UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU Biološka aktivnost i varijabilnost hemijskog sastava etarskog ulja Pinus mugo (Pinaceae) MASTER RAD Kandidat: 185 Mentor: Dr Zorica S. Mitić Niš, 2017.
UNIVERSITY OF NIŠ FACULTY OF SCIENCE AND MATHEMATICS DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY Biological activity and variability of chemical composition of the essential oil of Pinus mugo (Pinaceae) MASTER THESIS Candidate: 185 Mentor: Dr. Zorica S. Mitić Niš, 2017.
BIOGRAFIJA KANDIDATA rođena je 18. oktobra 1993. godine u Vranju, gde 2008. godine završava osnovnu, a 2012. godine gimnaziju Bora Stanković sa odličnim uspehom. Prirodno-matematički fakultet u Nišu upisuje 2012. godine na Departmanu za biologiju i ekologiju. Osnovne akademske studije završava 2015. godine i iste godine upisuje Master akademske studije, smer Biologija, koje u predviđenom roku završava.
ZAHVALNICA Najsrdačnije se zahvaljujem svom mentoru doc. dr Zorici Mitić na razumevanju, strpljenju, nesebičnoj pomoći i savetima koje mi je pružila tokom izrade i pisanja master rada. Takođe, najlepše se zahvaljujem i članovima Komisije za ocenu master rada prof. dr Gordani Stojanović i prof. dr Petru Marinu. Veliku zahvalnost dugujem i prof. dr Bojanu Zlatkoviću na dragocenoj pomoći u sakupljanju biljnog materijala kao i doc. dr Snežani Jovanović na pomoći u realizaciji hemijskih analiza. Zahvaljujem se i prof. dr Vladimiru Ranđeloviću na izradi geografske karte distribucije koja prati ovaj master rad. Na kraju, posebnu zahvalnost dugujem dragim ljudima oko sebe bez kojih ne bih mogla da ostvarim svoje zamisli, a posebno sam zahvalna svojoj porodici i prijateljima na pruženoj podršci, motivaciji i ljubavi. životu. Beskrajnu zahvalnost dugujem svojoj majci, osobi koja mi je bila najveća podrška u Veliko Hvala!
SAŽETAK U master radu je analiziran hemijski sastav etarskog ulja izolovanog hidrodestilacijom iz četina Pinus mugo sa područja Kosova i Metohije (Šar-planina). Rezultati su upoređeni sa literaturnim podacima o sastavu ulja krivulja poreklom iz različitih organa biljke. Etarsko ulje četina P. mugo sa pomenutog područja odlikuje dominacija monoterpena (75.7%) sa δ-3-karenom (21.3%) i α-pinenom (18.0%) kao glavnim komponentama. Sledeći najzastupljeniji monoterpeni, limonen + β-felandren, terpinolen i bornil-acetat, detektovani su u umerenim koncentracijama (7.6, 5.5 i 5.1%, respektivno). Sa druge strane, germakren D (5.6%) i (E)-kariofilen (5.0%) predstavljaju najznačajnije metabolite u okviru seskviterpenske frakcije koja čini 21.9% ulja. Manoil-oksid je jedina diterpenska komponenta detektovana u koncentraciji manjoj od 1%. Na osnovu dosadašnjih istraživanja možemo konstatovati da postoji velika varijabilnost hemijskog sastava ulja koje potiče iz različitih organa, ali istovremeno i iz različitih delova areala pomenute vrste. Međutim, u većini dosadašnjih istraživanja utvrđeno je da monoterpeni predstavljaju dominantnu grupu jedinjenja u etarskom ulju krivulja, bez obzira na tip organa iz kojeg je ulje izolovano (četine, izdanci ili šišarke) ili poreklo biljnog materijala (populacija iz prirode ili botanička bašta). U odnosu na ostale vrste borova, prema dostupnim literaturnim podacima, etarsko ulje P. mugo je relativno slabo ispitivano sa aspekta bioloških aktivnosti. Do sada je utvrđeno da poseduje značajan antibakterijski (naročito protiv Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes i Streptococcus agalactiae) i antioksidativni potencijal, dok se sa druge strane odlikuje potpunim odsustvom larvicidne aktivnosti protiv moljca duvana Spodoptera litura. Ključne reči: Pinus mugo, etarsko ulje, varijabilnost, biološka aktivnost
ABSTRACT This master paper includes analysis of chemical composition of essential oils isolated from needles of Pinus mugo from the territory of Kosovo and Metohija (Šar-planina) by hydrodistillation. The results were compared to literature data on composition of P. mugo essential oils collected from different plant organs. The essential oil of P. mugo needles from the study area was characterized by dominance of monoterpenes (75.7%) with δ-3-carene (21.3%) and α-pinene (18.0%) as the main components. The next group of the most abundant monoterpenes, limonene + β-phellandrene, terpinolene and bornyl acetate, was detected in moderate concentrations (7.6, 5.5 and 5.1%, respectively). On the other hand, germacrene D (5.6%) and (E)-caryophyllene (5.0%) represent the most important metabolites within the sesquiterpene fraction which forms 21.9% of studied oil. Manoyl oxide was the only diterpene component, detected in concentration lower than 1%. According to the existing studies it may be concluded that there is high variability in chemical composition of oils collected from different organs, but also from different parts of range of P. mugo. However, the results of most previous studies indicated that monoterpenes are the dominant group of compounds in the essential oil of P. mugo, regardless of the type of organ from which the oil was extracted (needles, twigs or cones) or origin of plant material (wild population or from botanical garden). In comparison to other pine species, available literature data indicate that essential oil of P. mugo was relatively poorly studied from the aspect of biological activity. So far there is evidence of significant antibacterial (especially against Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes and Streptococcus agalactiae) and antioxidant potential, while on the other hand there was a complete absence of any larvicide activity against tobacco cutworm Spodoptera litura. Keywords: Pinus mugo, essential oil, variability, biological activity
SADRŽAJ 1. UVOD... 1 1.1. Opšte karakterisitke vrste Pinus mugo... 1 1.1.1. Habitus i anatomija... 1 1.1.2. Stanište i distribucija... 1 1.1.3. Privredni značaj... 3 1.2. Opšte karakteristike etarskog ulja... 4 1.2.1. Fizičke osobine... 5 1.2.2. Hemijski sastav... 6 1.2.3. Varijabilnost sadržaja i sastava etarskog ulja... 6 1.2.4. Upotreba i biološke aktivnosti etarskog ulja borova... 7 2. CILJEVI RADA... 9 3. MATERIJAL I METODE... 10 3.1. Biljni materijal... 10 3.2. Izolacija etarskog ulja (hidro-destilacija)... 11 3.3. GC-FID i GC-MS analiza etarskog ulja... 11 3.4. Identifikacija komponenti... 12 4. REZULTATI I DISKUSIJA... 13 4.1. Hemijski sastav etarskog ulja P. mugo... 13 4.1.1. Etarsko ulje četina... 13 4.1.2. Etarsko ulje izdanaka... 23 4.1.3. Etarsko ulje četina i izdanaka... 23 4.1.4. Etarsko ulje šišarki... 24 4.2. Biološka aktivnost etarskog ulja P. mugo... 30 4.2.1. Antimikrobna aktivnost... 30 4.2.2. Insekticidna aktivnost... 31 4.2.3. Antioksidativna aktivnost... 31 5. ZAKLJUČCI... 33 6. LITERATURA... 35
1. UVOD 1.1. Opšte karakterisitke vrste Pinus mugo 1.1.1. Habitus i anatomija Pinus mugo Turra (Pinaceae) - krivulj, planinski bor, klekovina je žbun retko viši od 3 (-4) m, sa krivim, ukošenim deblom, jednim ili više (slika 1.1). Kora je sivosmeđa, sa nepravilnim ljuspama. Mlade grančice gole, svetlozelene, kasnije smeđe do crnkastosive. Pupoljci su jako smolasti, dugi do 6 mm, sa kratkim vrhom. Četine po dve, traju 3-6 godina, gusto stojeće, povijene na grani, malo uvrnute, tamnozelene, duge 3-8 cm, široke 2 mm. Smoni kanali subepidermalno, 2-6 na preseku. Epidermalne ćelije palisadnog oblika, dva puta više nego što su široke. Muške resolike šišarke (mikrostrobilusi) duge do 15 mm, na prošlogodišnjem izbojku. Ženske šišarke (makro-, megastrobilusi) su jajolike do jajolikokonične, duge 2-6 cm, široke 1.5-2 cm. Apofize rombične do kvadratne, piramidalne ili ravne. Grbica (umbo) izrazita, uokvirena tamnim prstenom. Zreli semeni zameci dugi do 5 mm, sa 2-3 puta dužim krilastim dodatkom. Oprašivanje je anemofilno, muški i ženski strobilusi se pojavljuju VI-VII meseca, semeni zameci sazrevaju krajem druge godine (Jovanović, 1992). 1.1.2. Stanište i distribucija Habitus krivulja odražava teške, u prvom redu klimatske, uslove pod kojima on živi; to su granični uslovi za život šumskog drveća, sa kratkim vegetacionim periodom (3-4 meseca) (slika 1.1). Na Suvoj planini se javlja u fitocenozi Sorbo-Pinetum mugo B. Jov., 1953. Na Prokletijama (Koprivnik, Streočke planine) krivulj raste u fitocenozi Wulfenio- Pinetum mugo M. Jank. et Bog., 1967. na kiselom humusno-silikatnom zemljištu, Pinetum mugo serpentinicum M. Jank., 1982. i nekim drugim (Jovanović, 1992). 1
Slika 1.1. P. mugo sa Kosova i Metohije (Šar-planina, Ostrovica; foto: Zlatković, 2016). 2
Prema Flori Evrope (Gaussen et al., 1993) i Atlasu Flore Evrope (Jalas i Suominen, 1972), P. mugo je endemičan za Evropski kontinent i može se naći na planinama srednje Evrope, Balkanskog poluostrva, i centralnog dela Apeninskog poluostrva. Pripadnost flornom elementu: Srednjo-južnoevropski planinski (temp-submerid) subalp-alp (Jovanović, 1992). Na slici 1.2 je prikazana distribucija žbunastih taksona P. mugo kompleksa prema Hamerník i Musil (2007): P. mugo sensu stricto (=var. mugo) i P. x pseudopumilio (=var. pumilio). Slika 1.2. Distribucija žbunastih taksona P. mugo kompleksa: mu (tamno zelena površina) P. mugo Turra (sensu stricto); pp (ljubičasta površina) Pinus x pseudopumilio; svetlo zelena površina predstavlja nesigurni deo areala (Hamerník i Musil, 2007). Za područje Srbije, Jovanović (1992) navodi sledeće lokalitete: istočna Srbija - Suva planina (Trem), Stara planina (Tri čuke, Tri kladenca); Metohija Prokletije (Koprivnik, Lumbardska planina, Nedžinat, Derviš kom, Đaravica, Juničke planine), Žljeb, Hajla, Maja Rusolija, Mokra planina, Paštrik, Koritnik, Ošljak, Kodža Balkan; Kosovo Šar-planina (ispod Jažinačkog jezera, Jelovarnik), Ostrovica. 1.1.3. Privredni značaj S obzirom na to da raste i na staništima gde druge drvenaste vrste ne uspevaju, veoma je značajan kao pionirska vrsta i čuvar zemljišta na starim, visokim planinskim terenima. Kao "armatura" snežnih masa služi kao zaštita od lavina (zaštitne šume). Drvo sa crvenkastosmeđom srčevinom i žućkastom beljikom, tvrdo i teško pogodno je za rezbarstvo i 3
gorivo (na planinskim pašnjacima). Iz četina se dobija etarsko ulje, koje se koristi u kozmetičkoj industriji. Krivulj je korišćen u protiverozionim radovima i hortikulturi (Jovanović, 1992). 1.2. Opšte karakteristike etarskog ulja Etarska ulja predstavljaju specifične, najčešće tečne produkte biljnih tkiva. To su više ili manje složene smeše isparljivih monoterpena, seskiviterpena i fenilpropanska jedinjenja (Kovačević, 2004). Etarska ulja su uglavnom lako pokretljive, mirisne tečnosti; pojedina su na sobnoj temperaturi viskozna ili čvrste konzistencije. Glavni sastojci etarskih ulja su monoterpeni, seskviterpeni i u manjoj meri derivati fenilpropana. To su različiti ugljovodonici (zasićeni ili nezasićeni), alkoholi, fenoli, estri, aldehidi, ketoni, epoksidi ili karboksilne kiseline. Etarska ulja su smeše oko 20-200 sastojaka. Ovi sastojci su, na osnovu koncentracije u etarskom ulju, podeljeni na: glavne (20-95%), sporedne (1-20%) i zastupljene u tragovima (ispod 1%). Etarska ulja su uglavnom produkti kopnenih biljaka (Embryophyta). Biljke koje sadrže etarska ulja nazivaju se aromatičnim biljkama. Ove biljke su raspoređene u preko pedeset familija, a najpoznatije su aromatične biljke familija Pinaceae, Cupressaceae, Lauraceae, Zingiberaceae, Myrtaceae, Rutaceae, Lamiaceae, Apiaceae i Asteraceae. Etarska ulja su lokalizovana u različitim delovima biljaka (korenu, rizomu, stablu, kori, semenu, listovima, cvetovima i plodovima). Interensantno je da za jednu istu vrstu sastav etarskih ulja varijabilan za različite organe, što zavisi od uslova sredine. Prinosi etarskih ulja se obično kreću između 0.2 i 2.0%, mada postoje znatna odstupanja. U zavisnosti od sadržaja etarskog ulja koji može da varira (prinos izuzetno cenjenog ružinog ulja često ne prelazi 0.03%, dok prinos nekih drugih ulja može dostizati i do 20%, npr. etarsko ulje karanfilića) biljke su podeljene u red bogatih ili siromašnih uljem (Gašić, 1985). Ove mirisne tečnosti nastaju u biljkama aktivnošću endogenih i egzogenih sekretornih tkiva, koja se mogu javiti u obliku pojedinačnih ćelija u parenhimskim tkivima, žlezdanog epitela šupljina ili kanala. Mada sekretorne ćelije nekada mogu biti organizovane i u specijalne strukture, žlezde i žlezdane dlake. 4
Biološka funkcija etarskih ulja povezana je sa atraktantnim delovanjem na insekte, čime je obezbeđeno prenošenje polena i oprašivanje biljaka. Sa druge strane, veoma je značajna i uloga etarskih ulja u zaštiti biljaka od napada insekata i životinja, herbivora. Takođe, gotovo sva ulja više ili manje intenzivno sprečavaju razvoj mikroorganizama, i tako suzbijaju širenje infekcija na biljkama u kojima nastaju. Interesantni su i podaci o specifičnim efektima ulja jedne biljke, koje prelazi u podlogu i inhibira klijanje semena drugih biljaka (alelopatija). Neka etarska ulja sprečavaju klijanje sopstvenih semena i obezbuđuju životni prostor svake individue. Stara je teorija, koja samo delimično može biti prihvaćena, da biljke sintezom i odavanjem ovih isparljivih produkata stvaraju specifičnu mikroklimu, koja ih štiti od prekomerne transpiracije u različitim nepovoljnim uslovima (Kovačević, 2004). 1.2.1. Fizičke osobine Na sobnoj temperaturi, etarska ulja su najčešće tečnosti, ređe imaju viskoznu ili polučvrstu konzistenciju (Kovačević, 2004). Lako su pokretljiva, bezbojna, žuta ili žutozelena; pojedina su specifično obojena (npr. etarsko ulje cimeta i karanfilića smeđecrveno). Droge sa proazulenima daju destilacijom vodenom parom plavo ili zeleno obojena etarska ulja (npr. plava etarska ulja daju Matricariae flos, Absinthii herba i Millefolii herba). Miris etarskih ulja potiče od sastojaka sa kiseoničnim funkcionalnim grupama. On je intenzivan čak i kada su ovi sastojci zastupljeni u niskom procentu (etarsko ulje limuna) (Petrović et al., 2009). Etarska ulja su lipofilna, rastvaraju se u nepolarnim organskim rastvaračima, etanolu, mastima i masnim uljima. Generalno, etarska ulja se ne rastvaraju u vodi. U stvari, samo mali broj sastojaka ulja je rastvorljiv; ovakvi proizvodi nazivaju se aromatične vode. Kao tečnosti, etarska ulja su definisana nekim fizičkim konstantama. Relativna gustina ulja može biti manja ili veća od 1; ipak neuporedivo je manji broj etarskih ulja čija je relativna gustina veća od 1. Kao parametar kvaliteta, značajne su vrednosti indeksa refrakcije i ugla skretanja ravni polarizovane svetlosti. Kao specifična karakteristika definisana je i rastvorljivost etarskog ulja u etanolu određenog razblaženja. Specifičnost ove grupe biljnih proizvoda je da nemaju tačno definisanu temperaturu ključanja. Pošto su to smeše različitih jedinjenja, svako od njih isparava na svojoj temperaturi ključanja. Tako, etarska ulja frakciono ključaju u intervalu od 150-350 C (Kovačević, 2004). 5
1.2.2. Hemijski sastav Etarska ulja su složene mešavine dve različite klase jedinjenja: terpena i fenilpropanskih derivata. U okviru terpenske frakcije, zastupljeni su isparljivi mono- i seskviterpeni. Monoterpeni se javljaju u obliku acikličnih (linearnih), mono- i bicikličnih, alifatičnih i aromatičnih struktura. Na osnovu uvedenih funkcionalnih grupa, sastojci ulja mogu biti ugljovodonici, alkoholi, aldehidi, ketoni, kiseline, estri, fenoli, etri, oksidi, peroksidi, epoksidi. U okviru frakcije seskviterpena, formirane su još raznovrsnije strukture osnovnog skeleta; zbog dužine lanaca C atoma veća je mogućnost različitih ciklizacija. I ova grupa terpena javlja se u obliku ugljovodonika, oksida, alkohola, ketona i estara. U etarskim uljima su aromatični, fenilpropanski sastojci (C6-C3) zastupljeni u manjim količinama. Postoje i izuzeci, kada glavninu ulja čine upravo ovakva jedinjenja. Najčešće su to aril- ili propenilfenoli (eugenol, anetol) i aldehidi (cimetni aldehid). Ovakva jedinjenja su uglavnom prisutna u etarskom ulju biljaka iz familija Apiaceae i Myrtaceae. Kao sastojci etarskih ulja sreću se i C6-C1 jedinjenja, kao što je vanilin i derivati antranilne kiseline. Tokom destilacije, iz biljne sirovine mogu predestilisati i različita alifatična jedinjenja manje molekulske mase (zasićeni i nezasićeni ugljovodonici, alkoholi, aldehidi, estri, laktoni) koji se rastvaraju u etarskom ulju i postaju njegov sastavni deo. Takođe, kod nekih droga koje su izložene fermentaciji ili torefakciji, na primer, male količine prisutnog etarskog ulja postaju obogaćene sumpornim i azotnim jedinjenjima koja nastaju tokom tih specifičnih procesa; time se formira specifična aroma ovakvih droga (seme kafe, kakaovca; Kovačević, 2004). 1.2.3. Varijabilnost sadržaja i sastava etarskog ulja Kao što je slučaj i s drugim sekundarnim metabolitima biljaka, i produkcija etarskih ulja je genetski definisana. Samo do nekih granica, genetska kontrola je podložna uticajima endogenih i egzogenih faktora. Ne postoje opšta pravila, tako da neke biljne vrste u različitim klimatskim uslovima i različitim delovima sveta proizvode približne količine etarskog ulja, gotovo identičnog sastava. S druge strane, pojedinačne jedinke u okviru iste populacije 6
biljaka mogu sintetisati međusobno različita etarska ulja. Ovakva varijabilnost biljnog genoma, omogućava pojavu različitih hemijskih rasa (hemotipova biljaka), kao i mogućnost izdvajanja visokoproduktivnih linija, i njihovo vegetativno kloniranje. Najvažniji faktori koji mogu uticati na sastav etarskog ulja neke vrste (jedinke) su: genotip, fenofaza ontogenetskog razvoja, što je veoma značajno za definisanje optimalnog vremena prikupljanja biljnog materijala, ekološki faktori (faktori sredine), način obrade biljne sirovine, način izolacije etarskog ulja. Temperatura, vlažnost i aeracija zemljišta, mineralne soli u podlozi, nadmorska visina, dužina izloženosti svetlu i kvalitet svetlosti, vlažnost vazduha i vazdušna strujanja, mogu da utiču na promenljivost količine etarskog ulja u biljnom materijalu. Svaka obrada aromatične sirovine (sušenje, usitnjavanje, ekstrakcija) uslovljava delimičan gubitak etarskog ulja i promene njegovog sastava. Procesom industrijske ekstrakcije uvek se dobija oko 20% manje ulja nego u laboratorijskim uslovima (Kovačević, 2004). 1.2.4. Upotreba i biološke aktivnosti etarskog ulja borova Prema Dervendzi (1992), etarsko ulje borova (Pini aetheroleum) najviše se koristi u narodnoj medicini za lečenje respiratornih infekcija praćenih kašljem, bronhitisom, bronhijalnom astom, efizemom, traheitisom, sinuzitisom, laringitisom, faringitisom i influencom. Pored toga, etarska ulja borova široko se koriste kao aditivi u prehrambenoj i industriji alkoholnih pića. U mnogim proizvodima namenjenim za čišćenje, ulja borova poznata su kao osvežavajuća i dezinfekciona sredstva. Takođe, ova ulja intenzivno se koriste u farmaceutskoj, kozmetičkoj i parfimerijskoj industriji. Na osnovu pregleda literaturnih podataka, možemo reći da etarsko ulje borova poseduje čitav niz bioloških aktivnosti: 7
antibakterijsku i antifungalnu (Toroglu, 2007; Kolayli et al., 2009; Politeo et al., 2011; Karapandzova et al., 2011; Šarac et al., 2014); akaricidnu (Macchioni et al., 2002); larvicidnu i repelentnu aktivnost protiv Diptera (Culicidae): Aedes albopictus (Koutsaviti et al., 2015), Aedes aegypti i Culex quinquefasciatus (Fayemiwo et al., 2014); herbicidnu aktivnost protiv Phalaris canariensis, Trifolium campestre i Sinapis arvesis (Amri et al., 2014). antiagregantnu (antitrombocitnu; Tognolini et al., 2006); antikancerogenu (Hoai et al., 2015); antioksidativnu (Ustun et al., 2012). 8
2. CILJEVI RADA Osnovni naučni ciljevi ovog istraživanja mogu se predstaviti u nekoliko teza: 1. Određivanje hemijskog sastava etarskog ulja četina poreklom iz jedne autohtone populacije P. mugo sa područja Kosova i Metohije (Šar-planina) 2. Poređenje dobijenih rezultata sa literaturnim podacima o hemijskom sastavu etarskog ulja P. mugo poreklom iz različitih organa biljke: četine, izdanci i šišarke 3. Određivanje varijabilnosti sastava etarskog ulja P. mugo 4. Upoznavanje sa biološkim aktivnostima etarskog ulja P. mugo 9
3. MATERIJAL I METODE 3.1. Biljni materijal Biljni materijal (sveže četine) P. mugo sakupljen je u jednoj autohtonoj populaciji na području Kosova i Metohije (Šar-planina, Ostrovica; tabela 3.1). Geografski položaj populacije određen je uz pomoć GPS uređaja (GPS Garmin etrex Vista C). Orografske karakteristike staništa, pre svega nadmorska visina i ekspozicija su preuzeti iz SRTM (Shuttle Radar Topography Mission) (Reuter et al., 2007) digitalnog elevacionog modela rezolucije 90 x 90 m (Farr et al., 2007) pomoću softvera ArcGIS 10 (ESRI, 2011) (tabela 3.1). Herbarski primerak je deponovan u Herbarijumu Departmana za biologiju i ekologiju, Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu ( Herbarijum Moesiacum Niš - HMN). U odabranoj populaciji krivulja izvršeno je sakupljanje četina sa većeg broja odraslih stabala. U ručnom frižideru materijal je sa mesta sakupljanja prenesen do zamrzivača (-20 C) na skladištenje do momenta upotrebe. Tabela 3.1. Geografski položaj i stanišne karakteristike odabrane populacije P. mugo. Takson Lokalitet Geografska širina (N) P. sylvestris Šar-planina (Ostrovica) 42 14'12.80" Geografska dužina (E) 20 55'13.53" Nadmorska visina (m a.s.l.) 1734 Ekspozicija jugozapad Geološka podloga serpentinit Datum sakupljanja 13.08.2016. Vaučer broj 12810 HMN 10
3.2. Izolacija etarskog ulja (hidro-destilacija) Iz 335 g svežih i iseckanih četina P. mugo destilovano je etarsko ulje u aparatu tipa Clavenger u toku 2.5 h. Ulje je ekstrahovano etrom, a etarski ekstrakt sušen anhidrovanim Mg2SO4 (European Pharmacopoeia, 1983). Posle odvajanja sredstva za sušenje filtracijom, etar je uklonjen destilacijom na rotacionom-vakuum uparivaču bez zagrevanja, a etarsko ulje čuvano u zatvorenim hromatografskim vijalama na 4 C do analize. Prinos etarskog ulja je izražen preko zapreminskih procenata (%) tj. w/w, obračunato u odnosu na 100 g biljnog materijala. 40 µl svakog ulja razblaženo je etrom do 1mL za dalje hromatografske analize. 3.3. GC-FID i GC-MS analiza etarskog ulja Hemijski sastav etarskog ulja određen je pomoću GC-FID (gasna hromatografija sa plameno jonizacionim detektorom) i GC-MS (gasna hromatografija-masena spektrometrija) tehnika analize. Uzorak etarskog ulja koji je rastvoren u etru sniman je u triplikatu na 7890/7000B gasnom hromatografu (Agilent Technologies, USA) sa Combi PAL autosemplerom i HP-5 MS kolonom (5% fenil metil siloksan, 30 m x 0.25 mm i.d. i 0.25 µm debljina filma) kuplovan sa plamenim jonizacionim detektorom 7890A (FID) i masenim detektorom 5977A (MS). Temperaturni program: izotermalno prvih 2.25 minuta 50 C, zatim linearni porast temperature (gradijent 4 C/min) od 50 do 290 C. Temperatura injektora 250 C, interfejsa 300 C; protok nosećeg gasa helijuma 1.0 ml/min. Injektovana zapremina ulja 1µL, split 40:1. Bekfleš 1.89 min, na 280 C, sa helijumom pod pritiskom od 50 psi. MS uslovi (EI): jonizacija -70 ev, opseg masa 35 435 amu (3 skena u sekundi), vreme skenova 0.2 sekunde. GC-FID analiza je izvedena pod istim eksperimentalnim uslovima kao što je već navedeno za GC-MS analizu. Procentni sastav je preračunat na osnovu površine GC-FID pikova sa hromatograma snimljenih pod istim uslovima kao GC-MS, bez korekcionih faktora. 11
3.4. Identifikacija komponenti Komponente etarskog ulja identifikovane su pomoću AMDIS softvera (Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System, Ver. 2.1, DTRA/NIST, 2011) na osnovu lineranih retencionih indeksa (RI), koji su određeni na osnovu retencionih vremena standardne serije n-alkana (C8-C40), snimljene na istom aparatu i pod istim uslovima kao i uzorak ulja. RI su upoređivani sa literaturnim vrednostima (Adams, 2007 i NIST Chemistry WebBook). 12
4. REZULTATI I DISKUSIJA 4.1. Hemijski sastav etarskog ulja P. mugo 4.1.1. Etarsko ulje četina Biljni materijal P. mugo prikupljen je na Šar-planini (Ostrovica) sredinom avgusta meseca 2016. godine (tabela 3.1). Iz svežih četina postupkom hidro-destilacije u aparatu po Clevenger-u izolovano je etarsko ulje svetlo žute boje sa prinosom od 0.30% (w/w). Kombinacijom GC-FID i GC-MS analize u etarskom ulju krivulja identifikovana je 71 komponenta čije su relativne koncentracije date u tabeli 4.1, a dobijeni hromatogram prikazan je na slici 4.1. U cilju poređenja dobijenih rezultata sa literaturnim podacima u tabeli 4.1. je, takođe, dat uporedni pregled pet studija sa sastavom etarskih ulja četina P. mugo, koja su izolovana postupkom hidro-destilacije kao i u ovom radu (Kubeczka i Schultze, 1987; Tsitsimpikou et al., 2001; Venditti et al., 2013; Ioannou et al., 2014; Hajdari et al., 2015). Etarsko ulje P. mugo, sa područja Šar-planine (ova studija), odlikuje dominacija monoterpena (75.7%) sa δ-3-karenom (21.3%) i α-pinenom (18.0%) kao glavnim komponentama. Sledeći najzastupljeniji monoterpeni, limonen + β-felandren, terpinolen i bornil-acetat, detektovani su u umerenim koncentracijama (7.6, 5.5 i 5.1%, respektivno). Sa druge strane, germakren D (5.6%) i (E)-kariofilen (5.0%) predstavljaju najznačajnije metabolite u okviru seskviterpenske frakcije koja čini 21.9% ulja. Manoil-oksid je jedina diterpenska komponenta detektovana u koncentraciji manjoj od 1%. Na ovaj način, prosečan hemijski profil glavnih terpenskih komponenti (preko 5%) u etarskom ulju P. mugo možemo predstaviti na sledeći način: δ-3-karen > α-pinen >> limonen + β-felandren > germakren D = terpinolen = bornil-acetat = (E)-kariofilen (>> označava razliku od 5.1-15.0%, > razliku od 1.1-5.0%, = razliku od 0.1-1.0%, prema Petrakis et al., 2001). 13
2 1 3 5 6 7 4 α-pinen δ-3-karen limonen + β-felandren terpinolen bornil-acetat (E)-kariofilen germakren D 1 2 3 5 6 7 4 Slika 4.1. Hromatogram etarskog ulja četina P. mugo sa Šar-planine (Ostrovica). 14
R. br. Takson Poreklo biljnog materijala Referenca Tabela 4.1. Hemijski sastav etarskog ulja četina P. mugo izolovanog hidro-destilacijom. P. mugo Kosovo, Šarplanina, Ostrovica ova studija P. mugo subsp. mugo Kosovo, Šarplanina, različiti sublokaliteti a ) Hajdari et al. (2015) P. mugo subsp. mugo Kosovo, Prokletije, različiti sublokaliteti a ) Hajdari et al. (2015) P. mugo Velika Britanija, Botanička bašta Univerziteta u Kembridžu Ioannou et al. (2014) P. mugo var. rostrata Velika Britanija, Botanička bašta Univerziteta u Kembridžu Ioannou et al. (2014) Komponente Sadržaj (%) P. mugo var. pumilio Velika Britanija, Botanička bašta Univerziteta u Kembridžu Ioannou et al. (2014) P. mugo subsp. mugo Italija, Nacionalni park Majela Venditti et al. (2013) P. mugo Velika Britanija, Kraljevska Botanička bašta u Edinburgu Tsitsimpikou et al. (2001) P. mugo subsp. pumilio Komercijalni uzorak min maks min maks 1. (Z)-2-Penten-1-ol tr - - - - - - - - - - 2. n-heksanal 0.3 - - - - - - - - - - 3. (E)-2-Heksen-1-al 0.5 - - - - - - - - - - 4. (Z)-3-Heksen-1-ol 0.3 - - - - - - - - - - 5. (Z)-2-Heksen-1-ol tr - - - - - - - - - - 6. n-heksanol 0.3 - - - - - - - - - - 7. Triciklen 0.8 0.7 0.9 0.9 1.1 0.5 1.6 1.7-1.2 0.4 8. α-tujen 1.5 1.3 2.0 tr 1.0 1.2 - - - - - 9. α-pinen 18.0 17.0 22.6 19.9 24.5 13.7 12.9 14.1 tr 33.3 13.1 10. α-fenhen - - - - - - - - - 6.4-11. Kamfen 3.0 2.2 3.2 3.2 4.0 2.4 6.5 6.3 - - 1.8 12. Tuja-2,4(10)-dien - tr 0.2 tr 0.3 - - - - - - 13. Sabinen 1.0 0.8 1.0 0.8 1.0 1.1 0.7 4.8 - - 0.6 14. β-pinen 4.1 1.6 5.5 2.7 3.4 2.1 2.8 0.8 0.1 2.8 7.6 15. β-mircen 2.2 1.4 2.6 2.4 6.1 6.9 2.6 3.2 0.1 1.2 5.0 16. α-felandren 0.4 tr 0.5 0.3 1.0 tr 0.6 tr tr - 0.5 17. δ-3-karen 21.3 16.3 19.8 15.5 27.9 9.9 6.4 12.0 0.8-35.2 18. α-terpinen 0.6 0.3 0.4 0.2 0.3 0.5 0.8 0.3 tr - 0.6 19. p-cimen 0.1 0.2 0.5 0.2 0.3 - - - tr - 0.7 20. Limonen + β-felandren 7.6 2.0 5.9 2.3 4.8 2.6 2.4 3.0 1.2 0.9 20.6 Kubeczka i Schultze (1987) 15
21. Silvestren - - - - - - 2.3 3.0 - - - 22. (Z)-β-Ocimen tr - - - - tr tr - - - - 23. (E)-β-Ocimen 0.5 tr 1.2 0.7 0.8 0.6 1.1 1.0 0.3-0.3 24. γ-terpinen 0.7 0.5 0.8 0.3 0.4 0.4 0.3 0.3 0.1-0.6 25. p-menta-2,4(8)-dien 0.1 tr tr tr tr - - - - - - 26. Terpinolen 5.5 3.2 4.3 2.2 3.3 3.8 1.5 2.5 0.5-3.6 27. Linalool 0.2 tr 0.3 tr tr - - - 0.3 - - 28. α-pinen-oksid - - - - - - - - - 1.5-29. n-nonanal tr - - - - - - - - - - 30. α-tujon - - - - - - - - - 1.2-31. endo-fenhol - - - - - - - - 0.1 - - 32. cis-p-ment-2-en-1-ol - - - - - - - - 0.3 - - 33. trans-pinokarvol - tr 0.2 0.3 0.4 - - - tr - - 34. trans-p-ment-2-en-1-ol - - - - - - - - 0.5 - - 35. Kamfor tr tr 0.5 0.4 0.5 - - - 0.2 - - 36. Kamfen-hidrat tr - - - - - - - 0.3 - - 37. cis-hrizantenol - - - - - - - - - 1.0-38. Izoborneol - - - - - - - - 0.1 - - 39. trans-pinokamfon - - - - - - - - tr - - 40. Borneol 0.2 0.5 0.7 0.3 0.5-0.2 tr 1.5 - - 41. p-menta-1,5-dien-8-ol - - - - - - - - 0.5 - - 42. Terpinen-4-ol 0.9 tr tr tr tr 0.2 0.1 tr 3.6 - - 43. m-cimen-8-ol - tr 0.2 tr tr - - - 0.5 - - 44. Kripton - - - - - - - - 0.4 - - 45. p-cimen-8-ol tr tr tr tr tr - - - 1.6 - - 46. α-terpineol 0.4 0.2 0.3 tr 0.2 - - - 7.3 - - 47. Metil-salicilat - tr tr tr tr - - - - - - 48. cis-piperitol - - - - - - - - 0.2 - - 49. Mirtenol tr 0.2 0.4 0.2 0.2 - - - 0.2 - - 50. trans-piperitol - - - - - - - - 0.4 - - 51. trans-karveol - - - - - - - - 0.2 - - 52. 2-Vinil-3-metil-anizol - - - - - - - - 0.1 - - 53. cis-karveol - - - - - - - - 0.3 - - 54. Citronelol - - - - - - - - 0.2 - - 55. Timol-metil-etar 0.2 0.3 0.8 tr 0.2 tr tr tr 0.7 - - 56. Karvon - - - - - - - - tr - - 57. 3-Karen-2-on - - - - - - - - 0.1 - - 58. Piperiton - - - - - - - - 1.0 - - 59. Felandral - - - - - - - - 0.2 - - 16
60. Pregeijeren B - - - - - - - - 0.6 - - 61. Linalil-acetat 0.2 0.2 0.2 0.2 0.3 0.2 0.5 - - - - 62. Bornil-acetat 5.1 2.6 5.2 4.6 8.1 3.8 14.1 7.6 11.5-1.3 63. Izobornil-acetat - - - - - - - - - 2.0-64. p-cimen-7-ol - - - - - - - - 0.3 - - 65. 2-Undekanon 0.1 - - - - - - - 0.2 0.8-66. Karvakrol - - - - - - - - - 1.6-67. izo-dihidrokarveol-acetat - - - - - - - - 0.1 - - 68. Bicikloelemen - - - - - 0.4 0.6 0.3 - - - 69. δ-terpinil-acetat - - - - - - - - tr - - 70. α-kubeben - - - - - tr 0.1 - - - - 71. α-terpinil-acetat 1.4 - - - - 1.3 1.0 0.7 2.4 3.6-72. β-terpinil acetat - 0.2 0.2 0.2 0.3 - - - - - - 73. Citronelil-acetat - - - - - - - - 0.1 - - 74. α-longipinen 0.1 - - - - - - - - - - 75. α-kopaen 0.1 tr 1.5 tr tr 0.2 0.3 0.1 0.1 - tr 76. β-burbonen 0.1 tr 0.2 tr 0.2 0.2-0.1 0.2 - - 77. β-kubeben - - - - - - tr - - - - 78. β-elemen 0.6 1.2 2.1 0.7 1.8 2.8 3.7 2.1 0.3 - - 79. Geranil-acetat tr - - - - - - - - - - 80. Longifolen - tr 0.5 tr tr - - - 0.2 - - 81. Junipen tr - - - - - - - - - - 82. (E)-Kariofilen 5.0 5.3 9.0 4.5 5.1 5.3 3.4 6.8 5.9 2.7 3.3 83. β-kopaen - 0.2 0.3 0.2 0.3 0.2 0.2 0.1 - - - 84. Gvaja-6,9-diene - - - - - - - - 1.4 - - 85. Aromadendren - 0.3 1.5 tr 0.3 tr 0.1 tr 0.1 - - 86. cis-muurola-3,5-dien 0.1 - - - - - - - - - - 87. trans-muurola-3,5-dien 0.1 - - - - - - - - - - 88. α-humulen 0.8 tr 0.6 0.5 0.8 1.1 0.7 1.2 1.2-0.5 89. cis-kadina-1(6),4-dien - - - - - 0.3 0.1 0.1 - - - 90. Seskvisabinen - - - - - - - 0.3 - - - 91. 9-epi-(E)-Kariofilen 0.2 - - - - - - - - - - 92. (E)-β-Farnezen - - - - - - 0.1 0.1 0.1 - - 93. trans-kadina-1(6),4-dien 0.1 - - - - - - - - - - 94. cis-muurola-4(14),5-dien 0.2 tr 0.2 tr 0.2-0.1 - - - - 95. β-hamigran - 0.2 0.7 0.2 0.5 - - - - - - 96. γ-gurjunen - tr tr tr tr - - - - - - 97. γ-muurolen 0.2 0.4 0.6 0.2 0.3 tr - tr 0.1 3.5-98. Germakren D 5.6 5.5 9.9 4.0 8.4 12.1 2.8 8.0 0.6-0.5 17
99. β-selinen 0.1 0.2 0.5 0.2 0.3 0.2 0.5 0.2 tr 2.1-100. trans-muurola-4(14),5- dien 0.2 - - - - 0.1 - tr - - - 101. Biciklogermakren 1.7 2.1 3.0 2.2 3.4 4.2 5.7 2.9 0.3 - - 102. γ-amorfen - 0.2 0.3 tr 0.2 - - - - - - 103. α-muurolen 0.6 0.6 1.0 0.3 0.4 0.6 1.5 0.3 0.3 2.4-104. Germakren A 0.2 - - - - - 0.2 - - - - 105. δ-amorfen - - - - - tr - - - - - 106. Bornil-izovalerat - - - - - - - - 0.3 - - 107. γ-kadinen 0.8 0.7 2.2 0.6 0.8 1.3 1.6 0.5 0.3 9.0-108. Izobornil-izovalerat - - - - - - - 1.0 0.2 - - 109. Kubebol - - - - - 0.3 - - - 1.8-110. δ-kadinen 2.6 2.1 3.6 2.2 2.3 2.2-1.5 1.2-0.4 111. Zonaren 0.1 - - - - - - - - - - 112. trans-kadina-1,4-diene 0.1 tr tr tr 0.3 0.2 - - - - - 113. α-kadinen 0.2 0.4 0.6 tr 0.2 0.2 - tr 0.1 - - 114. Furopelargon A - - - - - - - - 0.2 - - 115. (E)-Nerolidol - 0.4 0.7 0.6 0.7 - - - 0.1 - - 116. Germakren D-4-ol 0.2 - - - - 6.1 6.0 4.1 - - - 117. Spatulenol 0.1 1.1 1.4 1.2 1.3 1.5 0.6 0.8 0.8 3.5-118. Kariofilen-oksid 0.1 1.5 1.9 1.7 1.8 - - 0.2 2.0 6.1-119. Humulen-oksid II - - - - - - - - 0.4 - - 120. β-oplopenon - - - - - - - - - 0.8-121. Heksadekan - - - - - - - - tr - - 122. Juneol - tr tr tr tr - - - - - - 123. 1,10-di-epi-Kubenol tr - - - - tr 0.1 tr 0.3 - - 124. 1-epi-Kubenol tr 0.3 0.4 0.2 0.3 0.1 0.2 tr - - - 125. Kariofila-4(12),8(13)- dien-5-ol - - - - - - - - 0.1 - - 126. epi-α-kadinol - 0.7 1.6 0.3 0.7 0.6 1.2 0.4 1.3 - tr 127. epi-α-muurolol 0.7 - - - - 0.9 1.4 0.7 1.3 4.6 tr 128. α-muurolol 0.1 tr 0.2 tr tr 0.4 0.6 0.2 0.5 0.2-129. α-kadinol 0.9 - - - - 1.9 3.5 1.4 4.1 4.4 tr 130. 14-Hidroksi-9-epi-(E)- kariofilen - - - - - - - - 0.6 - - 131. Amorfa-4,9-dien-2-ol - tr tr tr tr - - - - - - 132. Heptadekan - - - - - - - - 0.2 - - 133. Oplopanon - - - - - - - - 0.1 - - 134. Benzil-benzoat - - - - - - - - 0.3 1.5-18
135. Oktadekan - - - - - - - - 0.2 - - 136. Izopimara-9(11),15-dien - - - - - - - - 0.1 - - 137. Nonadekan - - - - - - - - 0.1 - - 138. Pimaradien - - - - - - - 0.2 0.1 - - 139. Sandarakopimaradien - - - - - - - - 0.3 - - 140. Manoil-oksid 0.1 tr 0.2 tr 0.2 2.1 tr 0.9 1.0 - - 141. 13-epi-Manoil-oksid - - - - - - - - 2.9 - - 142. Abietatrien - - - - - - - tr 0.7 - - 143. Abietadien - tr tr tr tr - tr 0.8 0.5 - - 144. Abieta-8(14),13(15)-dien - - - - - - tr tr 0.6 - - 145. Abienol - - - - - - - - 1.6 - - 146. 2-Keto-manoil-oksid - - - - - 2.0 - - - - - 147. Sandarakopimarinal - - - - - - - - 0.3 - - 148. Okso-manoil-oksid - - - - - - - - 0.6 - - 149. Abieta-6,8(14)-dien-18- al - - - - - - - - 8.7 - - 150. Dehidroabietal - - - - - - - - 4.3 - - 151. Abietal - - - - - - - - 0.8 - - 152. 8,13-Abietadien-18-ol - - - - - - - - 0.3 - - 153. Metil-dehidroabietat - - - - - - - - 0.2 - - 154. Dehidroabietol - - - - - - - - 0.4 - - 155. Abieta-8,13(15)-dien-18- al - - - - - - - - 0.7 - - Ukupno 99.4 95.8 98.30 97.1 98.6 99.8 93.7 97.5 81.2 100 96.7 Monoterpeni 75.7 55.7 63.60 64.2 68.9 51.2 58.4 61.3 35.8 56.7 90.7 Seskviterpeni 21.9 29.9 34.10 22.9 27.1 43.4 35.3 33.4 24.7 41.1 5.96 Diterpeni 0.1 0.1 0.20 0.1 0.2 4.1 tr 2.8 25.8 - - Ostalo 1.6 3.6 6.50 5.4 8.2 0.0 0.0 0.0 0.9 2.2 - tr detektovano u tragu (<0.1%), - nije detektovano a ) Hajdari et al. (2015) su istraživali sastav etarskog ulja P. mugo sa po tri raličita lokaliteta na području Šar-planine i Prokletija; u ovom radu su prikazane samo minimalne i maksimalne vrednosti sadržaja identifikovanih komponenti 19
Hemijski sastav etarskog ulja izolovanog hidro-destilacijom iz četina krivulja ispitivao je veliki broj autora i u većini studija je pokazana dominacija α-pinena i δ-3-karena kao i u ovom radu (tabela 4.1, slika 4.2). Sa druge strane, poznato je da u etarskom ulju srodne vrste, P. uncinata, koja pripada P. mugo kompleksu (Hamernik i Musil, 2007) dominiraju bornil-acetat (30.2%) i α-pinen (12.2%), a u ulju P. uliginosa (bor tresavskih močvara koji ima veoma kontraverzan taksonomski status) α-pinen (8.1%), bornil-acetat (7.9%) i δ-3-karen (6.9%) (Bonikowski et al., 2015). Naime, prema mnogim autorima, bor tresavskih močvara je hibrid između P. mugo i P. uncinata: hibrid na nivou vrste (Holubičková, 1965) ili podvrste (Christensen, 1987a; 1987b; 1987c); ili hibrid između P. mugo i P. sylvestris (Staszkiewicz i Tyszkiewicz, 1969). Iako se navedeni taksoni P. mugo kompleksa razlikuju po svom fenotipu, geografskoj distribuciji i ekologiji (Hamernik i Musil, 2007), prethodna istraživanja na osnovu RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) markera, molekularne citogenetike i protočne citometrije ukazala su na konzervativnu organizaciju genoma i odsustvo genetičke diferencijacije između njih (Monteleone et al., 2006; Bogunić et al., 2011). Ipak, poređenjem dominantnih komponenti ulja P. mugo, P. uncinata i P. uliginosa, možemo zaključiti da se svaki takson odlikuje posebnim hemotipom, kao i da se terpenski profil P. uliginosa nalazi između P. mugo i P. uncinata, što ide u prilog hipotezi da je reč o taksonu hibridnog porekla između ove dve bliske Pinus vrste. Pored sastava etarskih ulja taksona P. mugo kompleksa dobijenih hidro-destilacijim, Celiński et al. (2015) objavili su sastav terpena u četinama P. mugo, P. unicanata i P. uliginosa na osnovu izolacije HS-SPME (headspace solid-phase microextraction). Autori su potvrdili da se isparljive komponente četina mogu koristiti kao pouzdani taksonomski markeri u identifikaciji ovih srodnih taksona. Utvrđeno je da su α-pinen (20.0%) i δ-3-karen (18.1%) glavne isparljive komponente u četinama P. mugo, δ-3-karen (21.5%) i α-pinen (16.1%) u četinama P. uliginosa, a α-pinen (28.4%) i bornil-acetat (10.8%) u četinama P. uncinata. Dosadašnja istraživanja sastava etarskog ulja P. sylvestris (vrsta koja se smatra najbližom P. mugo kompleksu) ukazala su, generalno, na dominaciju α-pinena i mogu se podeliti u dva hemotipa (grupe): hemotip bez ili sa niskom koncentracijom δ-3-karena i hemotip sa visokom koncetracijom δ-3-karena (Thoss et al., 2007). Prema tome, drugi opisani hemotip P. sylvestris odlikuje dominacija istih komponenti kao i P. mugo, što takođe 20
može da ukazuje na određeni stepen filogenetske sličnosti između ove dve vrste Dyploxlon borova. Iako je u većini dosadašnjih studija pokazana dominacija α-pinena i δ-3-karena u četinama krivulja (tabela 4.1.), Ioannou et al. (2014) su objavili bornil-acetat i α-pinen kao glavne komponente ulja P. mugo var. rostrata. Međutim, prema "The Plant List" (2013), P. mugo var. rostrata je zapravo sinonim vrste P. uncinata, što bi se na osnovu dominantnih komponenti ulja, takođe, moglo pretpostaviti. Ipak, veoma neobičan terpenski profil objavljen je za P. mugo subsp. mugo iz Nacionalnog parka Majela u Italiji (Venditti et al., 2013), u kome su bornil-acetat i terpineol glavne monoterpenske komponente ulja, dok su α- pinen i δ-3-karen detektovani u koncentraciji manjoj od 1%. Ovo etarsko ulje se, takođe, odlikuje neuobičajeno visokom količinom diterpena i to abietanskih derivata koji čine čak 25.8% ulja. Ovako visoka koncentracija diterpenskih jedinjenja nije utvrđena u nijednom dosadašnjem istraživanju P. mugo. Prema Venditti et al. (2013), prisustvo više aldehidnih diterpena kao što su abieta-6,8(14)-dien-18-al (8.7%), dehidroabietal (4.3%), abietal (0.8%) i abieta-8,13(15)-dien-18-al (0.7%) u četinama P. mugo ima i taksonomski značaj, s obzirom da su aldehidni diterpeni detektovani isključivo kod Pinus vrsta (npr. P. contorta, P. elliotti, P. hunneywelli, P. ponderosa, P. rhaetica), a odsustvuju kod ostalih rodova familije Pinaceae (Lambert et al., 2007). U svakom slučaju, u potpunosti drugačiji terpenski profil P. mugo subsp. mugo sa Apeninskog poluostrva u odnosu na balkanski, može se objasniti i veoma dugom izolacijom populacija krivulja iz ova dva evropska refugijuma. 21
Slika 4.2. Varijabilnost dominantnih terpena (>5%) u etarskom ulju četina P. mugo. 22
4.1.2. Etarsko ulje izdanaka Prema našim istraživanjima u literaturi postoji samo jedan rad u kome je ispitavan hemijski sastav etarskog ulja izolovanog hidro-destilacijom iz izdanaka P. mugo - populacije sa Šar-planine i Prokletija (tabela 4.2, slika 4.3). U populacijama sa oba planinska masiva utvrđena je prosečna dominacija monoterpena (83.4 i 79.6%, resp.) sa δ-3-karenom (31.7 i 34.9%, resp.) i limonenom + β-felandrenom (18.3 i 19.5%, resp.) kao glavnim komponentama. U okviru monoterpenske frakcije, u populacijama sa Šar-planine, sledeće najzastupljenije komponente su β-pinen (11.8%) i α-pinen (8.8%), dok je u populacijama sa Prokletija samo α-pinen utvrđen u umerenoj (6.6%), a β-pinen je detektvan u niskoj koncentraciji (2.8%). Seskviterpenska frakcija je zastupljena sa svega 13.2 i 15.8%, resp., sa (E)-kariofilenom kao glavnim metabolitom (6.4 i 7.2%, resp.). Dve diterpenske komponente, manoil-oksid i 3-okso-manoil-oksid, detektovane su u većini populacija samo u tragovima (Hajdari et al., 2015). 4.1.3. Etarsko ulje četina i izdanaka Hemijski sastav etarskog ulja izolovanog iz zajedno samlevenih četina i izdanaka P. mugo ispitivan je manje u odnosu na ulja koja su dobijena isključivo iz četina (tabela 4.2, slika 4.3). Bojović et al. (2016) su publikovali sastav etarskog ulja dobijenog hidrodestilacijom iz četina i izdanaka četiri populacije P. mugo sa područja Julijskih Alpa. Dominantnu grupu jedinjenja predstavljaju monoterpeni (79.7%), a glavne komponente su δ- 3-karen (20.7%), β-felandren (16.4%) i α-pinen (15.0%). Za ovakav rezultat možemo reći da je u potpunosti i očekivan, ako uzmemo u obzir da su dominantne komponente etarskog ulja četina α-pinen i δ-3-karen, a ulja izdanaka δ-3-karen i limonen + β-felandren (tabele 4.1 i 4.2). Sledeći najzastupljeniji monoterpeni, β-mircen i β-pinen, detektovani su u umerenim koncentracijama (7.8 i 5.8%, resp.). (E)-Kariofilen (5.3%) je najzastupljeniji metabolit u okviru seskviterpenske frakcije koja čini 19.0% ulja. Manoil-oksid i 3-okso-manoil-oksid su jedine identifikovane diterpenske komponente prisutne u koncentraciji manjoj od 1%. Sa druge strane, Stevanovic et al. (2005) su objavili sastav ulja izolovanog destilacijom vodenom parom iz četina i izdanaka P. mugo sa Šar-planine (Ostrovica). Utvrđeno je da su δ-3-karen (23.9%), α-pinen (17.9%) i limonen + β-felandren (11.1%) glavne komponente ulja, a pored njih samo je još β-pinen detektovan u koncentraciji većoj od 23
5%. Iako je u pitanju druga tehnika izolacije etarskog ulja (destilacija vodenom parom), kao i činjenica da je da je u ovom radu analiziran materijal sa područja Balkanskog poluostrva (Šar-planina), možemo primetiti sličnost u hemijskom sastavu sa uljem koje je izolovano metodom hidro-destilacije iz četina i izdanaka populacija krivulja sa Julijskih Alpa (Hajdari et al., 2015; Bojović et al., 2016). 4.1.4. Etarsko ulje šišarki Hajdari et al. (2015) su, takođe, objavili hemijski sastav etarskog ulja šišarki P. mugo u populacijama sa Šar-planine i Prokletija (tabela 4.2, slika 4.3). Monoterpeni predstavljaju glavnu terpensku klasu jedinjenja u populacijama sa oba planinska masiva (prosečni sadržaj 40.3 i 44.8%, resp.), zatim slede seskviterpeni (31.2 i 39.8%, resp.), dok su diterpeni utvrđeni u niskoj koncentraciji (0.9 i 1.9%, resp.). Dominantne komponente ulja, na oba planinska masiva, su δ-3-karen (15.8 i 23.4%, resp.) i (E)-kariofilen (16.7 i 21.8%, resp.). Sledeći najzastupljeniji metaboliti u ulju šišarki populacija sa Šar-planine su β-pinen (6.3%) i α-pinen (4.2%), a u ulju populacija sa Prokletija α-pinen (5.1%) i germakren D (6.9%). Primenom hijerarhijske klaster analize - HCA (hierarchical cluster analysis), Hajdari et al. (2015) ukazuju na jasno izdvajanje tri grupe P. mugo ulja koje odgovaraju sastavu tri biljna organa iz kojih su ulja izolovana: prva grupa uključila je ulja iz izdanaka, druga grupa ulja četina i treća ulja šišarki. HCA je, takođe, ukazala na sličniji sastav ulja četina i šišarki u odnosu na ulja izdanaka. Analiza glavnih komponenti - PCA (principal component analysis) potvrdila je grupisanje P. mugo ulja u odnosu na biljni organ iz kojeg su izolovana. Na grupisanje ulja iz četina uticao je veći sadržaj kamfena (3.0%), α-tujena (1.0%), biciklogermakrena (2.7%), bornil-acetata (5.3%), δ-kadinena (2.5), γ-kadinena (1.0%) i germakrena D (6.5%) u odnosu na preostale dve grupe. Ulja izdanaka odlikuje veći sadržaj δ- 3-karena (33.3%), sabinena (1.4%), limonena + β-felandrena (18.9%) i β-pinena (7.3%), dok ulja šišarki imaju veći sadržaj β-kariofilena (18.7%), aromadendrena (1.5%) i linaloola (1.1%), a manji sadržaj α-pinena (4.6%). Ovako velike razlike u hemijskom sastavu etarskog ulja iz različitih biljnih organa su i očekivane, s obzirom da se različiti organi odlikuju potpuno drugačijom ekspresijom gena koja je prilagođena funkciji datog ograna. 24
Slika 4.3. Varijabilnost dominantnih terpena (>5%) u etarskom ulju P. mugo poreklom iz različitih delova biljke (četine i izdanci; izdanci; šišarke). 25
Tabela. 4.2. Hemijski sastav etarskog ulja P. mugo poreklom iz različitih delova biljke (četine i izdanci; izdanci; šišarke). Takson P. mugo P. mugo P. mugo subsp. P. mugo subsp. P. mugo. subsp. P. mugo subsp. mugo mugo mugo mugo Poreklo biljnog Kosovo, Šarplanina (Ostrovica) planina a Kosovo, Prokletije Kosovo, Šar- Julijski Alpi materijala ) Kosovo, Šarplanina ) ) Kosovo, Prokletije a ) Organ Četine i izdanci Četine i izdanci Izdanci Izdanci Šišarke Šišarke Način izolacije Hidrodestilacija vodenom parom Destilacija Hidro-destilacija Hidro-destilacija Hidro-destilacija Hidro-destilacija Referenca Bojović et al. Stevanovic et al. (2016) (2005) Hajdari et al. (2015) Hajdari et al. (2015) Hajdari et al. (2015) Hajdari et al. (2015) R.br. Komponente Sadržaj (%) min maks min maks min maks min maks 1. Triciklen 0.5 0.4 tr 0.2 tr 0.2 tr tr tr tr 2. α-tujen 0.6 0.8 0.2 0.3 tr 0.2 tr 0.2 tr 0.2 3. α-pinen 15.0 17.9 7.9 9.7 5.6 7.4 3.1 5.4 4.6 5.7 4. Kamfen 1.8 1.7 0.2 0.9 0.5 0.8 0.3 0.7 0.2 0.4 5. Tuja-2,4(10)-dien - - 0.7 1.1 0.3 0.5 0.5 0.7 0.3 2.0 6. Sabinen 1.4 1.3 1.1 2.2 1.0 1.7 0.4 0.5 0.3 0.5 7. β-pinen 5.9 7.8 5.5 15.4 2.2 3.5 1.6 14.2 1.4 1.6 8. β-mircen 7.8 2.7 1.6 2.3 2.7 10.3 1.1 1.6 1.1 4.6 9. α-felandren 0.3 0.2 0.3 0.4 0.2 0.3 tr 0.2 tr tr 10. δ-3-karen 20.7 23.9 28.6 34.0 24.0 51.7 10.5 22.1 15.2 31.5 11. α-terpinen 0.2-0.2 0.2 0.2 0.3 tr 0.2 tr tr 12. p-cimen 0.2 1.1 0.4 0.6 0.3 0.4 0.3 0.4 0.3 0.5 13. Limonen + β- Felandren 16.4 11.1 12.7 24.3 14.3 23.2 2.0 9.3 4.0 6.3 14. (E)-β-Ocimen tr tr tr tr tr 0.6 tr 0.2 tr 0.2 15. γ-terpinen 0.4-0.4 0.5 0.4 0.6 0.3 0.4 0.2 0.4 16. p-menta-2,4(8)-dien 0.3 - tr tr tr 0.2 tr tr tr tr 17. Terpinolen 3.2 0.4 2.6 2.7 2.5 4.3 0.9 2.1 1.3 2.3 18. Linalool - 0.3 tr 0.2 tr tr tr 3.6 tr tr 19. cis-p-ment-2-en-1-ol tr - - - - - - - - - 20. trans-pinokarveol - - tr 0.2 0.2 0.5 tr 0.3 tr 0.4 21. trans-p-ment-2-en-1-ol tr - - - - - - - - - 22. Kamfor - - 0.3 0.4 tr tr tr 0.5 tr tr 23. Dekan-2-on 0.1 - - - - - - - - - 26
24. Borneol tr - 0.3 1.0 0.5 0.5 0.2 1.0 0.2 0.4 25. Terpinen-4-ol 0.2 1.3 0.2 0.2 0.2 0.3 tr tr tr 0.3 26. m-cimen-8-ol - - 0.2 0.3 tr 0.3 tr tr tr 0.2 27. Kripton 0.1 1.3 - - - - - - - - 28. p-cimen-8-ol - 0.9 0.2 0.4 0.2 0.3 tr tr tr 0.4 29. α-terpineol tr 0.5 0.2 0.3 tr tr tr 0.8 tr tr 30. Metil-salicilat - - tr 0.3 tr 0.2 tr 0.2 tr tr 31. Mirtenol 0.1-0.7 1.2 0.6 0.9 tr 0.5 0.2 0.2 32. Timol-metil-etar 0.4 0.2 0.2 0.2 tr 0.2 tr 1.1 tr tr 33. Kumin-aldehid - 0.6 - - - - - - - - 34. Linalil-acetat 0.1 - tr 0.2 tr tr tr 1.2 tr 0.2 35. (E)-2-Decenal 0.1 - - - - - - - - - 36. Bornil-acetat 2.8 3.2 0.4 2.6 1.8 3.0 0.5 1.5 0.8 1.3 37. 2-Undekanon tr - - - - - - - - - 38. p-vinilgvajakol 0.4 - - - - - - - - - 39. Piperitenon - 1.2 - - - - - - - - 40. α-terpinil-acetat 0.9 2.5 - - - - - - - - 41. β-terpinil-acetat - - tr tr tr tr tr tr tr tr 42. Citronelil-acetat tr - - - - - - - - - 43. α-kopaen 0.1 - tr 0.4 tr tr tr 0.2 tr tr 44. β-burbonen - - tr 0.3 0.2 0.3 tr tr tr tr 45. β-elemen 1.1-0.6 1.0 1.0 1.2 0.2 0.6 0.3 0.5 46. Longifolen - - tr 0.4 tr tr tr 2.8 tr tr 47. (E)-Kariofilen 5.3 2.4 5.9 7.3 4.0 10.9 10.4 20.5 16.6 27.0 48. β-kopaen 0.1 - tr tr tr tr tr 1.1 tr tr 49. Aromadendren - - tr 1.2 tr 0.6 tr 3.3 tr 1.0 50. α-humulen 0.9 0.4 0.5 1.0 tr 1.8 tr 2.6 1.8 4.5 51. trans-kadina-1(6),4- dien 0.2 - - - - - - - - - 52. cis-muurola-4(14),5- dien - - tr tr tr tr tr 0.2 tr tr 53. β-hamigren - - tr 0.3 0.2 0.5 tr 0.5 0.7 1.2 54. γ-gurjunen - - tr tr tr tr tr tr tr tr 55. γ-muurolen 0.2 - tr tr tr 0.6 tr 1.1 tr 1.2 56. Germakren D 4.4 0.7 0.4 0.6 tr 6.2 0.2 3.0 1.3 12.5 57. β-selinen tr - tr 0.2 tr tr tr tr tr tr 58. Biciklogermakren 1.9-0.6 0.8 0.5 1.0 tr 0.5 tr 0.4 59. γ-amorfen - - tr tr tr 0.2 tr 0.4 tr 0.4 60. α-muurolen 0.1 - tr 0.2 tr tr tr 0.3 tr 0.2 27
61. γ-kadinen 0.5 0.8 0.2 0.2 0.2 0.4 tr 0.6 tr 0.9 62. δ-kadinen 1.5 1.1 0.5 0.9 0.4 0.9 0.3 1.5 tr 1.8 63. trans-kadina-1,4-dien - - tr tr tr tr tr 0.5 tr 0.3 64. α-kadinen tr - tr tr tr tr 0.4 0.8 0.4 1.0 65. (E)-Nerolidol - - tr 0.2 tr 0.2 tr 0.4 tr tr 66. Germakren D-4-ol 1.2 - - - - - - - - - 67. Spatulenol - 1.2 0.2 0.4 tr 0.2 tr 0.3 tr 0.5 68. Kariofilen-oksid 0.2 1.6 0.20 0.60 0.20 0.40 0.02 0.50 0.02 0.70 69. Juneol - - tr tr tr tr 0.5 0.8 0.2 0.2 70. 1-epi-Kubenol - - tr tr tr tr tr tr tr tr 71. epi-α-kadinol - 0.7 0.2 0.3 tr 0.5 0.3 0.4 0.2 0.6 72. epi-α-murrolol 0.6 1.1 - - - - - - - - 73. α-murrolol - - 0.2 0.3 tr 0.5 1.3 2.6 1.3 3.0 74. α-kadinol 0.7 1.0 - - - - - - - - 75. Amorfa-4,9-dien-2-ol - - tr tr tr tr 0.2 0.5 0.4 0.7 76. Heksadekanal tr - - - - - - - - - 77. Manoil-oksid 0.1 - tr tr tr 0.2 tr 0.7 0.9 1.1 78. 3-Okso-manoil-oksid tr - - - - - - - - - 80. Abietadien - - tr tr tr 0.2 0.2 1.1 0.6 1.1 Ukupno 99.7 93.7 96.8 98.1 95.8 98.6 68.9 81.5 79.1 94.8 Monoterpeni 79.7 82.7 82.8 84.4 69.5 88.7 28.9 59.3 37.7 51.9 Seskviterpeni 19.0 11.0 11.2 14.4 8.3 24.6 19.6 40.8 24.0 55.6 Diterpeni 0.2 - - - - 0.4 0.3 1.8 1.5 2.2 Ostalo 0.8-0.8 3.3 2.2 3.3 1.6 3.0 1.1 1.3 tr detektovano u tragu (<0.1%), - nije detektovano a ) Hajdari et al. (2015) su istraživali sastav etarskog ulja P. mugo sa po tri raličita lokaliteta na području Šar-planine i Prokletija; u ovom radu su prikazane samo minimalne i maksimalne vrednosti sadržaja identifikovanih komponenti 28
Sa druge strane, utvrđeno je da razlike između ispitivanih populacija P. mugo (tri populacije sa Šar-planine i tri populacije sa Prokletija) nisu toliko velike, kao razlike između organa (Hajdari et al., 2015). S obzirom na izolovanost i udaljenost (oko 100 km) ispitivanih planina, autori su očekivali postojanje dve distinktne grupe (Šar-planina i Prokletije) na osnovu sastava etarskih ulja iz četina, izdanaka i/ili šišarki. Multivarijantne statističke analize nisu podržale ovu hipotezu, s obzirom da su se neki uzorci sa Šar-planine i Prokletija grupisali zajedno. Odsustvo diferencijacije između ispitivanih populacija P. mugo može se objasniti činjenicom da je ova vrsta imala znatno širu i kontinuiranu distribuciju na ovim prostorima u prošlosti. Naime, sadašnji areal P. mugo predstavlja samo ostatak nekadašnjeg većeg areala koji je značajno redukovan tokom ledenih doba u Pleistocenu. S obzirom da su populacije sa Šar-planine i Prokletija verovatno ostaci jedne veće, stare populacije do čijeg je razdvajanja došlo u skorijoj prošlosti, odsustvo njihove trenutne diferencijacije (na osnovu terpenskih markera) donekle je i očekivano. Pored toga, poznato je da se četinarske vrste, generalno, odlikuju niskim stepenom genetičke diferencijacije populacija usled efektivnog protoka gena putem rasejavanja polena i semena (Hamrick et al., 1979). 29