УНИВЕРЗИТЕТ У НОВОМ САДУ ПОЉОПРИВРЕДНИ ФАКУЛТЕТ Департман за ветеринарску медицину Дипломски рад ХИСТОЛОШКЕ КАРАКТЕРИСТИКЕ ЦРЕВНИХ РЕСИЦА БРОЈЛЕРА УСЛОВЉЕНЕ ДОДАТКОМ ТАНИНА У ИСХРАНИ Кандидат: Маријана Калић Ментор: Проф. др Слободан Стојановић Нови Сад, 2019.
КОМИСИЈА ЗА ОЦЕНУ И ОДБРАНУ ДИПЛОМСКОГ РАДА Проф. др Гордана Ушћебрка Председник Комисије Ужа научна област Анатомија, хистологија и физиологија животиња Пољопривредни факултет, Универзитет у Новом Саду Департман за ветеринарску медицину Проф. др Слободан Стојановић Ментор Ужа научна област Анатомија, хистологија и физиологија животиња Пољопривредни факултет, Универзитет у Новом Саду Департман за ветеринарску медицину Проф. др Зденко Каначки Члан Комисије Ужа научна област Анатомија, хистологија и физиологија животиња Пољопривредни факултет, Универзитет у Новом Саду Департман за ветеринарску медицину
САЖЕТАК Танини су једињења која се налазе у цитоплазми одређених биљних ћелија. Раније су сматрани за антинутритивне материје, али новија истраживања показују да танини из појединих биљних врста, додати у одређеној концентрацији у исхрану животиња, могу утицати на побољшање здравственог статуса јединки и производних параметарара. С обзиром на улогу цревних ресица у апсорпцији хранљивих материја, циљ овог рада је био да се испитају одређене хистолошке карактеристике танких црева бројлера условљене додатком танина у исхрани. У огледу је 450 јединки тешких хибрида пилића (Ross 308) било подељено на 3 једнаке групе: контролну групу и две групе којима су путем исхране додавани препарати на бази хидролизованог, односно кондензованог танина. Након жртвовања, прављени су хистолошки препарати танких црева (jejunum) у циљу анализе одређених хистолошких параметара. Утврђено је да је код јединки које су биле храњене са додатком танина, висина цревних ресица била већа, дубуна крипти мања, а однос висине ресица и дубине крипти већи, у поређењу са групом која није примала танинске препарате. Наведене карактеристике цревних ресица код бројлера који су били храњени уз додатак танина, указују на повећан степен апсорпције хранљивих материја, мањи степен обнављања ентероцита као и одржан интегритет цревних ресица. Последично, овакве карактеристике могу утицати и на побољшање производних перформанси бројлера. Резултати овог рада могу представљати основ за наредна испитивања везана за проблематику употребе танинских препарата у исхрани живине. Кључне речи: бројлери, цревне ресице, танини
SUMMARY Tannins are compounds found in the cytoplasm of certain plant cells. Previously, they were considered antinutritive substances, but recent studies show that tannins from certain plant species, added at a certain concentration in animal nutrition, can affect the health status of individuals and production parameters. Considering the role of intestinal villi in the absorption of nutrients, the aim of this study was to investigate certain histological characteristics of the small intestine of broilers due to the addition of tannin in the diet. In the experiment, 450 individuals of heavy chick hybrids (Ross 308) were divided into 3 equal groups: a control group and two groups in which preparations based on hydrolyzed or condensed tannins were added. After sacrificing, histological preparations of small intestines (jejunum) were made in order to analyze certain histological parameters. It was found that in broilers which were fed with the addition of tannins, the height of the intestinal villi was higher, the crypts depth were smaller, and the ratio between the height of the intestinal villi and the crypts depth was higher compared to the group that didn t receive tannin preparations. These characteristics of intestinal villi in broilers fed with the addition of tannin, indicate an increased degree of absorption of nutrients, a lower degree of renewal of enterocytes, and high degree of integrity of intestinal villi. Consequently, such characteristics can also affect on better production performances of broilers. The results of this paper can be used as a basis for further research related to the problem of the use of tannin preparations in the broilers diet. Keywords: broilers, intestinal villi, tannins
САДРЖАЈ 1. УВОД 1 2. ПРЕГЛЕД ЛИТЕРАТУРЕ 2 2.1. ХЕМИЈСКИ САСТАВ ТАНИНА 2 2.2. ПОДЕЛА ТАНИНА 2 2.3. УЛОГА ТАНИНА У ОРГАНИЗМУ 5 2.4. УТИЦАЈ ТАНИНА НА ЗДРАВЉЕ ЗИВОТИЊА 6 2.4.1. УТИЦАЈ ТАНИНА НА STAPHYLOCOCCUS AUREUS 7 2.4.2. УТИЦАЈ ТАНИНА НА CAMPYLOBACTER JEJUNI 8 2.4.3. АНТХЕЛМИНТИЧКИ ЕФЕКТИ КОНДЕНЗОВАНИХ ТАНИНА НА TRICHOSTRONGYLUS COLUBRIFORMIS 9 2.4.4. УТИЦАЈ КОНДЕНЗОВАНИХ ТАНИНА НА HAEMONCHUS CONTORTUS 10 2.4.5. УТИЦАЈ ТАНИНА НА ИНХИБИЦИЈУ SALMONELLA TYPHIMURIUM 11 2.4.6. УТИЦАЈ ХИДРОЛИЗОВАНОГ ТАНИНА НА CLOSTRIDIUM PERFRINGENS 12 2.5. ТАНИНИ КАО АНТИНУТРИТИВНЕ МАТЕРИЈЕ 14 2.6. АНАТОМСКЕ И ХИСТОЛОШКЕ КАРАКТЕРИСТИКЕ ТАНКИХ ЦРЕВА БРОЈЛЕРА 15 3. РАДНА ХИПОТЕЗА, ЦИЉ И ЗАДАЦИ ИСТРАЖИВАЊА 18 4. МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДЕ 19 4.1. ПЛАН ОГЛЕДА 19 4.2. УЗОРКОВАЊЕ 19 4.3. ХИСТОЛОШКЕ АНАЛИЗЕ 20 4.4. СТАТИСТИЧКА ОБРАДА ПОДАТАКА 20 5. РЕЗУЛТАТИ 21 6. ДИСКУСИЈА 26 7. ЗАКЉУЧАК 29 8. ЛИТЕРАТУРА 30
1. УВОД Цревне ресице танких црева живине, као и код других животиња, имају улогу у апсорпцији хранљивих материја. Епител танког црева је призматичан, грађен од ентероцита и пехарастих ћелија. Ентероцити су високо-призматичне ћелије, које су међусобно повезане спојним зонама. На њиховом апикалном делу се формира велики број микровила који утичу на процесе апсорпције, везивања и разлагања хранљивих материја. У грађи епитела цревних ресица, поред ентероцита учествују и друге ћелије које такође имају улогу у процесима апсорпције и дигестије, као што су пехарасте ћелије, ендокрине ћелије, матичне ћелије и др. У циљу што ефикаснијег функционисања апсорпције хранљивих материја, потребно је одржати интегритет цревних ресица који се може дефинисати праћењем одређених хистолошких параметара као што су: висина цревних ресица, дубина крипти, однос висине ресица и дубине крипти, површина ресица и дебљина мишићног слоја у цревима. Сваки од ових параметара утиче на очување потребног интензитета апсорпције хранљивих материја. У исхрани живине, данас је у употреби више група адитива, као што су пробиотици, пребиотици, ензими, антиоксиданти, и др. Екстракти биљака и њихови деривати представљају посебну групу адитива, који се често користе због својих ароматичних својстава, али и због других корисних особина. Танини су једињења која се налазе у цитоплазми различитих биљних органа. Са аспекта исхране, они су првобитно били сматрани као антинутритивни фактори, и као такви су били непожељни. Мађутим, у истраживањима новијег датума је показано да танини који су екстраховани из одређених биљних врста и додати у храну у прецизно дефинисаним концентрацијама, могу довести до очувања и побољшања интегритета цревних ресица, што утиче на интензитет апсорпције хранљивих материја, а последично и на здравствени статус јединке и побољшање производних перформанси. У овом раду су дефинисане хистолошке карактеристике цревних ресица бројлера који су били храњени уз додатак различитих препарата на бази танина, и праћен је утицај наведених третмана на очување интегритета цревних ресица. 1
2. ПРЕГЛЕД ЛИТЕРАТУРЕ 2.1. ХЕМИЈСКИ САСТАВ ТАНИНА Танини су полифенолни, безазотни, нетоксични, сложени и разноврсни састојци биљног порекла, опорог укуса. Молекуларна тежина танина је у распону од 500 до 3000. Термин "танин" не значи било које познато и прецизно дефинисано хемијско једињење. Ово је више збирно, органолептичко, техничко име, задржано до данас, као што је име етеричних уља, смола, сапонозида и других супстанци, које су такође хемијски веома хетерогене. Танини су веома распрострањени у биљном свету, и у већим количинама их има у цимету, киму, оригану, ванили, црвеном и црном пасуљу, шипку, гуарани, кестену. Воће богато танинима су трешње, нектарине, кајсије, боровнице, орашасти плодови, јагоде. Ретко се налазе у печуркама, алгама и маховинама, а Brassicaceae i Papaveraceae их не садрже. Има их у свим органима зељастих и дрвенастих биљака. У вишегодишњим зељастим биљкама, најбогатији танинима су подземни органи (ризоми и корени), а у дрвенастим, коре са корена, стабла и дебљих грана, лишће, плодови и др. Количина танина у различитим биљкама је различита: храстова кора има око 10%, петопрст (срчаник) око 20%, а различите шишарке 50-70%. Растворени су у ћелијском соку и локализовани у ћелијама паренхима. Они се растварају у води, етанолу, глицеролу и ацетону, док се у другим органским растварачима (етар, петрол етар итд.) не растварају. 2.2. ПОДЕЛА ТАНИНА Танини се деле на четири групе: хидролизоване (галотанине), кондензоване (катехине), мешовите (смеша две врсте танина) и псеудотанине. Хидролизовани танини су естри шећера и фенолних киселина или деривати ових киселина. То су галотанини, од којих се хидролизом, у присуству алкалија, производи гликолна киселина, као једини фенолни део; и елагитанини, који хидролизом поред галне киселине дају и један од њених деривата елагинску киселину. Мономерна пентагалоилглукоза (Acidum tannicum) или њени олигомери су најраширенији хидролизовани танини у биљном свету (слика 1). У комбинацији са магнезијумом и понекад активним угљем, танинска киселина се користила као третман за многе 2
токсичне супстанце крајем 19. и почетком 20. века, као што су стрихин, гљивична и друга тровања храном (Haslam, 1996). Увођење третмана са тешком танинском киселином 1920. године, значајно је смањило стопу смртности. Током Првог светског рата, облоге танинске киселине су биле прописане за лечење опекотина. Након рата, овај облик употребе је напуштен због развоја модернијих режима лечења. Танинска киселина још увек има фармацеутску примену у производњи албумин таната који се користи као средство против дијареје. Танинска киселина се такође користи за добијање танинских соли одређених антихистамина и антитусичних производа како би се обезбедила повећана стабилност или споро ослобађање активног фармацеутског састојка. Слично томе, танинска киселина је главни, мада вероватно најмање ефикасан састојак у антиалергијским спрејевима (Santos-Buelga и Scalbert, 2000). Слика 1. Танинска киселина (www.byjus.com/chemistry/tannic-acid/) Кондензовани танини ова група танина се формира кондензацијом неколико (обично три или четири молекула) флаван-3-ола или ређе флаван-3,4-диола. Током полимеризације делују ензими пероксидазе и оксидују орто-хидроксилне групе до ортохинона. Након тога долази до деполимеризације, при чему настаје пигмент антоцијанидин и други производи, те је стога друго име за кондензоване танине проантоцијанидини (ПА) или леукоцијанидини. Кондензовани танини су присутни у 3
биљкама и састоје се од катехина или епикатехина (слика 2), и често садрже естре галне киселине. Слика 2. Епикатехин (www.wikipedia.org/sr-el/epigalokatehin_galat) Псеудотенини су танини у ширем смислу. Настају од градивних једниница танина, али имају мању молекуларну тежину. Најчешће су естри галне киселине и фенол-карбонских киселина са глукозом, са веома слабо израженим танинским карактером. Примери су рузмаринска киселина (слика 3) и хлорогенска киселина (слика 4). Слика 3. Рузмаринска киселина (www.byjus.com/chemistry) Слика 4. Хлорогенска киселина (www.byjus.com/chemistry) 4
2.3. УЛОГА ТАНИНА У ОРГАНИЗМУ У циљу побољшања производних резултата и очувања доброг здравственог статуса бројлера као адитива за сточну храну, користе се различити биостимулатори и нетерапијски адитиви (Кавазовић и сар., 2009). Адитиви који имају различиту употребу додају се храни за животиње како би се постигла већа одрживост хране, боља манипулација и на крају повећала производња и побољшао квалитет хране животињског порекла. То су супстанце које се додају у оброк у малим количинама, потенцирају корисне и сузбијају штетне ефекте. Међу овим адитивима, посебна пажња се обраћа на стимулаторе раста. У ту сврху, као што је горе споменуто, антибиотици су се користили дуги низ година. Међутим, њихова употреба је резултирала бројним негативним ефектима, првенствено израженим у отпорности микроорганизама и задржавању остатака антибиотика у месу, што се показало потенцијално штетним по људско здравље. Све то је довело до потпуне забране употребе антибиотика као промотора раста од стране ЕУ у 2006. години (Шевић, 2016). Фитоботици имају велики потенцијал за употребу у тову бројлера због својих антиоксидативних својстава, утицаја на побољшање укуса хране, ефеката на побољшање функције дигестивног тракта и способности да побољшају имуни одговор организма. Ово је додатно појачано њиховим антимикробним својствима, што чини фитобиотике природним и прихватљивим надоместком антимикробних стимулатора раста. Јасан начин функционисања фитогених адитива још није у потпуности дефинисан, првенствено због широког спектра употребљених биљака, различитих начина обраде и употребе биљака и њихових деривата, различитих употребљених доза и релативно малог обима истраживања на ову тему. Међутим, на основу радова објављених у овој области, утврђено је да фитогени адитиви показују своју функцију у органима за варење: стимулишу секрецију ензима у танком цреву, побољшавају варење, смањују количину патогених бактерија и доприносе већој отпорности на болести. У дебелом цреву смањују број патогених бактерија и побољшавају микробни статус колона. Све ово доводи до побољшања имунитета, повећане отпорности на болести (нарочито болести пробавног тракта) и повећане производне перформансе (Scalbert, 1991). 5
Позитиван ефекат биљних екстраката на варење живине огледа се и у смањењу ph у илеуму и повећању броја бифидобактерија и лактобацила, што доприноси бољој равнотежи цревне микрофлоре која може да обезбеди оптималне услове за заштиту од патогених микроорганизама (Tekeli и сар., 2006; Vidanarachchi и сар., 2006). Резултати радова показују различите ефекте фитогених адитива на параметре цревних ресица јејунума и дебелог црева код пилића и свиња (Namkung и сар., 2004, Demir и сар., 2005, Jamroz и сар., 2006, Nofrarias и сар., 2006, Oetting и сар., 2006). Танини испољавају и друге физиолошке ефекте, као што су убрзавање згрушавања крви, смањење крвног притиска, смањење нивоа серумских липида, некроза јетре и модулисање имунолошких одговора. 2.4. УТИЦАЈ ТАНИНА НА ЗДРАВЉЕ ЖИВОТИЊА Утицај танина на здравље животиња је многоструко. Једно од њих је антимикробно дејство. Антимикробна активност танина је одавно препозната, и испитана је токсичност танина на бактерије, гљивице и квасце (Scalbert, 1991). Механизми који су до сада предложени за објашњење антимикробне активности танина укључују инхибицију екстрацелуларних микробних ензима, депривацију супстрата потребних за раст микроорганизама, директно деловање на метаболизам путем инхибиције оксидативне фосфорилације, лишавања металних јона или формирања комплекса са ћелијском мембраном бактерија, изазивање морфолошких промена ћелијског зида и повећање пропустљивости мембране (Scalbert, 1991; Liu и сар., 2013). Показано је да је ћелијска мембрана примарно место инхибиторног деловања танина (Мcallister и сар., 2005, Liu и сар., 2013) путем ћелијске агрегације и поремећаја ћелијских мембрана и функција. Иако је таложење протеина универзално својство за све танине, антимикробна активност танина је специфична за микробне врсте и уско је повезана са хемијским саставом и структуром танина. Генерално, антимикробна активност танина против грам-позитивних бактерија је већа у односу на грам-негативне бактерије (Ikigai и сар., 1993, Smith и Mackie, 2004), с обзиром да грам-негативне бактерије имају спољашњу мембрану која се састоји од липидне 6
двослојне структуре (спољашњег слоја липополисахарида и протеина, и унутрашњег слоја састављеног од фосфолипида). Међутим, показало се да танини, посебно кондезовани, изоловани из неколико биљака, имају јаку активност против грамнегативних бактерија. Важно је напоменути да су патогене бактерије као што су Escherichia coli О157:Н7, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Pseudomonas и Helicobacter pylori биле осетљиве на танине (Funatogawa и сар., 2004, Liu и сар., 2013). Wang и сар. (2013) су упоређивали 12 врста танина и пронашли да кондезован танин изолован из љубичасте преријске детелине и кондензован танин из смеђе алге поседују јаку активност против Escherichia coli и Escherichia coli О157: Н7. Утврђено је да су број хидроксилних група и ослобођен водоник пероксид након оксидације танина, два важна фактора одговорна за антимикробна својства танина (Акаgawa и сар., 2003; Mueller-Harvey, 2006). Флавоноли са трихидрокси Б прстеном (галокатехин) имају већи инхибиторни ефекат на Streptococcus, Clostridium, Proteus и Staphylococcus од флавонола са дихидрокси Б прстеном (Sakanaka и сар., 1989). Због велике разноликости танина, долази и до велике разноликости у њиховим антимикробним активностима, тако да праћење и идентификација танина који су ефикасни и специфични за циљне микробе захтева велике напоре. 2.4.1. УТИЦАЈ ТАНИНА НА STAPHYLOCOCCUS AUREUS Стафилокоагулаза је екстрацелуларни протеин који производи Staphylococcus aureus (слика 5). Комплекс тромбин-стафилокоагулаза настаје одмах након мешања протромбина и стафилкоагулазе. Комплекс тромбин-стафилокоагулаза је ензимски активан и иницира фибринску полимеризацију, након чега агрегацијом настаје растворљиви фибрин. Растворљиви фибрин се затим конвертује у коначном кораку у нерастворљиви фибрин помоћу активираног ензима за умрежавање, фактора XIIIa (фибрин-стабилизатора). Присуство јонског калцијума унапређује описану реакцију. Утврђено је да инхибиција коагулације плазме танинском киселином настаје услед смањења концентрације јонског калцијума, инхибиције производње ензима и спречавања ензимске реакције. 7
Антистафилококна активност антибиотика оксацилина, против мембранских структура Staphylococcus aureus повећава се у прицуцтву танинске киселине. Ови резултати указују да танинска киселина може бити корисно ађувантно средство за третман Staphylococcus aureus кожних инфекција, поред антибиотика. Имајући у виду очигледан тренд еволуције резистентних сојева, даље истраживање природних производа са антистафилококним активностима може открити корисне локалне примене у клиничкој дерматологији (Akiyama и сар., 2001). Слика 5. Staphylococcus aureus (www.cit.vfu.cz/alimentarni-onemocneni/xsa/xsa01.html) 2.4.2. УТИЦАЈ ТАНИНА НА CAMPYLOBACTER JEJUNI Campylobacter jejuni (слика 6) je водећи бактеријски узрок болести изазваних храном широм света. Процењено је да у Европи годишње око 1% људске популације може бити заражено кампилобактером (Anderson и сар., 2012). Тестирана је антимикробна активност хидролизованих танина из купине, бруснице, кестена и мимозе (сваки по 100 мг / мл) против C. jejuni, и откривено је, да су у поређењу са контролном групом, сви тестирани танини инхибирали раст C. jejuni. Резултати истраживања такође показују антимикробну активност различитих хидролизованих и кондензованих екстраката танина против C. jejuni, и откривају да кондензовани танини могу бити мање ефикасни од хидролизованих танина у контроли C. jejuni (Nelson, 2007). 8
Живина се традиционално сматра главним резервоаром за C. jejuni (преко гастроинтестиналног тракта). C. jejuni такође може лако колонизовати гастроинтестинални тракт говеда, оваца и свиња. Пренос C. jejuni унутар гастроинтестиналног тракта или спољашњих површина у постројењима за паковање меса, представља велик ризик. Стога, произвођачи и прерађивачи меса континуирано трагају за новим и побољшаним стратегијама за смањење контаминације животиња за клање. За третман против C. jejuni су најчешће коришћени флоротанини екстраховани из смеђих алги. Третман се заснивао на везивању танина за ћелијске протеине и ензиме (Anderson и сар., 2012). Слика 6. Campylobacter jejuni (www.microbeonline.com/campylobacter-jejuni-disease) 2.4.3. АНТХЕЛМИНТИЧКИ ЕФЕКAТИ КОНДЕНЗОВАНИХ ТАНИНА НА TRICHOSTRONGYLUS COLUBRIFORMIS Развој антхелминтичке резистенције представља феномен, у сталном ширењу, углавном код малих преживара. Многи фактори су укључени у развој резистенције на лекове као што су: генетска основа и број укључених гена; учесталост, доза и ефикасност антхелминтског третмана. У експерименту Sargison и сар. (2007) je утврђено значајно смањење инфицираности оваца Т. colubriformis (слика 7) код група које су третиране танинима из сирка и акације, у поређењу са зараженом контролном групом. У огледу је учестововало 20 оваца, држаних у затвореним условима, а биле су храњене сеном и концетратом. 9
Циљ ове студије je био да се потврди потенцијална употреба кондезованих танина, као суплементација у исхрани преживара и профилаксе у контроли паразита, што је у складу са резултатима других аутора (Аthanasiadou, 2000; Hordegen, 2003). Слика 7. Тrichostrongylus colubriformis (www.rvc.ac.uk/review/parasitology) 2.4.4. УТИЦАЈ КОНДЕНЗОВАНИХ ТАНИНА НА HAEMONCHUS CONTORTUS Контрола гастроинтестиналних нематода је углавном документована код оваца, док су студије везане за козе знатно ређе. Haemonchus contortus (слика 8) је високо патогена и широко распрострањена врста, посебно у тропским подручјима. Циљ студије Paolini и сар. (2003) је био да се процени могући утицај кондензованих танина код коза инфицираних са H. contortus. У експерименту је учествовало 17 коза које су заражене са H. contortus. Узгајане су у затвореном простору под условима који су искључивали друге нематодне инфекције и храњене су високо квалитетном пелетираном храном и сеном. Код групе која је у својој исхрани имала додатак танина комерцијално доступног екстракта коре тропског дрвета, забележено је смањење продукције јаја H. contortus за 64% у односу на контролну групу. 10
Слика 8. Haemonchus contortus (www.bio390parasitology) 2.4.5. УТИЦАЈ ТАНИНА НА ИНХИБИЦИЈУ SALMONELLA TYPHIMURIUM У огледу Reyes и сар. (2017), антимикробна активност танина на одабраним бактеријским сојевима је мерена у течној култури методом бројања плоча и тестом дифузије диска. У 10мл свежег медијума за раст инокулисано je 1% културе Salmonella typhimurium (слика 9) преко ноћи. Танини су додавани у медијум културе. Културе су добро мућкане и инкубиране на 37 C током 24 часа. Тестирани танини јасно су смањили број салмонела. Комерцијални галотанини су се показали нешто боље од комерцијалних елагитанина у смањењу броја бактерија. Танини екстраховани из Calliandra calothyrsus били су релативно неефикасни. Насупрот томе, танини екстраховани из Acacia nilotica показали су значајан антимикробни ефекат у свим концентрацијама. Тест дифузије диска је коришћен да се потврди антимикробна активност танина. Механизми помоћу којих танини инхибирају бактерије још нису у потпуности разјашњени, али су вероватно повезани са неколико различитих фактора као што су: број орто-фенолних група које могу да хелирају јоне метала, број орто-фенолних група и ароматични прстенови који могу везати супстрате, липофилност и молекуларна тежина који одређују степен интеракције са бактеријским мембранама. Резултати наведеног огледа потврђују да кондензовани, хидролизовани и мономерни флаванол танини имају активност против патогене S. typhimurium. 11
Танини који спречавају адхезију, узрокују бактеријску агрегацију, оштећују бактеријске мембране или успоравају раст бактерија могу се показати као довољно ефикасни у борби против бактеријских култура, јер њихово деловање може пружити довољно времена да се елиминишу патогене бактерије и да домаћин развије свој имуни одговор (Kubena и сар., 2001; VanParys и сар., 2010). Слика 9. Salmonella typhimurium (www.vetinst.no/nyheter) 2.4.6. УТИЦАЈ ХИДРОЛОЗОВАНОГ ТАНИНА НА CLOSTRIDIUM PERFRINGENS Некротични ентеритис (слика 10) је једна од најистакнутијих и најтежих болести код пилића, посебно код бројлера (McDevitt и сар., 2006). Болест је одговорна за високу стопу смртности и за значајано смањење производних параметара. Обично се јавља код бројлера од 2. до 6. недеље старости и изазвана је прекомерном концентрацијом Clostridium perfringens (тип А, у мањој мери тип Ц) у танком цреву и продукцијом екстрацелуларних токсина који оштећују црева. Иако је C. perfringens признат као изазивач некротичног ентеритиса (Elwinger и сар., 1992), други кофактори су обично неопходни да се изазове епидемија, укључујући животну средину, климу, хигијену и дијету. У комерцијалној производњи, кокцидиоза је још један важан фактор који утиче на изазивање епидемије некротичног ентеритиса. 12
У многим земљама се некротични ентеритис контролише употребом антибиотика у храни или води за пиће. Међутим, Европска унија је забранила употребу антибиотика у храни, а захтеви потрошача могу довести до ограничења употребе антибиотика. Дакле, алтернативна стратегија за контролу некротичног ентеритиса је потребна. Могућа решења укључују пробиотике, пребиотике, органске киселине и производе екстраховане из биљака. У хуманој медицини, биљке су познате као извор биоактивних једињења који служе као алтернатива лековима, али примене у ветеринарској медицини су веома ограничене. Танини из кестеновог дрвета су пример хидролизованих танина. Они су се показали ефикасни у борби против кокцидиозе и некротичхог ентеритиса код живине. У огледу Elizondo и сар. (2010), танин екстрахован хидролизом из кестена је тестиран на ефикасност у контроли пролиферацијe C. perfringens у црeвима бројлера у старости од 10 дана и 15 дана. Резултати сугеришу да се танин из кестена може користи као адитив храни у циљу контролисања инфекције клостридијом код бројлера, с обзиром да је број C. perfringens био смањен када је ниво танина у храни повећан. Слика 10. Црево бројлера оболело од некротичног ентеритиса (www.poultryhub.org/vaccinating-against-necrotic-enteritis/) 13
2.5. ТАНИНИ КАО АНТИНУТРИТИВНЕ МАТЕРИЈЕ Традиционални схватања која се односе на исхрану живине, сматрају танине антинутритивним факторима. За разлику од утицаја на преживаре, где животиње од додатих танина у исхрани могу имати значајне користи, танини се генерално сматрају непожељним у храни за животиње са једноставним желуцем. Код моногастричних домаћих животиња, ранији радови указују да додатак танина у храни смањује сварљивост хране (нарочито сирових протеина) и последично смањује производне перформансе (Barroga и сар., 1985; Trevino и сар., 1992). Међутим, резултати о антинутритивним ефектма танина се углавном заснивају на тестовима који се изводе са релативно високим концентрацијама танина у храни, углавном користећи пречишћене кондензоване танине или биљке са сувишком танина, као што је на пример танинска киселина из зрна сирка. Ови експерименти су показали негативне ефекте по животиње, као што су смањење искоришћености хранљивих материја, као и смањење продуктивности животиња. Резултати оваквих експеримената су били извор широко распрострањеног концепта да су танини негативни за здравље животиња. За разлику од старијих радова, студије новијег датума указују да корисне или штетне особине танина зависе од њихове хемијске структуре, употребљене концентрације, процеса припреме хране, састава хране, као и од других фактора као што су животињска врста и физиолошко стање животиње. Новији резултати указују на то да је умерени ниво танина у стању да побољша и исхрану и здравствени статус код моногастричних животиња, посебно код живине (Не и сар., 2006). Schiavone и сар. (2008) су показали да употреба екстракта кестена у исхрани живине не утиче на сварљивост хране, квалитет трупа или баланс азота, док има позитиван утицај на перформансе раста ако је укључен у исхрани до 0,2% у односу на суву материју. Marzoni и сар. (2005) су проучавали ефекте исхране фазана са квербахо танином и показали су да укључивање ових танина у исхртану до 0,2% не утиче на перформансе раста. Longstaff и McNab (2007) наводе да додатак танина из кестена у исхрани живине може да промени конзистенцију измета, што доводи до чвршће простирке у боксовима, 14
што позитивно утиче на здравствени статус и добробит пилића у системима интензивне производње. Танини се такође могу користити у комбинацији са пробиотицима, показујући позитивне ефекте на дигестивни систем. Наиме, утврђено је да танини из кестена повећавају толеранцију на транзит лактобацила у желуцу, а такође утичу на побољшање здравственог стања црева (Blaiotta и сар., 2013). Иако танини могу имати позитивне ефекте на варење, а самим тим и на производне параметре животиња, њихов примарни начин деловања није довољно изучен. Неки аутори сугеришу да ниска концентрација танина може побољшати укус хране и тиме стимулисати повећан унос хране (Windisch и Kroisma, 2007). Други сматрају да је стимулација секреције ћелија дигестивног тракта кључни начин деловања (Lee и сар., 2015). Један од модела деловања танина, који је литературно највише подржан, се заснива на смањењу микробне активности у организму животиње, посебно код младих животиња (Windisch и сар., 2008). 2.6. АНАТОМСКЕ И ХИСТОЛОШКЕ КАРАКТЕРИСТИКЕ ТАНКИХ ЦРЕВА БРОЈЛЕРА Танка црева (intestinum tenue) бројлера (слика 11) почињу од желуца и деле се на дванаестопалачно (duodenum), празно црево (jejunum) и вито црево (ileum). Дванестоплалачно црево је најкраћи део танких црева и карактеише га кривина (flexura duodeni) која јасно раздваја силазни део (pars descendens) од узлазног дела (pars ascendens). Ова два дела су паралелно постављена, а између њих је постављена гуштерача (pancreas). Место где се уливају изводни канали гуштераче и јетре назива се papilla duodeni и представља место од кога почиње празно црево које формира многобројне завоје и петљу (ansa jejuni). Празно црево се завршава још једном петљом (ansa axialis) на чијем средишњем делу се налази остатак жуманчане кесице Мeckel-ов дивертикулум (diverticulum vitellinum). Од овог дивертикулума наставља се вито црево. Вито црево прави једну петљу (Ansa ilei), а завршава илео-ректално-цекалним спојем (Nickel и сар., 2001). 15
Слика 11. Дигестивни систем живине (www.poultry.com) Црева бројлера се састоје од четири основна омотача (слика 12): слузокожа (tunica mucosa), подслузокожа (tunica submucosa), мишићни омотач (tunica muscularis) и серозни омотач (tunica serosa). Tunica mucosa је грађена од три листа (lamine): епителa (lamina epithelialis), крзнa (lamina propria) и мишићнoг листа (lamina muscularis). Слузокожа у цревима ствара наборе, цревне ресице (villi intestinales), које се пружају у лумен. Епител је једноредан призматичан, грађен од апсорпционих ћелија (ентероцита) и пехарастих ћелија. Ентероцити су најбројнији у дуоденуму, а њихов број се смањује ка аналном отвору, док је број пехарастих ћелија најмањи у дуоденуму и повећава се ка аналном отвору. Епител формира и бројне уврате, Либеркинијеве крипте, које се налазе у основи ресица. У криптама се налазе матичне ћелије, апсорпционе ћелије, пехарасте ћелије, ендокрине ћелије, М-ћелије и Панетове ћелије. Ентероцити су високопризматичне ћелије, у апикалном делу везане спојним зонама. На апикалном делу ових ћелија мембрана формира бројне наборе, микровиле. На микровилама се налази гликокаликс, чије компоненте помажу у апсорпцији хранљивих 16
материја. Пехарасте ћелије су једноћелијске жлезде које луче муцин. Улога муцина је заштита епитела црева. Матичне ћелије се налазе у дну крипти. Од ових ћелија настају интермедијерне ћелије од којих касније настају ентероцити и пехарасте ћелије. Улога им је у замени ове две врсте ћелија, a такође и ендокриних и Панетових ћелија. Замена ентероцита и пехарастих ћелија се врши на тај начин што пролиферацијом матичних ћелија у криптама настају ентероцити и пехарасте ћелије које мигрирају дуж цревних ресица и потискују постојеће ћелије које бивају одбачене на врху ресице. Lamina propria је грађенa од растреситог везивног ткива. Зависно од сегмента црева у њој је присутно мање или више дифузно лимфатично ткиво или појединачни лимфатични нодули. У lamina propria-и цревних ресица се налази добро развијена капиларна мрежа. Lamina muscularis се састоји од глатко-мишићних ћелија. Тunica submucosa је грађена од растреситог и густог везивног ткива. У tunica submucosa-и дуоденума се налазе Брунерове жлезде (gll. duodenales). У tunica submucosa-и илеума се налази лимфатично ткиво, које је у контакту са лимфним фоликулима из lamina propria-е и формира накупине које се називају Payer-ове плоче. Тunica muscularis је грађена од дебљег унутрашњег кружног слоја (stratum circulare) и танког спољашњег уздужног слоја (stratum longitudinale). Тunica serosa представља висцерални лист перитонеума (Junqueira и Carneiro, 2005). Слика 12. Грађа танких црева (www.histology-world.com) 17
3. РАДНА ХИПОТЕЗА, ЦИЉ И ЗАДАЦИ ИСТРАЖИВАЊА У досадашњим испитивањима је утврђено да додатак танина у исхрани живине, екстрахованих из одређених биљних органа у прецизно дефинисаним концентрацијама, може довести до пораста јединки као и контроле броја микроорганизама у дигестивном тракту живине. Претпоставка је да употреба танина у исхрани бројлера може утицати на интегритет цревних ресица, што последично утиче на интензитет апсорпције хранљивих материја. Циљ овог рада је испитивање одређених хистолошких параметара цревних ресица који утичу на њихов интегритет, код бројлера којима су у храну били додавани препарати на бази танина. У оквиру постављеног циља испитивања, одређени су следећи задаци испитивања: мерење одређених хистолошких параметара цревних ресица бројлера који утичу на њихов интегритет, код јединки којима су путем хране додавани различити препарати на бази танина, као и код јединки који су храњени без додатка танина упоређивање добијених резултата између експерименталних група и израчунавање статистички значајних разлика дефинисање утицаја примењених танинских препарата у исхрани бројлера на вредности посматраних хистолошких параметара цревних ресица, као и њиховог утицаја на интегритет цревних ресица и интензитет апсорпције хранљивих материја 18
4. МАТЕРИЈАЛ И МЕТОД РАДА 4.1. ПЛАН ОГЛЕДА У оквиру експерименталног дела овог рада, укупно 450 једники тешких хибрида пилића (Ross 308) су били подељени у 3 групе од по 30 пилића са 5 понављања. Прва група је представљала контролну групу, пилићима из друге групе је у храну додаван препарат на бази хидролизованог танина, док је пилићима из треће групе додаван препарат на бази кондензованог танина. Танин који је додаван путем препарата у храну је добијен екстракцијом из плода кестена, a препарат је додаван у количини од 750 грама по тони хране. Температурѕ и влажност су у објектима у којима су гајени пилићи одржавани у складу са технолошким нормама. Приступ пилића храни и води је био ad libitum. Исхрана пилића је вршена помоћу три смеше: стартера (од 1. до 14. дана), гровера (од 15. до 28. дана) и финишера (од 29. до 42. дана). 4.2. УЗОРКОВАЊЕ Након 42 дана, жртвовано је по 10 бројлера из сваке групе. Узети су узорци танких црева (jejunum) који су фиксирани у 10% раствору формалина. Након фиксирања је спроведена стандардна процедура дехидратације и просветљавања, а након тога су узорци калупљени у парафину. Серијски резови, дебљине 5µm су сечени на микротому и бојени хематоксилин-еозином (Х&Е) применом стандардне процедуре (Bancroft и Layton, 2012a, 2012b). 19
4.3. ХИСТОЛОШКЕ АНАЛИЗЕ Приликом анализе хистолошких препарата танких црева, одрђиване су вредности следећих параметара који утичу на интегритет цревних ресица: висина цревних ресица, дубина крипти, однос висине ресица и дубине крипти, површина цревних ресица, дебљина мишићног слоја (tunica muscularis) црева. Анализа хистолошких препарата је вршена на истраживачком светлосном микроскопу Leica DMLS повезаним са дигиталном камером Leica DC300 и софтвером за анализу слике Leica IM1000 (Leica Imaging Systems Ltd, Cambridge, UK). 4.4. СТАТИСТИЧКА ОБРАДА ПОДАТАКА Статистичка обрада података је вршена применом анализе варијансе (ANOVA) и post hoc Tukey теста употребом програмског пакета Statistica 13.0. Разлике су сматране значајне за вредности Р 0,05. 20
5. РЕЗУЛТАТИ Резултати испитивања хистолошких карактеристика танких црева (jejunum) бројлера којима су у храну додавани препарати на бази хидролизованог и кондензованог танина су приказани табеларно и путем графикона, а документовани приложеним микрофотографијама. Вредности испитиваних хистолошких параметара (висина цревних ресица, дубина крипти, однос висина ресица / дубина крипти, површина ресица, дебљина мишићног слоја) су приказани у табели 1. Табела 1. Вредности посматраних параметара код експерименталних група Параметри Контрола Додатак хидролизованог танина Додатак кондензованог танина Висина ресица (µm) 1465,37 Б 1513,04 АБ 1675,68 А Дубина крипти (µm) 295,32 А 256,85 Б 257,59 Б Однос висина ресица / 5,09 Б 6,11 А 6,67 А дубина крипти Површина ресица (mm 2 ) 0,22 0,22 0,23 Дебљина мишићног слоја (µm) 288,72 279,89 290,25 А, Б између вредности означених различитим словом унутар једног реда, постоје значајне разлике (Р 0,05) Утврђено је да је висина цревних ресица била значајно већа код групе која је храњена уз додатак кондензованог танина у односу на контролну групу (слика 13, графикон 1). 21
Слика 13. Висина ресица (ВР) и дубина крипти (ДК) код посматраних група бројлера: А контролна група, Б група којој је у исхрани додаван хидролизовани танин, Ц група којој је у исхрани додаван кондензовани танин. Бојење Х&Е. Бар = 200µm. 1700 1650 A 1600 µm 1550 1500 1450 Б АБ 1400 1350 K ХT KT Графикон 1. Висина ресица (µm) код посматраних група бројлера: К контролна група, ХТ група којој је у исхрану додаван хидролизовани танин, КТ група којој је у исхрану додаван кондензован танин. Између група означених различитим словом (А, Б) постоје значајне разлике. 22
Дубина крипти је била значајно мања код група које су биле храњене са додатком танина у односу на контролну групу (слика 13, графикон 2). 300 290 A 280 µm 270 260 Б Б 250 240 230 K ХT KT Графикон 2. Дубина крипти (µm) код посматраних група бројлера: К контролна група, ХТ група којој је у исхрану додаван хидролизовани танин, КТ група којој је у исхрану додаван кондензован танин. Између група означених различитим словом (А, Б) постоје значајне разлике. Однос висине ресица и дубине крипти је био значајно већи код група које су биле храњене са додатком танина у односу на контролну групу (слика 13, графикон 3). µm 8 7 6 5 4 3 2 1 0 A A Б K ХT KT Графикон 3. Однос висине ресица и дубине крипти код посматраних група бројлера: К контролна група, ХТ група којој је у исхрану додаван хидролизовани танин, КТ група којој је у исхрану додаван кондензован танин. Између група означених различитим словом (А, Б) постоје значајне разлике. 23
Између експерименталних група нису постојале значајне разлике између површине ресица (слика 14, графикон 4) и између дебљине мишићног слоја (слика 15, графикон 5). Слика 14. Површина цревних ресица (обојена жутим) код посматраних група бројлера: А контролна група, Б група којој је у исхрану додаван хидролизовани танин, Ц група којој је у исхрани додаван кондензовани танин. Бојење Х&Е. Бар = 200µm. 0,25 0,2 µm 0,15 0,1 0,05 0 K ХT KT Графикон 4. Површина цревних ресица (mm 2 ) код посматраних група бројлера: К контролна група, ХТ група којој је у исхрану додаван хидролизовани танин, КТ група којој је у исхрану додаван кондензован танин. 24
Слика 15. Дебљина мишићног слоја (МС) код посматраних група бројлера: А контролна група, Б група којој је у исхрану додаван хидролизовани танин, Ц група којој је у исхрану додаван кондензовани танин. Бојење Х&Е. Бар = 100µm. µm 300 290 280 270 260 250 240 230 220 210 200 K ХT KT Графикон 5. Дебљина мишићног слоја црева (µm) код посматраних група бројлера: К контролна група, ХТ група којој је у исхрану додаван хидролизовани танин, КТ група којој је у исхрану додаван кондензован танин. 25
6. ДИСКУСИЈА Резултати истраживања показују да су у појединим хистолошким параметрима који су били посматрани, постојале значајне разлике између групе која путем исхране није примала танинске препарате и група којима су у храну били додавани препарати на бази хидролизованог и кондензованог танина. У раду је висина цревних ресица била значајно већа код групе која је путем исхране примала кондензовани танин у поређењу са групом којој у храну није додаван танин. Наведени резултат се може објаснити утицајем кондензованих танина на повећан раст и развој ћелија које се налазе у епителу цревних ресица, као што су пре свега ентероцити и пехарасте ћелије, а затим и осталих ћелија које се налазе у цревним ресицама (Makovicky и сар., 2014). Потребно је напоменути да је висина цревних ресица код групе која је била храњена са додатком хидролизованог танина такође била већа у односу на контролну групу, али без значајних разлика. Дубина крипти је параметар који указује на потребу за обнављањем ћелија у епителу цревних ресица. У криптама цревних ресица се, између осталог, налазе и мултипотентне стем ћелије које по потреби утичу на стварање нових ћелија цревног епитела, пре свега ентероцита и пехарастих ћелија (Takashima и сар., 2013). То посредно указује и на степен интегритета цревних ресица. Уколико је потреба за обнављањем ћелија цревног епитела већа, дебљина крипти ће бити већа, док ће дебљина крипти бити мања уколико је смањена потреба за обнављањем цревног епитела. У раду је утврђено да је дебљина крипти била значајно мања код група које су путем исхране примале препарате на бази танина у односу на групу која није храњена уз додатак танина. То указује да су додати танински препарати утицали на одржање интегритета цревних ресица, што је узроковало смањену потребу за обнављањем ћелија цревног епитела, а самим тим мању активност мултипотентних стем ћелија и мању дубину крипти. Однос висине ресица и дубине крипти је параметар који сумира вредности добијене за појединачно посматране параметре (висина ресица, дубина крипти). Већа вредност 26
односа висине ресица и дубине крипти указује на већу висину цревних ресица и малу дубину крипти, што одсликава одржан интегритет цревних ресица и смањену потребу за обнављањем ћелија цревног епитела. Мање вредности односа висине ресица и дубине крипти указују на малу висину цревних ресица и већу дубину крипти, а такве вредности се добијају када интегритет цревних ресица није очуван и када је потреба за обнављањем епителних ћелија црева повећана (Picarelli и сар., 2013). У раду је показано да је однос висине ресица и дубине крипти био значајно већи код група које су путем исхране добијале танинске препарате у односу на групу која је храњена без додатка танина. Такви резултати су у складу са појединачно добијеним резултатима за висину ресица и дубину крипти, где је код група које су биле храњене са додатком танина висина ресица била већа, а дубина крипти мања, у односу на групу која је храњена без додатка танина. Све наведене вредности посматраних параметара где је уочена значајна разлика између групе која није примала танин и група које су примале танин путем исхране, утичу на повећану апсорпцију хранљивих материја из цревног садржаја код група које су примале танинске препарате. Већа висина цревних ресица омогућава присуство већег броја епителних ћелија, пре свега ентероцита, од којих директно зависи интензитет апсорпције (Kiela и Ghishan, 2016). Мања дубина крипти указује на очуван интегритет црева, а самим тим и мању потребу за обнављањем епителних ћелија. Тиме је омогућено да се мања количина створене метаболичке енергије троши на процесе обнављања ћелија, а да се већа количина створене енергије троши на процесе апсорпције хранљивих материја (Yang и сар., 2016). Све наведене карактеристике цревних ресица код група које су примале танинске препарате путем исхране (већа висина цревних ресица, мања дубина крипти, већи однос висине ресица и дубине крипти), самим тим што утичу на повећану апсорпцију хранљивих материја из цревног тректа, посредно утичу и на побољшање производних перформанси бројлерских пилића (Neves и сар., 2014), што свакако може бити значајно у индустријском узгоју тешких хибрида пилића. Резултати овог рада су показали да танински препарати утичу на очување интегритета црева с обзиром да је утврђена значајно мања дубина крипти код третираних јединки. Очуван интегритет цревних ресица посредно може утицати на целокупно 27
здравствено стање јединки. То је у сагласности са ранијим радовима, у којима је такође утврђено да танини утичу на побољшање здравственог стања бројлера, с обзиром да инхибирају раст бактерија Campylobacter jajuni (Nohynek и сар., 2006), Salmonella typhimurium у in vitro условима (Van Parys и сар., 2010), Clostridium perfrigens (Elizondo и сар., 2010), показују бактериостатски ефекат на Salmonella enteridis (Redondo и сар., 2013), и др. 28
7. ЗАКЉУЧАК На основу добијених резултата овог рада, могу се извести следећи закључци: Додатак кондензованог танина у исхрани бројлера значајно утиче на повећање висине цревних ресица танког црева Код бројлера који су путем исхране добијали танинске препарате на бази хидролизованог и кондензованог танина, забележена је значајно мања дубина крипти Однос висине ресица и дубине крипти је био значајно већи код бројлера којима су у исхрану додавани хидролизовани и кондензовани танини Наведене карактеристике цревних ресица бројлера који су путем исхране добијали танинске препарате указују на већу активност ентероцита, повећан процес апсорпције хранљивих материја, мањи степен обнављања епителних ћелија црева, очуван интегритет цревних ресица и ефикаснију потрошњу хране, што последично може утицати на побољшање производних перформанси бројлера Наведени резултати овог рада могу представљати корак ка даљим испитивањима усмереним ка што бољој примени танинских препарата у исхрани бројлера 29
8. ЛИТЕРАТУРА Akagawa, M., Shigematsu, T., Suyama, K. 2003. Production of hydrogen peroxide by polyphenols and polyphenol-rich beverages under quasi-physiological conditions. Biosci Biotechnol Biochem, 67: 2632 2640. Akiyama, H., Fujii, K., Yamasaki, O., Oono, T., Iwatsuki, K. 2001. Antibacterial action of several tannins against Staphylococcus aureus. J Antimicrob Chemother, 48(4): 487-491. Anderson, R.C., Vodovnik, M., Min, B.R., Pinchak, W.E., Krueger, N.A., Harvey, R.B. 2012. Bactericidal effect of hydrolysable and condensed tannin extractson Campylobacter jejuni in vitro. Folia Microbiol, 57: 253-258. Athanasiadou, S., Kyriazakis, I., Jackson, F., Coop, R.L. 2000. Consequences of long-term feeding with condensed tannins on sheep parasitised with Trichostrongylus colubriformis. Int J Parasit, 30(9): 1025-1033. Bancroft, J.D., Layton, C. 2012a. The hematoxylins and eosin. In: Suvarna SK, Layton C, Bancroft JD (Eds): Bancroft s theory and practice of histological techniques. 7 th edn., Churchill Livingstone, London, 173-186. Bancroft, J.D., Layton, C. 2012b. Connective and mesenchymal tissues with their stains. In: Suvarna SK, Layton C, Bancroft JD (Eds): Bancroft s theory and practice of histological techniques. 7 th edn., Churchill Livingstone, London, 187-214. Barroga, C. F., Laurena, A.C., Mendoza, M.T. 1985. Polyphenols in mung bean (Vigna radiata L., Wilczek): determination and removal. J Agric Food Chem, 33: 1006-1009. Blaiotta, G., Gattab, B.L., Capuaa, M.D., Lucciab, A.D., Coppolac, R., Aponte, M. 2013. Effect of chestnut extract and chestnut fiber on viability of potentialprobiotic Lactobacillus strains under gastrointestinal tract conditions. Food Microbiol, 36: 161-169. Demir, E., Sarica, S., Özcan, M.A., Suicmez, M. 2005. The use of natural feed additives as alternative to an antibiotic growth promoter in boiler diets. Arch Geflugelkd, 69: 110-116. 30
Elizondo, A.M., Mercado, E.C., Rabinovitz, B.C., Fernandez Miyakawa, M.E. 2010. Effect of tannins on the in vitro growth of Clostridium perfringens. Veter Microbiol, 145: 308-314. Elwinger, K., Schneitz, C., Berndtson, E., Fossum, O., Teglöf, B., Engstöm, B. 1992. Factors affecting the incidence of necrotic enteritis, caecal carriage of Clostridium perfringens and bird performance in broiler chicks. Acta Vet Scand, 33: 369-378. Funatogawa, K., Hayashi, S., Shimomura, H., Yoshida, T., Hatano, T., Ito, H. 2004. Antibacterial activity of hydrolyzable tannins derived from medicinal plants against Helicobacter pylori. Microbiol Immunol, 48: 251-261. Haslam, E. 1996. Natural polyphenols (vegetable tannins) as drugs: possible modes of action. J Nat Prod, 59: 205-215. He, Q., Shi, B., Yao, K. 2006. Interactions of gallotannins with proteins, amino acids, phospholipids and sugars. Food Chem, 95: 250-254. Hordegen, P., Hertzberg, H., Heimann, J., Langhans, W., Maurer, V. 2003. The anthelmintic efficacy of five plant products against gastrointestinal trichostrongylids in artificially infected lambs. Vet Parasit, 117(1): 51-60. Ikigai, H., Nakae, T., Hara, Y., Shimamura, T. 1993. Bactericidal catechins damage the lipid bilayer. Biochim Biophys Acta, 1147: 132-136. Jamroz, D., Wertelecki, T., Houszka, M., Kamel, C. 2006. Influence of diet type on the inclusion of plant origin active substances on morphological and histochemical characteristics of the stomach and jejunum walls in chicken. J Anim Physiol Anim Nutr, 90: 255-268. Junqueira, L., Carneiro, J. 2005. Основи хистологије. Дата Статус, Београд. Kavazović, A., Gagić, A., Rešidbegović, E., Alibegović-Zečić, F., Goletić, T., Crnkić, Ć., Kustura, A., Softić, A. 2009. Učinak probiotika na proizvodne rezultate brojlerskih pilića. Stočarstvo, 63: 49-55. 31
Kiela, P., Ghishan, F. 2016. Physiology of Intestinal Absorption and Secretion. Best Pract Res Clin Gastroenterol, 30(2): 145-159. Kubena, L.F., Byrd, J.A., Young, C.R., Corrier, D.E. 2001. Effects of tannic acid on cecal volatile fatty acids and susceptibility to Salmonella typhimurium colonization in broiler chicks. Poult Sci, 80(9): 1293-1298. Lee, H.J., Choi, I.H., Kim, D.H., Amanullah, S.M., Kim, S.C. 2015. Nutritional characterization of tannin rich chestnut (Castanea) and its meal for pig. J Appl Anim Res, 44(1): 258-262. Liu, X.L., Hao, Y.Q., Jin, L., Xu, Z.J., McAllister, T.A., Wang, Y. 2013. Anti-Escherichia coli O157: H7 properties of purple prairie clover and sainfoin condensed tannins. Molecules, 18: 2183-2199. Longstaff, M.A., McNab, J.M. 2007. The effect of concentration of tannin-rich bean hulls (Vicia faba L.) on activities of lipase (EC3.1.1.3) and α-amylase (EC3.2.1.1) in digesta and pancreas and on the digestion of lipid and starch by young chicks. Br J Nutrit, 66: 139-143. Makovicky, P., Tumova, E., Volek, Z., Makovicky, P., Vodicka, P. 2014. Histological aspects of the small intestine under variable feed restriction: The effects of short and intense restriction on a growing rabbit model. Exp Ther Med, 2014; 8(5): 1623-1627. Marzoni, M., Castillo, A., Romboli, I. 2005. Dietary inclusion of quebracho (Schopsis lorentzii) tannins on productive performances of growing pheasant females. Ital. J. Anim. Sci., 4(2): 507-509. Mcallister, T.A., Martinez, T., Bae, H.D., Muir, A.D., Yanke, L.J., Jones, G.A. 2005. Characterization of condensed tannins purified from legume forages: chromophore production, protein precipitation, and inhibitory effects on cellulose digestion. J Chem Ecol, 31(9): 2049-2053. McDevitt, R.M., Brooker, J.D., Acamovic, T., Sparks, N.H.C. 2006. Necrotic enteritis: acontinuing challenge for the poultry industry. World Poultry Sci J, 62: 221-247. Mueller-Harvey I. 2006. Unravelling the conundrum of tannins in animal nutrition and health. 2006. J Sci Food Agri, 86(13): 2010-2037. 32