Glasnik hemičara, tehnologa i ekologa Republike Srpske, 13 (2017) 7-14 Promjene proteinskih profila u domaćim fermentisanim kobasicama sa dodatkom pro

Glasnik hemičara, tehnologa i ekologa Republike Srpske, 13 (2017) 7-14 Promjene proteinskih profila u domaćim fermentisanim kobasicama sa dodatkom proteina surutke i soje tokom čuvanja Ana Velemir * 1, Snježana Mandić 1, Ivan Samelak 2, Zoran Kukrić 1 1 Univerzitet u Banjoj Luci, Tehnološki fakultet 2 Univerzitet u Banjoj Luci, Prirodno-matematički fakultet ISSN 2232-755X UDC: 637.521.4.04:664.8.035 DOI: 10.7251/GHTE 1713007V Originalni naučni rad Rad primljen: 29.03.2017. Rad prihvaćen: 31.10.2017. Rad dostupan od 20.12.2017. na https://glasnik.tf.unibl.org/ Ključne riječi: fermentisane kobasice, sarkoplazmatični i miofibrilarni proteini, proteini soje i surutke. Proteoliza sarkoplazmatičnih i miofibrilarnih proteina je vrlo važna biohemijska pojava koja se javlja u toku zrenja fermentisanih proizvoda od mesa. Kao rezultat aktivnosti proteinaza i peptidaza, povećava se sadržaj polipeptida, peptida i slobodnih aminokiselina, koji učestvuju u razvoju mirisa, ukusa i teksture. SDS-PAGE elektroforezom analizirani su proteinski profili domaćih fermentisanih kobasica sa dodatkom 0,5% i 1,5% izolata surutke i soje. Pripremom uzoraka razdvojene su sarkoplazmatične i miofibrilarne frakcije. Denzitometrijski su preračunate molekulske mase proteina. Praćene su kvalitativne promjene proteina nadjeva, kobasica nakon zrenja i tokom šestomjesečnog čuvanja vakuum pakovanih uzoraka na temperaturi od +4 C. Biohemijske promene, u osnovi, se malo razlikuju. Dinamika promjene elektroforetskih profila sarkoplazmatičnih i miofibrilarnih proteina, pokazuju veoma slične tendencije. Elektroforetska slika miofibrilarnih proteina nadjeva prije punjenja u crijeva nam pokazuje da su prisutni proteini od 12 kda do 105 kda, kod uzoraka sa dodacima proteina surutke i soje je vidljiv manji broj proteinskih frakcija u istom opsegu. U nadjevu svih uzoraka prisutan je veoma veliki broj sarkoplazmatičnih proteinskih frakcija, koje se kreću od 9 kda do 110 kda. Tokom zrenja dolazi do progresivne degradacije miofibrilarnih proteina, ali i do degradacije sarkoplazmatičnih proteina visokih molekulskih masa. Nakon šest mjeseci domaća fermentisana kobasica i kobasice sa dodatkom proteina soje imaju očito smanjenje broja frakcija, i identičan profil, dok su kod uzoraka sa dodatkom proteina surutke primjetne frakcije kojih nema u ostalim uzorcima. UVOD Procesi fermentacije i sušenja predstavlja jednu od najstarijih tehnika za očuvanje mesa, a kobasice jedan od najstarijih proizvoda od mesa. Tradicija proizvodnje suvih, fermentisanih kobasica u Evropi datira još iz vremena starog Rima, a potiče iz oblasti Mediterana (Singh et al., 2012; Talon et al. 2007; Urso et al., 2006), odakle se proširila na Njemačku, Mađarsku i druge zemlje, uključujući SAD, Argentinu i Australiju (Talon et al. 2007). Današnja Evropa je i dalje glavni proizvođač i potrošač suvo fermentisanih kobasica (Demeyer, 2004). Tradicionalno, proizvodnja se odvijala u hladnijem dijelu godine, pošto su za fermentaciju, sušenje i zrenje potrebne relativno niske temperature. Danas su ovi uslovi obezbijeđeni u klimatizovanim pogonima, pa proizvodnja nije više uslovljena klimatskim uslovima. Proizvodnja fermentisanih kobasica podrazumijeva pripremu nadjeva, koja počinje odabirom i pripremom sirovina. Zajedno sa mesom i masnim tkivom, kao osnovnim sastojcima, u proizvodnji fermentisanih kobasica koriste * Korespondentni autor: Ana Velemir, Univerzitet u Banjoj Luci, Tehnološki fakultet, Stepe Stepanovića 73, Banja Luka; email: ana.velemir@tf.unibl.org se i drugi sastojci, od kojih su neki apsolutno neophodni, kao so i začini, dok se drugi koriste u zavisnosti od specifičnosti samog proizvoda. Mliječni proizvodi se često koriste kao dodaci za poboljšanje funkcionalnih svojstava proizvoda od mesa. Dodavanje proteina mlijeka ima veliki uticaj na teksturu proizvoda od mesa, zavisno od dodane količine nastali proizvod može biti elastičan, pri nižim koncentracijama proteina, ili suv pri većim koncentracijama (Abdolghafour & Saghir, 2014). Rastvorljivi mliječni proteini, koncentrat proteina surutke i djelomično hidrolizovani kazein, koriste se i za mariniranje ili se ubrizgavaju u meso (Petracci & Bianchi, 2012). Izolat proteina surutke (WPI-whey protein isolate) se proizvodi kao kremasti bijeli prah i ima vrlo blagi okus mlijeka. Najvažnije funkcionalne osobine proteina surutke, kao dodatka u proizvode od mesa, su: topljivost, vezivanje vode i viskoznosti, emulgovanje, adhezivnost, želiranja i senzorne osobine. Ostali svojstva proteina surutke, kao što su dispergovanje, formiranje jestivog filma, antioksidativna aktivnost i tamnjenje su od manje važnosti (Prabhu, 2006). Pored toga, upotrebom koncentrata proteina surutke (WPC-whey protein concentrate) mogu se mijenjati svojstva hrane, kao što su okus i tekstura, hidratacija, strukturne, teksturne i reološke osobine (Russell, 2004). 7

A. Velemir i sar.: PROMJENE PROTEINSKIH PROFILA U DOMAĆIM FERMENTISANIM KOBASICAMA... Proteini soje dodati proizvodima od mesa utiču na poboljšanje sposobnosti vezivanja vode i masti, poboljšanje stabilnosti emulzije i povećanje prinosa. Dobijeni proizvod ima nježniju teksturu i smanjen sadržaj masnoće, a drugi hemijski parametri se praktično ne mijenjaju (Abdolghafour & Saghir, 2014). Upotreba proteina soje doprinosi stabilnosti lipidne oksidacije u proizvodima (Menegas et al., 2013), a izolat sojinih proteina može imati antioksidativno djelovanje u fermentisanim kobasicama (Bloukas et al., 1997). Sojini proteini daju izvrsne aromatske osobine fermentisanim kobasicama, a pozitivno djeluju i na bakterije mliječne kiseline, što utiče na odgovarajući pad ph. Kvalitet sirovina i njihov tretman direktno utiču na kvalitet gotovog proizvoda, posebno kada se radi o higijeni, imajući u vidu da procesom nastanka fermentisanih kobasica dominiraju biološki i biohemijski procesi (Heinz & Hautzinger, 2007; Radetić, 1997; Vuković, 2012). Biohemijske promjene u fermentisanim proizvodima veoma su kompleksne i intenzivne usljed aktivnosti prisutne mikroflore. Proteoliza sarkoplazmatičnih i miofibrilarnih proteina vrlo je važna biohemijska pojava koja se javlja u toku zrenja fermentisanih proizvoda od mesa. Kao rezultat aktivnosti proteinaza i peptidaza, povećava se sadržaj polipeptida, peptida i slobodnih aminokiselina, koji učestvuju u razvoju mirisa, ukusa i teksture (Ikonić i sar., 2012; Živković i sar., 2011). Cilj ovog rada je bio da se utvrdi kako dodaci proteina surutke i soje utiču na proteolitičke promjene u domaćim kobasicama tokom zrenja i skladištenja. MATERIJAL I METODE RADA Priprema uzoraka Prilikom izrade nadjeva fermentisanih kobasica, upotrebljeno je zrelo svinjsko i juneće meso prve i druge kategorije i određen udio leđne slanine svinja. Odnos ovih sastojaka se zasniva na empirijskom iskustvu samog proizvođača. Osnovni sastav za sve tipove kobasica čine svinjsko (59.3%) i juneće (7.6%) meso prve kategorije i smrznuto čvrsto masno tkivo (28.7%), nitritna so 2.5%, glukono-delta-lakton 0.3% (GDL/ TARI S 77), bijeli luk u granulama 0.3%, ljuta crvena paprika 0.4%, slatka crvena paprika 0.4%, mljeveni crni biber 0.3% i 0.3% aditiva- MIOCOLOR VS (homogena smjesa antioksidansa na osnovi soli aksorbinske kiseline, prehrambene organske kiseline i dekstroze). Za potrebe eksperimenta napravljeno je pet vrsta domaćih kobasica sljedećeg sastava: kontrolni uzorak K, konvencionalna domaća kobasica; uzorak 2A, domaća fermentisana kobasica sa dodatkom 0.50% izolata surutke (Impact Whey Isolat, Myprotein, Nortwich, UK); uzorak 2B, domaća fermentisana kobasica sa dodatkom 1.50% izolata surutke; uzorak 3A, domaća fermentisana kobasica sa dodatkom 0.50% sojinog izolata (IZOPROT S, Ireks Aroma, Zagreb, Hrvatska); uzorak 3B, domaća fermentisana kobasica sa dodatkom 1.50% sojinog izolata. Nakon usitnjavanja i miješanja u kuteru, nadjev je punjen u prirodne omotače promjera ~30 mm. Kobasice su prvo temperirane (22 o C), zatim dimljene tri dana (18 o C do 20 o C), a potom podvrgnute fermentaciji (zrenju) pri temperaturi od 16 o C do završetka proizvodnje (nakon 18 dana). Relativna vlažnost vazduha postepeno se smanjivala od 85% na početku zrenja, do 65% na kraju zrenja. Uzorci kobasica kao gotovi proizvodi su vakuum upakovani i skladišteni u rashladnoj komori na temperaturi 4 C i u takvim uslovima čuvani do momenta uzorkovanja. Tokom procesa proizvodnje kobasica, vršena su ispitivanja uzoraka svih grupa kobasica, nadjeva, kobasice nakon završene proizvodnje, te nakon skladištenja tri i šest mjeseci. Ekstrakcija sarkoplazmatičnih i miofibrilarnih proteina Pripremom uzoraka prema metodi Toldra et al. (1993) razdvojene su sarkoplazmatične i miofibrilarne frakcije. Četiri grama kobasice homogenizovano je u 40 ml 0.03M natrijum- fosfatnog pufera (ph 7.4), pet minuta. Homogenizovana smjesa centrifugirana je 15 minuta na 6000 rpm. Supernatant sadrži sarkoplazmatične proteine. Talog je homogenizovan sa rastvorom koji sadrži ureu (8M) i 1% β- merkaptoetanol, dva minuta u blenderu. Homogenat je ponovo centrifugiran 15 minuta na 6000 rpm i dobijen je supernatant koji sadrži miofibrilarne proteine. Natrijum dodecil sulfat poliakrilamid gel elektroforeza (SDS-PAGE) Natrijum dodecil sulfat poliakrilamid gel elektroforezom (SDS-PAGE) analizirani su proteinski profili. Uzorci su prije elektroforeze pomješani sa puferom za uzorke (0.125M TrisCl, 4% SDS, 20% glicerol, 2% 2-merkaptoetanol, Bromfenol plavo, ph 6.8) i grijani na 100 C, 10 minuta. Za razdvajanje korištena je smjesa 15% gela za razdvajanje i 4% gela za koncentrovanje. I sarkoplazmatični i miofibrilarni proteini analizirani su SDS-PAGE elektroforezom, metodom po Laemmli-ju (He, 2011), upotrebom Mighty Small II SE 250 mini vertical Gel Electrophoresis jedinice (Hoefer, USA), napajanje PS 200-HC, 200W izlazna snaga (Hoefer, USA). Na gelove je nanijeto 10 μl uzorka sarkoplazmatičnih i 10 μl miofibrilarnih proteina. Prvo je puštena struja jačine 36 ma, dok su uzorci putovali kroz gel za koncentrovanje, a kad su ušli u gel za razdvajanje jačina struje je podignuta na 40 ma. Elektroforeza je trajala oko 1 sat. Poslije elektroforeze, gelovi su bojeni bojom Commasie Brilliant Blue R-250 (0.25%) u fiksativu (50% metanol, 7% sirćetna kislina). Gelovi su obezbojeni korištenjem rastvora za obezbojavanje (50% metanol, 7% sirćetna kiselina). Računarskim programom Total Lab denzitometrijski su preračunata retenciona vremena pojedinačnih proteina. Molekulske mase su određene na osnovu baždarne 8

Glasnik hemičara, tehnologa i ekologa Republike Srpske, 13 (2017) 7-14 krive za standard poznatih molekulskih masa. Za ovo određivanje korišten je standard Prestained Pink Protein Ladder (NIPPON Genetics EUROPE), 15-175 kda. Određivanje ph-vrijednosti ph vrijednost domaćih kobasica mjerena je upotrebom digitalnog ph-metra sa ubodnom kombinovanom elektrodom za proizvode od mesa (Hanna, HI 99161; Hanna Instruments, USA), u skladu je sa standardnom metodom ISO 2917:2004. Kalibracija je vršena standardnim puferima (Merck) na ph 4.0 i 7.0. Prikazane vrijednosti predstavljaju srednju vrijednost tri mjerenja. REZULTATI I DISKUSIJA U sušenim fermentisanim kobasicama dešavaju se intenzivne biohemijske promjene u toku proizvodnje, a proteoliza je jedna od bitnijih i veoma važnih promjena za konačan kvalitet proizvoda. Proteoliza ima veoma značajan uticaj na teksturu i ukus, kao i na razvijanje arome kobasice (Ikonić i sar., 2012; Toldra & Reig, 2006; Živković i sar., 2011). Elektroforetska slika miofibrilarnih proteina nadjeva prije punjenja u crijeva, koji su predstavljeni u Tabeli 1, ukazuje da su prisutni proteini od 12 do 105 kda. Može se primjetiti da kod uzoraka sa dodatkom surutke nedostaju proteini masa 105 kda, ali je prisutan znatno veći broj frakcija u odnosu na ostale uzorke. Uzorci sa dodatkom soje imaju manji broj miofibrilarnih proteinskih frakcija, ali profil sličan kontrolnom uzorku. Iz prikazanih rezultata vidi se veliki broj sarkoplazmatičnih proteinskih frakcija, koje se kreću od 9 do 110 kda. Kod uzoraka sa dodatkom proteina soje javlja se frakcija više molekulske mase ( 110 kda), a kod uzoraka sa dodatkom proteina surutke niže molekulske mase (>10 kda). U gotovim kobasicama, nakon 18 dana (Tabela 2), prisutne su frakcije miofibrilarnih proteina od 8 do 120 kda. Može se uočiti da kod uzoraka 2A i 2B nema frakcija sa višom molekulskom masom (od 100 do 120 kda), kao ni nižih molekulskih masa (od 7.5 do 12 kda). Manje razlike primjetne su između kontrolnog uzorka i uzoraka sa sojom kod kojih nije prisutna frakcija od 70 kda. Nakon zrenja došlo je do manje promjene sarkoplazmatičnih proteina, frakcije se kreću od 8 do 98 kda. Uzorci sa dodatkom soje se nešto više razlikuju, nisu prisutne niske molekulske mase od 8 do 12 kda, kao ni od 80 do 85 kda. Kod sarkoplazmatičnih proteina došlo je do smanjenja broja frakcija nakon zrenja. Harkouss et al. (2015) navode da tokom zrenja dolazi do progresivne degradacije miofibrilarnih proteina. Više početne temperature prilikom zrenja ( 15 C) uzrokuju bržu fermentaciju, intenzivan pad ph pozitivno utiče na sušenje i proces proteolize, te dovodi do intenzivnije degradacije miofibrilarnih proteina (Ikonić i sar., 2014). Živković i sar. (2011) ističu da do intenzivne razgradnje sarkoplazmatičnih proteina, naročito u zoni 30-44 kda, dolazi već u prvih sedam dana zrenja. Tokom perioda zrenja, Ikonić i sar. (2012) navode povećanje frakcija sa molekulskom masom 14, 25, i 60 kda, ali i nastajanje novih proteinskih frakcija, naročito viših molekulskih masa (od 100 do 129 kda) od drugog do petnaestog dana, uzrokovanih razlaganjem proteina velikih molekulskih masa, koje nismo mogli detektovati u ispitivanim uzorcima, jer su viši od upotrebljenog standarda. Živković i sar. (2011) smatraju da blaga acidifikacija (ph oko 5.10) ima veliki uticaj na nizak nivo razgradnje miofibrilarnih proteina, dok Verplaetse ukazuje na izražen uticaj visoke ph vrijednosti na smanjenje intenziteta proteolize (citirano u Živković i sar., 2011). Uočeno je Tabela 1. Prikaz molekulskih masa miofibrilarnih i sarkoplazmatičnih proteina, u nadjevima ispitivanih uzoraka Table 1. The display of the molecular masses of myofibrillar and sarcoplasmatic proteins in analyzed samples fillings miofibrilarni proteini/myofibrillar proteins sarkoplazmatični proteini/sarcoplasmatic proteins K 2A 2B 3A 3B K 2A 2B 3A 3B 105.5 80.8 87.4 104.9 105.8 66.9 91.5 91.9 106.0 108.5 55.7 76.6 82.3 53.5 53.5 61.6 67.2 68.9 87.7 88.4 47.0 69.0 74.3 45.3 45.3 49.5 62.2 62.5 81.5 80.9 35.7 59.7 65.1 35.5 35.7 45.2 50.5 50.9 69.0 68.7 28.9 56.8 61.1 17.8 17.7 40.0 46.5 46.5 57.3 56.6 26.8 43.7 47.1 16.1 15.9 37.2 27.7 27.6 45.2 45.0 17.7 38.1 41.0 12.2 12.3 33.6 25.7 25.1 42.4 42.0 15.9 31.8 34.1 20.9 12.9 12.6 23.5 23.2 26.5 28.3 11.7 12.1 11.8 18.7 18.3 18.1 18.8 9.1 8.5 13.2 14.0 9

A. Velemir i sar.: PROMJENE PROTEINSKIH PROFILA U DOMAĆIM FERMENTISANIM KOBASICAMA... Tabela 2. Prikaz molekulskih masa miofibrilarnih i sarkoplazmatičnih proteina u uzorcima nakon zrenja Table 2. The display of the molecular masses of myofibrillar and sarcoplasmatic proteins in analyzed samples after ripening miofibrilarni proteini/myofibrillar proteins sarkoplazmatični proteini/sarcoplasmatic proteins K 2A 2B 3A 3B K 2A 2B 3A 3B 98.7 94.4 92.5 121.0 119.1 95.3 93.7 95.6 97.5 95.3 89.2 88.2 82.1 106.8 100.7 84.1 68.7 68.9 70.8 68.9 75.4 76.4 71.6 88.9 79.7 66.9 63.0 63.1 65.5 62.9 68.7 68.3 61.7 60.4 64.5 61.7 50.7 50.7 52.9 50.7 55.5 55.5 48.8 45.9 52.3 48.4 38.1 37.3 39.5 38.3 46.9 44.7 40.4 33.9 38.2 35.3 26.9 26.8 35.8 34.4 36.5 37.8 35.1 25.6 28.4 25.4 12.3 12.3 27.5 26.1 31.9 34.4 32.3 20.4 19.2 11.5 8.4 8.4 26.7 22.4 25.5 11.3 10.4 8.2 19.3 15.8 17.2 7.8 7.8 15.5 14.4 13.9 10.3 smanjenje koncentracije teškog miozina tokom zrenja fermentisanih kobasica i njihovu potpunu razgradnju, vjerovatno kao posljedica proteolize teškog miozina i komigracije drugih produkata razgradnje, pojačava intenzitet traka u zoni molekulskih masa α-aktinina (97 kda) kao i molekulske mase oko 60 kda, što je zapaženo i kod ispitivanih uzoraka. Razgradnja aktina (45 kda), naročito traka koje vjerovatno odgovaraju tropomiozinu i lakom miozinu u zoni ispod njega, posebno je intenzivna tokom prvih sedam dana zrenja (Živković i sar., 2011). Formiranje i povećanje nekih proteina niske molekulske mase (<20 kda) dokazao je veći broj autora (Hughes, 2002; Martín-Sánchez et al., 2011; Spaziani et al., 2009). Ikonić i sar. (2012) navode da polipeptidi molekulske mase 32, 42 i 53 kda gube oko 50% od svoje početne koncentracije nakon mjesec dana od obrade, dok proteini 16, 44 i 93 kda potpuno iščezavaju u narednih 30 dana. Poslije tri mjeseca skladištenja (Tabela 3) vidljivo je smanjenje broja frakcija miofibrilarnih proteina, njihove mase se kreću od 9.5 do 113 kda. Kontrolni uzorak (K) i uzorci sa dodatkom surutke (2A i 2B) imali su identičan profil. Kod uzoraka sa dodatkom soje vide se frakcije kojih nema u ostalim uzorcima ( 105 kda, od 60 do 80 kda, 32 kda, 14 kda). Primjetne su i razlike kod nižih molekulskih masa između uzoraka 3A i 3B. Kod sarkoplazmatičnih proteina došlo je do razgradnje proteina viših molekulskih masa ( 95 kda), molekulske mase su se kretale od 9.5 do 80 kda. Sličan profil imali su kontrolni uzorak K i uzorci sa dodatkom soje (3A i 3B). Kod uzoraka 2A i 2B primjeti se nedostatak viših molekulskih frakcija (od 73 do 80 kda), ali i prisustvo frakcije niske molekulske mase od 9.5 kda, jedino u ovim uzorcima. Paiva i Furtado (2011) u ispitivanju proteina soje u calabrese kobasici navodi tipične molekulske mase sojinih proteina, 60 i 33 kda, koji se javljaju i kod uzoraka 3A i 3B. Poslije šest mjeseci čuvanja (Tabela 4), kod kontrolnog uzorka K i uzoraka sa dodatkom soje (3A i 3B) imamo očito smanjenje broja frakcija, i identičan profil. Mase se kreću od 20 do 95 kda. Kod uzoraka sa dodatkom surutke primjetan je veliki broj frakcija kojih nema u ostalim uzorcima (od 19 do 42 kda, 64 kda i 80 kda). Kod sarkoplazmatičnih proteina primjeti se nestanak ili razgradnja frakcija visokih i niskih molekulskih masa. Interval masa prisutnih proteinskih frakcija je od 22 do 85 kda. Kod uzoraka sa dodatkom surutke (2A i 2B) prisutne su frakcije niže molekulske mase od 22 kda do 29 kda, dok je kod uzoraka sa dodatkom soje (3A, 3B) prisutna frakcija mase 85 kda. Hughes et al (2002) smatraju da su endogeni mišićni enzimi i denaturacija, indukovani nižim ph i odgovarajućom količinom soli, odgovorni za inicijalnu degradaciju sarkoplazmatskih proteinskih frakcija. Mnogi autori (Casaburi et al., 2007; Martín-Sánchez et al., 2011; Spaziani et al., 2009) smatraju da proteolizom u fermentisanim kobasicama bez starter kulture, kao što je slučaj kod ispitivanih uzoraka kobasica, takođe dolazi do degradacije samo sarkoplazmatičnih proteina niskog intenziteta, najvjerovatnije zbog slabe aktivnosti endogenih proteaza. 10

Glasnik hemičara, tehnologa i ekologa Republike Srpske, 13 (2017) 7-14 Tabela 3. Prikaz molekulskih masa miofibrilarnih i sarkoplazmatičnih proteina u uzorcima nakon tri mjeseca skladištenja Table 3. The display of the molecular masses of myofibrillar and sarcoplasmatic proteins in analyzed samples after three-month storage miofibrilarni proteini/myofibrillar proteins sarkoplazmatični proteini/sarcoplasmatic proteins K 2A 2B 3A 3B K 2A 2B 3A 3B 113.3 113.3 113.8 103.9 108.8 78.9 59.9 59.9 78.7 80.8 90.6 94.5 96.3 76.3 80.7 73.1 46.6 46.7 73.1 74.4 60.3 59.2 57.8 59.5 62.0 57.8 31.2 31.3 58.9 59.9 39.4 39.2 38.5 51.3 53.5 43.3 27.6 27.6 39.8 41.1 28.8 29.7 28.6 40.9 41.9 29.5 22.1 22.2 29.1 30.0 22.4 22.0 21.3 31.4 32.0 22.9 9.5 9.5 26.2 26.2 16.2 16.8 16.7 28.6 28.9 19.6 10.29 9.68 9.28 14.30 14.05 Osnovna fizičko-hemijska i jedna od najvažnijih promjena za vrijeme zrenja fermentisanih kobasica jeste smanjenje ph vrijednosti, što je posljedica aktivnosti mikroflore koja razlaže šećere do mliječne kiseline (Vasilev i sar., 2009), kao i uticaj korištenih aditiva koji snižavaju ph. Tokom čitavog perioda proizvodnje kobasica, od momenta izrade sirovog nadjeva do pakovanja, ali i tokom skladištenja, pa i kasnije, do momenta konzumiranja, u kobasicama se odvija proces zrenja. Istovremeno s tim procesom, vrijednost ph nadjeva opada usljed fermentacije u manjem ili većem obimu (Ikonić i sar., 2013). Snižavanje ph vrijednosti utiče na održivost proizvoda, stvaranje stabilne boje, povezivanje nadjeva i formiranje konzistencije i arome kobasice. U kasnijim fazama zrenja može doći do postepenog povećanja ph vrijednosti, kao rezultat nakupljanja produkata proteolize (Vuković, 2012). Inicijalne ph vrijednosti izrađenih nadjeva (Slika 1) za kobasice iznosile su od 5.76 za nadjev sa dodatkom 0.5% izolata soje (3A), do 5.84 u kontrolnom uzorku (K). Nakon 18 dana, po završetku proizvodnje, dolazi do pada ph vrijednosti, koji se kreće u interval od 5.34 u kontrolnom uzorku do 5.64 u uzorku 3B. Poslije tri mjeseca skladištenja dolazi do laganog rasta ph vrijednosti, vjerovatno kao posljedica proteolitičkih promjena. Izmjerene vrijednosti ispitivanih uzoraka su dosta ujednačene i kreću se u rasponu od 5.68 (uzorci K i 3A) do 5.77 (uzorak 3B). Vrijednosti ph nakon šest mjeseci skladištenja znatno su niže za sve ispitivane uzorke. Vrijednost ph kretala se u rasponu od 5.44 (3A) do 5.56 (3B). Istu dinamiku kao i slične finalne vrijednosti ph, tokom perioda skladištenja, utvrdili su Živković i sar. (2011) u tradicionalno proizvedenoj sremskoj kobasici. Tabela 4. Prikaz molekulskih masa miofibrilarnih i sarkoplazmatičnih proteina, u uzorcima nakon šest mjeseci skladištenja Table 4. The display of the molecular masses of myofibrillar and sarcoplasmatic proteins in analyzed samples after six-month storage miofibrilarni proteini/myofibrillar proteins sarkoplazmatični proteini/sarcoplasmatic proteins K 2A 2B 3A 3B K 2A 2B 3A 3B 96.1 93.0 90.8 97.1 94.4 78.4 81.6 83.6 84.8 82.6 85.8 80.4 78.4 91.1 88.1 68.1 66.6 72.4 80.1 78.9 76.6 75.2 72.9 72.9 71.9 57.2 54.9 61.2 69.5 69.7 61.7 65.9 63.2 60.8 59.6 45.3 40.2 48.8 57.1 57.2 52.5 60.9 58.8 53.2 51.5 78.4 26.2 29.5 48.7 47.9 49.9 48.8 68.1 22.3 22.8 42.8 41.6 25.1 23.7 19.1 18.3 11

A. Velemir i sar.: PROMJENE PROTEINSKIH PROFILA U DOMAĆIM FERMENTISANIM KOBASICAMA... Nakon inicijalnog pada ph vrijednosti dolazi do laganog rasta ph vrijednosti kao posljedica proteolitičkih promjena (Živković i sar., 2011), a kao mogući uzrok navode formiranje raznih alkalnih spojeva, poput biogenih amina (Roig-Sagués et al., 1999). S druge strane, autori Salgado et al. (2005) ističu da se povećanje ph u kasnijim fazama zrenja više odnosi na smanjenje mliječne kiseline nego na formiranje azotnih spojeva niske molekulske mase. Iako nisu primjećene veće razlike između ispitivanih uzoraka, autori navode da dodatak soje i surutke barenim kobasicama malo povećava ph vrijednost ili ta vrijednost ostaje ista (Akesowan, 2008; Serdaroğlu & Sapancı- Özsümer, 2003). ZAKLJUČAK Na osnovu prikazanih rezultata dobijenih ispitivanjem tradicionalnih fermentisanih kobasica proizvedenih u industrijskim uslovima u toku zrenja i skladištenja može se zaključiti da su upotrebljeni dodaci imali uticaj na smanjenje ph vrijednosti. Intenzivniji pad ph vrijednosti ima pozitivan uticaj na sušenje i proces proteolize u uzorcima. Proteolitičke promjene su bile značajne te je došlo do degradacija miofibrilarnih i sarkoplazmatičnih proteina. Elektroforetski profili ispitivanih modela domaćih kobasica, veoma su slični. Nakon šest mjeseci domaća fermentisana kobasica i kobasice sa dodatkom proteina soje imaju očito smanjenje broja frakcija, i identičan profil, dok su kod uzoraka sa dodatkom proteina surutke primjetne frakcije kojih nema u ostalim uzorcima. LITERATURA Abdolghafour B., & Saghir A. (2014). Development in sausage production and practices - A review, Journal of Meat Science and Technology, Vol 2, Issue 3, 40-50, http://www.jakraya.com/journal/ pdf/6-jmstarticle_1.pdf Akesowan A. (2008). Effect of soy protein isolate on quality of light pork sausages containing konjak flour, African Journal of Biotechnology 7, 4586-4590, http://www.academicjournals.org/ajb 12 Slika 1. ph vrijednost ispitivanih uzoraka Figure 1. ph value of samples Bloukas J.G., Paneras E.D., & Fournitzis G.C. (1997). Effect of replacing pork backfat with olive oil on processing and quality characteristics of fermented sausages, Meat Science 45 (2), 133-144, DOI: 10.1016/S0309-1740(96)00113-1 Casaburi A., Aristoy M.C., Cavella S., Di Monaco R, Ercolini D., Toldrá F. & Villani F. (2007). Biochemical and sensory characteristics of traditional fermented sausages of Vallo di Diano (Southern Italy) as affected by the use of starter cultures, Meat Science 76(2), 295 307, DOI:10.1016/j.meatsci.2006.11.011 Demeyer D. (2004). Meat fermentation: Principles and applications - Chapter 20: In: Hui, Y.H., Meunier- Goddik, L., Hansen, AS., Josephsen, J., Nip, W-K., Stanfield, PS., Toldrá, F., eds., Handbook of Food & Beverage Fermentation Technology, Marcel Decker Inc. New York, 353 368. DOI: 10.1201/9780203913550.ch20 Harkouss R., Astruc T., Lebert A., Gatellier P., Loison O., Safa H., Portanguen S., Parafita E., & Mirade P. (2015). Quantitative study of the relationships among proteolysis, lipid oxidation, structure and texture throughout the dry-cured ham process, Food Chemistry 166, 522 530, DOI:10.1016/j.foodchem.2014.06.013 He F. (2011). Laemmli-SDS-PAGE. Bio-protocol Bio101: e80. http://www.bio-protocol.org/e80 Heinz G., & Hautzinger P. (2007). Meat processing technology for small- to medium-scale producer, Food and Agriculture Organization of the United Nations Regional office for Asia and Pacific. RAP Publication, Bangkok, http://www.fao.org/3/a-ai407e.pdf Hughes M.C., Kerry J.P., Arendt E.K., Kenneally P.M., McSweeney P.L.H., & O Neill E.E. (2002). Characterization of proteolysis during the ripening of semi-dry fermented sausages, Meat Science 62, 205-216, DOI:10.1016/S0309-1740(01)00248-0 Ikonić, P., Petrović, Lj., Tasić, T., Škaljac S., Šojić B., Jokanović, M., i Tomović V. (2012). Hydrolysis of sarkoplasmic proteins during the ripening of traditional Petrovská klobása sausage, 6th Central European Congress on Food, CEFood2012, 1343-1348, http://fins.uns.ac.rs/ uploads/zbornici/cefood-proceedings2012.pdf Ikonić P., Tasić T., Petrović Lj., Škaljac S., Jokanović M., Mandić A., i Ikonić B. (2013). Proteolysis and biogenic amines formation during the ripening of Petrovská klobása, traditional dry-fermented sausage from Northern Serbia, Food Control 30, 69-75, DOI: 10.1016/j.foodcont.2012.06.021 Ikonić P. M., Tasić T. A., Petrović L. S., Škaljac S. B., Jokanović M. R., Tomović V. M., Šojić B. V., Džinić N. R.,

Glasnik hemičara, tehnologa i ekologa Republike Srpske, 13 (2017) 7-14 Torbica A. M., i Ikonić B. B. (2014). Proteolysis in Serbian traditional dry fermented sausage Petrovská klobása as influenced by different ripening processes, International Journal of Biological, Biomolecular, Agricultural, Food and Biotechnological Engineering 8(9), 1010-1013, DOI: 10.1016/j.foodcont.2012.06.021 Martín-Sánchez A. M., Chaves-López C., Sendra E., Sayas E., Fenández-López J., & Pérez-Álvarez J.Á. (2011). Lipolysis, proteolysis and sensory characteristics of a Spanish fermented dry-cured meat product (salchichón) with oregano essential oil used as surface mold inhibitor, Meat Science 89(1), 35-44, DOI: 10.1016/j.meatsci.2011.03.018 Menegas Z. L., Colombo P. T., Garcia S., & Prudencio S. H. (2013). Dry-fermented chicken sausage produced with inulin and corn oil: Physicochemical, microbiological, and textural characteristics and acceptability during storage, Meat Science 93, 501 506, DOI: 10.1016/j.meatsci.2012.11.003 Paiva I.M., & Furtado M. A. M. (2011). Determination of soy proteins in calabresa sausage by densitometry on gel electrophoresis, Rev Inst Adolfo Lutz.Sao Paulo, 70 (3) 311-5, http://periodicos.ses.sp.bvs. br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=s0073-98552011000300009&lng=es&nrm=iso Petracci M., & Bianchi M. (2012). Functional ingredients for poultry meat products, XXIV World s Poultry Congress, Salvador-Bahia-Brazil, DOI: 10.1016/j.tifs.2013.06.004 Prabhu G. (2006). U.S. whey proteins in processed meats, U.S. Dairy Export Council, Arlington, USA, http://www.thinkusadairy.org/documents/ Customer Site/C3-Using Dairy/C3.7-Resources and Insights/03-Application and Technical Materials/PROCESSEDMEATS_ENG.pdf Radetić, P. (1997). Sirove kobasice, Monografija, Izdavač: autor, Roig-Sagués A.X., Hernández-Herrero M.M., López- Sabater E.I., Rodríguez-Jerez J.J.&Mora-Ventura M.T. (1999). Microbiological events during the elaboration of fuet, a Spanish ripened sausage. Relationships between the development of histidine-and tyrosine-decarboxylase-containing bacteria and ph and water activity, Eur. Food Res. Technol. 209(2), 108-112, DOI:10.1007/s002170050467 Russell T.A. (2004). Comparison of sensory properties of whey and soy protein concentrates and isolates, Graduate Faculty of North Carolina State University, Department of Food Science, Raleigh, http://www.lib.ncsu.edu/resolver/1840.16/76 Salgado A., García Fontán M.C., Franco I., López M. & Carballo J. (2005). Biochemical changes during the ripening of Chorizo de cebolla, a Spanish traditional sausage. Effect of the system of manufacture (homemade or industrial), Food Chemistry 92, 413-424, DOI:10.1016/j.foodchem.2004.07.032 Serdaroğlu M., & Sapancı-Özsümer M. (2003). Effects of soy protein, whey powder and wheat gluten on quality characteristics of cooked beef sausages formulated with 5%, 10% and 20% fat, Electronic Journal of Polish Agricultural Universities, Food Science and Technology 6, Issue 2, http://www. ejpau.media.pl/volume6/issue2/food/art-03. html Singh V. P., Pathak V., & Verma A. K. (2012). Fermented meat products: Organoleptic qualities and biogenic amines-a Review, American Journal of food Technology 7(5), 278 288, DOI:10.3923/ajft.2012.278.288 Spaziani M., Del Torre M., & Stecchini L. (2009). Changes of physicochemical, microbiological, and textural properties during ripening of Italian low-acid sausages. Proteolysis, sensory and volatile profiles, Meat Science 81, 77 85, DOI: 10.1016/j.meatsci.2008.06.017 Talon R., Leroy S., & Lebert I. (2007). Microbial ecosystems of traditional fermented meat products: The importance of indigenous starters, Meat Science 77, 55 62, DOI:10.1016/j.meatsci.2007.04.023 Toldrá, F., Rico E., & Flores J. (1993). Cathepsin B, D, H and L activities in the processing of dry cured ham, Journal of the Science of Food and Agriculture 62, 157-161, DOI: 10.1002/jsfa.2740620208 Toldrá F., & Reig M. (2006). Biochemistry of Raw Meat and Poultry, Food Biochemistry and Food Processing edited by Hui Y.H., Blackwell Publishing 293-314 DOI: 10.1002/9780470277577.ch13 Urso R., Comi G., & Cocolin L. (2006). Ecology of lactic acid bacteria in Italian fermented sausages: isolation, identification and molecular characterization, Systematic and Applied Microbiology 29, 671 680, DOI:10.1016/j.syapm.2006.01.012 Vasilev D., Vuković I., Tomović V., Jokanović M., Vasiljević N., Milanović-Stevanović M., i Tubić M. (2009). Važnije fizičke, fizičko-hemijske i senzorske osobine kvaliteta funkcionalnih fermentisanih kobasica, Tehnologija mesa 50, 5-6, 342-350, http://scindeks.ceon.rs/issue.aspx?issue=8400 Vuković I. (2012). Osnove tehnologije mesa, četvrto izdanje, Veterinarska komora Srbije, Beograd Živković D., Tomović V., Perunović M., Stajić S., Stanišić N., i Bogićević N. (2011). Senzorna prihvatljivost sremske kobasice izrađene od mesa svinja različite starosti, Tehnologija mesa 52, 252-261, http://scindeks.ceon.rs/issue.aspx?issue=9699 13

A. Velemir i sar.: PROMJENE PROTEINSKIH PROFILA U DOMAĆIM FERMENTISANIM KOBASICAMA... Changes of protein profiles in homemade fermented sausages with addition of whey and soy protein during storage Ana Velemir * 1, Snježana Mandić 1, Ivan Samelak 2, Zoran Kukrić 1 1 University of Banja Luka, Faculty of Technology 2 University of Banja Luka, Faculty of Natural Sciences and Mathematics Key words: fermented sausages, sarcoplasmic and myofibrillar protein, whey and soy protein. Proteolysis of sarcoplasmic and myofibrillar protein is a very important biochemical process that occurs during ripening of fermented meat products. As a result of proteinases and peptidases, the content of polypeptides, peptides and free amino acids, which participate in the development of odor, flavor and texture, increases. SDS-PAGE protein profiles of homemade fermented sausage with the addition of 0,5% and 1,5% whey and soy isolates were analyzed. In the preparation of samples sarcoplasmic and myofibrillar fractions were separated. Densitometric molecular weights of the proteins were calculated. Qualitative protein changes of fillings, sausages after ripening and during the six-month storage of vacuum packed samples at +4 C were analyzed. Biochemical changes, basically, were a bit different. Dynamics of changes in electrophoretic profiles of sarcoplasmic and myofibrillar proteins show very similar trends. Electrophoretic image of myofibrillar protein of fillings shows that proteins from 12 kda to 105 kda were present. Samples with added whey and soy protein had a smaller number of protein fractions in the same range. In the fillings of all samples a very large number of sarcoplasmic protein fractions were present, ranging from 9 kda to 115 kda. During ripening there was a progressive degradation of myofibrillar proteins, but also sarcoplasmic proteins of high molecular weight. After six months, homemade fermented sausage and sausages with the addition of soy protein had evident reduction in the number of fractions, and identical profile, while the samples with the addition of whey protein had fractions that were not present in other samples. Based on the results, obtained by testing the traditional fermented sausages produced in industrial conditions during ripening and storage, it can be concluded that the used supplements had impact on reducing the ph. Intensive decrease of ph had a positive effect on the drying and proteolysis in the samples. 14