Univerzitet u Nišu Prirodno-matematički fakultet Departman za hemiju Bioakumulacija teških metala u biljci hiperakumulatoru Pistia stratiotes - Master

Univerzitet u Nišu Prirodno-matematički fakultet Departman za hemiju Bioakumulacija teških metala u biljci hiperakumulatoru Pistia stratiotes - - Mentor: Prof. dr Tatjana Anđelković Student: Aleksandra Malovac Niš, 2017.

Univerzitet u Nišu Prirodno-matematički fakultet Departman za hemiju Bioakumulacija teških metala u biljci hiperakumulatoru Pistia stratiotes - - Mentor: Prof. dr Tatjana Anđelković Student: Aleksandra Malovac Niš, 2017.

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА Редни број, РБР: Идентификациони број, ИБР: Тип документације, ТД: Тип записа, ТЗ: Врста рада, ВР: Аутор, АУ: Ментор, МН: Наслов рада, НР: монографска текстуални / графички Мастер рад Александра Маловац Татјана Анђелковић Биоакумулација тешких метала у биљци хиперакумулатору Pistia stratiotes Језик публикације, ЈП: српски Језик извода, ЈИ: српски Земља публиковања, ЗП: Р. Србија Уже географско подручје, УГП: Р. Србија Година, ГО: 2017 Издавач, ИЗ: Ауторски репринт Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33. Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/цитата/табела/слика/графика/прилога) Научна област, НО: Научна дисциплина, НД: Предметна одредница/кључне речи, ПО: 63 страна; 7 поглавља; 8 табела; 23 слика Хемија Хемија животне средине Биоакумулација, тешки метали, хиперакумулатори, Pistia stratiotes УДК 546.4/.8 : 582.521.41 Чува се, ЧУ: библиотека Важна напомена, ВН: Извод, ИЗ: Предмет овог мастер рада је испитивање биоакумулације тешких метала (Ni, Zn, Cu, Pb, Cd) у биљци хиперакумулатору Pistia stratiotes. Испитивање је вршено излагањем биљака растворима са садржајем тешких метала, а затим је након сушења и минерализације, садржај метала у биљкама одређен атомском апсорпционом спектрофотометријом. Добијени резултати су показали да поређењем просечне концентрације тешких метала одређених у сувом узорку биљака након излагања растворима метала и њихових дозвољених вредности да се кадмијум акумулира у концентрацији која је око 5 пута већа од дозвољене, никл и бакар се акумулирају у два пута мањој концентрацији од дозвољене, олово у десет пута мањој концентрацији од дозвољене, док се цинк акумулира у чак двадесет пута мањој концентрацији од оне концентрације која би могла да изазове фитотоксичност. Датум прихватања теме, ДП: Датум одбране, ДО: Члановикомисије, КО: Председник: Члан: Члан, Ментор:

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ Accession number, ANO: Identification number, INO: Document type, DT: Type of record, TR: Contents code, CC: Author, AU: Mentor, MN: Title, TI: Language oftext, LT: Language of abstract, LA: Country of publication, CP: Locality of publication, LP: KEY WORDS DOCUMENTATION monograph textual / graphic Master work Aleksandra Malovac Tatjana Anđelković Bioaccumulation of heavy metals in hyperaccumulator plant Pistia stratiotes Serbian English; Serbian Republic of Serbia Serbia Publication year, PY: 2017 Publisher, PB: author s reprint Publication place, PP: Niš, Višegradska 33. Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes) Scientific field, SF: Scientific discipline, SD: Subject/Keywords, S/KW: 63 pages; 7 chapters; 8 tables; 23 figures chemistry Environmental chemistry UC 546.4/.8 : 582.521.41 Bioaccumulation, heavy metals, hyperaccumulator, Pistia stratiotes Holding data, HD: library Note, N: Abstract, AB: The subject of this work is investigation of heavy metal bioaccumulation (Ni, Zn, Cu, Pb, Cd) in hyperaccumulator plant Pistia stratiotes. The investigation was carried out by exposing the plants to the solutions with the content of heavy metals, and then after drying and mineralization, the content of the metal in plants was determined by atomic absorption spectrophotometry. The obtained results showed that by comparing the average concentration of heavy metals determined in the dry sample of plants after exposure to the metal solutions and their allowed values, it was determined that cadmium is accumulated at a concentration about 5 times higher than the allowed, nickel and copper are accumulated at twice the concentration of permitted, lead in ten times lower concentration than allowed, while zinc accumulates in as much as twenty times less concentration than that concentration that could cause phytotoxicity. Accepted by the Scientific Board on, ASB: Defended on, DE: Defended DB: Board, President: Member: Member, Mentor:

Eksperimentalni deo ovog master rada urađen je u istraživačkoj laboratoriji Katedre za primenjenu i industrijsku hemiju Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu. Ovom prilikom bih iskazala zahvalnost svom mentoru, prof. dr Tatjani Anđelković, na prihvaćenoj saradnji, pomoći oko izbora teme master rada i definisanju njenih okvira. Veliko hvala i dr Ivani Kostić, naučnom saradniku, na nesebičnoj stručnoj pomoći, strpljenju i razumevanju. Zahvaljujem se i dr Darku Anđelkoviću, naučnom saradniku i dr Bojanu Zlatkoviću, vanrednom profesoru Departmana za biologiju i ekologiju, na pomoći oko prikupljanja biljaka i pripreme eksperimentalnog dela rada. Zahvaljujem se i Milici Branković, studentu doktorskih studija, na korisnim savetima i uputstvima tokom izrade eksperimentalnog dela master rada. Na kraju, neizmernu zahvalnost dugujem svojoj porodici, ocu Perici, majci Dušici i sestri Ani, kao i prijateljima na pruženoj ljubavi, pomoći, podršci i motivaciji tokom studiranja.

Sadržaj 1. Uvod... 1 2.... 3 2.1. Biljke hiperakumulatori... 4 2.2. Teški metali... 9 2.2.1. Olovo... 9 2.2.3. Bakar... 11 2.2.4. Cink... 11 2.2.5. Nikl... 12 2.2.6. Toksični efekti teških metala u biljkama... 13 2.2.7. Transport metala među biljnim tkivima... 16 2.2.8. Mehanizmi mobilizacije metala od strane biljaka i usvajanje... 16 2.2.9. Transport koren-nadzemna tkiva... 18 2.2.10. Intracelularni transport... 18 2.3. Načini pripreme biljnih uzoraka za analizu... 23 2.3.1. Postupak mokrog razaranja... 23 2.3.2. Postupak suvog razaranja... 24 2.4. Atomska apsorpciona spektrofotometrija... 25 2.4.1. Atomski apsorpcioni spektrofotometar... 26 2.4.2. Način rada atomskog apsorpcionog spektrofotometra... 33 2.4.3. Osetljivost i tačnost određivanja... 34 2.4.4. Smetnje... 35 3. Eksperimentalni deo... 39 3.1. Program i metodika eksperimenta... 40 3.2. Eksperimentalni postupak... 41 3.2.1. Pribor i aparatura... 41 3.2.2. Reagensi... 41 4. Rezultati i diskusija... 43 4.1. Prikaz rezultata... 44 4.1.1. Kalibracione krive standardnih rastvora metala... 44 4.1.2. Masa celih biljaka... 46 4.1.3. Mase biljaka za mineralizaciju... 47 4.1.4. Koncentracije i mase metala u uzorcima... 48 4.1.5. Mase metala u uzorku... 50 4.2. Diskusija rezultata... 51 7. Biografija... 58

Uvod 1. Uvod 1

Uvod Teški metali su prirodne komponente Zemljine kore, ali su koncentracije nekih od njih, u mnogim ekosistemima, dostigle toksične nivoe, pre svega kao posledica antropogenih aktivnosti. Do današnjih dana, ukupno 53 elementa je svrstano u kategoriju teških metala, koja je preciznije definisana kao grupa elemenata čija je gustina veća od 5 g/cm 3. Teški metali su široko rasprostranjeni u životnoj sredini. Njihova zastupljenost u radnoj i životnoj sredini predstavlja ozbiljan zdravstveni i ekološki problem zato što su toksični, veoma dugo se zadržavaju u zemljištu i akumuliraju u žive sisteme kroz lance ishrane. Prema svojoj biološkoj funkciji koju imaju u organizmu metali se dele na esencijalne i neesencijalne. Metali, kao što su Cu, Fe, Zn, Mn, Mo, Ni, Co su neophodni za normalan rast i razvoj biljaka. Nedostatak ili potpuni izostanak ovih metala može da dovede do ozbiljnih poremećaja u organizmu biljaka, pa čak i do uginuća. Zbog toga ovi metali spadaju u grupu esencijalnih metala. U grupu neesencijalnih metala spadaju Pb, Cd, Hg, As, Cr. Oni nemaju nikakvu poznatu korisnu ulogu i ispoljavaju samo toksično dejstvo na organizam biljaka. Toksičnost koja se ispoljava prema biljkama naziva se fitotoksičnost. Na celularnom nivou, posledice produžene izloženosti visokim koncentracijama metala mogu biti dezintegracija membrane, gubitak jona, peroksidacija lipida, degradacija DNK/RNK i konačno smrt ćelije. Da bi se biljke normalno razvijale i rasle, one moraju održavati koncentracije esencijalnih elemenata u okviru optimalnih vrednosti-stanje homeostaze. Cilj ovog rada je ispitivanje bioakumulacije teških metala (Ni, Cu, Zn, Pb, Cd) u biljci hiperakumulatoru Pistii Stratiotes. Sadržaj teških metala u biljkama izloženim rastvorima koji su sadržali teške metale, određen je nakon sušenja i mineralizacije primenom atomske apsorpcione spektrofotometrije. 2

2. 3

2.1. Biljke hiperakumulatori Biljke koje opstaju na zemljištu zasićenom metalima, mogu biti grupisane u tri kategorije: 1) Ekskluderi vrste biljaka koje sprečavaju usvajanje toksičnih metala unutar ćelija korena i u kojima se koncentracija metala u nadzemnim delovima održava ispod kritičnih vrednosti, tj. na niskom nivou u odnosu na koncentracije metala u zemljištu. Ekskluderi mogu biti iskorišćeni za stabilizaciju zemljišta i za izbegavanje daljeg širenja zagađenja, povezanog sa erozijom. 2) Akumulatori vrste biljaka u kojima se metali koncentrišu u nadzemnim delovima. Akumulatori ne sprečavaju ulazak metala u koren, te samim tim dozvoljavaju bioakumulaciju visokih koncentracija metala u svojim tkivima. 3) Indikatori vrste biljaka kod kojih unutrašnje koncentracije proporcionalno odražavaju, tj. reflektuju eksterne koncentracije. U odnosu na molekularne mehanizme koje koriste u postizanju svoje rezistentnosti/tolerantnosti prema metalnom stresu, tj. smanjenju negativnih posledica toksičnosti metala, biljne vrste se mogu posmatrati kao: 1. Vrste osetljive prema metalima (metal-sensitive species), 2. Vrste rezistentne prema metalima ekskluderi (metal-resistant excluder species), 3. Nehiperakumulatorske vrste tolerantne prema metalima (metal-tolerant nonhyperaccumulator species) i 4. Vrste hiper-tolerantne prema metalima (metalhypertolerant hyperaccumulator species) Slika 1. A. Biljke osetljive na teške metale, koje ne mogu sprečiti ulazak metala u koren, niti mogu sprečiti transport metala do izdanka. B. Metal-rezistentni ekskluderi, koji su sposobni da drže metale van domašaja korena, ili obezbede brz efluks u slučaju ulaska u ćelije korena. C. Metal-tolerantne nehiperakumulatorne biljke, u kojima metali ulaze u ćelije korena gde se vrši njihova sekvestracija u vakuole čime se sprečava translokacija kroz stablo. D. Metalhipertolerantne hiperakumulatorne biljke, u kojima se metali aktivno usvajaju kroz koren i u velikim količinama ubacuju u ksilem. U izdanku, metali se bezbedno odlažu (sekvestriraju) u vakuole. Zn-plave sfere, Cd-crvene sfere. Hiperakumulatori su podgrupa akumulatorskih vrsta, koja akumulira ekstremno visoke koncentracije metala u lišću i drugim nadzemnim delovima. Najčešće se radi o endemičnim vrstama koje prirodno rastu na zemljištu prezasićenom metalima i to kako u kontinentalnim, tako i u tropskim zonama. Ove vrste biljaka su indentifikovane u vegetaciji regija Južne Afrike, Nove Kaledonije, Latinske Amerike kao i Severne Amerike i Evrope. U početku, termin 4

hiperakumulator se odnosio na biljke sposobne da akumuliraju više od 1 mg/g (suve mase) Ni u nadzemne delove, što su izuzetno visoke koncentracije, uzevši u obzir da se u organima većine biljaka toksičnost ovog metala može ispoljiti pri koncentracijama > 10 µg/g suve mase kod osetljivih i > 50 µg/g suve mase kod umereno osetljivih biljaka. Danas se hiperakumulatori definišu kao one vrste koje su sposobne da akumuliraju metale u koncentracijama koje su i do 100 puta veće od onih koje su normalno prisutne u biljkama. Oni mogu koncentrovati metale i do 0.1% suve mase u svom lišću za Ni, Co, Cr, Cu, Al i Pb; 1% za Zn i Mn i 0.01% za Cd i Se. Tabela 2.1. Sadržaji metala u biljkama (mg/g suve mase) definisani radi kategorizacije statusa akumulatora, ili hiperakumulatora Element Prag za akumulatore (mg/g) Prag za hiperakumulatore (mg/g) Broj hiperakumulatorskih vrsta As / 1 Nije zabeležen Cd 0,02 0,1 1 Co 0,02 0,1 28 Cr 0,05 0,1 Nepoznat Cu 0,1 1 37 Mn 2 10 9 Ni 0,1 1 317 Pb 0,1 1 14 Se 0,01 1 20 Zn 2 10 11 Vreme koje je potrebno biljkama da umanje količinu teških metala u kontaminiranim zemljištima zavisi od produkcije biomase, kao i od njihove sposobnosti akumulacije, tj. njihovih biokoncentracionih faktora (BCFs). BCF predstavlja odnos koncentracije metala u tkivima izdanka i koncentracije metala zemljištu, mada se može odnositi i na odnos koncentracije u korenu i zemljištu. On je određen kapacitetom biljnog organa prema usvajanju metala i njegove sposobnosti da akumuliše, skladišti i detoksifikuje metale, dok održava metabolizam, rast i produkciju biomase. Kod hiperakumulatora, BCF je uvek viši od 1, ponekad dostižući vrednosti od 50 do 100. Ukupno je detektovano preko 500 vrsta biljaka hiperakumulatora iz oko 101 familije biljaka uključujući članove Asteraceae, Brassicaceae, Caryophyllaceae, Cyperaceae, Cunouniaceae, Fabaceae, Flacourtiaceae, Lamiaceae, Poaceae, Violaceae i Euphobiaceae, što čini oko 0.2% svih angiospermi. Posebno je interesantna familija Brassicaceae, sa rodovima Alyssum i Thlaspi, kod kojih je primećena akumulacija više vrsta metala. Čak 25% detektovanih hiperakumulatora pripada ovoj familiji. Najpoznatiji hiperakumulator metala je biljka Thlaspi caerulescens, koja akumulira velike količine Zn (39 600 mg/kg) i Cd (1800 mg/kg) bez vidljivijih oštećenja. Ova mala, diploidna biljka može lako da raste u laboratorijskim uslovima, čime predstavlja odličan eksperimentalni sistem za ispitivanje mehanizama usvajanja, akumulacije i tolerancije metala povezanih sa fitoekstrakcijom. Osim T. caerulescens, Brassica juncea je takođe služila kao čest model za ispitivanje fiziologije i biohemije biljaka tokom akumulacije metala. Preko 75% taksona može da akumulira Ni, dok je samo mali broj hiperakumulatora (5 vrsta) do danas pronađeno za Cd. Takođe, Ni je metal koji dostiže najveće koncentracije u biljkama. Hiperakumulatori Zn su manje zastupljeni i uključuju Arabidopsis halleri i vrste Thlaspi, kao i Sedum alfredii. Vrste A. halleri i S. alfredii, zajedno sa T. caerulescens i T. praecox su četiri poznate vrste koje pored Zn, hiperakumuliraju i Cd. Od skora je i Solanum nigrum (krompir) prepoznat kao peti hiperakumulator kadmijuma. Vrste koje hiperakumuliraju Se su rasprostranjene u rodovima različitih familija, među kojima su Fabaceae, Asteraceae, Rubiaceae, Brassicaceae, Scrophulariaceae i Chenopodiaceae. Takođe, neke angiosperme, kao što su Brassicaceae isatis 5

cappadocica i Hesperis persica, ali i neke vrste paprati koje pripadaju rodu Pteris su identifikovane kao hiperakumulatori As. Nedavno je "Environment Canada" objavila bazu podataka "Fitoterm" koja predstavlja svetsku popisnu listu za više od 750 kopnenih i vodenih biljaka sa dobrim potencijalom za fitoremedijaciju. Očigledno je da se terminom "hiperakumulator" može opisati veliki broj biljaka koje pripadaju taksonomski udaljenim familijama, ali da sve one dele jednu istu sposobnost akumulacije izvanredno visokih količina teških metala u nadzemnim delovima, količina mnogo većih nego što su pronađene u većini drugih biljaka i to bez podleganja fitotoksičnim efektima, što je od posebnog značaja za eventualnu primenu u postupku fitoekstrakcije/fitoakumulacije. 2.1.1. Pistia stratiotes Pistia stratiotes je slobodno plutajuće vodeno bilje iz Azije, Afrike i ekvatorijalne Amerike. Postoji određena debata o tome da li Severna teritorija Amerike čini deo njenog rodnog područja. Smatra se da je uneta u reke i brane kao zamka za jegulje u Kvinslendu. Koristi se kao biljka za akvarijume i može se kupiti u rasadnicima. Reke, močvare, jezera, rezervoari i usporeni tokovi su područja koja su najizloženija dejstvu ovog korova. Uticaj Pod povoljnim uslovima, Pistia stratiotes će obilno rasti, brzo će se širiti i formirati opstruktivne podloge. Ove velike guste plutajuće podloge mogu imati negativne uticaje na vodene biljke i životinje. Mogu, takođe, ometati navodnjavanja, plovidbu i vodene sportove. Poznato je da guste patosnice predstavljaju sklonište komarcima koji izazivaju razne bolesti. Stanište Najbolje raste na mirnim slatkovodnim površinama kao što su brane, rezervoari, jezera, reke i potoci. Opstaje na temperaturama između 15 C i 35 C, a optimalne temperature za rast se kreću između 22 C i 30 C. Osetljiva je na mraz, a rast je ograničen u područjima sa dugim hladnim zimama. Pistia stratiotes može dugo vremena opstati na blatnjavim područjima ili na drugim vlažnim lokacijama kao što su odvodni kanali pored puteva. Izgled Pistia Stratiotes je biljka slobodnog plutanja koja izgleda vrlo slično kao otvorena glava salate. Može dostići visinu 15 cm i širinu 30 cm. Biljke majke i ćerke su povezane stolonima (bele strukture poput korena koje povezuju biljke zajedno) i dostižu dužinu do 60 cm. Listovi Slika 2. Pistia stratiotes (podseća na otvorenu glavu zelene salate) Bledo zeleni listovi su rebrastii, talasasti i formiraju rozetu. Oni su sunđerasti na dodir i imaju baršunast izgled zbog malih gustih dlaka koje ih pokrivaju. 6

Koren Veliki broj žiličastih korena dužine do 80 cm uronjen je u vodu ispod listova biljaka. Cvetovi Slika 3. Pistia stratiotes slobodno pliva sa potopljenim žiličastim korenom Cvetovi su beličasto-zelene boje, vrlo mali (dužine do 1,5 cm) i skriveni su u središtu biljke među listovima. Cvetanje se dešava tokom cele godine. Plod Plod je zelenkasta bobica prečnika 5 10 mm. Četiri do petnaest semenki se nalaze obložene i formiraju bobicu. Semenke su prvo zelene, a zatim zriju do braon boje i dugačke su oko 2 mm. Reprodukcija Pistia stratiotes je višegodišnja biljka koja se reprodukuje vegetativno od semena. Svaka biljka proizvodi brojne stolone, pri čemu svaka proizvede novu rozetu ili ćerku na svom kraju. Svaka ćerka-biljka će tada formirati svoje stolone, što će omogućiti biljci da brzo raste. U jednom trenutku seme će plivati na površini vode pre nego što padne na dno. Ono klija početkom leta kada temperature dostignu preko 20 C, a potom plutaju na površini kao sadnice. Cvetanje i reprodukcija mogu se desiti već u fazi razvoja od četiri do pet listova. Kada su uslovi za rast dobri, biljka može brzo reprodukovati i pokrivati celu vodu gustim slojem povezanih rozeta. Prenošenje Smatra se da se ova biljka proširila odlaganjem vode iz akvarijuma ili ribnjaka u potoke, reke i močvare ili namernom kultivacijom. Pistia stratiotes može biti raspršena u vidu slomljenog komada, plutajućih sadnica ili kao biljka u celosti. Delovi biljke mogu se proširiti brodovima ili opremom za ribolov, koji se pomeraju iz dela gde je biljka prisutna u deo gde je nema. Seme može plutati nizvodno i obezbediti rezervu u područjima gde ova biljka nije naseljena. 7

Kontrola i upravljanje Slika 4. Pistia stratiotes se može brzo razmnožavati i pokriti celu površinu vode Brzo razmnožavanje ove biljke može poremetiti normalan život vodenih biljaka i životinja, pa se zbog toga dosta pažnje posvećuje kontroli i upravljanju njenog rasta i razmnožavanje. To se postiže na nekoliko načina: 1)sprečavanje širenja 2)uklanjanje herbicidima i biološka kontrola 3)fizička i mehanička uklanjanja 8

2.2. Teški metali 2.2.1. Olovo U prirodi uglavnom nalazi u neorganskom obliku, kao oksid (PbO, PbO2), sulfid, ali i kao karbonat, sulfat ili hromat. U organskom obliku se može naći u vidu soli, koje gradi sa organskim kiselinama. Usled antropološkog zagađenja životne sredine Pb se može naći i u obliku alkil-olova, i drugih različitih derivata, koji se koriste u proizvodnji benzina. Prosečan nivo Pb u Zemljinoj kori procenjen je na 20 mg/kg. U gornjim slojevima zemljišta njegova koncentracija varira između 10 i 70 mg/kg. U blizini većih saobraćajnica i preko 100 mg/kg. Nivoi u površinskim vodama su generalno ispod 0,01 mg/l, dok se u zagađenim vodama može očekivati koncentracija i do 1 mg/l. Vazduh u gradskim područjima sadrži 0,2 3,0 μg/m 3 dok je u brdskim područjima ta količina 10 puta manja. Vegetacija sadrži 0,2 0,6 mg/kg. Olovo u tlo, osim prirodnim putem, može doći i antropogenim putem. Najveći izvori zagađivanja prirode olovom su motorna vozila, industrijske otpadne vode, deponije, rudnici olova, topionice, hemijska industrija, industrija boja, keramička industrija, industrija proizvodnje i obrade stakla, industrija baterija i akumulatora, fabrike oružja i municije. Iz atmosfere, zemljišta i voda, Pb se unosi i zadržava u biljkama, a dalje preko lanca ishrane i vode za piće dospeva i u ljudski organizam. Nakupljanje olova u biljkama zavisi od udaljenosti biljaka od centra emisije, pokrivenosti zemljišta biljkama, dužine trajanja vegetacije, pravca i intenziteta vetra i dr. Biljke olovo u neorganskom obliku slabo usvajaju i premeštaju u nadzemne organe, izuzev na kiselim zemljištima. Organska jedinjenja olova, veoma se brzo usvajaju i transportuju u nadzemne delove biljaka. Taloženje olova kod većine biljaka intenzivnije je u korenu u odnosu na nadzemne delove. Velika moć korena u akumulaciji olova mogla bi da bude i jedan vid zaštite nadzemnog dela. Olovo u većim koncentracijama inhibira izduživanje korena i rast listova, inhibira proces fotosinteze, utiče na morfološko-anatomsku građu biljaka. Olovo kod čoveka uzrokuje anemiju, razne poremećaje digestivnog trakta, utiče na centralni nervni sistem, izaziva kardiovaskularna oboljenja, oboljenje kostiju i dr. Koncentracija olova u krvi od 60 μg/dl je tokom šezdesetih godina smatrana bezopasnom. Vremenom, proučavanjem toksičnih efekata olova, prihvatljiv sadržaj u krvi je smanjen na 25 μg/dl, pa zatim i na 10 μg/dl 1991. god. Bez obzira na ove izmene, subklinički simptomi izloženosti olovu se javljaju i pri njegovom sadržaju manjem od 10 μg/dl. Međutim, bezopasan nivo olova u organizmu još uvek nije definisan. Dnevne količine unetog olova, oralno i inhalacijom, mogu biti i oko 0,3 mg. Iste se delom eliminišu iz organizma ekskrecijom ali i akumuliraju pa se tako se u krvi normalno može naći oko 250 μg/l. Porast nivoa ovog metala u krvi je dalje umereno rizičan (250-490 μg/l), visokorizičan (500-690 μg/l) i urgentan, sa više od 700 μg/l telesne tečnosti. Olovo nije esencijalni metal, ali uneto u organizam može se naći u gotovo svim tkivima i organima sisara. Nakon unošenja u organizam olovo ispoljava toksični efekat na jetru, bubrege i mozak, koji se i smatraju ciljanim organima za njegov uticaj. Kao metal sa kumulativnim dejstvom olovo je konkurentno esencijalnim metalima (gvožđu, kalcijumu, bakru i cinku) za njihove brojne funkcije u organizmu, posebno one vezane za prisustvo slobodnih SH grupa u delovima biomolekula proteina i enzima. 9

2.2.2. Kadmijum Prema geohemijskoj klasifikaciji hemijskih elemenata on je litofilni i halkofilni element. Relativno je redak metal koji se nalazi na 67. mestu po zastupljenosti u Zemljinoj kori. Do ph 8 je uvek prisutan kao dvovalentno pozitivan jon (pod uslovom da se u sredini ne nalaze fosfati i sulfati koji ga mogu istaložiti), kada se može lako sorbovati na suspendovanim česticama ili nagraditi kompleksna jedinjenja sa organskim ligandima. Tako, sa akvatičnim huminskim supstancama u zemljištu gradi humatne komplekse. Kadmijum je označen kao jedan od 126 najvećih zagađivača životne sredine od strane Agencije za zaštitu životne sredine USA. Kadmijum je element sa vrlo toksičnim dejstvom za biljke, životinje i čoveka. Cd i Zn su vrlo slični, a pored toga Cd može zameniti (imitirati) ponašanje i nekih drugih esencijalnih elemenata u usvajanju iz zemljišta i metabolizmu. Glavni uzrok toksičnosti kadmijumom predstavlja veliki afinitet Cd za tiolne grupe (SH) u enzimima i u drugim proteinima. Višak Cd takođe može poremetiti metabolizam Fe i izazvati hlorozu. U ishrani životinja i ljudi Cd je kumulativni otrov. Remeti metabolizam Ca i P, te uzrokuje bolest kostiju, ali i respiratornih organa i nervnog sistema. Brzo se transportuje iz tla u biljku. Pristupačnost mu u najvećoj meri zavisi od ph, i prisustva ostalih katjona. Ca i Zn smanjuju usvajanje Cd, a transport u velikoj meri zavisi od koncentracije u okolini. Utvrđeno je da 30-60% kadmijuma, sadržanog u biljkama dolazi direktno iz atmosfere, a 40-60% iz zemljišta. Jedan od načina kojim on dospeva u zemljište su mineralna đubriva, koja se dobijaju razlaganjem sirovih fosfata mineralnim kiselinama. Kod brojnih biljnih vrsta intenzitet transporta kadmijuma u nadzemne organe je u korelaciji sa njegovom koncentracijom u hranljivoj podlozi. Kadmijum usvojen iz hranljive podloge najvećim delom se zadržava u korenu. Udeo ovog elementa u stablu i listovima biljaka je približno isti, ali manji od njegove koncentracije u podzemnom delu biljke. Veće koncentracije u biljkama inhibiraju metabolizam gvožđa i smanjuju intenzitet fotosinteze. Isto tako, visoke koncentracije kadmijuma inhibiraju disanje i transport elektrona u procesu oksidativne fosforizacije. Najveći izvor inhalacione intoksikacije kadmijumom je pušenje. Preko duvanskog dima 50% kadmijuma se apsorbuje iz pluća u sistemsku cirkulaciju u toku aktivnog pušenja. Kadmijum se unosi u organizam u obliku para i čestica prašine kao oksid, hlorid, fluorid, sulfid, karbonat i acetat. Apsorpcija se uglavnom odvija respiratornim putem, a manjim delom gastrointestinalnim traktom, dok je transkutani put (putem kože) neznatan. Kod nepušača je prosečna koncentracija kadmijuma u krvi oko 0,5 μg/l. Preko industrijskog otpada kadmijum ulazi u sastav površinskih voda. Oko 90% kadmijuma u biljkama dospeva iz zemljišta, a oko 10% iz atmosfere. Preko zagađenog zemljišta i vode biljke su polazna karika ishrane i osnovni izvor kadmijuma za životinje i ljude. Unos ovog metala vazduhom je oko 0,5 μg dan, dok putem vode oko 1 μg dan. Najveća količina kadmijuma se unosi putem kontaminirane hrane (pirinač, iznutrice, pečurke). Koncentracija kadmijuma u vodi za piće treba da bude manja od 1μg l. Po ulasku u organizam, kadmijum se transportuje u krv pomoću crvenih krvnih zrnaca i visoko molekularnog proteina krvi-albumina. Normalni nivo kadmijuma u krvi kod odraslih osoba manji je od 1μg/l. Iako se kadmijum širi putem krvi kroz ceo organizam, najveća akumulacija (od 50 do 60% telesnog opterećenja kadmijumom) je u bubrezima i u jetri.opterećenje kadmijumom, naročito u bubrezima, uglavnom linearno raste sa godinama, do 50-60. godine starosti, nakon čega nivo kadmijuma u bubrezima ostaje konstantan ili vrlo malo opadne. 10

Visoko toksičan efekat kadmijuma, rezultat je njegovih interakcija sa neophodnim mikro i makro bioelementima, posebno sa gvožđem, kalcijumom, bakrom i cinkom. 2.2.3. Bakar Bakar je zastupljen je u Zemljinoj kori u količini od 55 ppm u vidu minerala: halkopirita (Cu2S x FeS2), halkozina (Cu2S), kuprita (Cu2O) i drugih. Biljke ga usvajaju u vidu jona bakra Cu 2+ ili u vidu helata. Za usvajanje bakra iz zemljišta je neophodna energija, mada se smatra i da postoji specifičan receptor koji igra ulogu prenosioca bakra. Prilikom usvajanja bakra iz zemljišta glavnu konkurenciju mu čine mangan, gvožđe i cink. Ispitivanja su pokazala da biljke koje imaju visoke koncentracije kiseonika i fosfora uglavnom odlikuje i niska koncentracija bakra. Najveća koncentracija bakra se nalazi u korenu biljaka, zbog relativno slabe translokacije kroz ostale delove biljke. Biljke u proseku sadrže između 2-20 ppm bakra u suvoj supstanci, dok one koje imaju koncentraciju ispod 4 ppm, spadaju u slabo snabdevene biljke. Bakar koji se nalazi u zemljištu vodi poreklo iz primarnih minerala gde se nalazi u jednovalentnom obliku, a nakon njihovog raspadanja oksiduje u Cu 2+ oblik. Bakar zajedno sa organskim kiselinama u zemljištu gradi stabilne komplekse i kao takav je biljkama slabo dostupan. Manjak bakra se zbog toga uglavnom nalazi na zemljištima koja su bogata humusom. Pokretljivost bakra kroz različite delove biljke je osrednja. Uzlazni transport kroz biljku i iskorišćenje zavise od stepena obezbeđenosti biljaka ovim elementom. Ukoliko ga nema dovoljno u zemljištu, premeštanje iz korena u nadzemne delove, kao iz pravca starijih listova u mlađe, je jako mala, skoro neznatna. Koncentracija ovog elementa se kreće u proseku od 5 do 30 mg/kg suve materije. Ukoliko je udeo bakra manji od 4% suve biljke, onda se smatra da datim biljkama nedostaje bakar, dok je u slučajevima kada njegova koncentracija iznosi od 20 do 100 mg/kg, smatra se da te biljke imaju veliku koncentraciju ovog elementa. Osetljivost i reakcije biljaka na njegov nedostatak su jako različite. Osnovni znaci na biljci koji ukazuju na nedostatak bakra su venjenje listova, savijanje istih, hloroza, odumiranje mladih listova, nekroza i smanjenje prinosa biljaka. Toksični efekat ovog elementa se javlja kada je njegov ukupan sadržaj u zemljištu od 25 do 40 mg/kg i ukoliko je udružen sa kiselim zemljištem čija se ph vrednost kreće oko 5,5. Uglavnom se visoke koncentracije bakra javljaju u kiselim zemljištima. Bakru, kao ekološkom činiocu, treba posvetiti posebnu pažnju, s obzirom da je u visokim koncentracijama jako toksičan. 2.2.4. Cink Cink biljke usvajaju u obliku jona Zn 2+, ZnCl +, Zn helata i za razliku od Fe, Mn, Cu i Mo u biljkama se uvek nalazi u formi Zn 2+. Slično kao i bakar, cink se apsorbuje iz zemljišta aktivnim putem, pri čemu na njegovo usvajanja negativno deluju visoke koncentracije kalcijuma i magnezijuma. Biološka i fiziološka uloga cinka je ogromna imajući u vidu da učestvuje u sintezi DNK, RNK, proteina kao i u sintezi biljnog hormona auksina. Najniža fiziološki podnošljiva koncentracija cinka u suvoj materiji biljaka iznosi 15 30 ppm. Višak cinka u biljkama se javlja uglavnom na kiselim podlogama. Gornja granica koncentracije cinka koju biljka može da podnese iznosi između 200-500 ppm preračunato na suvu materiju lišća. Osnovni izvor cinka u zemljištu jesu primarni i sekundarni minerali. Granit i gnajs kao kisele stene sadrže manju koncentraciju cinka u odnosu na basalt koji je alkalne prirode. Nedostatak cinka koji biljka može da usvoji javlja se najčešce na teškim glinovitim podlogama. Cink spada u grupu elemenata čija je pokretljivost kroz različite delove biljaka osrednja. U slučaju kada je njegova koncentracija u zemljištu mala, izuzetno je slab intenzitet prenošenja iz starijih u mlađe delove biljke. U slučajevima kada je njegova koncentracija u zemljištu visoka, uglavnom se taloži u korenu biljaka. Koncentracija ovog elementa u suvoj 11

materiji biljaka u proseku se kreće od 30 do 150 mg/kg, a najčešće se nalazi u opsegu između 20 do 50 mg/kg. Ukoliko je njegova koncentracija u biljkama između 10 i 20 mg/kg suve materije, može se smatrati da ovakavo stanje ima jako toksičan, čak letalan efekat na biljku u smislu nedostatka ovog elementa. S obzirom da cink ima višestruku ulogu u rastu i razvoju biljaka, njegov nedostatak izaziva velike promene, kako u razmeni materija, tako i u morfološkoj i anatomskoj građi biljaka. Po svojoj prirodi i efektima, cink spada u grupu umereno toksičnih metala. Njegova toksičnost za biljke je manja u odnosu na stepen toksičnosti koji je karakterističan za bakar. Prvi znaci visoke koncentracije cinka javljaju se na kiselim tresetnim zemljištima, kao i na zemljištima koja su nastala iz matičnog supstrata bogatog cinkom, kao i u okolini rudnika i topionica cinka. Jasni znaci viška ovog elementa javljaju se kada njegova koncentracija u suvoj materiji prelazi 300 do 5000 mg/kg. U takvim slučajevima kod biljaka dolazi do nižeg rasta, smanjenja korenovog sistema, obrazovanja sitnih listova i njihove nekroze. 2.2.5. Nikl Nikl gradi dva tipa jedinjenja: nikl(ii) i nikl(iii). Veoma retko se nalazi u vidu ovih drugih jedinjenja. Od poznatijih jedinjenja sa oksidacionim stanjem +2, tu su svakako nikl sulfat- NiSO4, i nikl hlorid-nicl2, koji se koriste kao komponente elektrolita za elektrohemijsko nanošenje nikla na metale. Problem koji se javlja u procesima galvanske zaštite metala su otpadne vode koje se moraju prečistiti pre ispuštanja u reke. Za to se koriste različiti postupci. Osim njih, poznat je i nikl hipofosfit, koji služi kao komponenta rastvora za hemijsko nanošenje prevlaka, takođe i nikl tetrakarbonil, kompleksno jedinjenje koje se primenjuje u organskoj sintezi. Još jedno jedinjenje koje ima veliki značaj jeste NiO2. Iako je nikl ovde u oksidacionom stanju +4, i ovo je jedno od retkih jedinjenja nikla u ovom oksidacionom stanju, ovaj oksid je našao primenu u izradi Ni-Cd akumulatorima. Oni predstavljaju izuzetan problem kao otpad, nakon prestanka korišćenja, te se moraju pažljivo i kontrolisano odlagati pre procesa reciklaže, koji je u poslednjim decenijama razvijen u svetu i kod nas. Tako će se na najbolji način unaprediti stanje životne sredine i smanjiti štetni uticaj nikla. Nikl spada u grupu teških metala. Rasprostranjen je u prirodi. Veoma je toksičan metal i može veoma štetno uticati na životnu sredinu ali je zbog svojih osobina našao je široku primenu. Veliki sadržaj nikla u hrani direktno zavisi od njegovog sadržaja u zemljištu. Pravilnom upotrebom hemijskih sredstava u poljoprivrednoj proizvodnji, smanjuje se rizik od pojave nikla u hrani i tako eliminiše mogućnost pojave bolesti kod biljaka koja može u lancu ishrane izazvati i razne bolesti kod čoveka. Posebna uloga nikla u uticaju na stanje životne sredine je prisustvo ovog metala u zemljištu i vodi. Prosečan sadržaj nikla u zemljištu je 40 mg/kg, a sadržaj zavisi od tipa zemljišta. Nikl se u biljkama nalazi u malim koncentracijama od 1-10 ppm, pretežno u dvovalentnom obliku. Gornja granica visoke koncentracije koja postaje toksična iznosi 10-50 ppm. Fiziološka uloga mu se ogleda u pomaganju biljkama pri usvajanju gvožđa. Jako je bitan za aktivnost enzima ureaze, a ima uticaj i na klijanje semena. Dva najveća izvora nikla u zemljištu su matični supstrat i čovek, koji upotrebom poljoprivrednih materijala i nepravilnim odlaganjem različitih proizvoda koji sadrže nikl, povećava sadržaj ovog metala u zemljištu. Nikl ima dobru pokretljivost kako u ksilemu tako i u floemu (biljnim tkivima) i u značajnoj količini se nakuplja u plodovima i semenu. Uočeno je da višak nikla izaziva hlorozu koja podseća na hlorozu izazvanu nedostatkom gvožđa. Nikl nepovoljno utiče ne samo na pokretljivost, odnosno translokaciju gvožđa, već i na samo njegovo usvajanje. Ispitivanjem uticaja nikla na porast paradajza ustanovljeno je da relativno male koncentracije mogu 12

izazvati hlorozu, naročito kod mladih listova. Kod ovsa dolazi do nekroze a kod pšenice, suncokreta i kukuruza do smanjenja rasta. Visoke koncentracije nikla u zemljištu izazivaju pojavu oboljenja kod biljaka, a korišćenje biljaka u ishrani ljudi i životinja mogu da prouzrokuju pojavu malignih oboljenja, kao rezultat inhibicije nekih enzima i poremećaja u radu imunološkog sistema. Nikl se u vodi nalazi u vidu Ni 2+ jona. MDK u vodi je 0,01mg/l. Povećan sadržaj nikla u vodi može izazvati oboljenja bubrega kod čoveka. 2.2.6. Toksični efekti teških metala u biljkama U ekološkom pogledu, svaki metal, ili metaloid koji prouzrokuje problem u životnoj sredini, odnosno onaj koji se ne može biološki uništiti, trebalo bi posmatrati kao teški metal. Teški metali su prirodne komponente Zemljine kore, ali su koncentracije nekih od njih, u mnogim ekosistemima, dostigle toksične nivoe, pre svega kao posledica antropogenih aktivnosti. Do današnjih dana, ukupno 53 elementa je svrstano u kategoriju teških metala, koja je preciznije definisana kao grupa elemenata čija je gustina veća od 5 g/cm 3. Na osnovu svoje rastvorljivosti u fiziološkim uslovima, 17 teških metala može biti relativno lako dostupno živim ćelijama, te su zato oni od posebnog značaja za organizme i ekosisteme u celini. Fe, Mo i Mn su važni kao mikronutrijenti, Zn, Ni, Cu, V, Co, W i Cr su toksični elementi neophodni u tragovima, dok As, Hg, Ag, Sb, Cd, Pb i U, nemaju nikakvu poznatu korisnu ulogu i oni su toksični po žive organizme Mnogi autori ukazuju da se i elementi kao što su: Cu, Zn, Ni i Co mogu smatrati esencijalnim za normalan rast i metabolizam, jer je odavno poznato da su neophodni u brojnim fiziološkim procesima koji se odvijaju u biljkama. Većina ovih metala su kofaktori enzima i uključeni su u važne procese kao što su fotosinteza (Cu, Mn), transkripcija DNK (Zn), hidroliza uree u CO2 i NH3 (Ni), kao i nodulacija (stvaranje čvorova) kod leguminoza i fiksacija azota (Co, Zn); neki od njih igraju važnu ulogu u cvetanju i produkciji semena, kao i porastu biljaka (Cu, Zn) (tabela2). Da bi se biljke normalno razvijale i rasle, one moraju održavati koncentracije ovih esencijalnih elemenata u okviru optimalnih vrednosti (stanje homeostaze). Kada njihove koncentracije pređu te vrednosti, metali mogu ispoljiti i svoje toksične efekte (fitotoksičnost), koji se obično ogledaju u redukovanoj biomasi, hlorozi lišća (smanjenje intenziteta fotosinteze), inhibiranju rasta korena, kao i morfološkim alteracijama (slika1). Na celularnom nivou, posledice produžene izloženosti visokim koncentracijama metala mogu biti dezintegracija membrane, gubitak jona, peroksidacija lipida, degradacija DNK/RNK i konačno smrt ćelije. Fitotoksičnost je pre svega povezana sa neesencijalnim metalima kao što su to: As, Cd, Pb i Cr, koji uobičajeno imaju i veoma niske pragove toksičnosti (tabela 2). Slika 5. Kriva zavisnosti mase biljaka od koncentracije metala (Zn i Cd) Za esencijalne mikronutrijente postoji gornja granica rasta biljaka u odnosu na niske i visoke koncentracije metala. Kada su koncentracije Zn ispod donjih kritičnih vrednosti, biljke će 13

ispoljavati deficit, ali ako su koncentracije iznad gornjih granica, biljke će pokazati toksičnost izazvanu viškom cinka. Kako bi se biljke normalno razvijale i rasle, one moraju održavati koncentracije esencijalnih mikronutrijenata u okviru optimalnih vrednosti. Neesencijalani elementi nisu neophodni za rast biljaka. Kada je koncentracija Cd na primer, ispod graničnih vrednosti, biljke će biti tolerantne. U suprotnom, kada koncentracija Cd pređe granične vrednosti biljke će postati osetljive. Tabela 2.2. Uloga metala u biljkama i mogući toksični efekti sa odgovarajućim koncentracijama Prag toksičnosti Normalne u tkivu koncentracije Metal Funkcija u biljkama Toksični efekti biljaka (mg/kg suve (mg/kg suve mase) mase) Cu Redoks aktivan; odlučujući kofaktor komponenata lanca transporta elektrona u mitohondrijama i hloroplastu; konstituent brojnih enzima; važna uloga u kvalitetu reprodukcije i roda biljne kulture; asimilacija CO2 i sinteza ATP. Usporen biljni rast i hloroza lišća. 4-15 5-20 15-20 2-100 Pb / Inhibicija enzimske aktivnosti vezivanjem na sulfhidrilne grupe, vodni disbalans, promene u permeabilnosti membrane i poremećaj mineralne ishrane. 1-13 0.2-20 10-20 30-300 Zn Konstituent enzima i ćelijske membrane; aktivacija enzima; transkripcija DNK; učešće u reprodukciji i određivanju roda i kvaliteta biljnih kultura; otpornost na biotičke i abiotičke stresove; čvorovanje kod mahuna i fiksacija azota; redoks neaktivan. Cd / Ograničen rast korena i izdanka, kao i hloroza pre svega mladog lišća. Višak cinka može izazvati deficitarnost u bakru, manganu i fosforu. Direktno - oštećenje ćelijske strukture, ili indirektno zamena esencijalnih metala. Inhibicija metabolizma gvožđa, hloroza; inhibicija disanja i transporta elektrona u procesu oksidativne fosforilacije; inhibicija transpiracije kao i stominih pokreta. 8-100 1-400 0.1-2.4 150-200 100-400 5-10 10-20 5-30 Ni Konstituent enzima; aktivacija ureaze Hloroza koja podseća na hlorozu izazvanu nedostatkom gvožđa. Nepovoljno utiče ne samo na translokaciju Fe, već i na samo njegovo usvajanje; poremećaji u balansu nutritijenata, vode i funkciji ćelijske membrane. 1 0.02-5 20-30 10 kod osetljivih vrsta 50 kod umereno tolerantnih vrsta 10-100 Brojne biohemijske reakcije postoje u biljkama koje trpe stres izazvan metalima, ili metaloidima. Većina ovih reakcija nastaje kao posledica zamene u katjonskim centrima proteina, 14

zatim visokog afiniteta za vezivanje na tiolne grupe metabolički važnih molekula (blokiranje funkcionalnih grupa enzima), ili pak povećanja produkcije reaktivnih kiseoničnih vrsta, tj. radikala (Reactive Oxygen Species, ROS) (slika 6). Produkcija slobodnih radikala je inače efekat koji se uobičajeno javlja kod svih stresnih uslova koji se mogu pojaviti u okruženju biljke kao što su: izraženi salinitet zemljišta, suša, ekstremne temperature, napad različitih vrsta patogena, kao i preterane koncentracije teških metala. Kao posledica nastalog oksidativnog stresa, javlja se akumulacija ROS molekula, koji pak dalje aktiviraju određeni odbrambeni mehanizam u biljci (slika 6), tako da se može reći da ROS imaju dvostruku ulogu: oni deluju i kao oksidacioni molekuli koji agresivno reaguju sa ćelijskim makromolekulima, ali i kao signalni molekuli koji pomažu biljci da oseti prisustvo metala. Preciznije rečeno, biljci je potrebno da oseti te sofisticirane promene u koncentracijama metala u svojim tkivima, odnosno promene koje se dešavaju već na nivou citoplazmatičnih koncentracija i koncentracija u organelama, radi pripreme za detoksifikaciju. Biljka u ove procese uključuje i enzimske (superoksid-dismutaza, SOD, katalaza, itd.) i neenzimske molekule (askorbat i glutation, GSH) koji imaju sposobnost detoksifikacije ROS. Slika 6. Toksični efekti teških metala u biljkama Afinitet teškog metala za vezivanje na proteine promeniće njihovu aktivnost i prouzrokovati disbalans i prekide koji vode do makromolekularnih oštećenja. Međutim, ćelije se mogu "podesiti" prema toksičnim metalima i signalizirati određene reakcije kako bi prevenirale oštećenja. Ljubičaste sfere-metali koji imaju oksido-redukcione sposobnosti; crvene i plave sfere- metali koji ne poseduju ove sposobnosti; zelene sfere- metalni centri u proteinima napadnuti od strane teških metala. 15

Vrlo često, međutim u slučajevima velike izloženosti, bilo koji od navedenih poremećaja, može dovesti i do uginuća biljaka. I dok životinje i ljudi mogu da se kreću i tako izbegnu kontaminirane predele, sa biljkama to nije slučaj, tako da su one prinuđene da pronađu drugačiju vrstu taktike kako bi mogle da se izbore sa ovim problemom. Neke biljke su u tome bile toliko uspešne, da su se razvile u takozvane tolerantne vrste, tj. vrste koje mogu opstati i razvijati se i na teško kontaminiranim terenima. Brojne studije ukazuju da te biljne vrste ovo ostvaruju adaptiranjem mehanizama koji su uključeni u homeostazu. Strategija usvojena od strane biljaka kao odgovor na visoke koncentracije teških metala u okruženju, regulisana je na molekularnom nivou i ogleda se u izbegavanju usvajanja preteranih količina metala u samu citoplazmu (citosol), gde metali u stvari i ispoljavaju svoju fitotoksičnost. Pri tome, primećeno je da biljke poseduju čitav niz celularnih mehanizama koji se potencijalno mogu uključiti u proces ostvarivanja ovog cilja, praktično u proces detoksifikacije teških metala, odnosno u proces tolerancije prema metalnom stresu. 2.2.7. Transport metala među biljnim tkivima Do današnjih dana ostalo je nerazjašnjeno da li je u proces detoksifikacije/tolerancije prema pojedinom metalu uključen samo jedan, ili više pomenutih mehanizama. Takođe je nedovoljno jasno kakvi su mehanizmi adaptacije uključeni u uslovima kada biljka raste na zemljištu koje je zasićeno prisustvom više teških metala. Postoji mišljenje da se u ovom slučaju razvija pojava poznata kao "kotolerancija" (co-tolerance) zasnovana na delovanju nedovoljno specifičnog mehanizma koji razvija otpornost prema širokom opsegu metala, ili pak pojava poznata kao "višestruka tolerancija" (multiple tolerance) koja uključuje seriju nezavisnih mehanizama specijalno razvijenih za svaki pojedini metal. Kako su dokazi za pojavu kotolerancije još uvek nedovoljno jaki, pretpostavlja se da je višestruka tolerancija onaj mehanizam koji je i realno moguć. Mnoge od esencijalnih uloga metala odvijaju se u fotosintetičkim tkivima nadzemnog dela biljke. Zbog toga se metali moraju transportovati iz korena do onih tkiva u kojima su potrebni za normalno funkcionisanje biljke. Iz epidermalnih ćelija korena, metalni joni se dalje mogu kretati kroz simplastične prolaze do pericikla, kako bi bili ubačeni u ksilem. Ovo je moguće ostvariti jedino aktivnim transportom. Metali dalje putuju kroz ksilem transpiracionim tokom, do nadzemnih delova. Kako se pojedina tkiva, kao što je tkivo semena, ne ishranjuju putem transpiracionog toka, to se ona moraju oslanjati na floem. Ovo se odnosi i na tkiva mladog lišća u razvoju, koja još uvek nemaju dobro oformljen ksilem (floem se diferencira mnogo brže u odnosu na ksilem). 2.2.8. Mehanizmi mobilizacije metala od strane biljaka i usvajanje Efikasno usvajanje esencijalnih metala neophodno je za normalan rast i razvoj biljaka, odnosno za održanje normalne homeostaze i svaka biljna vrsta u tom smislu, razvija odgovarajuće sposobnosti. Plazma-membrana korena biljke može se posmatrati kao prva živa struktura koja se nalazi na putu usvajanja metala u samu biljku. Najaktivnije područje ovog procesa nalazi se 20-40 mm iznad korenove kape. Sa ove tačke, bilo koja apsorbovana supstanca može da prolazi u druge delove biljke kroz sva živa tkiva (simplast floem i ćelijska citoplazma), ali i neživa tkiva (apoplast ćelijski zidovi i ksilem). Smatra se da metali mogu da uđu u biljku pasivno, prodiranjem vode, putem apsorpcije u simplast korena vođeni gradijentom elektrohemijskog potencijala same plazma-membrane, ili pak aktivno, uz učešće proteina smeštenih u dvostrukom lipidnom sloju membrane koji omogućavaju transport metala kroz plazmalemu (tzv.transportni proteini, ili proteini-transporteri). Naime, iako metalni joni mogu da difunduju u apoplast korena (prostor između ćelijskog zida i plazma-membrane), njihov dalji transport kroz apoplast je ustvari blokiran nepropusnim 16

prostorom smeštenim u endodermalnom sloju tkiva korena ( tzv. Kasparijev prostor). Na ovom mestu, metalni joni moraju dalje biti transportovani kroz plazmamembranu u simplastični prostor na jedan aktivan način. Ovaj transport u simplast epidermisa opet podrazumeva angažovanje transportnih proteina membrane. Familije proteina-transportera su brojne i uglavnom specifične za svaki pojedini metal. Tako na primer, Fe 2+ se primarno usvaja transporterom visoke specifičnosti IRT1 koji pripada tzv. familiji ZIP-proteina (Zinc-regulated transporter/iron-regulated transporter Proteins) koji omogućavaju transport dvovalentnih jona i kod korena i kod izdanka. Ekspresija (pojava) IRT1 je regulisana (dirigovana, uslovljena) nedostatkom Fe u zemljištu. Akumulacija Fe u tkivu biljke prilikom pojave IRT1, očigledno se javlja kao njen odgovor na izazvan stres. Ovo sve nameće zaključak o genetskoj kontroli ekspresije IRT1. Ovaj protein može transportovati i druge dvovalentne metalne jone, ali ne i Zn. Još uvek nije poznato koji su to tačno transporteri iz ZIP familije zaduženi za usvajanje Zn, ali se pretpostavlja da i Ni koristi isti put ulaska u biljku. ZIP transporteri takođe omogućavaju ulazak neesencijalnih jona Cd 2+ u ćelije korena. U ovom slučaju radi se o više ortologa. Pri ovome, primećeno je da visoke koncentracije Fe u zemljištu često redukuju usvajanje Cd od strane biljaka. I drugi dvovalentni metali, kao što su Zn, Ca, Mg i Cu, takođe mogu da inhibiraju usvajanje Cd iz rizosfernog rastvora, među kojima nivo Ca ima najjači uticaj. Naime, kako oba ova jona mogu prolaziti kroz membranu i putem katjonskih kanala, to je njihova kompeticija jako izražena. Dodatno, kako i Cd i Zn mogu biti transportovani u biljku istim transporterom ZNT1 (Zinc Transporter), to je odnos ova dva elementa (Zn/Cd), veoma značajan za eventualno kasnije ispoljavanje toksičnosti samog Cd. Za razliku od Fe, Zn i Cd koji se usvajaju kao dvovalentni joni, Cu se izgleda usvaja kao Cu + i to pomoću proteina COPT1 (Copper Transporter). Kako se Cu u zemljištu uglavnom nalazi kao dvovalentni jon, to se Cu 2+ prvo mora redukovati pomoću FRO2 enzima (feri-helat-reduktaza, koja inače redukuje i trovalentno Fe do dvovalentnog). Ipak, izgleda da je u nekim slučajevima moguće da se Cu usvaja i kao dvovalentni jon, jer je primećena akumulacija proteina ZIP familije u slučajevima deficijencije ovog jona. Neesencijalni arsen(v) se od strane biljaka lako mobiliše i usvaja kroz transportne kanale fosfata. Zbog njihove hemijske sličnosti, As(V) se nadmeće sa fosfatima u procesu usvajanja i interferiše sa metaboličkim procesima, kao što je sinteza ATP-a (adenozin-trifosfat) i oksidativna fosforilacija. Za olovo, kao još jedan izrazito toksičan element, biljke nemaju kanale za usvajanje i još uvek je nepoznato kako tačno ulazi u koren. Jedino se pouzdano zna da ovaj element može da ostane vezan na karboksilne grupe uronskih kiselina na površini korena. Količina olova koja se apsorbuje korenom uglavnom i ostaje u njemu, čineći tako koren prvom barijerom za dalju translokaciju Pb u nadzemne delove biljke, gde bi njegova fitotoksičnost mogla da dođe do fatalnog izražaja. U korenu, olovo se najvećim delom vezuje na ćelijski zid kao ekstraćelijski precipitat u vidu fosfata, ili karbonata. I druge metalne forme uobičajeno formiraju sulfatne, fosfatne, karbonatne i druge precipitate. Ovi precipitati se dalje imobilišu ne samo u apoplastičnim prostorima, kao što je ćelijski zid, već i u simplastičnim (unutarćelijskim) prostorima, kao što su vakuole. Vakuole su ćelijske organele koje se smatraju rezervoarima za čuvanje metala i to pre svega u ćelijama semena, kome su zalihe metala neophodne u onim inicijalnim fazama razvoja, kada usvajanje iz okolne sredine još uvek nije moguće. Iako su obično prisutni u zemljištu u dovoljnim količinama, metali su često teško dostupni usvajanju od strane biljaka, jer u podlozi predominantno postoje u svojim nerastvornim formama. 17

Tako na primer, Zn i Cu su obično adsorbovani na česticama gline, CaCO3, ili organsku materiju, dok se Fe sreće najčešće u vidu svojih hidroksida. Primećeno je da visoke vrednosti parametara kao što su kapacitet izmene katjona (cation exchange capacity, CEC) i ph zemljišta, redukuju dostupnost većine metala, samim tim i mobilnost i izluženje. Naime, primećeno je da usvajanje metala od strane biljaka više zavisi od njihovih biodostupnih frakcija, a manje od ukupne količine metala u zemljištu. U ovom smislu, ističe se dostupnost metala zavisi od: intenziteta adsorpcije metala na česticama zemljišta, sposobnosti biljaka da desorbuju i prenesu metale do svojih tkiva, ali i interakcije sa mikroorganizmima zemljišta. Kako bi se izborile sa nedostupnošću metala, tj. kako bi ih učinile dostupnijim za usvajanje (biodostupnost), biljke su razvile različite mehanizme. Tako se na primer, biljke iz familije trava (Poaceae), tj. monokotiledone biljke, služe strategijom baziranom na helatizaciji metala, dok su dikotiledone biljke razvile strategiju baziranu na promeni oksidacionog stanja metala (praktično na redukciji). Takođe, biljke se sa ovim problemom mogu izboriti i pokušajem zakišeljavanja zemljišta. 2.2.9. Transport koren-nadzemna tkiva Tačan transporter koji prevodi Fe u ksilem još uvek nije poznat, ali je najverovatnije da se Fe transportuje u helatnom obliku do drugih molekula. Kao kandidati za helatizaciju pojavljuju se citrati i nikocian-amin (NA). NA je nađen u svim višim biljkama i služi kao prekursor u formiranju fitosiderofora kod trava. Međutim, ph koje vlada u ksilemu favorizuje helatizaciju Fe sa citratima, pre nego sa NA. Nesumnjiva je činjenica da Fe postoji u ksilemu pre svega kao Fe 3+ -citrat (slika 3). Transporter citrata, feri-reduktaza FRD3, koja je smeštena na plazma-membrani pericikla korena i vaskularnog cilindra, je onaj protein koji isporučuje citrat u ksilem. Biljke koje nemaju ove proteine, hiperakumuliraju Fe u tkivu korena. Cink se isporučuje u ksilem na dugodometni transport preko HMA2 transportera (Heavy Metal transporting ATP-ases), koji su lokalizovani na plazma-membrani između korena i nadzemne vaskulature (slika 3). Generalno, HMAs proteini se dele u dve klase: oni koji transportuju monovalentne katjone (Cu/Ag grupa) i oni koji transportuju dvovalentne katjone (Zn/Co/Cd/Pb grupa). Ligandi koji bi mogli da omoguće transport Zn u nadzemne delove su NA i organske kiseline. Da isporučivanje Cu u vaskulaturu takođe postoji kroz HMAs familiju proteina, pokazali su i eksperimenti: ekspresija HMA5 postoji u korenu samo u slučaju previsokih koncentracija ovog metala u tom delu biljke. Akumulacijom HMA5, biljka nastoji da te visoke koncentracije prevede iz korena u nadzemne delove. Tom prilikom, Cu se izgleda pre svega helatizuje na NA. Biljke translociraju u svoje nadzemne organe čak i Pb, koje, kao ekstremno toksičan element inače nastoje da zadrže u korenu. Tako se preostalo nevezano Pb, preko Ca-kanala prvo prebacuje do Kasparijevog prostora endodermisa. Pri niskim koncentracijama Pb, ovaj prostor može da bude dobra barijera za dalje kretanje prema tkivu centralnog cilindra. Međutim, Pb se može helatizovati na fitohelatine i tako preneti u nove strukture. Takođe, neke biljke transportuju Pb do stabljika i listova u strukturama sličnim Pb-acetatu, Pb-nitratu i Pb-sulfidu. 2.2.10. Intracelularni transport Kada su jednom transportovani u odgovarajuće tkivo, metali se moraju ispravno distribuirati i na celularnom nivou, tj. u samoj ćeliji, kako bi se njihovi neophodni nivoi osigurali u odgovarajućim delovima ćelije, ili pak kako bi se bezbedno uklonili njihovi viškovi. Tako na 18

primer, Fe, Cu i Zn se moraju transportovati do hloroplasta, mitohondrija, ali i vakuola, što je sve takođe uslovljeno i omogućeno ekspresijom odgovarajućih proteina transportera. Slika 7. Međućelijski transport metala u dikotiledonim biljkama. Oblast kvadrata, tamno braon boje, predstavlja Kasparijev prostor; FRO2 i AHA enzimi koji doprinose boljem usvajanju metala; ZIP, IRT1, COPT1, HMAs, FRD3, YSL proteini transporteri; NA nikocian-amin Biljke mogu da poseduju čitav niz potencijalnih celularnih mehanizama koji su uključeni u procese detoksifikacije i tolerancije prema metalnom stresu, kao što su: 1. upotreba mikoriza u restrikciji kretanja metala prema korenu, 2. vezivanje metala na ćelijski zid i izlučivanje ekstracelularnih ekskudata korena, 3. redukovano usvajanje, ili čak ispumpavanje metala na plazma membrani korena, 4. helatizacija metala u citosolu različitim ligandima (peptidi bogati cisteinom: fitohelatini, PCs i metalotioneini, MTs, kao i amino- i organske kiseline) radi: a) popravke proteina membrane koji su oštećeni stresom (MTs i HSPs (Heat Shock Proteins, proteini indukovani toplotnim šokom)) i b) kompartmentacije metala u vakuole fitohelatinima i to transporterima lokalizovanim u tonoplastu (na primer: razmenjivač protona sa jonima metala, tj. antiporter: H + /katjon metala je protein koji je integralni deo fosfolipidne membrane i omogućuje aktivni transport dva jona u suprotnim pravcima, tj. omogućuje njihovu razmenu). Uloga mikoriza Uloga gljiva koje žive na korenju biljaka (pre svega drveća i žbunja), a posebno ektomikoriza, još uvek je nedovoljno jasna u smislu efekata koji se pojavljuju prilikom usvajanja metala od strane biljaka. Brojna istraživanja koja su se bavila ovim pitanjem pružila su kontradiktorne rezultate. Tako na primer, pokazalo se da ektomikorizalna gljivica Paxillus involutus zadržava Zn, tj. ne dozvoljava njegov prodor u tkiva biljke crnog bora (Pinus sylvestris), dok jedna druga ektomikorizalna gljivica: Thelephora terrestris, zadržava samo manju količinu cinka i čak omogućava povećanje sadržaja ovog metala u domaćinu. Naime, gljive pre svega ostvaruju restrikciju kretanja metala prema korenju biljke-domaćina, što se realizuje kroz: apsorpciju metala na samom gljivičnom omotaču, redukovani pristup metala u apoplast korena (u skladu sa hidrofobnošću samog štita), helatizaciju ekskudatima gljiva i adsorpciju na spoljašnjem micelijumu. 19

Vezivanje metala na ćelijski zid i izlučivanje ekstracelularnih ekskudata korena Vezivanje metala na ćelijski zid korena je još jedna kontroverzna tema, jer iako je ovaj biljni organ u direktnom kontaktu sa zemljišnim rastvorom, adsorpcija metala na ćelijskom zidu mora da bude ograničenog kapaciteta, te zbog toga ima i ograničeni uticaj na aktivnost metala na površini plazma-membrane. Ipak, istraživanja su pokazala da metal-tolerantna vrsta, Silene vulgaris ssp. humilis akumulira brojne metale na ćelijskom zidu epidermisa, podjednako vezane na proteine, ili pak u vidu silikata. Ćelijski zid korena identifikovan je kao krucijalno mesto nagomilavanja kod biljaka, kao i da je ta depozicija jedan od odlučujućih mehanizama u toleranciji teških metala. Pretpostavlja se, naime, da zbog svog negativnog naelektrisanja, ćelijski zid ima značajan kapacitet za vezivanje i zadržavanje teških metala. Analiza lokalizacije Cd elektronskim mikroskopom pokazala je da ćelijski zid korena sadrži najveći deo ovog metala u poređenju sa sadržajem u citoplazmi. Mnogo pouzdaniji dokazi nađeni su na polju izlučivanja različitih ekskudata biljaka, za koje se pokazalo da mogu na više načina da deluju na metale iz zemljišta. Ekskudati biljaka uobičajeno sadrže ligande koji su pogodni za helatizaciju metala (brojne amino i organske kiseline, itd.), te se njihovim izlučivanjem u zemljište uobičajeno mobilišu mnogi metalni joni, koji na taj način postaju dostupniji za usvajanje. Slika 8. Sistemi koji su uključeni u usvajanje i translokaciju od korena do izdanka, kao i sekvestraciju teških metala kod biljaka hiperakumulatora Uloga plazmaleme Visoke koncentracije teških metala (posebno Cu) mogu značajno uticati na funkciju plazmaleme. Tako je na primer, bilo pokazano da visoke koncentracije Cu, ali ne i Zn, izazivaju povećani efluks K + -jona iz korenja Agrostis capilaris. Sličan efekat Cu je pokazao i na druge jone, te se danas smatra da je ovo "curenje" jona glavni pokazatelj oštećenja membrane usled toksičnog 20

dejstva Cu. Ovakvo oštećenje može biti rezultat različitih mehanizama uključujući oksidaciju i unakrsno vezivanje tiolnih grupa proteina, inhibiciju ključnih membranskih proteina, kao i promenu u sastavu i permeabilnosti lipida membrane. Kontradiktorno, tolerancija može obuhvatiti zaštitu integriteta plazma-membrane čak i putem povećanog curenja ćelijskog rastvora, mada u ovom smislu, još nema dovoljno dokaza. Drugi faktor koji može biti uključen u održanje integriteta membrane u prisustvu teških metala može biti i poboljšana reparacija membrane posle njenog oštećenja. Ovo uobičajeno podrazumeva učešće proteina indukovanih toplotnim stresom (Heat Shock Proteins) i metalotioneina (MTs). Sledeći faktori koji igraju značajnu ulogu u homeostazi metala jesu prevencija, ili redukcija njihovog ulaska u biljnu ćeliju, ili pak aktivni efluks, odnosno izbacivanje metala ukoliko su već usvojeni u citosolu. Međutim, kako su mnogi od metala i esencijalni za biljke, to njihova potpuna ekskluzija nije moguća; selektivni efluks je mnogo verovatniji. Najjasniji primer redukovanog usvajanja kao mehanizma tolerancije stečenog adaptacijom vezan je za As: kod genotipa biljke Holcus lanatus koji je tolerantan prema ovom metaloidu, iznosi usvajanja su mnogo niži nego kod netolerantnog genotipa. Tolerantne biljke verovatno razvijaju supresiju transportnog sistema visokog afiniteta i to zajedno sa povećanom produkcijom fitohelatina ( PCs), pošto se značajne količine As svakako još uvek mogu naći u citosolu. Alternativna strategija za kontrolu intracelularnih nivoa metala, aktivni efluks (efluks pumping) je mehanizam za koji postoji vrlo malo direktnih dokaza. Kod bakterija, međutim, ovo je osnova skoro svih rezistencija prema toksičnim jonima, gde su uključeni transporteri kao što su ATP-aze P-tipa, ili katjon/h + antiporteri. Kod biljaka, efluks transporteri koji su identifikovani su: CPx-ATP-aze, NRAMP (Natural Resistance Associated Macrophage Protein), familija proteina CDF (Cation Diffusion Facilitator) i familija ZIP proteina. Uloga helatora metala Proteini indukovani toplotnim šokom Proteini indukovani toplotnim šokom (HSPs) su pronađeni u svim vrstama organizama, kao odgovor na stresne uslove, pa tako i u slučajevima metalnog stresa. Mogu biti različite molekulske mase, pa se razlikuju "sitni" i "krupni" HSPs. HSPs su odgovorni za normalno funkcionisanje proteina, ali imaju i ulogu u njihovoj zaštiti i reparaciji. U uslovima visokih koncentracija teških metala kao što su Cu i Cd na primer, primećena je povećana ekspresija ovih proteina kod mnogih metaltolerantnih biljaka i to kako u nukleusu i citosolu, tako i u plazma-membrani (praktično, zaštita i unutrašnjosti ćelije i same membrane). Fitohelatini Jedan od najvažnijih mehanizama u detoksifikaciji i toleranciji prema teškim metalima predstavlja stvaranje helata u citosolu ćelije. Ovo se odvija zahvaljujući prisustvu onih molekula koji imaju visok afinitet prema metalima, te tako grade sa njima odgovarajuće komplekse. Kao što je već istaknuto, potencijalni ligandi u ovom slučaju su amino-kiseline, organske kiseline i peptidi bogati cisteinom: fitohelatini (PCs) i metalotioneini (MTs). PCs su peptidi koji se indukuju u biljci vrlo brzo posle izlaganja metalnom stresu. PCs se sintetišu uz enzim PC-sitaza koji se aktivira upravo u prisustvu metalnih jona koristeći kao supstrat molekul glutationa. Osim funkcije prekursora fitohelatina, GSH se danas smatra najvažnijim 21

antioksidantom uključenim u ćelijsku odbranu od toksikanata; on funkcioniše kao direktni "hvatač" slobodnih radikala nastalih u biljci koja se razvija pod stresnim uslovima. Koristeći biljku Brassica juncea, bilo je pokazano da se ovi peptidi brzo biosintetišu u ćeliji posle izlaganja visokim koncentracijama Cd i to čak u količini koja je teoretski bila dovoljna da helatizuje sav usvojeni Cd. PCs helatizuju slobodne jone Cd preko tiolnih grupa cisteina, štiteći na taj način citosol od toksičnih efekata ovog opasnog polutanta, dok poslednji korak u Cddetoksifikaciji uključuje akumulaciju helata Cd-PCs u vakuolama. Osim Cd, PCs su važni i za detoksifikaciju od As, ali zato nije do kraja jasno kakvu ulogu igraju u detoksifikaciji Zn, Ni i Se. Takođe, njihova uloga u detoksifikaciji Cu još uvek nije dovoljno jasno potvrđena. PCs takođe mogu helatizovati i druge ekstremno toksične metale, kao što je olovo. Metalotioneini Metalotioneini (MTs) su polipeptidi koji su lokalizovani u citosolu i mogu da helatizuju metalne jone formirajući komplekse. Oni se produkuju kao odgovor na metalni stres i mogu se klasifikovati u dve osnovne grupe. Klasa 1MTs poseduje ostatke cisteina koji se mogu porediti sa ostacima cisteina kod MTs sisara, dok se ova paralela ne može povući kod klase 2MTs. Mnoge više biljke imaju i više klasa ove familije proteina, ali njihova potpuna uloga u detoksifikaciji teških metala tek treba da bude objašnjena. Smatra se da mogu imati značajnu ulogu u vezivanju Cd. Takođe se smatra ispravnim da oni mogu delovati u popravci oštećene membrane i kao antioksidansi. Organske kiseline i amino-kiseline Karboksilne kiseline kao što su: limunska, jabučna i amino-kiseline poput histidina (His) i NA su helatori teških metala, tako da se pretpostavlja da mogu uzeti ušešća i u procesima detoksifikacije. Tako na primer, zapaženo je povećanje koncentracije His u ksilemu i do 36 puta veće u odnosu na normalno, onda kada je biljka hiperakumulator Ni bila izložena visokim nivoima ovog metala. Histidin takođe može biti i konstituent ekskudata korena. Kompartmentalizacija u vakuole Većina stručne javnosti se slaže da opisani efluks jona kroz plazma-membranu i transport u vakuole predstavljaju dva najvažnija mehanizma tolerancije. Kompartmentalizacija u vakuole potvrđena je u slučaju mnogih metala. Tako na primer, pomenuti mehanizam transporta Cd u vakuole fitohelatinima se pokazao uspešnim i u slučaju Zn, što je bilo potvrđeno eksperimentima sa Zn 65 obeleženim jonom. Međutim, izgleda da ovo nije slučaj kada je u pitanju jon Ni. Moguće je da se Ni i neki drugi metalni joni ubacuju u vakuole putem razmene sa jonima H +, tj. sistemom katjon/h + antiportera, ali i ova pretpostavka još uvek nije nesumnjivo potvrđena. Za Zn se pouzdano zna da se može prebaciti iz citosola u vakuolu putem Zn 2+ /H + antiportera, a isto važi i za Cd (pomoću Cd/H + antiportera). 22

2.3. Načini pripreme biljnih uzoraka za analizu 2.3.1. Postupak mokrog razaranja Ove metode su malo manje zavisne od prirode uzorka jer velike količine dodatog reagensa teže da potisnu uticaj raznolikosti sastava. One su stoga verovatno prvi izbor kada se radi sa novom vrstom uzorka, pa se mokri postupak oksidacije realno može preporučiti za dobijanje svakog elementa. Kod tradicionalnog mokrog postupka razaranja uzorak se razgrađuje u Kjeldahl boci za spaljivanje sa dugačkim grlom. Međutim, tip aparata prikazan na Slici 8 ima mnogo prednosti u odnosu na tradicionalnu Kjeldahl metodu, i preporučuje se njegova upotreba. Ključna karakteristika je slavina (A) sa tri položaja, koja se koristi da se omogući refluks (položaj a) ili destilacija (položaj b) i uklanjanje destilata (položaj c). Njenom primenom, oksidacioni potencijal sistema se može stabilizovati omogućavanjem refluksa smeše kiseline, ili se može pospešiti omogućavajući destilaciju, i zatim ponovo stabilisati ispuštanjem destilata i vraćanjem u položaj za refluks. Mogu se izdvojiti frakcije destilata, sačuvati za kasnije tretmane, ili ispitati (u slobodno vreme u toku ispitivanja). U nekim slučajevima pogodno je koristiti bocu sa dva grla umesto sa jednim (kao što je prikazano), da bi se stavio termometar u bocu. Na ovaj način, dužina stupnjeva destilacije se može kontrolisati preko temperature koju dostiže reakcioni rastvor; ovo može biti posebno važno kod smeša koje sadrže perhlornu kiselinu. Slika 9. Aparatura za kontrolisano razaranje organskih materija Predložene su različite smeše za razaranje, ali do sada nema ni jedne smeše koja na odgovarajući način razara sve uzorke sa potpunim dobijanjem svih tragova metala. Smeša azotne i sumporne kiseline Ovo je najčešće korišćena smeša oksidacionih sredstava, i u jednoj i u drugoj opisanoj varijanti je pogodna za dobijanje praktično svih elemenata osim selena, i moguće rutenijuma i osmijuma, iz skoro svih tipova uzoraka, osim možda onih koji sadrže kovalentni hlorin. U ovom poslednjem slučaju mogu nastupiti problemi sa elementima kao što je arsen ili germanijum gde se mogu formirati isparljivi hloridi. 23

Problemi mogu nastati kod uzoraka bogatih kalcijumom, jer usled taloženja kalcijum-sulfata mogu nastati gubici usled koprecipitacije. Iako se većina metala dobija u potpunosti, razaranje je sporo a potpuna razgradnja masti može da traje i do 24 h; sloj masti se obično izdvoji bez razgradnje. Mnoge laboratorije još uvek koriste ovu metodu radije nego upotrebu perhlorne kiseline, koja može biti štetna u drvenim digestorima. Smeše sa perhlornom kiselinom Perhlorna kiselina se može koristiti kao mali finalni dodatak u postupku koji se uglavnom bazira na drugim oksidansima, ili kao glavni konstituent prisutan u sistemu od početka. U oba slučaja moraju se preduzeti mere zaštite kod rukovanja perhlornom kiselinom. Ne preporučuje se da se koristi perhlorna kiselina za razgradnju osim u prisustvu viška azotne kiseline; azotna kiselina efikasno oksidiše većinu reaktivnih jedinjenja u uzorku pri srazmerno niskim temperaturama, gde perhlorna kiselina nije efikasna, i pri nastavljenom zagrevanju povećana snaga oksidacije perhlorne kiseline će delovati u pravcu dovršavanja razgradnje. 2.3.2. Postupak suvog razaranja Mnogo je teže opisati suvu oksidaciju koja zadovoljava potrebe širokog spektra uzoraka. Verovatno da ima toliko varijacija u osnovi postupka suvog razaranja, koliko ima i prehrambenih analitičara i upoređivanje rezultata je često veoma teško, ali za davanje osnove za neophodne varijacije sledeći postupak bi trebalo da bude odgovarajući. Suština ovog postupka je u tome da se za razgradnju organskog dela uzorka koristi atmosferski kiseonik. Prednost mokrog postupka razaranja je što je dosta brz, potrebna je jednostavna aparatura i manje su sklonosti ka gubicima usled isparavanja i zadržavanja na zidovima posude zahvaljujućim tečnim uslovima i niskim temperaturama. Nedostaci su: da je zbog velike količine reagenasa potrebna slepa proba, nije pogodan za velike uzorke (do 10 g) i potrebno je značajno nadgledanje. Nasuprot tome, postupak suvog razaranja ima i prednosti i nedostatke koji su skoro suprotni postupku mokrog razaranja. Lako se radi sa velikim uzorcima, ništa ili malo reagensa se dodaje, tako da je problem slepe probe sveden na minimum i potrebno je malo nadgledanja. Problem je što je potrebno više vremena, oprema je skuplja i veća je mogućnost da dođe do gubitaka usled isparavanja i zadržavanja na zidovima posude usled visoke temperature i suvih uslova. 24

2.4. Atomska apsorpciona spektrofotometrija Atomska apsorpciona spektrofotometrija je apsorpciona metoda koja se zasniva na merenju smanjenja intenziteta monohromatskog zračenja, nakon prolaska istog kroz atomsku paru uzorka. To je tehnika koja se koristi u kvalitativnoj i kvantitativnoj analizi. Ovom tehnikom se određuje oko 60 elemenata periodnog sistema. Metoda se zasniva na Lambert-Beer-ovom zakonu i smanjenje intenziteta monohromatskog zračenja zavisi od broja atoma u osnovnom stanju koji su u stanju da apsorbuju monohromatsko zračenje. I t = I 0 10 εln 0 ε-molarni apsorpcioni koeficijent l-debljina sloja atomske pare uzorka No-broj atoma u osnovnom stanju koji mogu da apsorbuju zračenje Ako se prethodna jednačina predstavi u logaritamskom obliku, kao: i ako se uzme da je dužina apsorpcionog sloja konstantna pri određivanjima, dobija se: U atomskoj apsorpciji linearnost postoji samo pri manjim vrednostima apsorbance, najčešće do A <0,2. Dakle, linearna zavisnost moguća je samo u oblasti niskih apsorbanci ali i tada je taj opseg različit za različite elemente. Najčešće odstupanje od linearnosti je povijanje prema koncentracionoj osi što se definiše kao normalna zakrivljenost. Retko je povijanje prema osi apsorbance obrnuta zakrivljenost, vrlo retko se događa složena zakrivljenost. Slika 10. Zavisnost apsorbance od koncentracije, 1 linearna zavisnost, 2 normalna zakrivljenost, 3 obrnuta zakrivljenost Atomska apsorpciona spektrofotometrija je relativna analitička metoda u kojoj se signal elementa koji se ispituje poredi sa signalom istog u standardnom rastvoru poznate koncentracije. 25

U atomskoj apsorpcionoj spektrofotometriji primenjuju se dve metode kalibracije: 1) direktna kalibracija, pri određivanju metala iz rastvora poznatog ili jednostavnijeg sastava matrice 2) kalibracija standardnim dodavanjem, kod složenog ili nepoznatog sastava matrice. Ova tehnika se često koristi i pri ekstrakcionim postupcima određivanja kada se neorganski standard podvrgava kompleksiranju i ekstrakciji kao i uzorak. Direktna kalibracija daje veću tačnost određivanja u širokom rasponu apsorbance, za razliku od kalibracije standardnim dodavanjem koja ima ograničenja zbog potrebe rada u oblasti linearne zavisnosti apsorbance od koncentracije. Direktna kalibracija podrazumeva određivanje uz upotrebu standardnih rastvora koji su pripremljeni sa istovetnim rastvaračem kao i uzorak, sa ili bez upotrebe jonizacionih pufera, reagenasa za oslobađanje ili dodataka za podešavanje sastava matrice. 2.4.1. Atomski apsorpcioni spektrofotometar AAS aparati zovu se atomski apsorpcioni spektrofotometri. Osnovni delovi: 1) izvor zračenja 2) atomizer 3) monohromator (disperzioni element) 4) detektor Izvor zračenja Kao izvor zračenja koristi se lampa sa šupljom katodom koja je diskontinualni izvor zračenja. Razlog je to što kontinualni izvori emituju široke spektralne linije slabog intenziteta, pa veći deo zračenja (95%) ne biva apsorbovan, a lampa sa šupljom katodom emituje uske i intenzivne spektralne linije. Intenzitet apsorpcione trake određivanog elementa je 10 puta manji od propusne širine monohromatora, pa kad se koristi kontinualni izvor veliki deo zračenja ostaje neapsorbovan. Lampa sa šupljom katodom emituje linije koje su reda veličine ili manje od poluširine apsorpcione linije ispitivanog elementa. Cev sa šupljom katodom (Slika 11) se sastoji od staklenog balona sa prozorom od kvarca u kojem je smeštena šuplja katoda i anoda koja se izrađuje od volframa ili cirkonijuma u obliku spirale. Katoda se izrađuje od ispitivanog elementa ili ako to nije moguće tehnički onda od legure tog elementa ili se ispitivani element u vidu tankog sloja nanosi na unutrašnjost katode. Za svaki ispitivani element potrebna je druga lampa. Lampa se puni inertnim gasom, neonom ili argonom pod niskim pritiskom (200-1000Pa). Inertni gas služi kao energetski pufer, jer jonizacioni potencijal gasa određuje maksimalnu energiju ekscitacije. Na ovaj način se sprečava pojava drugih rezonantnih linija, koje zahtevaju veću energiju ekscitacije. Da bi se povećao intenzitet pražnjenja i da bi se ono usmerilo što bolje u unutrašnjost katode oko nje se nalazi ekran od izolatorskog materijala, najčešće stakla ili kvarca. Napon pražnjenja iznosi do 200V a struja pražnjenja je od 220Ma. Maksimalna jačina struje na kojoj lampa radi utisnuta je na telu lampe. 26

Slika 11. Cev sa šupljom katodom Kada se lampa uključi u struju usled saopštene razlike potencijala između anode i katode, dolazi do jonizacije inertnog gasa. Stvoreni pozitivni joni kreću se ka katodi i reaguju sa atomima ispitivanog elementa, dolazi do pobuđivanja atoma i nakon vraćanja u osnovno stanje dolazi do emisije zračenja koje je karakteristično za svaki ispitivani element. Elektroni nastali jonizacijom vrše dodatnu jonizaciju gasa, pa se gas kojim je punjena lampa naziva nosiocem pražnjenja. Do danas su uspešno konstruisane cevi sa šupljom katodom za veliki broj elemenata (metala). Na tržištu nalaze lampe koje predstavljaju 10 elemenata u kombinaciji. Cevi sa šupljom katodom nisu konstruisane za elemente koji imaju rezonantnu liniju u oblasti ispod 190 nm (vakuumska UV oblast), jer je spektrofotometrijsko merenje u ovoj oblasti teško izvodljivo (potreban je vakuum), a to su elementi C, H, N, O, S, P, halogeni elementi i inertni gasovi. Slika 12. Šematski prikaz atomskog apsorpcionog spektrofotometra i principa merenja atomske apsorpcije Atomizer 1) plameni 2) termalni Uloga atomizera je da vrši atomizaciju uzorka. Postoje dve vrste: 27

Plameni atomizer Plamen je niskotemperaturni izvor pobuđivanja. Temperatura plamena varira i zavisi od sastava gasne smeše tj. od goriva i oksisansa. U zavisnosti od temperature plamena razlikuju se niskotemperaturni (od 1000 do 2000 K), srednjetemperaturni (od 2000 do 3000 K) i visokotemperaturni (od 3000 do 4500 K). Temperatura ugljovodoničnih plamena ne prelazi 3000 K, jedino smeša dicijana i kiseonika dostigne 4500 K. Kao niskotemperaturni izvor pobuđivanja plamen se koristi za pobuđivanje elemenata koji imaju niske energije jonizacije (alkalni i zemnoalkalni elementi). U strukturi plamena razlikuju se tri zone: 1) unutrašnja zona u kojoj se vrši mešanje goriva i oksidansa i njihovo paljenje 2) središnja zona (redukciona) u kojoj se vrši nepotpuno razlaganje goriva tj. Redukcija (plavozelena boja) 3) spoljašnja zona u kojoj se vrši potpuno razlaganje goriva tj. potpuna oksidacija (plavoljubičasta boja) Slika 13. Zone plamena U AAS se koristi smeša acetilena i vazduha (ili acetilena i azot-suboksida). Ovi plamenovi spadaju u srednjetemperaturne (2000 3000K). Ako bi se koristili niskotemperaturni plamenovi efikasnost atomizacije bi bila mala (negativna karakteristika), dok sa druge strane ne bi dolazilo do hemijskih interferencija (pozitivna karakteristika). Ako bi se koristili visokotemperaturni plamenovi efikasnost atomizacije bi bila dobra ali bi dolazilo do hemijskih interferencija. Kod srednjetemperaturnih plamenova postignut je kompromis u pogledu atomizacije uzorka i mogućih hemijskih interferencija. Uzorak se uvodi u vidu aerosola. 28

Oblik plamena je konusan i zavisi od brzine prostiranja gasova i mešanja gasova. Brzina prostiranja i mešanja gasova treba da bude 2-3 puta veća od brzine prostiranja plamena da ne bi došlo do uvlačenja plamena u gorionik i eksploziji. Danas se koristi difuzioni plamen kod koga se mešanje goriva i oksidanasa vrši na samom izlazu iz gorionika. Plamenik koji se koristi je većeg otvora kako bi zračenje iz lampe sa šupljom katodom duže putovalo kroz atomizer pri čemu bi bila efikasnija apsorpcija tog zračenja od strane slobodnih atoma. U plamenoj fotometriji plamenik je okruglog oblika. Tabela 2.3. Vrste plamena Smeše, temperature i elementi za određivanje Naziv smeše Radne temperature Elementi koji se određuju Vazduh/vodeni gas 1800 o C Alkalni metali, Zn, Cu, Cd, Pb Vazduh/propan 1900 o C Alkalni metali, Zn, Cu, Cd, Pb +isparljivi elementi Vazduh/acetilen (siromašna smeša) 2300 o C Zemnoalkalni metali + mnogi drugi Vazduh/acetilen (bogata smeša) 2300 o C Sn, Ba, Cr i dr. H2O/acetilen 2950 o C Refraktorni elementi: Al, V, Ti, Ta, Be, Si i dr. Elektrotermalni atomizer Kao elektrotermalni atomizeri koriste se grafitne peći koje se izrađuju u obliku cevi/kivete. Najčešću primenu imaju grafitne peći dužine do 8mm i prečnika 5 mm. S obzirom na to da je grafit porozan, unutrašnjost peći se oblaže pirolitičkim grafitom koji sprečava apsorpciju uzorka od strane zidova peći. Rad peći je programiran i sastoji se iz nekoliko faza: 1) sušenje uzorka (T = 100K) 2) sagorevanje i oksidacija organskog dela (T = 100 500K) 3) atomizacija uzorka (nastaju slobodni atomi koji mogu da apsorbuju upadno monohromatsko zračenje, T = 2000 3000K) 4) čišćenje peći (od ostatka uzorka koji se deponuje na zidove peći, T > 3000K) 29

Ceo proces traje 60-90 sekundi, a sama atomizacija 10-ak sekundi. S obzirom da uzorak u peći boravi relativno dugo, atomizacija je potpuna čime se postižu niže granice detekcije u poređenju sa plamenim atomizerom. Uzorak se u grafitnu peć unosi pomoću mikropipete pri čemu ne dolazi do gubitka uzorka usled rasprašivanja kao što je to slučaj kod plamenog atomizera. Uzorak se uvodi u vidu aerosola pri čemu se za dobijanje finih kapljica rastvora koristi pneumatski rasprašivač u kombinaciji sa rasprašivačkom komorom. Sistem za raspršivanje Nebulizer Slika 14. Grafitna peć Sistem za raspršivanje ima vrlo značajnu ulogu u osetljivosti određivanja plamenom atomskom apsorpcionom spektrofotometrijom. Na osetljivost određivanja u velikoj meri utiče količina rastvora koja dospeva u plamen u jedinici vremena kao i veličina i ujednačenost (homodisperznost) kapljica raspršenog rastvora. Povećanjem količine rastvora koji dospeva u plamen, smanjenjem veličine kapljica i povećanjem homodisperznosti povećava se osetljivost atomske apsorpcione spektrofotometrije. Za raspršivanje rastvora se uglavnom koriste pneumatični raspršivači, pri čemu se gas koji potpomaže sagorevanje gorećeg gasa, obično vazduh, koristi za raspršivanje. U atomskoj apsorpcionoj spektrofotometriji koriste se tzv. posredni raspršivači. Za razliku od neposrednih raspršivača, kod kojih se rastvor neposredno raspršuje u plamen, rastvor se kod posrednih tipova raspršivača raspršuje u jednoj komori. U rastvor ispitivane supstance uronjena je kapilarna cevčica, čiji je drugi kraj izložen struji oksidacionog gasa (obično vazduh). Pod dejstvom strujanja vazduha na kraju kapilarne cevčice stvara se vakuum, pri čemu se ispitivani rastvor usisava i raspršuje u komoru u obliku finih kapi. Komore u kojima se vrši raspršivanje, u literaturi se nazivaju kondenzacione ili homogenizacione komore. U ovim komorama pored stvaranja smeše sa gorećim gasom (obično acetilen), koja odlazi kroz plamenik, gde se pod uticajem temperature plamena ispitivana supstanca prevodi u atomsko stanje, dolazi i do taloženja većih kapljica čime se obezbeđuje da u plamen dospeju samo sitne i ujednačene veličine kapljica, što povećava osetljivost određivanja. U cilju poboljšavanja mešanja gasova i ubrzanja taloženja kapljica većih prečnika, u kondenzacione komore se često ugrađuju pera za ometanje protoka gasa. U nekim atomskim apsorpcionim spektrofotometrima (npr. Pye Unicam SP 90 A serija 2) postoji mogućnost postavljanja jedne kuglice ispred raspršivača u cilju povećanja efikasnosti raspršivanja. Raspršene kapi iz raspršivača udaraju u površinu kuglice i na taj način dolazi do dodatnog raspršivanja kapi, odnosno do smanjivanja prečnika kapi. Mana posrednih sistema za raspršivanje je što relativno mala zapremina raspršenog rastvora 30

(oko 10%) dospeva u plamen, jer se veći deo raspršenog rastvora kondenzuje i preko odvodne cevi kondenzacione komore izvodi kao neupotrebljiv rastvor za dalje određivanje. Monohromator Kao monohromator koristi se difrakcina rešetka. Ona razlaže zračenje po talasnim dužinama. Mogu da budu transprarentne i refleksione rešetke. Refleksione mogu da budu sa ravnom refleksionom površinom i refleksionom površinom koja je pod nagibom. Poseban tip refleksione rešetke su konkavne rešetke. Transparentne rešetke predstavljaju staklene ploče na kojima je pomoću dijamantskog šiljka urezan veliki broj linija na jediničnom rastojanju. Broj linija zavisi od moći razlaganja rešetke i kreće se od 500-4000 linija po milimetru. Osnovna karakteristika rešetke je konstanta rešetke d koja predstavlja zbir širine ureza i rastojanja između dva ureza. Refleksione rešetke se nalaze u modernim uređajima. Poseban tip refleksione rešetke je konkavna rešetka kod koje su po obimu Rolandovog kruga smešteni razrez i detektor. Ova rešetka je ujedno i disperzioni element i element za fokusiranje. Da bi se dobio dobar spektar poluprečnik radijusa krivine na kome je smeštena rešetka treba da bude veći od poluprečnika Rolandovog kruga (R > r). Kada zračenje padne na rešetku na mestima ureza dolazi do difrakcije. Zraci koji padaju između između ureza padaju kroz rešetku bez difrakcije. Zraci čija je putna razlika jednaka celobrojnom umnošku talasnih dužina pojačavaće se, dok će se intenzitet ostalih zraka smanjivati. Najviše skreću zraci najvećih talasnih dužina. Rešetka daje više spektralnih redova. Zrak koji prolazi između dva ureza prolazi bez difrakcije i na zaklonu izaziva najveće zacrnjenje. Takav zrak obrazuje difrakcioni maksimum nultog reda. Zraci čija je putna razlika jednaka jednoj talasnoj dužini obrazuju spektar prvog reda, a oni čija je putna razlika jednaka 2λ obrazovaće spektar drugog reda. Sa povećanjem spektralnog reda slabi intenzitet zračenja. Slika 15. Monohromator- Difrakciona rešetka 31

Za disperzonu rešetku važi Brag-ova jednačina: a - putna razlika dva susedna zraka m redni broj difrakcionog maksimuma d - konstanta rešetke α - upadni ugao β - ugao difrakcije Kada su upadni i difraktovani ugao sa iste strane normale znak je +, a kada su sa različite znak je. Iz Bragove jednačine sledi da će zraci iste λ imati maksimum u svakom od pravaca u zavisnosti od spektralnog reda, upadnog i difraktovanog ugla. Detektor Detekcija je fotoelektrična. Kao uređaj za detekciju koristi se fotomultiplikator. To je evakuisani balon od stakla ili kvarca u kome se nalazi anoda, katoda i sistem dinoda. Katoda je na negativnom potencijalu, anoda na pozitivnom a dinode su poređane po rastućem potencijalu. Kada svetlosni zrak koji ima određenu energiju padne na katodu dolazi do izbijanja elektrona koji se kreću do prve dinode. Sa nje se izbija dvostruko veći broj elektrona koji dolazi do druge dinode i tako redom. Multiplicirana struja elektrona dolazi do anode. Faktor multipliciteta se kreće do 10 6 i zavisi od broja dinoda. Ovo znači da se kod fotomultiplikatora primarna struja se pojačava na račun sekundarne emisije elektrona. Slika 16. Detektor Fotomultiplikator 32

2.4.2. Način rada atomskog apsorpcionog spektrofotometra Lampa sa šupljom katodom emituje svetlost koja prolazi kroz plamenik. Istovremeno u plamenik se usisava rastvor ispitivanog uzorka. Pod uticajem visoke temperature uzorak disosuje na atome koji su sada sposobni da apsorbuju deo emitovane energije, odnosno svoju rezonantnu liniju proporcionalno njihovoj koncentraciji. Iza plamenika postavljen je monohromator ili specijalan filter pomoću koga se rezonantna linija odvaja od nekarakterističnih radijacija i registruje na detektoru. Nastali električni signal pojačava se u elektronskom pojačalu a dobijeni rezultati očitavaju na galvanometru ili pisaču (rikorderu). Visina pika na pisaču proporcionalana je koncentraciji ispitivanog elementa. Šema najjednostavnijeg AAS je prikazana na slici, a sistem je poznat kao istosmerni sistem sa jednim zrakom. Ovaj sistem ima svojih nedostataka obzirom da detektor nije u mogućnosti da razlikuje fotone koji potiču od lampe sa šupljom katodom i one koje emituje plamen, pa ih oba registruje. Slika 17. Šema jednozračnog spektrofotometra Da bi se otklonio ovaj nedostatak izrađen je sistem kod koga je svetlost dok plamen zrači kontinualno. Ovaj sistem je poznat kao naizmenični sistem sa jednim zrakom, jer isprekidana svetlost na izlazu iz detektora daje signal naizmenične struje. Elektronski pojačivač je konstruisan tako da pojačava samo naizmeničnu struju pa na taj način svetlost iz plamenika uopšte ne registruje. Emitovanje isprekidane svetlosti u pravilnim vremenskim intervalima može se postići ugrađivanjem rotirajućeg sektora između svetlosnog izvora i plamenika ili pak napajanjem lampe pulsirajućim naponom. Slika 18. Šema dvozračnog spektrofotometra 33

Danas se u praksi najčešće može sresti sistem poznat pod nazivom naizmenični sistem sa dvostrukim zrakom. Umesto rotirajućeg sektora ugrađen je rotirajući reflektorni sektor (sistem ogledala) koji naizmenično šalje svetlost iz lampe kroz plamenik (zrak uzorka) i pored plamenika (referentni zrak). Zrak koji potiče od uzorka i referenti zrak se kasnije rekombinuju pomoću specijalnog polupropustljivog ogledala i prolaze zajedno kroz preostali deo instrumenta. Kod ovog sistema, elektronika je tako podešena da registruje odnos intenziteta ova dva zraka pri čemu intenzitet uzorkovanog zraka nalazi u brojiocu, a intenzitet refrektovanog zraka u imeniocu. Eventualne promene u intenzitetu lampe, osetljivosti detektora, ili pojačalu kompenzuju se jer se javljaju podjednako u brojiocu i imeniocu. Ovaj sistem ima svoje prednosti u odnosu na sistem sa jednim zrakom: Daje stabilnu baznu liniju koja omogućava da se primete najmanji otkloni koji kod instrumenta sa jednim zrakom nije moguće učiniti Omogućava veliku preciznost zbog stabilne bazne linije Lampe se mogu koristiti odmah po uključenju Omogućava korišćenje široke ekspanzije skale na pisaču Međutim, pored ovih prednosti on ima i svoje nedostatke: Duži optički put zraka kroz instrument Komplikovanost uređaja zahteva predhodnu dužu obuku analitičara Aparat je skuplji u odnosu na instrument sa jednim zrakom 2.4.3. Osetljivost i tačnost određivanja Atomskom apsorpcinom spektrofotometrijom se mogu neposredno određivati svi oni elementi čije se rezonantne linije nalaze u oblasti od 190 do 850 nm (bliska ultravioletna i vidljiva oblast spektra) i koji se mogu prevesti u osnovno atomsko stanje. Ovim uslovima uglavnom odgovaraju metali. Osetljivost u atomskoj apsorpcionoj spektrofotometriji je definisana kao onaj sadržaj vodenog rastvora ispitivanog elementa, u μg/ml (ppm), koji izaziva apsorpciju od 1%. Pri eksperimentalnim određivanjima, poznavanje osetljivosti je veoma koristan podatak za pripremu uzorka i standardnih rastvora, jer se optimalni interval određivanja obično nalazi u rasponu od 20 do 200 puta većim koncentracijama od osetljivosti za dati element. Mnogo značajniji pojam je granica detekcije. Vrednost granice detekcije ne zavisi samo od vrednosti merenog signala, nego i od vrednosti šuma aparata. Granica detekcije definiše se onim sadržajem elementa u rastvoru koji izaziva dvostruko veći signal od signala šuma aparata. Osetljivost i granica detekcije aparata veoma se razlikuju za pojedine elemente. Ova razlika potiče od razlika između apsorpcionih koeficijenata elemenata, ali zavisi i od osobina elementa u procesima koji se dešavaju pri dovođenju u atomsko stanje. Optimalna osetljivost i tačnost mogu se postići kada se, prethodnim ispitivanjima, za dati aparat i element koji se određuje, nađu najpogodniji uslovi raspršivanja, najpogodniji sastav gorućeg gasa i gasa koji potpomaže sagorevanje, njihova brzina strujanja, visina plamena i intenzitet izvora svetlosti. 34

Tačnost određivanja atomskom apsorpcionom spektrofotometrijom definiše se relativnom greškom određivanja koncentracije (Δc 100/c). Pri vrlo pažljivom radu, vodeći računa o činjenici da su najtačnija merenja apsorbancije u intervalu apsorbancije od 0,2 do 0,8, može se postići minimalna greška od 0,3 do 0,8%. 2.4.4. Smetnje Atomska apsorpciona spektrofotometrija spada u relativne metode, tj u metode pri kojima se, pomoću rastvora poznatih koncentracija (standardnih rastvora), određuje nepoznata koncentracija ispitivanog elementa u rastvoru pomoću kalibracionog grafa. Usled različitog hemijskog sastava standardnih rastvora i uzorka, mogu nastati različite greške. Ove greške se manifestuju time da se pri istovetnim koncentracijama posmatranog elementa u standardnom rastvoru i rastvoru uzorka, atomizacijom dobija različiti broj atoma sposobnih za apsorpciju. Smetnje koje se javljaju u plamenoj atomskoj apsorpcionoj spektrofotometriji dele se na: 1) Spektralne smetnje 2) Hemijske smetnje 3) Smetnje usled apsorpcije pozadine 4) Jonizacione smetnje 5) Fizičke smetnje Spektralne smetnje Atomska apsorpciona spektrofotometrija je veoma selektivna i specifična metoda. Talasne dužine, na kojima apsorbuju pojedini elementi, dobro su definisane, a mogućnost da dva elementa apsorbuju na istoj talasnoj dužini je neznatna. Primenom modulacije emitovane svetlosti sa šupljih katodnih lampi i usklađenog pojačavanja ove modulovane frekvencije, praktično je eliminisana mogućnost pojave spektralnih smetnji Hemijske smetnje Hemijskim smetnjama se naziva svako obrazovanje hemijske veze posmatranog elementa koja ometa kvantitativnu termičku disocijaciju (atomizaciju). Kvantitativna atomizacija praktično se postiže iz neutralnih ili slabo kiselih vodenih rastvora hlorida ili nitrata ispitivanih metala, pod optimalno podešenim uslovima. Hemijske smetnje se prema uzročnicima dele na katjonske i anjonske, a prema mehanizmu njihove pojave na dve grupe: 1) Hemijske smetnje koje nastaju kada termička disocijacija ispitivanog elementa nije kvantitativna. To se događa kada u plamenu nastaju teško topljive soli ili teško isparljive soli koje termički ne disociraju u potpunosti. 2) Hemijske smetnje koje nastaju usled toga što atomi ispitivanog elementa u osnovnom stanju, nakon svog nastanka, vrlo brzo reaguju sa drugim atomima ili radikalima u plamenu, pa atomi nisu dovoljno dugo u osnovnom stanju i ne mogu apsorbovati svetlosne zrake rezonantne talasne dužine. Pojava druge grupe hemijskih smetnji je vrlo karakteristična za atomizaciju u plamenu. Pojava ovog tipa smetnji zavisi od hemijskog sastava i afiniteta posmatranog atoma prema mogućim partnerima za reakciju u plamenu. Pri ovoj smetnji 35

posmatrani atomi najčešće grade okside ili oksidne radikale, hidrokside ili hidroksilne radikale, karbide i nitride. Ovo je uzrok da oko 30 elemenata, među koje spadaju svi lantanidi, zatim elementi kao Al, Si, B i drugi, imaju vrlo malu osetljivost određivanja u plamenu, jer spontano grade okside. Veći broj hemijskih smetnji može se izbeći ili smanjiti povišenjem temperature plamena i izborom pogodnije hemijske okoline (sastav plamena) pri atomizaciji. Tako se veći deo hemijskih smetnji koje se javljaju u plamenu acetilen/vazduh može izbeći primenom redukujućeg plamena acetilen/azot-suboksid, koji pored više temperature (oko 2750 C) poseduje pogodniji hemijski sastav, dok se, na primer u plamenu acetilen/kiseonik, koji ima još višu temperaturu (oko 3050 C), nasuprot očekivanju, povećava broj i intenzitet hemijskih smetnji, zbog izrazito oksidacionih osobina plamena. Smetnje usled apsorpcije pozadine Do pojave ove smetnje (Background ili Matrix interference) dolazi usled rasipanja svetlosti na čvrstim ili tečnim česticama prisutnim u plamenu i usled apsorpcije svetlosti od strane molekula ili radikala u plamenu. Uzročnici pojave ovog tipa smetnji većinom potiču iz matriksa uzorka. Efekti rasipanja svetlosti na čvrstim ili tečnim česticama, iako nemaju veze sa apsorpcijom, uvrštavaju se u smetnje usled apsorpcije pozadine, jer su njihovi krajnji efekti slični ovome tipu apsorpcije, a i način njihove kompenzacije, odnosno eliminisanja, istovetan je. Ispitivanja su pokazala da se ovaj tip smetnji vrlo retko javlja primenom posrednih raspršivača sa dobro konstruisanim kondenzacionim komorama, ako je ukupan sadržaj soli u rastvoru ispod 5% i ako je radna talasna dužina iznad 300 nm. Drugi efekt je prava apsorpcija svetlosti od strane molekula i radikala u plamenu. Do smetnji dolazi kada rezonantna linija ispitivanog elementa pada u oblast molekularne apsorpcije molekula ili radikala koji se nalaze u plamenu. Do pojave većeg broja molekula u plamenu dolazi kada je plamen niže temperature, kada se određuju elementi koji se lako atomizuju u prisustvu teško atomizirajućeg matriksa, ili ako neki elemenat, koji se nalazi u većim koncentracijama u matriksu, gradi sa gasovima plamena oksidne molekule ili hidroksilne radikale. U modernijim atomskim apsorpcionim spektrofotometrima ugrađena je jedna deuterijumova lampa kao izvor UV svetlosti. Pomoću UV svetlosti meri se vrednost smetnji usled apsorpcije pozadine i automatski se obavlja kompenzacija merenog signala na rezonantnoj liniji posmatranog elementa. Jonizacione smetnje U plamenu visoke temperature (posebno u plamenu azot-suboksid/acetilen, a delimično i u plamenu vazduh/acetilen), dolazi do znatne jonizacije atoma većeg broja metala, a naročito onih metala koji imaju niže jonizacione potencijale. Jonizovani atomi više ne apsorbuju rezonantno elektromagnetno zračenje, što dovodi do smanjenja osetljivosti, a i do greške u merenju, ako je stepen jonizacije posmatranog metala iz rastvora uzorka i standardnog rastvora različit. U plamenu postoji ravnoteža između atoma u osnovnom stanju i jona: Me Me n+ + ne- 36

Do različitog stepena jonizacije posmatranog metala u plamenu dolazi zbog različitog sastava ispitivanih rastvora, a samim tim i različitog sastava plamena. Ako je u rastvoru (najčešće u uzorku) prisutan neki drugi elemenat koji u datom plamenu takođe jonizuje, doći će do povećanja koncentracije elektrona u plamenu i time će biti suzbijena jonizacija posmatranog metala. Pojava jonizacije je i uzrok zakrivljenja kalibracione krive ka osi apsorbancije. Iz navedenih razloga, pokazalo se neophodnim eliminisanje pojave jonizacije, naročito onih elemenata koji imaju niže jonizacione potencijale (alkalni i zemnoalkalni metali). Najjednostavniji način uklanjanja pojave jonizacije, a time i smetnje koju ona izaziva, jeste primena plamena nižih temperatura. Na žalost, ovaj vrlo efikasan način uklanjanja jonizacije često nije primenljiv, jer se u plamenu niže temperature dati elemenat ne može određivati (npr. lantanidi). Zbog toga se najčešće primenjuje metoda pri kojoj se u rastvor uzorka i u standardne rastvore dodaje u velikom višku neki elemenat niskog jonizacionog potencijala (jonizacioni pufer), koji će u plamenu jako jonizovati, najčešće kalijum ili cezijum. Jonizacioni pufer povećava koncentraciju elektrona u plamenu i time suzbija jonizaciju posmatranog elementa. Fizičke smetnje Uopšteno se fizičke smetnje definišu kao smetnje koje se javljaju usled različitih fizičkih dejstava na procese atomizacije posmatranog elementa iz rastvora uzorka i iz standardnih rastvora. U fizičke smetnje spadaju već opisane smetnje usled apsorpcije pozadine, rasipanja svetlosti i jonizacije, koje su posebno izdvojene zbog svoje specifičnosti. Fizičkim smetnjama će se smatrati samo one smetnje koje nastaju usled različitih fizičkih osobina rastvora uzorka i standardnih rastvora, tj. usled razlike u viskoznosti, površinskom naponu i gustine rastvora. Ove razlike u velikoj meri utiču na brzinu raspršivanja i na veličinu raspršenih kapljica, a time i na osetljivost određivanja. Ako u rastvoru ispitivanog uzorka, pored posmatranog elementa, postoji velika koncentracija (iznad 1%) neke soli ili kiseline, tada se već javljaju fizičke smetnje. Smatra se da u ovakvim slučajevima već dolazi do promene fizičkih osobina rastvora u odnosu na standardne vodene rastvore posmatranog elementa, pa se smanjuje brzina raspršivanja i povećava prosečna veličina raspršenih kapljica. Ukupni efekat ovog dejstva je smanjenje osetljivosti određivanja, tj. pojave greške u određivanju, ako standardni rastvori ne sadrže istu koncentraciju soli. Ako umesto neorganskih soli ima više od 1% organskih jedinjenja (npr. belančevina, šećera, itd.), efekat smetnje je znatno izraženiji, iako je najčešće kombinovan sa pojavom hemijskih smetnji. Organske supstance (rastvarači) mogu već i veoma malim koncentracijama u rastvoru metala da izazovu smetnje, pri čemu mogu izazvati ili povećanje ili smanjenje osetljivosti (mernog signala). U literaturi se može naći veliki broj objašnjenja načina na koji različite organske materije izazivaju smetnje. 37

Izazivaju promenu uslova raspršivanja rastvora. To je čista fizička smetnja koja najčešće nastaje usled promene površinskog napona ili viskoziteta rastvora. Utiču na promenu temperature plamena (termički efekat). Izazivaju redukcioni efekat u plamenu, jer njihovim sagorevanjem povećava se koncentracija ugljeničnih radikala u plamenu. Izazivaju prave hemijske smetnje stvaranjem organskih jedinjenja sa metalima, kompleksa ili helata. Zavisno od osobina ili koncentracije organskog jedinjenja, pomenuti načini dejstva mogu biti manje ili više izraženi u sumarnom dejstvu smetnji. Faktori koji utiču na rezultate U principu se slobodni atomi svih elemenata mogu, dovođenjem zračenja referentne talasne dužine, prevesti u pobuđeno stanje. Međutim, samo se atomi metala i metaloida mogu pobuditi zracima ultravioletne i vidljive svetlost (190-850 nm). Za pobuđivanje nemetala potrebno je zračenje kraćih talasnih dužina. U oblasti ispod 190 mn počinje da apsorbuje vazduh. Za talasne dužine veće od 850 nm potreban je detektor osetljiv na crvenu svetlost. Ove činjenice odredile su domet atomske apsorpcije kao metode za određivanje, pre svega metala. Dva različita pristupa susreću se pri radu u atomskoj apsorpciji: maksimalnom osetljivošću izmeriti minimalni signal elementa ili precizno odrediti koncentraciju kada je element prisutan u velikoj koncentraciji. Brojni efekti doprinose neizvesnosti signala a izvori greške su sledeći: nestabilnost izvornog signala lampe sa šupljom katodom, šumovi elektronike, netačnost sistema očitavanja nestabilnost plamena, šum raspršivanja i atomizacije, interferencije između elemenata, sistemske i slučajne greške kod pripreme uzorka i standardnih rastvora. Pojedini od ovih faktora uslovljeni su dizajnom aparata a neke može da kontroliše operater. Na osetljivost i preciznost atomskog apsorbera utiču sledeći parametri: propusni opseg, struja lampe, visina plamenika, ravnanje plamenika, protok goriva, tip plamena, podešenost komore 38

Eksperimentalni deo 3. Eksperimentalni deo 39

Eksperimentalni deo 3.1. Program i metodika eksperimenta Predmet ovog diplomskog rada je određivanje bioakumulacije teških metala u biljci hiperakumulatoru Pistia stratiotes. Bioakumulacija je ispitivana izlaganjem biljaka određenim koncentracijama teških metala. Praćeno je usvajanje sledećih metala: Ni, Cu, Zn, Pb i Cd. Program eksperimentalnog dela master rada se sastojao iz sledećih faza: 1. Priprema rastvora 1.1. Priprema standardnog rastvora Ni 1.2. Priprema standardnog rastvora Cu 1.3. Priprema standardnog rastvora Zn 1.4. Priprema standardnog rastvora Pb 1.5. Priprema standardnog rastvora Cd 1.6. Priprema rastvora nutrijenata 1.7. Priprema rastvora za mineralizaciju 1.8. Priprema razblaženog rastvora HNO3 2. Prikupljanje biljaka 3. Priprema kanistra sa vodenim rastvorima nutrijenata i teških metala 4. Postavljanje biljaka u kanistre sa rastvorima 5. Uzorkovanje biljaka 6. Sušenje biljaka, usitnjavanje i merenje mase biljaka 7. Mineralizacija biljaka 8. Određivanje sadržaja metala pomoću AAS 40

Eksperimentalni deo 3.2. Eksperimentalni postupak Uzorci biljke Pistia stratiotes prikupljeni su u ataru sela Ostrovica, nadomak Niša. U kanistrima su pripremljeni rastvori ispitivanih metala koncentracije 10 µmol/l. Biljke su postavljene i podvrgnute uticaju metala u toku 30 dana. Nakon isteka vremena od 30 dana, biljke su izvađene iz vodenih rastvora i osušene na vazduhu, na sobnoj temperaturi. Uzorci pripremljeni za eksperimentalnu analizu stavljeni su na sahatno staklo i preneti u sušnicu gde su sušeni na 100 o C u toku 20 minuta. Nakon toga osušene biljke su izvađenjene iz sušnice i ostavljene da se hlade. Ohlađeni uzorci su usitnjeni i homogenizovani u avanu sa tučkom, svaki uzorak je izmeren i masa je zabeležena. Oko 0,3 grama od svake mase uzorka je preneto u čase u kojima je vršena mineralizacija. Mineralizacija je izvršena smešom koncentrovanog H2O2 i koncentrovane HNO3 u razmeri 1:2, odnosno sa 5 ml H2O2 i 10 ml HNO3. Nakon mineralizacije, suvi ostatak je ohlađen, a nakon hladjenja rastvoren u potpunosti pomoću 13 ml 0,1M HNO3. Rastvori su proceđeni kroz kvantitativni filter papir, a nakon filtracije fitrat je proceđen i kroz mikrofilter, veličine pora 0,45 µm. Ovako pripremljen filtrat je snimljen na atomskom apsorpcionom spektrofotometru. 3.2.1. Pribor i aparatura U toku eksperimentalnog rada korišćeni su sledeći pribor i aparatura 1. Atomski apsorpcioni sprektrofotometar (Perkin Elmer) 2. Analitička vaga (Kern, Nemačka) 3. Dejonizator (Smart2Pure, Thermo) 4. Rešo (Gorenje) 5. Sušnica (Raypa Dry Oven) 6. Čaše od 100 ml i 150 ml (15 kom.) 7. Sahatno staklo (15 kom.) 8. Pipeta od 5 ml i 10 ml (10 kom.) 9. Propipete (3 kom.) 10. Levak (5 kom.) 11. Stakleni štapić (5 kom.) 12. Plastične kivete (75 kom.) 13. Metalni prsten (5 kom.) 14. Mikrofiltri (75 kom.) 15. Špric od 5 ml (75 kom.) 16. Avan sa tučkom (3 kom.) 3.2.2. Reagensi U toku eksperimentalnog rada korišćeni su sledeći rastvori i reagensi: 1. Koncentrovana HNO3 2. Koncentrovan H2O2 3. 0,1M HNO3 (dobijen rastvaranjem 7 ml koncentrovane HNO3 u 993 ml dejonizovane vode ) 4. Dejonizovana voda 5. Destilovana voda 6. Bakar(II)-hlorid, koncentracije 0,0916 mol/l 41

7. Nikal(II)-hlorid, koncentracije 0,0454 mol/l 8. Kadmijum(II)-hlorid, koncentracije 0,0513 mol/l 9. Olovo(II)-nitrat, koncentracije 0,0516 mol/l 10. Cink(II)-sulfat, koncentracije 0,0565 mol/l 11. Kalijum-di-H-fosfat, koncentracije 0,1000 mol/l 12. Amonijum-nitrat, koncentracije 0,7601 mol/l Eksperimentalni deo 42

Rezultati i diskusija 4. Rezultati i diskusija 43

4.1. Prikaz rezultata Rezultati i diskusija 4.1.1. Kalibracione krive standardnih rastvora metala Određivanje sadržaja metala nakon mineralizacije izvršen je pomoću atomske apsorpcione spektrofotometrije. Na slikama 19 23. prikazane su kalibracione krive pomoću kojih je određen sadržaj metala. Korelacioni koeficijenti kalibracionih kriva za rastvore Ni, Cu, Zn, Pb i Cd su bili veći R > 0,99 iznosili su 0,9993; 0,99344; 0,99783; 0,99707 i 0,99426, respektivno. 0, 30 0, 25 0, 20 0, 15 0, 10 0, 05 0, 00 0 2 4 6 8 10 Koncentracija Ni (mg/l) Slika 19. Kalibraciona kriva rastvora Ni Slika 20. Kalibraciona kriva rastvora Cu 44