresije gena istraživanje procesa starenja istraživanja interakcije genoma i citoplazme Rekombinantna DNA tehnologija je vrlo korisna i potrebna, ali njena primjena zahtijeva oprez te postavlja mnoga etička pitanja: npr. kloniranje organizama (čovjek?), kloniranje stanica, tkiva i organa u terapijske svrhe. 61

Izbor gena Prije namjernog izdavajanja i umnožavanja određenog dijela DNA potrebno ga je identificirati. Za identifikaciju se koriste postupci hibridizacijske analize. (Hibridizacija-postupak stvaradnja hibrida. Nukleinske kiseline koje su međusobno srodne tj. koje u velikom dijelu molekule posjeduju komplementarnu sekvenciju baza, mogu se spojiti u dvostruku uzvojnicu, izgrđenu od po jedne niti svake nukleinske kisline). 62

Genska biblioteka DNA iz čije se raznolikosti, primjenom opisanog postupka hibridizacije, odabiru pojedini fragmenti, koji se dalje analiziraju, može biti u različitim oblicima. 1. Može se cijeli genom ispitivanog organizma razrezati u velike fragmente koji se tada ugrađuju u DNA vektora na mjestu ustupljenog odsječka genoma. Nakon infekcije, moraju se identificirati postupkom hibridizacije oni rekombinantni genomi bakteriofaga koji sadrže traženi segment DNA. 63

Genska biblioteka 2. Može se nakon obrade restrikcijskim enzimom, fragmente ispitivanog genoma direktno ugraditi u plazmide i naknadno selekcionirati 3. Moguća je i DNA sinteza in vitro očitavanjem redosljeda baza sa RNA. Ovaj postupak omogućava sintezu DNA koja je komplementarna informacijskoj RNA, pa se i zove komplemantarna DNA čija je skraćenica cdna. 64

Vektor DNA molekule u koje se ugrađuju strane DNA. To mogu biti bakterijski plazmidi ili DNA bakteriofaga. Stanice domaćina Su najčešće bakterije u kojima se razmnožavaju plazmidi ili bakteriofagi i identificiraju postupcima hibridizacije ili dodatkom genskog produkta. Bakterijski sojevi koji se koriste za to toliko su izmjenjeni da mogu živjeti samo u utvrđenim laboratorijskim uslovima, tako da je praktično isključeno njihovo razmnožavanje izvan laboratorija 65

66

67

Kloniranje DNA Klon = identična kopija; velik broj stanica ili molekula identičnih jednoj početnoj stanici ili molekuli. Kloniranje DNA uključuje 5 osnovnih postupaka: 1. Rezanje DNA na tačno određenim mjestima. Molekulske makaze su endonukleaze specifične za pojedine sljedove (restrikcijske endonukleaze). 2. Odabiranje male molekule DNA sposobne za samoumnažanje. Ove DNA nazivaju se klonirajući vektori (vektor u smislu prenositelja). To su obično plazmidi ili virusne DNA. 3. Kovalentno povezivanje dvije molekule DNA. Molekulsko ljepilo je DNA-ligaza koja povezuje klonirajući vektor s DNA koju treba klonirati. Kompozitne (složene) molekule DNA koje sadrže kovalentno vezane odsječke iz dva ili više izvora nazivaju se rekombinantne DNA. 4. Unos rekombinantne DNA u stanicu domaćina koja osigurava enzimsku mašineriju za umnažanje (replikaciju) DNA. 5. Probiranje (selekcija) ili identifikacija stanica domaćina koje sadrže rekombinatnu DNA. 68

Skup enzima važnih u tehnologiji rekombinantne DNA - proizašlih tokom desetljeća istraživanja metabolizma nukleinskih kiselina. 69