UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO MATEMATIĈKI FAKULTET DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU MASTER RAD GAJENJE AZOTOFIKSIRAJUĆIH I FOSFOSOLUBILIZIRAJUĆIH BAKT

UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO MATEMATIĈKI FAKULTET DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU MASTER RAD GAJENJE AZOTOFIKSIRAJUĆIH I FOSFOSOLUBILIZIRAJUĆIH BAKTERIJA U KONTROLISANIM USLOVIMA FERMENTORA U CILJU BIOFERTILIZACIJE ZEMLJIŠTA Niš, 2016.

UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO MATEMATIĈKI FAKULTET DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU MASTER RAD GAJENJE AZOTOFIKSIRAJUĆIH I FOSFOSOLUBILIZIRAJUĆIH BAKTERIJA U KONTROLISANIM USLOVIMA FERMENTORA U CILJU BIOFERTILIZACIJE ZEMLJIŠTA Kandidat: Dunja Ţ. Ilić Mentor: Prof. Dr Tatjana Mihajilov-Krstev Niš, 2016.

UNIVERSITY OF NIŠ FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY MASTER THESIS GROWING NITROGENFIXATION AND PHOSPHORSOLUBIZING BACTERIA UNDER CONTROLLED CONDITIONS IN FERMENTOR WITH A GOAL TO FERTILISE THE SOIL Candidate: Dunja Ţ. Ilić Mentor: Prof. dr Tatjana Mihajilov-Krstev Niš, 2016.

ZAHVALNICA Zahvaljujem svima koji su pomogli u izradi ovog master rada. Najveću zahvalnost dugujem svom mentoru, prof. dr Tatjani Mihajilov Krstev, kao i Jovani Jović, na nesebičnoj podršci i pomoći. Veliku zahvalnost dugujem i firmi,,fertico, kao i vlasniku Slavoljubu Vukičeviću, koji su mi omogućili sprovođenje celokupnog istraživačkog rada i dobijanje određenih rezultata. Posebno zahvaljujem svojoj porodici na razumevanju, podršci i strpljenju za vreme studiranja, a najviše svojoj mami, kojoj i posvećujem ovaj master rad.

SAŽETAK Zemljišni mikroorganizmi imaju znaĉajnu ulogu u ekosistemu. Njihova višestruka korist se ogleda u fiksaciji, solubilizaciji, mobilizaciji i obnavljanju nutritijenata u zemljištu. Obogaćivanje zemljišta korisnim mikroorganizmima je biofertilizacija tj. implementacija u zemljište u formi mikrobioloških Ċubriva. U ovom radu je opisan proces optimizacije medijuma kao i Fed-Batch procesa gajenja azotofiksatorskih i fosfosolubilizirajućih bakterija, sa ciljem povećanja njihove biomase, proizvodnje mikrobioloških Ċubriva i njihove implementacije u zemljište. Bakterijske kulture Bacillus subtilis, Bacillus megatherium i Azotobacter vinelandii su korišćene za ispitivanje procesa fermentacije u strogo kontrolisanim uslovima bioreaktora. Rezultati naših istraţivanja su pokazali da je odgovarajućom optimizacijom podloge i kinetikom Fed-batch procesa moguće postići što veću biomasu korisnih mikroorganizama u fermentoru. Kljuĉne reĉi: azotofiksirajuće i fosfosolubizirajuće bakterije, mikrobiološka Ċubriva, biofertilizacija.

ABSTRACT Soils play the crucial role in the ecosystem. Their multiple use is shown in fixation, solubilization, mobilization and recover of nutritients in soil. Soil fertilization with useful microorganisms is biofertilization so called implementation of soil in form of microbiological fertilizer. This work shows the process of optimization of medium as well as fed batch growth nitrogenfixation and phosphorsolubizing bacteria in order to improve biomass and production of microbiological fertilizer and their implementation in soil. Bacterias culture Bacillus subtilis, Bacillus megatherium and Azotobacter vinelandii are used for research of process of fermentation in strictly controlled conditions of bioreactor. The final results of the search shows that appropriate optimization of the soil and kinetics fed batch process is possible to gain bigger biomass of useful microorganisms in fermentor. Key words: nitrogenfixation and phosphorsolubizing bacteria, microbiological fertilizer, biofertilization.

SADRŽAJ 1. UVOD...1 2. OPŠTI DEO...2 2.1. OSOBINE BAKTERIJA I NJIHOVA GRAĐA...2 2.2. ZEMLJIŠTE I MIKROORGANIZMI U ZEMLJIŠTU...7 2.3. ODNOSI MIKROORGANIZAMA U ZEMLJIŠTU...9 2.4. ELEMENTI POTREBNI ZA RAZVOJ BILJAKA... 11 2.5. CIKLUS AZOTA... 13 2.6. CIKLUS SUMPORA... 18 2.7. CIKLUS FOSFORA... 19 2. 8. ĐUBRIVA... 20 2.8.1. MINERALNA ĐUBRIVA... 20 2.8.2. ORGANSKA ĐUBRIVA... 23 2.9. MIKROBIOLOŠKA ĐUBRIVA I BIOFERTILIZACIJA... 25 3. CILJ RADA... 34 4. MATERIJAL I METODE... 35 4.1. MATERIJAL... 35 4.2. METODE... 36 4.2.1. PRIPREMA BAKTERIJSKIH KULTURA... 36 4.2.2. PRIPREMA STARTNE KULTURE (inokuluma)... 37 4.2.3. KONTROLA STERILNOSTI I ODREĐIVANJE BROJNOSTI MIKROORGANIZAMA... 39 4.2.4. PRIPREMA FERMENTORA... 40 4.2.5. METODE BIOFERMENTACIJE... 40 5. REZULTATI I DISKUSIJA... 42 Bacillus subtilis... 42 Bacillus megaterium... 43 Azotobacter vinelandii... 44 6. ZAKLJUČAK... 45 7. LITERATURA... 46 8. BIOGRAFIJA... 49

1. UVOD U poljoprivrednoj proizvodnji i uzgajanju biljnih kultura je neophodno zemljištu dodavati odreċene asimilate, jer se oni, ili u velikoj koliĉini nalaze u vazduhu (azot), ili su prisutni u zemljištu u formi koja je nedostupna biljkama (fosfor, azot, kalijum, gvoţċe i dr.). Zbog toga se zemljištu dodaju veštaĉka sintetska Ċubriva. Rezultati velikog broja istraţivanja su pokazali da sintetsko azotno Ċubrivo to jest, dodavanje kombinovanog azota u zemljište u formi koja je laka za asimilovanje, kroz duţi vremenski period, dovodi do potsticanja razvoja mikroorganizama (bakterija i plesni) koje se hrane organskom materijom. Sa smanjenjem sadrţaja organske materije, zemljište podleţe kompaktizaciji, ĉime se ograniĉava rast korena biljaka i smanjuje sposobnost zadrţavanja vode te zemljište postaje zavisnije od iritacije i podloţnije eroziji. Sa promenama u fiziĉko hemijskim karakteristikama zemljišta i sa smanjenjem raspoloţivog kiseonika usporava se rastmikroflore zemljišta, menja se struktura prirodnih mikrobiocenoza i sloţeni sistem biološke razmene asimilativa se narušava. Antropogeno delovanje i navedene promene u zemljištu su prisutne i na obradivim površinama u Srbiji. Osim toga, povećanje oticanja nitrata dovodi do zagaċenja nadzemnih voda, dok emisija azot-dioksida u atmosferu znaĉajno doprinosi efektu staklene bašte. I najzad, proizvodnja veštaĉkih Ċubriva troši rezerve fosilnih goriva, zagaċuje ţivotnu sredinu i veoma mnogo košta. Mikroorganizmi su, kao neizostavni ĉlanovi svih ţivotnih zajednica, kljuĉni za odrţavanje biogeohemijskih ciklusa kruţenja materija na Zemlji, i kao najznaĉajnija komponenta biološke faze zemljišta, vaţni indikator plodnosti i procesa degradacije u njemu. Pored azotofiksatora koji vraćaju azot iz atmosfere u zemljište, mikroorganizmi mobilišu fosfor, kalijum, gvoţċe, sumpor i ĉine ih dostupnim biljkama. Budućnost poljoprivredne proizvodnje je u primeni biofertilizacije (unošenje ţivih mikroorganizama u zemljište) to jest, u upotrebi mikrobioloških Ċubriva. U ovom radu je vršena optimizacija uslova za gajenje azotofiksirajućih bakterija u cilju proizvodnje velike biomase tj. mikrobioloških Ċubriva. 1

2. OPŠTI DEO 2.1. OSOBINE BAKTERIJA I NJIHOV ZNAĈAJ I GRAĐA Mikrobiologija je nauka koja se bavi prouĉavanjem mikroorganizama, odnosno ispitivanjem ţivota veoma sitnih organizama. Naziv mikrobiologija potiĉe od grĉkih reĉi micros-mali, bios-ţivot, logos-nauka. Mikrobiologija se bavi prouĉavanjem svih pojava i zakonitosti vezanih za ţivot mikroorganizama, odnosno ona ukljuĉuje morfologiju, fiziologiju, genetiku, ekologiju i sistematiku mikroba. Mikroorganizmi su veoma stara grupa organizama, negde oko 4 milijardi godina i imali su ulogu u formiranju ţivota na Zemlji, a i danas uĉestvuju u njegovom odrţavanju. Sam naziv kaţe, to su veoma mali organizmi, koji se ne mogu golim okom videti, jer su manji od 0,1 mm. Mikrobi predstavljaju veoma heterogenu grupu u svakom pogledu, oni obuhvataju najsitnije organizme viruse veliĉine 0, 01 mikrometara (virusi nemaju ćelijsku graċu), ali obuhvataju i organizme vidljive golim okom (neke alge i gljive). Kao što je već reĉeno, mikroorganizmi su heterogena grupa koja obuhvata viruse, bakterije, alge, gljive, lišajeve i protozoe, pa u zavisnosti od toga, mikrobiologija obuhvata sledeće discipline: bakteriologiju, virusologiju, algologiju, mikologiju, lihenologiju i protozologiju. Oni imaju razliĉit oblik, veliĉinu, graċu i fiziologiju, ali se u njihovom prouĉavanju uglavnom koriste iste metode, dok su im zajedniĉke karakteristike: mala veliĉina tela, brz metabolizam, brzo razmnoţavanje, rasprostranjenost po celom svetu kosmopoliti (Petrović et al., 2007). Mikroorganizmi koji nemaju ćelijsku graċu su virusi, dok su mikroorganizmi sa prokariotskim tipom ćelija (nemaju organizovano jedro) bakterije i modrozelene alge, a sa eukariotskim tipom ćelija (imaju organizovano jedro) su protozoe, gljive, lišajevi, alge. Uloga mikroorganizama je veoma velika, neophodni su u mnogim procesima. Oni imaju degradacionu ulogu, to jest, ulogu razlagaĉa, ĉime se omogućava kruţenje materije i proticanje energije u prirodi. To uglavnom obavljaju bakterije i gljive. Mikroorganizmi su i producenti primarne organske materije i proizvoċaĉi kiseonika, a za to su zasluţne alge. Oni su neizostavni deo ţivota ĉoveka. Njihov uticaj moţe biti i štetan i koristan. Štetni mikroorganizmi su izazivaĉi mnogih bolesti, pa tako ostvaruju negativan uticaj na ĉoveka. Mikrobi su neophodni u proizvodnji hrane i pića (proizvodnja jogurta, pravljenje hleba, turšija). Koriste se u hemijskoj, farmaceutskoj industriji, rudarstvu, agronomiji, zaštiti šivotne sredine, medicini, genetici, dobijanju energije i drugim oblastima, što prikazuje njihov 2

pozitivan efekat po ĉoveka. Na osnovu ovoga, vidimo da je mikrobiologija veoma bitna nauĉna disciplina, koja se još uvek razvija i koja ima veliku primenu u svim segmentima ţivota, dok se mikroorganizmi sve više i više primenjuju u razliĉitim granama. Mikrobiologija je doprinela razvoju molekularne biologije, genetike, biohemije, biotehnologije (Petrović et al., 2007). Bakterije spadaju u prokariotske mikroorganizme. One su veoma malih dimenzija,pa se posmatraju pomoću mikroskopa. Bakterije su najsitniji organizmi celularne graċe. Postoje razliĉiti oblici bakterijskih ćelija, ali se kao osnovni oblici izdvajaju: loptast, štapićast, izvijen i konĉast oblik. Loptaste bakterije su koke, koje obuhvataju više tipova: monokoke, diplokoke, tetrade, sarcine, u zavisnosti od naĉina razdvajanja nakon deobe. Štapićaste bakterije su bacilli koji isto obuhvataju razliĉite tipove. Bakterije koje imaju izvijen oblikili izgled zapete su vibrioni. Konĉast oblik imaju bakterije kod kojih je jedna dimenzija izraţenija od ostalih i one mogu biti granate i negranate. Postoje i mnogidrugi izvedeni oblici bakterija (Petrović et al., 2007). Bakterije u svom sastavu imaju odreċene morfološke i funkcionalne strukture (Slika 1.) koje obuhvataju: - površinske ćelijske strukture i vanćelijske tvorevine (spoljašnji omotaĉi, ćelijski zid i izraštaji na ćeliji); - citoplazmu, citoplazmatske ćelijske strukture i ćelijske inkluzije (citoplazma, citoplazmatska membrane i intracelularne membranske tvorevine, ribozomi, nukleoid). Spoljašnji omotaĉi bakterijskih ćelija su: - Glikokaliks predstavlja omotaĉ koji naleţe na ćelijski zid. On je izgraċen od homo ili heteropolisaharida, a reċe od glikoproteina i polipeptida. - Kapsula predstavlja kompaktan omotaĉ bakterijske ćelije koji je izgraċen od polisaharida, ĉvrstine gela. Postoje razliĉite vrste polisaharida koje grade kapsulu. Nemaju sve bakterijske ćelije kapsulu na svojoj površini. Bakterije koje imaju kapsulu uglavnom imaju sjajnu i glatku površinu S tip kolonija, dok one koje je nemaju su hrapave i mat R tip kolonija. Osnovna funkcija kapsule je zaštita bakterijskih ćelija. Ona je osmotska barijera, spreĉava isušivanje ćelija i štiti ćeliju od spoljnih uticaja. - Sluzna sara predstavlja rigidni omotaĉ proteinsko-polisaharidno-lipidne graċe gvoţċevitih i manganskih bakterija. 3

- S omotaĉi su planarne kristalne strukture na samoj površini ćelija, izgraċene od proteina ili glikoproteina. Kod arhea su jedini omotaĉi, ali se sreću i kod ostalih bakterija. Slika 1. GraĊa bakterijske ćelije Ćelijski zid bakterija je sloţene graċe i ĉine ga polisaharidi i peptidi, koji su povezani kovalentnom vezom. Njegova osnovna jedinica graċe je muropeptid koji je sastavljen iz N- acetilglukozamina povezanog β (1-4) glikozidnom vezom sa N-acetilmuraminskom kiselinom, vezanom za tetrapeptid. Ćelijski zid se razlikuje u graċi kod Gram pozitivnih i Gram negativnih bakterija. Razlika je po tipu veza u mureinu, hemijskom sastavu i strukturi. Osnovna funkcija ćelijskog zida je da daje oblik ćeliji i štiti od spoljašnjih uticaja. On ne predstavlja osmotsku barijeru, jer je porozan. Antibiotski agensi narušavaju strukturu ćelijskog zida, jer ometaju njegovu sintezu (Petrović et al., 2007). Bakterije se mogu kretati pasivno i aktivno. Pasivan naĉin kretanja bakterija je rezultat fiziĉkih sila i pokretanja ĉestica teĉnosti, dok je aktivan naĉin kretanja bakterija rezultat metaboliĉkih procesa u samoj ćeliji, pri ĉemu se bakterije kreću klizeći ili plivajući. Bakterije se kreću plivajući pomoću flagela. Flagele su tanki i dugaĉki izraštaji koji se sastoje iz bazalnog tela, kuke i filamenta (u ĉijem sastavu ulaze proteinske subjedinice flagelina). Za pokretanje flagela je neophodno prisustvo Mot proteina, bitnog za stvaranje energije. Flagele se pokreću rotacijom, u smeru suprotnom kazaljci na satu. Broj flagela kod bakterija je razliĉit, mogu imati jednu flagelu i to su monotrihe bakterije ili više njih i to su politrihe bakterije.bakterije koje nemaju flagele su atrihe. Spirohete imaju specifiĉne strukture za 4

kretanje, odnosno aksijalni filament. Ukoliko su pokreti bakterija uslovljeni nekim nadrţajem, onda se nazivaju taksije (hemotaksije, fototaksije). Bakterije imaju još površinskih struktura, a to su fimbrije i pili. Fimbrije nemaju ulogu u kretanju, već omogućavaju adheziju bakterija. One su tanje od flagela i u mnogo većem broju (Petrović et al., 2007). Pili su sliĉni fimbrijama, graċeni od subjedinica pilina i uglavnom se javljaju jedan do tri. Njihova uloga je u razmeni genetiĉkog materijala, u procesu konjugacije, pa se zato i zovu sex pili. Citoplazma bakterija se sastoji iz vode, 70 80 %, u kojoj su rastvoreni razliĉiti organski molekuli, koji su gradivne materije ćelije (aminokiseline, peptidi, proteini, lipidi, ugljeni-hidrati, vitamini, joni). Koliĉina vode odreċena je fiziološkim procesima u ćeliji, starenjem ćelija, kao i spoljnim uticajima. U citoplazmi bakterijskih ćelija se ne javljaju organele karakteristiĉne ze eukariote. Prisutni su ribozomi, koji imaju ulogu u sintezi proteina. Broj ribozoma zavisi od metaboliĉkih aktivnosti ćelija. Bakterije kao ekvivalent jedru imaju nukleoid, koji predstavlja deo citoplazme sa DNK, ali bez jedrovog omotaĉa (Petrović et al., 2007). Intracelularne membranske tvorevine mezozomi, u širem smislu su razliĉite morfološke invaginacije citomembrane koje predstavljaju morfološki i funkcionalno jedinstven sistem. Ove tvorevine su, zapravo, analozi eukariotskih organela, pa tako ovde spadaju: - analozi mitohondrija imaju ulogu u ćelijskoj respiraciji; - mezozomi imaju ulogu u deobi Gram pozitinih bakterija; - kruškaste tvorevine imaju ulogu u replikaciji DNK; - analozi glatkog, hrapavog endoplazmatiĉnog retikuluma i druge strukture. Citoplazmatske inkluzije se mogu javljati u ćelijama i biti organskog ili neorganskog porekla. Uglavnom predstavljaju rezervne hranljive materije (primer, glikogen i skrob, koji su polisaharidne inkluzije) (Petrović et al., 2007). Neki bakterijski rodovi imaju sposobnost formiranja endospora. To su zaštitne, latentne forme ili forme za konzervaciju i uglavnom ih formiraju Gram pozitivne bakterije (Clostridiumi Bacillus). Enzimska i metaboliĉka aktivnost endospora svedena je na minimum ili je potpuno odsutna pa ona predstavlja dormantni stadijum. Spore nastaju tokom sporogeneze, odnosno sporulacije koja poĉinje kada dostupnost hranljivih materija kreće da opada u stacionarnoj fazi rasta. Spora je u stanju mirovanja sve dok ne dospe u povoljne uslove za ţivot, što moţe trajati i nekoliko stotina godina. Aktivacija spora kreće pod uticajem 5

nekih spoljašnjih faktora. Spore imaju zaštitnu ulogu, odnosno omogućavaju preţivljavanje nepovoljnih perioda. Bakterije stvaraju i dodatne formacije koje su oznaĉene kao ciste (karakteristiĉne za rod Azotobacter). Ciste su otporne na isušivanje, mehaniĉke uticaje i UV zraĉenje, ali nisu otporne na visoke temperature i nisu potpuno dormantne. Postoje i mikrospore ćija je otpornost mnogo manja nego li kod endospora. Neke bakterije stvaraju i egzospore, dok su za metanogene i fotosintetske bakterije karakteristiĉne dormantne egzospore. Aktinomicete i Gram pozitivne filamentozne razgranate bakterije formiraju konidije, koje prvenstveno sluţe za razmnoţavanje (Petrović et al., 2007). Kao i svi drugi organizmi, bakterije rastu i razmnoţavaju se. Za rast bakterija neophodna je hrana koja potiĉe iz spoljašnje sredine, pri ĉemu bakterije usvajaju hranljive materije. Hrana je neophodna za sve ţivotne procese i predstavlja izvor energije, kao i gradivne materije. Pod rastom prokariotskih ćelija podrazumeva se povećanje koliĉine svih hemijskih komponenti koje ih grade. U mikrobiologiji se uglavnom prati rast populacije, koja predstavlja skupinu ogromnog broja ćelija koje vode poreklo od jedne ćelije. Ukoliko su populacije nastale u definisanim uslovima sredine, pod kontrolisanim laboratorijskim uslovima, oznaĉavaju se kao kulture. Kulture su ĉiste ako sadrţe samo jednu vrstu organizma, a mešovite ako sadrţe više vrsta organizama. Rast bakterija nije beskonaĉan, jer nakon dostizanja odreċenih veliĉina ćelija stupa u deobu. Rast je uvek praćen deobom ćelija što dovodi do povećanja broja ćelija. Bakterije se razmnoţavaju prostom ćelijskom deobom, koja je binarna, popreĉna i dovodi do obrazovanja dve identiĉne ćerke ćelije. Deoba poĉinje udvajanjem genetiĉkog materijala. Nasledni materijal bakterija je jedan, dvostruki, cirkulatorni DNK molekul, koji je smešten u nukleoidu (Petrović et al., 2007). Razmena genetiĉkog materijala kod prokariota, a samim tim i bakterija vrši se: - transformacijom, usvajanjem DNK fragmenata jedne bakterije od strane druge bakterije, direktno iz spoljašnje sredine u koju ona dospeva nakon smrti i lize bakterijske ćelije; - konjugacijom, uspostavljanjem bliskog kontakta dve bakterije pomoću sex pila (F pila); - transdukcijom, prenošenje genetskog materijala sa jednje bakterije na drugu pomoću bakteriofaga (virusi koji inficiraju bakterije) (Petrović etal., 2007). Na osnovu metode diferencijalnog bojenja bakterija po Gramu, koje je dobilo naziv po danskom nauĉniku Kristian Gramu, bakterije se dele na: Gram pozitivne i Gram negativne bakterije i zbog toga, ovaj naĉin bojenja sluţi za identifikaciju bakterijskih grupa. Ovim 6

bojenjem Gram pozitivne bakterije se boje ljubiĉastom bojom, a Gram negativne bakterije se boje crvenom bojom. Ove razlike su uslovljene fiziĉko hemijskim osobinama bakterija, a i hemijskim sastavom ćelijskih zidova. Gram negativne bakterije u svom ćelijskom zidu imaju lipopolisaharid, dok Gram pozitivne bakterije imaju peptidoglukane, koje etanol ne rastvara pa i nakon obezbojavanja ostaju ljubiĉaste. Lipopolisaharide etanol rastvara pa se u sledećem bojenju boje crveno (Mihajilov Krstev, 2008). Mikroorganizmi su kosmopoliti, odnosno oni imaju širok spektar rasprostranjenja. Naseljavaju celokupnu biogeosferu (pedosferu, hidrosferu, atmosferu i biosferu). Mikroorganizmi imaju znaĉajnu ulogu u stvaranju, odrţavanju i funkcionisanju razliĉitih ekosistema i rasprostranjeni su u svim ekološkim sistemima, pri ĉemu se njihova aktivnost odvija stalnom interakcijom abiotiĉkih i biotiĉkih komponenti (Petrović et al., 2007). 2.2. ZEMLJIŠTE I MIKROORGANIZMI U ZEMLJIŠTU Zemljište (pedosfera) je obavezna komponenta svake biogeocenoze i predstavlja tanak površinski sloj zemljine kore. Zemljište nastaje procesom pedogeneze, usled dugotrajnog delovanja klimatskih, bioloških i reljefnih faktora na matiĉnu stenu. Zemljište je polidisperzni sistem i ĉine ga tri faze: ĉvrsta, teĉna i gasovita faza. Tip i kvalitet zemljišta odreċuju mnogi faktori kao što su njegove fiziĉke osobine (veliĉina ĉestica), organski ostatak (humus, nastaje degradacijom ţivotinjskih i biljnih otpadaka), voda i gasovi. Zemljište predstavlja ţivotnu sredinu mnogih biljaka, ţivotinja i mikroorganizama, a njegova ekološka uloga se razmatra u vidu: - biogeocenotiĉke funkcije zemljišta i - globalne funkcije zemljišta (Đukić et al., 2000). Globalnim funkcijama zemljišta pripadaju: biohemijske transformacije površinskih slojeva litosfere; hidrološke funkcije zemljišta; uticaj zemljišta na gasni reţim i kruţenje vode u atmosferi; uloga zemljišta kao faktora evolucije (Đukić et al., 2000). Biogeocenotiĉke funkcije zemljišta su u neposrednoj vezi sa ţivotnom aktivnošću zemljišnih mikroorganizama. Ovde spadaju: - fiziĉke funkcije (stanište i sklonište, mehaniĉki oslonac, depo semena); 7

- fiziĉko hemijske funkcije (izvor hranljivih elemenata; stimulator i inhibitor biohemijskih procesa; depo vlage, hranljivih materija i energije; sorpcija materija i mikroorganizama); - informacione funkcije (signal za niz bioloških procesa; regulator brojnosti istrukture biogeocenoza; pogonski mehanizam nekih sukcesija; odrţavanje istorije razvoja biogeocenoze) - opšteekološke funkcije (akumulacija i transformacija materije i energije; sanitarna funkcija; puferni i zaštitini biogeocenotiĉki ekran; uslovi nastanka i evolucije organizama) (Đukić et al., 2007). Zemljište kao ţivotna sredina pruţa najpovoljnije uslove za ţivot skoro svih grupa mikroorganizama. Mikrobi koji se nalaze u zemljištu svojom aktivnošću utiĉu na osnovne karakteristike zemljišta, njegovu strukturu i plodnost. Zbog svega ovoga, mikroorganizmi koji ţive u zemljištu se smatraju posebnom grupom i predstavljaju nerazdvojni ĉinilac zemljišta. Tako zemljište predstavlja njihov rezervoar, pri ĉemu oni dospevaju i u druge ţivotne sredine. Odnos mikroorganizama u zemljištu je uravnoteţan i karakteristiĉan za svaki tip zemljišta. Ukoliko se zemljište tretira pesticidima, obraċuje i koriste Ċubriva odnos mikroorganizama se narušava.to se manifestvuje promenom brojnosti, sastava i aktivnosti mikroorganizama. Ove karakteristike (brojnost i aktivnost mikroorganizama) karakterišu se kao plodnost zemljišta (Đukić et al., 2007). U zemljištu mikroorganizmi imaju odreċeni raspored i on moţe da bude: - horizontalni raspored mikroorganizama; - vertikalni raspored mikroorganizama. Horizontalni raspored mikroba u zemljištu podrazumeva njihovo prisustvo od polova ka ekvatoru. On je uslovljen najviše klimatskim faktorima. Na osnovu ovog rasporeda, utvrċeno je da su juţnija zemljišta bogatija mikoorganizmima. Vertikalni raspored zemljišta se definiše kao raspored mikroorganizama po dubini zemljišta. Tu je izraţena odreċena pravilnost koja govori o odreċenim mikrobiološkim profililma u zemljištu, odnosno o posebnom rasporedu mikroorganizama. Ovaj mikrobiološki profil je karakteristiĉan za svaki tip zemljišta. Kada je organska materija zastupljenija na površini zemljišta, onda se mikroorganizmi nalaze bliţe površini i tu je njihova brojnost veća (Petrović et al., 2007). Mikrobno naselje u zemljištu ima veoma vaţnu i veliku ulogu. Mikroorganizmi uĉestvuju u nastanku i stvaranju zemljišta (pedogenezi), kao i u njegovoj daljoj evoluciji. Svojom aktivnošću oni doprinose promenama u sredini, ali i prilagoċavaju uslove svojim 8

potrebama. Istovremeno su sposobni da se adaptiraju promenjenim uslovima. Tako utiĉu, pored stvaranja i na odrţavanje sadašnjeg zemljišta. Oni se u zemljištu nalaze u ogromnim koliĉinama, ali njihov precizan broj nije utvrċen. Na brojnost mikroba u zemljištu utiĉu mnogi faktori, kako ekološki, tako i mnogi drugi. Najveći uticaj imaju njegove fiziĉko hemijske osobine, tip zemljišta, karakter vegetacije, temperatura, dostupnost vode i hranljivih materija, ph vrednosti i biotiĉki faktori. Najveća brojnost mikroorganizama je u zemljištu koje ima visok sadrţaj organskih materija, odnosno humusa. Nastanak humusa je uslovljen i aktivnošću mikroorganizama, pri ĉemu se od biljnih i ţivotinjskih ostataka, procesima fermentacije, amonifikacije i saponifikacije dobijaju CO 2, H 2 O, NH 3, mineralne soli, druga organska jedinjenja i mikrobiološki protein. Polimerizacijom i kondenzacijom dobija se organska materija koja se razlikuje od polaznih jedinjenja, a sadrţi visok sadrţaj humusnih kiselina pa se zato zove humus, a sam proces je humifikacija. Ove humusne kiseline se stvaraju od fenolnih azotnih jedinjenja (Đukić et al., 2007). U zemljištu su zastupljene razliĉite vrste mikroorganizama i one se oznaĉavaju kao zemljišni mikroorganizmi. Najzastupljenije su bakterije, aktinomicete, gljive, alge i na kraju protozoe. Aktinomicete su zastupljene u manjem broju od bakterija i njihova uloga je u razgradnji kompleksnih organskih supstrata. Odlikuje ih produkcija antibiotika. Gljive koje se nalaze na površini zemljišta imaju ulogu u razgradnji celuloze, pektina, lignina, povezivanju ĉestica zemljišta. Zelene i silikatne alge imaju ulogu u formiranju zemljišta. Što se bakterija tiĉe, javljaju se i autotrofni i hetrotrofni predstavnici, aerobne i anaerobne bakterije koje mogu biti i mezofili, termofili. Njihova uloga je ogromna, svojom metaboliĉkom aktivnošću, celulolitskom, proteolitskom ili uzimanjem šećera tokom azotofiksacije imaju vaţnu ulogu u obogaćivanju zemljišta azotom (Đukić et al., 2007). 2.3. ODNOSI MIKROORGANIZAMA U ZEMLJIŠTU Mikroorganizmi u zemljištu su meċusobno povezanim razliĉitim odnosima,ali su takoċe, povezani i sa drugim stanovnicima zemljišta, algama, ţivotinjama, biljkama (njihovim korenovim sistemom). Ovi odnosi su veoma sloţeni. Njihovu osnovu ĉine kruţenje materije i proticanje energije pri ĉemu se u toku ţivotne aktivnosti mikrobne populacije razmenjuju izmeċu sebe i sa drugim predstavnicima, svojim proizvodima metabolizma, biološki aktivnim supstancama. Odnosi izmeċu mikroorganizama su neutralizam (bez efekata populacija jedne na drugu), amensalizam (jedna populacija suzbija drugu, ali ne trpi negativno dejstvo), parazitizam (jedna populacija nepovoljno deluje na drugu, ali zavisi od nje), komensalizam 9

(jedna populacija ima korist iz zajednice, a druga nema ni korist, ni štetu), protokooperacija (obe populacije imaju korist, ali njihova veza nije obligatna) i mutualizam (obe populacije imaju korist i ne mogu jedna bez druge) (Đukić et al., 2007). Odnosi izmeċu mikroorganizama se dele u dve grupe i to su antagonizam i simbioza. Prilikom borbe za hranu, pogotovo ako ona nedostaje, dominiraju konkurencija i amensalizam. To moţe dovesti i do eliminacije jedne populacije. PrilagoĊeniji mikrobi mogu istisnuti one manje prilagoċene. Jedan od naĉina borbe jeste produkcija antibiotika jedne populacije, koji ima negativni uticaj na drugu populaciju. Tako, na primer, Streptomyces olivocinereus, koji je producent heliomicina, suzbija u nesterilnom zemljištu populaciju Arthrobacter crystallopoietes (Đukić et al., 2007). Simbiotski odnosi se manifestvuju razliĉito i oni se razvijaju po tipu komensalizma. Primećena je koegzistencija izmeċu celuloznih mikroorganizama i slobodnih azotofiksatora, u osnovi ĉega leţi protokooperacija (Cellvibrio, Corynobacterium + Clostridium; mikromicete + Clostridium; Cytophaga + Azotobacter) (Đukić et al., 2007). Pored meċusobnih odnosa mikroorganizama znaĉajni su i njihovi odnosi sa zemljašnim ţivotinjama, koji mogu biti pozitivni i negativni. Mikrobi ţivotinjama mogu sluţiti kao hrana, ali oni mogu da stvaraju odreċene antibiotiĉke materije protiv odreċenih zemljišnih ţivotinja (protozoe). Znaĉajni su i odnosi izmeċu algi i mikroba, pri ĉemu su zasnovani na protokooperaciji i obe populacije imaju korist. Alge se primenjuju u poljoprivredi u ulozi biostimulatora mikroba i biljaka, a i u vidu organskog Ċubriva, što omogućava manju upotrebu veštaĉkih Ċubriva. U samom zemljištu se aktiviraju mikrobiološki procesi, smanjuju se gubici mineralizovanog azota, zemljište se obogaćuje mikroelementima i drugim materijama (Đukić et al., 2007). Odnosi izmeċu mikroorganizama i biljaka isto mogu biti pozitivni i negativni. Negativni odnosi se odnose na produkciju jedinjenja kojia imaju inhibitorno dejstvo na rast biljaka, ali i jedinjenja koja izazivaju razliĉita oboljenja biljaka, koja mogu zahvatati nadzemni deo ili korenov sistem. Postoji mnogo toksiĉnih oblika bakterija i nalaze se u svim tipovima zemljišta. Poznati su Bacillus i Pseudomonas. Pozitivni odnosi su oni koji ĉine osnovu pedogeneze i plodnosti zemljišta. Mikrobi zajedno sa algama pripremaju mrtve supstrate za razvoj poĉetnih biljnih zajednica. Osnovni destruktori biljnog otpada su mikroorganizmi i time doprinose kruţenju ugljenika i drugih elemenata u prirodi. Bakterije i drugi oblici mikroorganizama doprinose ishrani biljaka. Oni se razvijaju aktivno u zoni korenova i njihovoj blizini transformišu organska i mineralna jedinjenja zemljišta, snabdevajući biljke potrebnim elementima ishrane. Mikrobi stvaraju i 10

biološki aktivne materije vitamine, aminokiseline, biljne hormone (auksine i gibereline) koji imaju ulogu u ţivotu biljke, disanju, fotosintezi, oploċivanju, fosfornu i azotnu razmenu (Đukić et al., 2007). Biljke takoċe utiĉu na razvoj mikroba u zemljištu stvarajući im povoljne uslove za njihov opstanak. Tokom njihove vegetacije izdvajaju se mineralna i organska jedinjenja koja predstavljaju hranu mikrobima. One regulišu ph zemljišta i nivo vlaţnosti što stvara povoljne uslove za rast mikroba (Đukić et al., 2007). 2.4. ELEMENTI POTREBNI ZA RAZVOJ BILJAKA Za rast i razvoj biljaka neophodni su mnogi elementi. Biljke primaju razliĉite mineralne soli iz zemljišta na kome ţive. Elementi bez kojih biljke ne mogu da ţive oznaĉavaju se kao esencijalni elementi i njih ĉini grupa od 17 elemenata. To su ugljenik, kiseonik, vodonik, azot, sumpor, fosfor, kalijum, kalcijum, magnezijum, gvoţċe, mangan, cink, bakar, bor, hlor, molibden, nikl. Korisni elementi su elementi bez kojih biljka moţe da opstane,ali ipak imaju pozitivni efekat ukoliko su prisutni (silicijum je koristan za mnoge trave, jer daje ĉvrstinu ćelijskom zidu; aluminijum utiĉe na boju nekih cvetova, a samim tim i na oprašivanje). Na osnovu potreba biljaka, elemente moţemo da podelimo na: - makroelemente, biljci potrebni u velikim koliĉinama (N, P, K, Ca, Mg, S ); - mikroelemente, biljci potrebni u malim koliĉinama (B, Cl, Fe, Mn, Zn, Cu, Mo, Ni) (Kastori., 1991). Uloga ovih elemenata je višestruka i raznovrsna. Zbog toga su oni grupisani u nekoliko grupa: 1. Elementi koji ulaze u sastav organskih molekula. Veliki broj elemenata uĉestvuje u izgradnji najvaţnijih organskih jedinjenja. To su ugljenik, vodonik i kiseonik. Ugljenik, vodonik i kiseonik biljke dobijaju iz vode i ugljen-dioksida. Pored ovih elemenata, ovde spadaju i azot, fosfor, sumpor, magnezijum, bakar i cink. 2. Kofaktori u enzimskim reakcijama. U većini enzimskih reakcija neophodno je uĉešće nekog mineralnog elemenata. Mnogi enzimi sadrţe jone metala (kalcijum ulazi u sastav amilaze, cink u alkoholnoj dehidrogenazi). 3. Uĉesnici u transportu elektrona. Najrasprostranjeniji su prenosioci koji sadrţe jon gvoţċa, bakar i molibden. 4. Slobodni joni. Neki elementi se nalaze kao slobodni joni u citosolu i tako odrţavaju osmotski potancijal ćelije. Takvu ulogu imaju kalijum i hlor, ali mogu 11

inatrijum i kalijum da doprinesu odrţavanju osmotskog potencijala (Kastori., 1991). Azot je element koji uĉestvuje u izgradnji proteina, nukleinskih kiselina, u formiranju peptidnih veza. On obezbeċuje porast i plodonošenje voćaka, pre svega, uslovljava rast i razvoj svih organa. U sluĉaju njegovog nedostatka biljka usporava svoj rast, zbog smanjene sinteze organskih jedinjenja. Lišće gubi zelenu boju, sitniji su listovi, cvetovi i plodovi. Ukoliko se nalazi u većim koliĉinama isto nepovoljno utiĉe na biljku. Stabla i listovi su bujno razvijeni, koren je manji, smanjeni su plodovi. Sumpor ulazi u sastav aminokiselina, koenzima i vitamina. Nedostatak sumpora je redak u prirodi, ali dovodi do istih simptoma kao i nedostatak azota. Biljke su male, zakrţljalog rasta, listovi su mali, uski. Prevelika koliĉina sumpora za biljku je štetna. Fosfor je sastavni deo ATPa, nukleotida, nukleinskih kiselina, fosfolipida, fosforilizovanih šećera, koenzima NAD, NADP, FAD. Biljka jednu istu koliĉinu fosfora moţe stalno da koristi i to je reutilizacija fosfata, tako što fosfat prelazi iz starijih delova biljke u mlaċe. U sluĉaju njegovog nedostatka ili povećane koncentracije, dolazi do promena na biljkama, odnosno nekroze biljaka. Kalijum je jedini elemenat koji se u biljci javlja iskljuĉivo u jonskom obliku. On se nikada ne ugraċuje u organska jedinjenja. Kalijuma ima najviše u meristemskim tkivima u kojima se vrše aktivne ćelijske deobe. Kalijum uĉestvuje u uspostavljanju osmotskog potencijala (Kastori., 1991). Kalcijum inkrustrira ćelijske zidove, odrţava integritet membrane i spreĉava njena oštećenja i pasivnu propustljivost. Neophodan je za dejstvo mnogih enzima. Joni magnezijuma su aktivatori mnogih enzima i uĉestvuju u graċi molekula hlorofila. GvoţĊe ima ulogu u razliĉitim redoks sistemima, jer lako moţe da primi i otpusti elektron. Mangan kao dvovalentni je aktivator mnogih enzima u ciklusu TCA, sintezi masnih kiselina i nukleinskih kiselina. Bakar uĉestvuje u nekim redoks sistemima, jer njegov atom moţe da menja valencu. Sastavni je deo citohrom oksidaze u mitohondrijama i plastocijanina u hloroplastima (Kastori., 1991). Cink je sastavni deo alkoholne dehidrogenaze i u njegovom nedostatku biljke su malog rasta, sa kratkim internodijama. Bor je esencijalan samo za više biljke i lokalizovan je u ćelijskom zidu gde utiĉe na transport kroz membranu, naroĉito na transport šećera. Molibden je sastavni deo nitratne reduktaze i u njegovom nedostatku biljke ne mogu da koriste nitrat. Kod mikroorganizama 12

koji fiksiraju azot, molibden je neophodan i kao sastavni deo enzima nitrogenaze (Kastori., 1991). Hlor je kofaktor u fotosintezi pri transportu elektrona od vode do fotosistema II. Prateći je anjon pri transportu kalijuma i ima znaĉaja za odrţavanje turgora. U sluĉaju nedostatka svih ovih elemenata ili ukoliko se oni nalaze u povećanim koncentracijama dolazi do promena na biljkama, koje uglavnom utiĉu na rast i boju biljaka (Kastori., 1991). Azot i sumpor ulaze u većinu organskih jedinjenja samo u redukovanom obliku i zato njihovi oksidovani oblici, nitrat i sulfat moraju prethodno da se redukuju. Redukciju azota i sumpora obavljaju samo biljke. Azot je najobilniji sastojak vazduha, ali biljke ne mogu da koriste atmosferski azot za svoje potrebe. Tu sposobnost imaju samo izvesne bakterije i aktinomicete. One redukciju obavljaju u biljci (biljka odmah ukljuĉuje amonijum u svoje metaboliĉke procese) ili u zemljištu, pri ĉemu ga biljka apsorbuje iz zemljišta (Kastori., 1991). 2.5. CIKLUS AZOTA Azot se nalazi u vazduhu i ĉini 78% atmosferskog vazduha, u obliku neorganskih jona NO - 3 i NH - 4 ulazi u sastav zemljišta i kao sastojak mnogih organskih jedinjenja rasprostranjen je u celom ţivom svetu. Ovi oblici azota se neprikidno transformišu jedan u drugi i sve te promene su povezane u ciklus azota. Više biljke dobijaju azot iskljuĉivo iz zemljišta na kome ţive. Zemljište se stalno obogaćuje azotnim jedinjenjima koja potiĉu od ţivih ili izumrlih ţivotinja i biljaka. Skoro 90% azota u zemljištu se nalazi u obliku organskih azotnih jedinjenja koje bakterije i gljivice razlaţu i obrazuju amonijak (Jemcev and Đukić., 2000). Mikrobiološka fiksacija azota je veoma bitna, pošto drugi organizmi ne mogu da fiskiraju elementarni azot iz atmosfere. On je kao takav nedostupan za njih i zbog toga je veoma bitno postojanje azotofiksatora. Azotofiksatori imaju sposobnost da elementarni azot iz vazduha ukljuĉuju u svoj azotni metabolizam. Taj proces katalizuje enzimski kompleks nitrogenaza. Za aktivnost ovog kompleksa neophodna je odreċena koliĉina energije, ATPa. Elementarni azot se pomoću ovog enzima redukuje do amonijaka. Amonijak se dalje koristi za sintezu aminokiselina. Azotofiksatori su uglavnom bakterije, modrozelene alge, aktinomicete i neke gljive. Ovi organizminastanjuju sva zemljišta i sve vodene sredine (Jemcev and Đukić., 2000). Postoji više grupa azotofiksatora: - Slobodni azotofiksatori, ţive u zemljištu ili rizosferi biljaka, ali nisu vezani za biljke i ne izazivaju morfološke promene. Slobodni azotifiksatori iz bakterijskih 13

rodova su Azotobacter, Derxia, Azomonas i Clostridium, a tu se svrstavaju i Cianobacteria. - Asocijativni azotofiksatori, vezani su za biljke, ali ne izazivaju morfološke promene. Oni predstavljaju prelaz izmeċu simbiotske i slobodne azotofiksacije. Predstavnici ove grupe azotofiksatora su Azospirillum, Pseudomonas, Enterobacter. - Simbiotski azotofiksatori, vezani su za biljke i izazivaju promene na biljkama. Ţive na korenu leguminoznih biljaka i tu formiraju nodule, odnosno kvrţice. Simbioza izmeċu njih i biljaka je genetski odreċena i specifiĉna. U grupu slobodnih azotofiksatora spadaju Rhizobium i Bradyrhizobium (Jemcev and Đukić., 2000). Od ukupnog biološkog azota, 80% proizvedu slobodni azotofiksatori. Koliĉina takvog azota po jedinici površine je znatno manja nego što mogu da proizvedu simbiotski azotofiksatori, ali je ipak znaĉajna, jer ĉak i bez Ċubrenja usevi mogu da daju 30% prinosa u odnosu na poċubrenu varijantu. Od asocijativnih azotofiksatora najvaţniji su: Azotobacter chroooccum, Azotobacter vinelandii, Azospirillum lipoferum, Beijerinckia derxii, Klebsiella planticola, Bacillus subtillis, Bacillus megaterium, Pseudomonas sp., Clostridium i dr. Ovo su heterotrofni organizmi kojih ima svuda u zemljištu, ali je vaţna njihova odlika da imaju dobar interakcijski odnos sa biljkama zato što najbolje uslove za ţivot imaju u njihovoj rizosferi, pri ĉemu od biljke dobijaju energiju u vidu šećera koje biljka izluĉuje na aktivnom delu korenovog sistema, a zauzvrat joj daju fiksirani azot u obliku vezane forme NH, hidroksilamina, aminokiselina, peptida, hormona rasta, biofungicida itd. Osim fiksacije atmosferskog azota, većina ovih mikroorganizama je sposobna za izvlaĉenje fosfora, kalijuma ili nekog drugog elementa iz kristalne rešetke minerala u zemljištu i da ga stave u vodeni rastvor pristupaĉan biljkama. U okviru jedne vrste bakterija postoji mogućnost pojave sojeva, koji su posebno prilagoċeni na jednu biljnu vrstu ili ĉak sortu, tako da njihovim izdvajanjem i umnoţavanjem, zatim inokulacijom semena ili predsetvenom inkorporacijom u zemljište, moţe da se postigne povećanje prinosa 10-20% (Jemcev and Đukić, 2000). Kod jednogodišnjih biljaka najbolji rezultati su postignuti inokulacijom semena, pri ĉemu bakterije prate rast mladih korenĉića, a kod povrtarskih vrsta i voća bolje je namoĉiti korenov sistem rasada i sadnica u teĉnu kulturu azotofiksatora. Istovremeno, treba smanjiti unos azotnih Ċubriva za 30-40%. Pošto su ovi mikroorganizmi jako osetljivi na direktnu svetlost, taĉnije, ultravioletni zraci su smrtonosni za njih, podrazumeva se da se tretiranje biljnog materijala vrši u senci. 14

Ima mnogo gotovih preparata sa bakterijama azotofiksatorima koji se mogu kupiti, a moguće je vrlo lako u domaćoj radinosti napraviti mikrobiološko Ċubrivo. Obiĉno se uzima plodna baštenska zemlja u kojoj sigurno ima Azotobactera. Sitna i prosejana zemlja se meša sa 2-5% nekog izvora ugljenih hidrata (brašno, melasa, šećer,...), uz to se dodaje voda da smesa doċe u stanje lepljive plastiĉne mase, koja se u tankom sloju 1-2,5 cm razmazuje u posudama i ostavlja na toplom. Za 3-4 dana celu masu prekrije i proţme sluzava masa od ćelija Azotobaktera, koja se potom rastvara u vodi za nanošenje na biljni material (Radić., 2015). Fiksacija azota je redukcioni proces u kome se gas azota iz vazduha prevodi u amonijak. Sve biljke imaju potrebu za azotom u obliku amonijaka ili nitrata koji im je potreban za sintezu aminokiselina. Od tih aminokiselina one izgraċuju svoje proteine, a biljni proteini predstavljaju jedini izvor proteina za ţivotinje. Zato je fiksacija azota vitalan ekološki proces. Organizmi koji mogu da obavljaju ovu vrstu redukcionih reakcija su neke vrste bakterija i cijanobakterija (modrozelene alge). Celokupan ţivot na planeti zasnovan je na zavisnosti od ovih organizama. (Jemcev and Đukić., 2000). Azot koji se fiksira u obliku amonijaka ili amonijuma je osnovni materijal za hemoautotrofne nitrifikacione bakterije. Fiksacija azota je sloţen proces koji predstavlja seriju redukcionih reakcija. Atomi azota su meċusobno povezani trostrukom kovalentnom vezom unutar molekula. Zato je azot stabilan molekul. Ovu vezu mogu da redukuju samo azotofiksirajuće bakterije i cijanobakterije koje poseduju heterociste. Heterociste predstavljaju nefotosintetiĉke ćelije u kojima se vrši fiksacija azota. One koriste fotosistem i pri tome obezbeċuju energiju koja je potrebna za fiksaciju azota. Time gube deo procesa svetle faze fotosinteze gde dolazi do oslobaċanja O 2 (Jemcev and Đukić., 2000.). Na osnovu analize azotofiksatorskih fotosintetiĉkih cijanobakterija moţemo da zakljuĉimo da su to organizmi koji su sami sebi dovoljni. Potrebni su im samo ugljen-dioksid i neke organske materije, a sve ostalo mogu sami sebi da obezbede. Zato su ovi oblici pionirske zajednice, jer uspevaju da kolonizuju nova staništa. Za proces fiksacije azota neophodni su ATP i enzim nitrogenaza. Trostruka kovalentna veza koja se javlja u atomu azota je veoma stabilna i potrebna je velika koliĉina energije kako bi se ona raskinula. Nitrogeneza je neophodna za ovaj proces, ali se ona brzo inaktiviše prisustvom molekularnog kiseonika i ne moţe da funkcioniše u ćeliji gde dolazi do proizvodnje kiseonika u toku fotosinteze. Zbog toga se fiksacija azota kod cijanobakterija vrši u heterocistama. 15

Dosta su prouĉavane bakterije koje vrše fiksaciju azota, pogotovo zbog njihovog znaĉaja u poljoprivredi. Biljke mahunarke (pasulj, grašak, detelina) su znaĉajne kulture u rotiranju useva, jer poboljšavaju plodnost zemljišta. To je zbog toga, jer na ĉvorićima korena ovih biljaka ţive bakterije koje koriste šećere. Te šećere biljke proizvode u procesu fotosinteze, a one ih zauzvrat snabdevaju amonijakom. Ovoj grupi bakterija pripada rod Rhizobium (Ahemad et al., 2014). Sve više i više se ovaj fenomen koristi kako bi se smanjila upotreba azotnih Ċubriva, a poboljšao kvalitet proteina ovih kultura. Ova oblast istraţivanja ukljuĉuje selekciju, mikrobiologiju i genetiĉki inţenjering. U daljem radu biće opisani rodovi odreċenih vrsta bakterija i neke od metoda koje omogućavaju fiksaciju azota, sa ciljem smanjenja upotrebe veštaĉkih Ċubriva. Ciklus kruţenja azota (Slika 2.) poĉinje kada azotofiksatori apsorbuju atmosferski azot i vezuju ga u svom telu u nekim organskim jedinjenjima azota (aminokiselinama). Bakterije iz roda Rhizobium isto vrše fiksaciju azota, u simbiozi sa korenom leguminoznih biljaka. Kada doċe do truljenja tela ovih azotofiksatora, njihove aminokiseline se pretvaraju u amonijak, koji se pod uticajem drugih vrsta bakterija nitrifikacionih bakterija, pretvara u nitrate, koji su dostupni biljkama (Jemcev and Đukić., 2000). Amonifikatori su mikroorganizmi koji mogu razliĉitim putevima dezaminacije polipeptida i aminokiselina da oslobaċaju amonijak. To je mikrobiološki proces koji dovodi do oslobaċanja azota iz organskih materija u formi amonijaka i oznaĉava se kao amonifikacija. Amonifikaciju vrše razliĉiti mikroorganizmi koji mogu biti aerobi, anaerobi, fakultativni anaerobi, sporogeni, asporogeni. U zemljištu, u kome vladaju neutralni i slabo alkalni uslovi, glavni razlagaĉi proteina su bakterije iz roda Bacillus. To su sporogene vrste i tu spadaju Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Bacillus cereus. Od asporogenih vrsta to su Pseudomonas fluorescenes, Escherihia coli (Mihajilov Krstev., 2008). Ukoliko su zemljišta kisela, razlaganje proteina vrše gljive iz rodova Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus. Nitrifikacija je sloţen proces, koji obuhvata dva sukcesivna procesa: nitritaciju i nitrataciju. Bakterije koje vrše oksidaciju amonijaĉnih soli do nitrita i nitrata se oznaĉavaju kao nitrifikatori. Nitritacija je proces oksidacije NH + 3 do NO - 2 i to obavljaju nitritacione bakterije. Nitratacija je proces oksidacije NO - 2 do NO - 3 i u tom procesu uĉestvuju nitratacione bakterije. Procesi nitritacije i nitratacije su meċusobno povezani. Odvijaju se istovremeno i u zemljištu. Nitrifikatori predstavljaju obligatne aerobne mikroorganizme i pripadaju grupi hemoautotrofa. Oksidaciju amonijaka do nitrita vrše Nitrosomonas europea, Nitrosococusmobilis, Nitrosospira briensis i to je proces nitritacije. Proces nitratacije, 16

odnosno oksidaciju nitrita do nitrata vrši Nitrobacter winogradsky, Nitrospira gracilis (Mihajilov Krstev., 2008). Heterotrofni mikroorganizmi koji u anaerobnim uslovima redukuju soli azotne kiseline do gasovitih proizvoda (N 2, N 2 O) su denitrifikatori. Do redukcije nitrata dolazi, jer su u anaerobnim uslovima, akceptori soli azotne kiseline - nitrati, dok je u aerobnim uslovima, akceptor vodonika i elektrona kiseonik. Redukcija nitrata se odvija u dva stupnja, nitrat se redukuje u nitrit, a nitrit se zatim redukuje u amonijumov jon. Za ove procese najbitniji su enzimi nitratna i nitritna reduktaza. Redukcija nitrata se moţe odvijati u korenu, gde se izgraċuju aminokiseline i amidi. Oni se dalje transportuju putem ksilema. Nitratni jon se moţe transportovati u listove, gde se vrši sinteza i redukcija organskih jedinjenja. Tada se aminokiseline floemom vraćaju u koren. Redukciju nitrata u nitrit vrši enzim nitratna reduktaza u citosolu ćelija korena i lista. Redukciju nitrita u amonijum vrši enzim nitritna reduktaza, koja je u plastidima. Slika 2. Ciklus azota Azot se ugraċuje u organska jedinjenja samo u vidu amonijumovih jona. Biljka prima amonijumov jon iz spoljašnje sredine ili on nastaje redukcijom nitrata u korenu ili listu. Amonijum ulazi u sastav aminokiselina, a zatim i u druga jedinjenja. Biosinteza aminokiselina je zavisna od fotosinteze koja obezbeċuje sve ove uslove. U korenu, u njegovim ćelijama, obavljaju se procesi sinteze aminokiselina i amida. Deo produkata se koristi u samom korenu, a ostatak se prenosi u nadzemni deo biljke, putem ksilema (Mihajilov Krstev., 2008). 17

2.6. CIKLUS SUMPORA Sumpor ima veoma veliki biološki znaĉaj. On predstavlja strukturnu komponentu u izgradnji nekih aminokiselina (cistein, metionin), belanĉevina, kao i enzima. Sumpor se nalazi u zemljištu u obliku mineralnih soli i organskih jedinjenja. Ulazak sumpora u ţive sisteme je u vidu sulfata i sulfida, koje biljke apsorbuju iz zemljišta. Nakon toga, oni podleţu redukciji i ugraċuju se u aminokiseline, proteine (Jemcev and Đukić., 2000). Sumpor se u atmosferi nalazi u vidu SO 2, SO 3 i H 2 S, koji nastaju sagorevanjem fosilnih goriva. Pri sagorevanju fosilnih goriva oslobaċaju se najveće koliĉine sumpora, u obliku SO 2. Danas je to jedan od najvećih zagaċivaĉa vazduha. Ovi gasovi sa kišom padaju na zemlju u vidu sulfita. Deo SO 2 se transformiše do sumporne kiseline i javlja u obliku kiselih kiša. U ciklus kruţenja (Slika 3.) sumpora ukljuĉene su i neke autotrofne, sumporne bakterije, kao što je rod Begiatoa. Sumpor iz zemljišta se prevodi u sulfate, a zatim sintezom proteina se pretvara u organski vezan sumpor. Najĉešći oblik sumpora koji biljke koriste je sulfatni jon. Biološka redukcija sulfata je analogna redukciji nitrata i samo su biljke sposobne da je obavljaju. Ipak, glavni izvor sumpornih jedinjenja u zemljištu su organske materije, koje su poreklom od tela uginulih biljaka i ţivotinja. Usled aktivnosti razliĉitih mikoorganizama, sumporna jedinjenja se cikliĉno oksiduju i redukuju. U kruţenju sumpora moţe doći i do digresija putem njegove sedimentacije u obliku nerastvorljivih soli fero-sulfata (FeS), ferisulfata (Fe 2 S 3 ) i kalcijum-sulfata (CaSO 4 ). Tako dolazi do blokiranja gvoţċa i ostalih nutritivnih sastojaka koji su znaĉajni za biološke sisteme (bakar, cink,). Ukoliko doċe do odstupanja od normalnih koliĉina odreċenog elementa, to se manifestvuje poremećajima u kruţenju materije (Jemcev and Đukić., 2000). Slika 3. Ciklus sumpora 18

2.7. CIKLUS FOSFORA Fosfor je znaĉajan elemenat i javlja se u zemljištu u razliĉitim organskim i neorganskim oblicima. Na osnovu dostupnosti ţivom svetu, najvaţniji oblik fosfora je ortofosfat, koji nastaje oksidacijom u procesima mineralizacije organskih materija koje sadrţe fosfor. Fosfor je takoċe strukturna komponenta ţivih sistema. Uĉestvuje u graċi ćelijskih jedinjenja, nukleinskih kiselina, fosfolipida, jedinjenja bogata energijom (ATP, ADP, AMP). Biljke apsorbuju fosfor u obliku ortofosfata i zatim se prenosi do konzumenata i razlagaĉa u obliku organskog fosfora. Nakon mineralizacije, opet dolazi do biljaka (Slika 4.) (Jemcev and Đukić., 2000). Fosfor se u zemljištu nalazi u obliku fosfata, koji potiĉu od razliĉitih organskih jedinjenja. Biljke najbolje primaju jednovalentni fosfat i to je pristupaĉni fosfat. Fosfat se ugraċuje u organska jedinjenja bez prethodne redukcije. Prvi stupanj usvajanja fosfata u biljnim ćelijama je njegovo vezivanje ze šećer inozit pri ĉemu nastaje fitinska kiselina. Pravi ulazak fosfora u organska jedinjenja koja imaju metaboliĉku funkciju je sinteza ATP, koja se odvija u hloroplastima, mitohondrijama, u glikolizi. Sa ATPa se fosfat prenosi na mnoga druga jedinjenja. Sve veze koje gradi ATP oslobaċaju visoku energiju pri hidrolizi i one su najvaţniji naĉin transformacije iprenosa energije u ţivoj ćeliji (Jemcev and Đukić., 2000). Slika 4. Ciklus fosfora 19

2. 8. ĐUBRIVA Na osnovu svega navedenog, znamo da su svi do sada opisani elementi neophodni biljkama, a samim tim su neophodni i za nastavak ţivota, jer bi bez njih to bilo nemoguće. Kako bi se poboljšao kvalitet zemljišta i biljkama povećala dostupnost svih hranljivih materija, u poljoprivredi se koriste azotna Ċubriva. Azotna Ċubriva predstavljaju hranu za biljke, odnosno ona pojaĉavaju mobilizaciju hranljivih materija u zemljištu i povećavaju energiju ţivotnih procesa u njemu, a samim tim i menjaju svojstva zemljišta (Đukić et al., 2007). Postoje dve osnovne grupe Ċubriva, na osnovu njihovog hemijskog sastava i to su: - Organska Ċubriva (stajnjak, gnojivo, kokošiji izmet, treset, siderati, slama, smeće, pleva, talog otpadnih voda, kao i bakterijska Ċubriva) i - Mineralna Ċubriva, mogu biti jednostavna (azotna, fosforna, sumporna, kalijumova, magnezijumova..) i kompleksna ( sloţena Nitrofos; sloţeno-mešovita; mešovite smese NPK, NK). Postoje industrijska i mesna Ċubriva, u zavisnosti od porekla i mesta njihovog dobijanja (Đukić et al., 2007). 2.8.1. MINERALNA ĐUBRIVA Mineralna Ċubriva koja se proizvode industrijski su zastupljena u veoma velikom broju. Njihova široka primena u poljoprivredi uslovljena je slabom zastupljenošću zemljišta elementima ishrane. To se posebno odnosi na zastupljenost azota. Od azotnih Ċubriva najĉešće se koriste amonijaĉno nitratna (amonijaĉna i kreĉno-amonijaĉna šalitra), amonijaĉna (amonijum sulfat, amonijum hlorid, amonijum sulfat), nitratna (natrijumova i kalcijumova šalitra), amidna (karbamid, urea formaldehid). U pokušaju je dobijanje azotnih mineralnih Ċubriva koje sporo odaju azot biljkama, odnosno Ċubriva sa povećanom otpornošću. To su jedinjenja koja se slabo rastvaraju u vodi ili su pokrivena materijama, koje oteţavaju brzo rastvaranje jedinjenja azota. Koliĉina dostupnog azota biljkama, u zemljištu, je ograniĉena i odreċena uslovima zemljišta. Njegove zalihe uglavnom ne prelaze 4% ukupnog azota. Kako bi postale pristupaĉne biljkama, azotne materije prolaze sloţene biohemijske transformacije, da bi se dobili amonijaĉni i nitratni azot, kojima se biljke hrane. Azotna mineralna Ċubriva utiĉu na poboljšavanje strukture zemljišta, doprinose smanjenju vode i slabljenju erozije. Koriste se u odreċenim dozama, mada postoji veliki broj ĉinjenica koje ukazuju na negativni uticaj mineralnih Ċubriva, koja se primenjuju u visokim dozama i duţem vremenskom periodu. Kada je zemljište bogato humusom, mineralna Ċubriva 20

ubrzavaju proces mineralizacije organske materije, pa to moţe dovesti i do gubitka humusa. Unošenjem mineralnog Ċubriva povećava se sadrţaj azota po ĉitavom zemljišnom profilu. MeĊutim, povećanjem sadrţaja nitrata u zemlji, dolazi do zagaċenja podezemnih voda, što utiće na njihov ţivi svet. Mineralna Ċubriva dovode i do smanjenja ph vrednosti, pri ĉemu slabi puferna sposobnost zemljišta. To dovodi do gubitka nekih elemenata (kalcijuma, kalijuma, magnezijuma), aktivacije i mobilizacije gvoţċa, mangana, vezivanja fosfora i povećanje toksiĉnog dejstva teških metala. Nekada se smatralo da se korišćenjem mineralnih Ċubriva povećava brojnost i biomasa zemljišnih mikroorganizama, ali danas je dokazano suprotno. Korišćenje mineralnih azotnih Ċubriva ima negativni uticaj na zemljišne mikrobe, gde se, pri njihovoj duţoj upotrebi smanjuje njihova brojnost i biomasa. Do toga dolazi zbog promena aktivne reakcije zemljišnog rastvora i povećanja sadrţaja mobilnog aluminijuma. Primena ovih Ċubriva dovodi i do poremećaja u biogeohemijskim ciklusima hranljivih materija. Dolazi do poremećaja prirodne ravnoteţe zemljišnih mikroorganizama koji su odgovorni za procese azotofiksacije, nitrifikacije, humifikacije. Veoma bitna pojava, koja se javlja usled dugotrajnog unošenja azotnih mineralnih Ċubriva, jeste stvaranje ekstra azota. Njegova koliĉina raste još većim dodavanjem azotnog Ċubriva. Stvaranje ovog ekstra azota praćeno je gubitkom organskog ugljenika, pa se zato zemljištu dodaje i organik, gde se na odreċenu koliĉinu azotnog Ċubriva, zemljištu dodaje i odreċena koliĉina organskog ugljenika (5kg organskog ugljenika na 1kg unešenog azota). Primenom mineralnih Ċubriva menja se i struktura zemljišnih organizama, dolazi do smanjenja brojnosti bakterija, ali raste broj bacila u toj cenozi, pogotovu Bacillus mesentericus, kao posledica osiromašivanja zemljišta organskim jedinjenjima. Specifiĉno je to da se brojnost Bacillus mycoides takoċe smanjuje. Primećeno je da se pod uticajem NPK povećava sadrţaj gljiva u cenozi, zbog promene ph zemljišta. Korišćenjem velikih doza mineralnih Ċubriva smanjuje se koliĉina cijanobakterija, pa se azotofiksatorske vrste zamenjuju drugim vrstama. Smatra se da mineralna Ċubriva povećavaju periodiĉnu toksiĉnost zemljišta, verovatno nakupljanjem odreċenih bakterija (Đukić et al., 2007). Na osnovu analize mineralnih azotnih Ċubriva (nitratnih, amonijaĉnih i amidnih) utvrċeno je njihovo negativno dejstvo. Oni smanjuju proces disanja u zemljištu, azotofiksirajuću aktivnost i antibiotiĉki potencijal zemljišta, pri ĉemu stimulišu razvoj patogena. Smatra se da su nitratna Ċubriva najmanje štetna, odnosno da su posle amidnih i amonijaĉnih, jer najmanje utiĉu na procese azotofiksacije i denitrifikacije. MeĊutim, nitratna Ċubriva takoċe smanjuju brojnost odreċenih mikoorganizama u zemljištu, što je i dokazano odreċenim metodama (Đukić et al., 2007). 21

Azot se u mnogim poljoprivrednim oblastima nalazi u veoma malim koliĉinama, pa zbog toga azotna Ċubriva imaju vaţnu ulogu, jer povećavaju prinos poljoprivrednih kultura. Neophodan uslov za njihovu primenu je kombinovanje sa fosfornim, kalijumovim i mikroċubrivima, kako bi se ona efikasno iskoristila. Od unete doze azotnih Ċubriva odreċenu koliĉinu iskorišćavaju zemljišni mikroorganizmi, dok jedan deo ĉine nepovratni gasoviti gubici. Ti gubici su osnovni uzrok smanjenja iskorišćavanja azota od strane biljaka, što samim tim, smanjuje i njegovu efikasnost. Nakon unošenja mineralnih Ċubriva poĉinje njihova fiziĉka, hemijska i mikrobiološka transformacija. Gasoviti gubici azota povezani su sa aktivnošću denitrifikacionih bakterija koje vrše redukciju nitratnog azota. Ovi gasoviti proizvodi denitrifikacije, pored toga što smanjuju efikasnost azotnih Ċubriva, oni su i ekološka opasnost, jer uĉestvuju u razgradnji ozonskog omotaĉa stratosfere, zbog oksdidacije N 2 O i NO. Kako bi se zaštitila okolna ţivotna sredina i povećala efikasnost azotnih Ċubriva, prouĉavani su mnogi naĉini smanjenja gubitka azota u gasovitom sadrţaju i smanjenje sadrţaja oksida azota. Jedan od naĉina je primenom preparata, koji ograniĉavaju razmnoţavanje denitrifikacionih bakterija, ali oni još uvek nisu razraċeni. Zbog toga se koriste preparati koji ograniĉavaju aktivnost nitrifikacionih bakterija. Jedan odtakvih preparata je N-serve koji se koristi za smanjenje gubitka amonijaĉnih i amidnih oblika azotnih Ċubriva i njegovo dejstvo se ispoljava i inhibiciji razvoja Nitrosomonas, koji je izazivaĉ prve faze nitrifikacije. Bitna osobina ovog inhibitora je to što je male toksiĉnosti, brzo se razlaţe u zemljištu. Dokazano je da se korišćenjem ovog inhibitora povećao rast mnogih kultura (pšenice, kukuruza) (Đukić et al., 2007). Mnogi inhibitori koji se danas koriste utiĉu na smanjenje razmnoţavanja nitrifikacionih bakterija, ali i denitrifikacionih bakterija. Na dejstvo inhibitora nitrifikacije manje su osetljive amonifikacione bakterije. Njihovo razmnoţavanje je smanjeno samo prvih 10 20 dana nakon unošenja preparata. Inhibicija razmnoţavanja nitrifikacionih bakterija omogućava ĉuvanje amonijaĉnog oblika azota iz Ċubriva, pri ĉemu se gasoviti oblici azota smanjuju. Nakon privremenog zaustavljanja razmnoţavanja zemljišnih mikroorganizama, dolazi do fiksiranja azota Ċubriva u zemljištu, a i do jaĉanja procesa mobilizacije azota zemljišta. Tako, pri unošenju inhibitora dolazi do povećanog usvajanja azota od strane biljaka. Kod kultura jeĉma, ovi inhibitori nemaju uticaj na njihov prinos. Na osnovu toga, utvrċeno je da unošenje inhibitora ne mora dovesti do povećanja prinosa, ali ima pozitivno dejstvo na bilans azota iz Ċubriva, na njegovo fiksiranje u zemljištu, smanjenje gasovitih gubitaka i na mobilizaciju zemljišnog azota (Đukić et al., 2007). Veoma je vaţno da se azotna Ċubriva unose u odreċeno vreme, odnosno u periodu kada biljke mogu da iskorišćavaju hranljive elemente. To povećava njihovu efikasnost korišćenja i smanjuje gubitke. Uglavnom se azotna Ċubriva unose na jesen ili proleće. 22

Ukoliko se unose na jesen dolazi do znaĉajnih gasovitih gubitaka azota, jer su u tom periodu usporeni mikrobiološki procesi, kao i proces denitrifikacije azota unesenih Ċubriva (Đukić et al., 2007). 2.8.2. ORGANSKA ĐUBRIVA U grupu organskih Ċubriva spadaju stajnjak, gnojivo, treset, izmet, komunalni otpad, komposti i mnogi drugi. Oni predstavljaju izvore energije i mineralnih elemenata, a njihova uloga je i u intenziviranju mikrobioloških procesa. Stajnjak ĉini 20 25 % organske materije (azot, fosfor, kalijum) i ostatak predstavlja voda. Industrijskim stoĉarenjem dobija se stajnjak koji sadrţi oko 90% vode. Postoje ĉetiri naĉina ĉuvanja stajnjaka i to je: štalsko ĉuvanje (pod stokom), ĉuvanje na Ċubrištu, priprema hladnog stajnjaka (ubrzanim sabijanjem) i priprema toplog stajnjaka (povremenim rastresanjem i sabijanjem). Đubrivo viskog kvaliteta dobija se ĉuvanjem stajnjaka pod stokom, odnosno štalskim ĉuvanjem, ali zbog antisanitarnih uslova se najmanje koristi. U sveţem stajnjaku nalazi se veliki broj mikoorganizama, ĉiji je razvoj specifiĉan u zavisnosti od njegovog ĉuvanja. U sazrevanju hladnog stajnjaka najveću ulogu imaju asporogene bakterije. U sveţem stajnjaku najzastupljenije su koke predstavljene amonifikatorima koje zapoĉinju proces truljenja. Bakterije iz roda Pseudomonas su dosta zastupljene u stajnjaku, ali se nalaze i truleţne sporogene bakterije Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus mycoides. Mnoge amonifikacione bakterije iz stajnjaka mogu da dovedu do razlaganja uree. U njemu se nalaze i vrste koje razlaţu celulozu, zatim nitrifikatori, koji oksidišu amonijak i razlaţu purinske baze iz stajnjaka. U nastanku stajnjaka menja se zastupljenost materija, oko 40% azota stajnjaka nalazi se u vidu hipurne i mokraćne kiseline, ali je najveći deo u vidu uree koju hidrolizuju urobakterije i saprofitne bakterije i time se stvara amonijum karbonat, koji zatim disocira na amonijum i ugljendioksid (Đukić et al., 2007). Slama se koristi kao organsko Ċubrivo i njenim unošenjem zemljište se obogaćuje humusom, ali ona sadrţi i elemente potrebne biljkama, azot i druge. Razlaganjem slame oslobaċa se ugljendioksid, što povoljno utiĉe na useve. U slami je odnos ugljenika i azota veliki, odnosno 100 : 1, pa njenim dodavanjem biljke pate od nedostatka azota, izuzetak su leguminoze. Nedostatak azota bi se prevazišao dodavanjem azotnih Ċubriva. Smatra se da slama sadrţi i neke toksiĉne materije za biljke, ali adekvatnom primenom i obradom zemljišta to bi se prevazilazilo (Đukić et al., 2007). Treset se takoċe moţe primenjivati kao organsko Ċubrivo. On sadrţi veliku koliĉinu vode, organskih materija, od kojih su najzastupljenija humusne supstance i supstance sliĉne 23

ligninu. Uglavnom se primenjuje nizijski treset, ali i on sadrţi malu koliĉinu azota, koji se i sporo mineralizuje (Đukić et al., 2007). Kompost, kako bi se dobila organska Ċubriva i time smanjilo korišćenje mineralnih Ċubriva i hemijskih sredstava za zaštitu biljaka, primenjuje se metod kompostiranja razliĉitih organskih otpada. Taj otpad moţe biti gradsko smeće, koje predstavlja smešu organskih i neorganskih materija, biljni otpad (mulj). U kompostiranju se organski supstrat podvrgava aerobnoj biodegradaciji sa mikrobima u uslovima povećane temperature i vlaţnosti. Ovim procesom, organska komponenta trpi fiziĉke i hemijske transformacije, pri ĉemu se na kraju stvara stabilni humikovani proizvod - kompost, koji ima veliku koliĉinu organskih jedinjenja, biomasu uginulih mikroorganzama, odreċenu koliĉinu ţivih organizama. Kompostiranje predstavlja dinamiĉan mikrobiološki proces u kome uĉestvuju mikrobi (bakterije, gljive, alge, virusi), mikrofauna (praţivotinje, protozoe), makrofauna (stonoge, krpelji, crvi) (Đukić et al., 2007). Ostvarivanje maksimalne produktivnosti i profita u poljoprivredi podrazumeva intenzivnu obradu zemljišta, navodnjavanje, adekvatnu primenu Ċubriva, hemijsku kontrolu štetoĉina, korova i bolesti, kao i maksimalnog iskorišćavanja genetskog potencijala gajenih biljaka. Sve to dovodi do mnogih negativnih posledicana agroekosistem i kvalitet ţivota sredine. Brz razvoj biotehnologije, zasnovan na ekološkim principima, utiĉe da tradicionalni sistemi zemljoradnje doţive brojne promene. Rezultati mnogih nauĉnih istraţivanja pokazali su da Ċubriva hemijskog porekla zbog sadrţaja toksiĉnih materija, mogu da se dovedu u vezu sa neţeljenim efektima koje ispoljavaju na zdravlje ljudi, reprodukciju, probleme sa krvlju i jetrom kao i na pojavu hiperaktivnosti dece. Nikako se ne moţe dozvoliti da se zanemari negativan uticaj koji prekomerna upotreba ovih Ċubriva ima na ţivotnu sredinu (Đukić et al., 2007). Razvoj poljoprivrede je zasnovan na promenama u tehnologiji gajenja useva i oplemenjivanju biljaka. Biljka je ţivo biće koje ţivi u dve sredine, atmosferi i pedosferi. Zemljište sluţi biljkama za uzimanje vode, hranljivih materija i energije, koji se nalaze u njemu. Ako je zemljište nestrukturno, bez dovoljno vode i hranljivih materija onda je broj korisnih mikroba i zreo humus u zemljištu, osnov za planiranje dobrog i kvalitetnog prinosa. To doprinosi boljem uspostavljanju ekološke ravnoteţe i stabilnosti prirodnih resursa. Zbog toga se uvodi novi pojam, a samim tim i nova metoda biofertilizacija (Singh., 2012). 24

2.9. MIKROBIOLOŠKA ĐUBRIVA I BIOFERTILIZACIJA Biofertilizacija predstavlja unošenje ţivih mikroorganizama u zemljište sa ciljem poboljšanja snabdevanja biljaka neophodnim nutritijentima. Tako se moţe poboljšati snabdevanje biljaka azotom, fosforom, kalijumom, gvoţċem, sumporom, ali i stimulisati rast korena. Unošenjem ovih bakterija u rizosferu biljaka ubrzavaju se procesi transformacije organske materije i biljka se snabdeva potrebnim nutritijentima (Singh., 2012). Mikrobiološka Ċubriva predstavljaju ĉiste kulture aktivnih mikroorganizama koje se gaje na hranljivoj podlozi. Nazivaju se i bakterijska Ċubriva. Njihova upotreba je najzastupljenija u voćarstvu. Mikrobiološka Ċubriva svoj uticaj na biljke ispoljavaju kroz: - ubrzanje procesa pretvaranja organske materije u forme koje su pogodne za ishranu voćaka; - poboljšanje snabdevanja voćaka azotom; - oslobaċanje elemenata iz teško pristupaĉnih formi, u forme koje voćke mogu lako koristiti; - smanjenje koncetracije CO 2 u zemljištu; - umanjenje mogućnosti asfikacije korena. Mikrobiološka Ċubriva mogu se koristiti u razliĉitim oblicima: vlaţna, teĉna, zamrznuta (granulirana) i suva (u prahu). U praksi se bakterijska Ċubriva primenjuju na sledeće naĉine: - potapanjem korena sadnice u suspenziji odreċenog Ċubriva, - zalivanjem voćaka rastvorom smeše ţivinskog i bakterocidnog Ċubriva. Najĉešće se koriste sledeća mikrobiološka Ċubriva: - Azotofiksatori, povećavaju koliĉinu azota u zemljištu. Đubriva mogu biti sa slobodnim i simbiotskim azotofiksatorima, pa na osnovu toga imaju razliĉite komercijalne nazive: Azotobakterin, Rizotrofin, Nitrogin, Azotofiksin i dr. - Fosfobakterin-ova Ċubriva sadrţe bakterije koje mineralizuju organska jedinjenja sa fosforom i pretvaraju ih u oblike lako dostupne korenovom sistemu biljaka. - Mikorizin, sadrţi mikorizne gljive koje se mogu inokulirati na koren mladih sadnica, neposredno pred sadnju. Mikorizin se sastoji od gljiva sposobnih da 25

potpomaţu ishranu voćaka (apsorpciju vode i hranljivih elemenata). Koristi se u formi vlaţnog Ċubriva. - Humivorin, unosi se u zemljište sa stajnjakom ili kompostom. Sastoji se od raznih bakterija sposobnih da humus pretvaraju u mineralne materije pogodne za ishranu biljaka. - Silikobakterin, doprinosi oslobaċanju kalijuma iz alumo silikata. Sojevi ovih mikroorganizama proizvode veće kolićine ugljene kiseline i na taj naĉin rastvaraju alumo silikate i druge minerale kalijuma. Komponente mikroloških Ċubriva su uglavnom Azotobacter, Azospirillum, Bacillus, Pseudomonas i druge. Pošto je azot veoma znaĉajan u ishrani biljaka, posebno mesto se pridaje bakterijama koje snabdevaju biljke azotom. To su bakterije iz grupe azotofiksatora koje elementarni, atmosferski azot prevode u oblike pristupaĉne biljkama. Ove bakterije se nalaze u neposrednoj blizini korena i azot predaju neposredno biljkama. Za rast biljaka neophodan je i fosfor, koji je prisutan u zemljištu u formama koje su nepristupaĉne biljkama. Bakterije iz roda Bacillus i Azotobacter mogu da sintetišu organske kiseline i fosfataze koje će nepristupaĉan fosfor prevesti u biljkama pristupaĉnu formu (Gowathy et al., 2008). Kalijum je u zemljištu u obliku alumosilikata. Zahvaljujući aktivnosti bakterija iz roda Bacillus, postaje pristupaĉan biljkama. Neke bakterije zahvaljujući prisustvu siderofora doprinose snabdevanje biljaka gvoţċem. TakoĊe je poznato da bakterije iz roda Pseudomonas mogu transformisati organske forme sumpora u neorganski i na taj naĉin ga uĉiniti pristupaĉnim za biljke (Đukić et al., 2007). Ovo ukazuje da se primenom mikrobioloških Ċubriva koja u sebi sadrţe mešane populacije mikroorganizama moţe poboljšati snabdevanje biljaka neophodnim nutritijentima uz istovremeno oĉuvanje ţivotne sredine i proizvodnju zdravstveno bezbedne hrane. Pored toga ove bakterije imaju sposobnost sinteze biljnih hormona tipa giberalina, auksina, ĉime se dodatno stimuliše biljni rast i utiĉe na otpornost biljaka. Unošenjem mikrobioloških Ċubriva u zemljište utiĉe se na tok i usmeravanje mikrobioloških procesa u zemljištu što će uticati na rast, razviće biljaka ali i na zemljište. Neki od mikroorganizama koji su uneti u zemljište odlikuju se mogućnošću sinteze sluzavih materija koje igraju znaĉajnu ulogu u slepljivanju mikroagregata što doprinosi formiranju fine strukture zemljišta. Nakon izumiranja mikroorganizama unetih u zemljište povećava se ukupna biomasa, a efekti će se odraziti u sledećoj vegetaciji. Povećanjem organske biomase dovešće do povećanja plodnosti zemljišta i stvaranje biljkama neophodnih mineralnih nutritijenata. Pri tome ne dolazi do zagaċivanja 26

zemljišta, voda i atmosfere. Azotobacter chroococum prisutan je u rizosferi mnogih biljaka, a kod nekih biljnih vrsta pribliţava se asocijativnim azotofiksatorima. U tim uslovima Azotobacter prevodi elementarni azot iz atmosfere u oblik koji je pristupaĉan biljkama. Bacillus megaterium var. phosphaticus uĉestvuje u procesu amonifikacije. Fosfor na taj naĉin dolazi u neorganski oblik, pristupaĉan za biljku. U zemljištu je prisutna silikatna bakterija Bacillus circulans koja razlaţe alumosilikate iz kojih se oslobaċa kalijum. Sve ovo upućuje da primena mikrobioloških Ċubriva ima svoje mesto u savremenoj konvencionalnoj, ali i organskoj poljoprivrednoj proizvodnji (Đukić et al., 2007). Osnovu biofertilizatora ĉine bakterije koje direktnim ili indirektnim delovanjem pozitivno utiĉu na rast biljke i porast useva, a vrlo se jednostavno nanose na površinu biljke, semena ili zemlje. Reĉ je o bakterijskim vrstama koje pozitivno deluju na rast biljaka kroz sposobnost: - fiksacije atmosferskog azota; - pretvaranje jedinjenja fosfora u oblike lako pristupaĉne za biljku; - razlaţu organsku materiju; - izluĉuju supstance antibiotskog i fungistatiĉkog delovanja i - poseduju sposobnost produkcije hormona i drugih supstanci koji su neophodne za rast i razviće biljaka (tzv. PGP Plant Growth Promoting bakterije). Hormoni koje produkuju bakterije (auksini, citokinini, giberelini) su potpuno prirodni analozi biljnim hormonima (Singh., 2012). FOSFAT SOLUBILIZIRAJUĆI MIKROORGANIZMI (PSM) Mikroorganizmi koji imaju sposobnost da konvertuju nedostupne u dostupne forme jedinjenja koje korenov sistem biljaka moţe da usvoji, su solubilizatori. Fosfosolubilizatori (PSM Phosphorus Solubizing Microorganisms) su grupa bakterija i gljiva koje konvertuju neorganski oblik fosfora u organski. Ovaj mehanizam se odvija zahvaljujući sekreciji organskih kiselina (glukonska, mleĉna, limunska, oksalna, fumarna), u spoljašnju okolinu mikroorganizama, što je rezultat razgradnje šećea. Sniţenje ph sredine dovodi do toga da anjonska forma kiselina, vezuje katjon neorganskog oblika fosfata i tako konvertuje nedostupna fosfatna jedinjenja u rastvorljive forme, dostupne korenovom sistemu. Proces zavisi od vrste mikroorganizama i kiseline koju stvara. Najefikasniji put je ekstracelularna oksidaza glukoze, posredstvom enzima glukozna dehidrogenaza, gde se stvara glukonska kiselina. Alifatiĉna kiselina (glukonska kiselina, 2-ketoglukonska kiselina) se pokazala najefikasnijom (Richardson andsimpson., 2011). 27

Fusarium i dr. Ovde spadaju vrste iz roda: Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus, Penicillium, FOSFAT MOBILIZIRAJUĆI ORGANIZMI (PMB) U ovu grupu spadaju mikroorganizmi sa sposobnošću mobilizacije nedostupnih formi jedinjenja fosfora, cinka i sumpora, ĉineći ih dostupnim za biljke. Posebno se izdvajaju mikorizalne gljive fosofomobilišuće gljive koje stupaju u mutualistiĉki odnos sa biljkama. Hife povećavaju apsorpcionu površinu korena što je od velikog znaĉaja ukoliko je neki od nutritijenata u manjku. Mikorizalne gljive se dele na: - ektomikorize, - endomikorize (AM arbuskularne mikorize); Glomus, Gigaspora, Sclerocystis... - ektendomikorize (Richardson andsimpson., 2011) Bakterija Frateuria aurentia je poznata po sposobnosti mobilizacije kalijuma. BILJNI HORMONI (FITOHORMONI) Fitohormoni su organske supstance male molekulske mase, koje ne spadaju u hranljive materije, a koje (u malim koliĉinama) stimulišu, inhibiraju ili na neki drugi naĉin modifikuju rast i razvoj biljaka. To su prirodne supstance koje se izgraċuju u biljnom organizmu koje utiĉu na rastenje i razviće biljaka. Svi hormone deluju tokom celog razvića biljke na procese u razliĉitim ćelijama i organima. Efekat jednog hormona na iste ćelije moţe biti razliĉit u zavisnosti od stadijuma razvića ćelija. Fitohormoni obuhvataju nekoliko klasa jedinjenja, meċu kojima su auksini, giberelini, citokini i drugi (Kastori., 1991). Auksini su prva grupa biljnih hormona koji su otkriveni na osnovu toga što stimulišu rastenje biljaka. Po hemijskoj strukturi slavna grupa auksina su indolna jedinjenja, a centralno mesto pripada indolil-3-sirćetnoj kiselini (IAA). Glavne funkcije auksina su: - stimulativni efekat auksina na izduţivanje ćelija stabla i koleoptila (fototropska i geotropska reakcija); - u deobi ćelija; - inhibicija mirujućih pupoljaka (Ortiz Castro., 2009). 28

Giberelini su otkriveni u Japanu kao produkt gljive Ascomycetes. Biljke izgraċuju gibereline u tkivima koja aktivno rastu, kao što su apikalni delovi stabla, mladi listovi, koreni, nezrela semena i plodovi. Fiziološki efekti giberelina su: - rastenje ćelija u vegetativnim tkivima; - izduţivanje stabla; - razvoj listova i izduţivanje lisnih drški; - diferencijacija floemskih elemenata; - izduţivanje polenovih cevi; - klijanje semena (Kastori., 1991). Citokini su grupa biljnih hormona ĉija je osnovna funkcija da stimulišu ćelijske deobe, ali su za to neophodni i auksini. Citokina ima najviše u vrhu korena, koji je dominantno mesto njihove sinteze, odakle se transportuju ksilemom u ostale organe (stablo i listove). Glavne funkcije citokina su: - stimulacija ćelijskih deoba u prisustvu auksina; - indukcija novih pupoljaka i stimulacija mirujućih pupoljaka; - ukidanje apikalne dominacije; - fascijacija i debljanje stabla; - rastenje listova; - diferencijacija hloroplasta; - stimulacija cvetanja i regulacija pola cvetova; - usmeravanje transporta i akumulacija asimilata i metabolita u organima bogatim citokinima (Ortiz Castro., 2011). ANTIBIOTICI Antibiotici su metaboliti jednih mikroorganizama, koji deluju inhibitorno ili ĉak latentno na druge mikroorganizme. Antibiotike je prvi uoĉio Aleksandar Fleming 1929. godine kada je primetio da gljiva Pencilium naotatum stvara zonu u kojoj ne dolazi do razvića bakterija zona inhibicije. Antibiotici se najĉešće dobijaju mikrobiološkim putem procesom fermentacije, kao i polusintetskim i sintetskim putem (Kastori., 1991). Biofertilizatori su organskog porekla i unapreċuju primarnu poljoprivrednu proizvodnju popravljajanjem fiziĉkih svojstava zemljišta na kome se koriste, njegovu plodnost i produktivnost. Ĉinjenica da se njihovom upotrebom smanjuje koliĉina hemikalija u poljoprivrednoj proizvodnji ĉini biofertilizaciju eko frendli procesom. Uticaj biofertlizatora 29

zavisi od soja bakterija, ali i od koncentracije bakterijskih ćelija u inokulatu biljne vrste, primenjenih mera i osobina zemljišta (Singh., 2012). Biofertilizatori kojima se pospešuje proces azotofiksacije su uglavnom bakterije iz rodova Rhizobium, Bradyrhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, Allorhizobium, Azorhizobium. Ovi mikroorganizmi uĉestvuju u simbiotskoj azotofiksaciji, prodiru u koren ili stablo leguminoznih biljaka i formiraju kvrţice (nodule). Rodovi koji uĉestvuju u asocijativnoj azotofiksaciji uglavnom ne formiraju kvrţice i koriste se pre setve na seme ili se unose tokom vegetacije. U ovu grupu spadaju Acetobacter, Bacillus, Azrospirillum, Pseudomonas. Sve ove vrste fiksiraju azot iz atmosfere i proizvode materije koje utiĉu na rast biljaka (Singh., 2012). Pored obezbeċivanja azota, slobodni azotofiksatori produkuju i mnoga biološki aktivna jedinjenja, organske kiseline koje razlaţu fosfate, aerišu zemljište, a i sintetišu mnoga organska jedinjenja. Kod proizvodnje neleguminoznih biljaka i ostalih povrtarskih biljaka uglavnom se koristi Azotobacter sp, a u proizvodnji pirinĉa se koriste razliĉite vrste cijanobakterija (Singh., 2012). 2.9.1. ROD AZOTOBACTER Rod Azotobacter pripada grupi Gram negativnih aerobnih/mikroaerofilnih štapića i koka. To je heterogena grupa bakterija. Kod ovih bakterija zastupljen je respiratorni tip metabolizma. Bakterije su pleomorfne i imaju razliĉit oblik. Mogu biti štapići ili koke. Javljaju se pojedinaĉno, u parovima ili u nepravilnim grupama. Azotobakter su uglavnom pokretne bakterije, kreću se peritrihama, mada su primećeni i neki nepokretni oblici. Ove bakterije rastu mikroaerofilno i neki sojevi proizvode pigment. Za Azotobakter je karakteristiĉna sposobnost azotofiksacije. Ove bakterije su zastupljene u zemljištu i vodi a karakteriše ih i sposobnost formiranja asocijacija sa višim biljkama. Tipiĉan predstavnik ovog roda je Azotobakter chroococum. Azotobacter pored sposobnosti azotofiksacije ima sposobnost i proizvodnje hormona rasta (citokini, giberelini), vitamina (produkuje B vitamine). On konvertuje azot u amonijak koji uzimaju biljke. Ova bakterija moţe da proizvede i antifugalna jedinjenja, koja se koriste u zaštiti biljaka. Proizvodnja Ċubriva sa Azotobacter vrši se na odreċenim ĉvrstim ili teĉnim podlogama, u zavisnosti od biljne vrste (Petrović et al., 2007). 30

Azotobacter vinelandii Azotobacter vinelandii je rod slobodnoţivećih diazotrofnih bakterija koje fazu odmaranja provode u vidu ciste. Nalazi se u alkalnom zemljištu, akvatiĉnoj sredini i na nekim biljkama. To je Gram-negativna bakterija. Poseduje nekoliko metaboliĉkih mogućnosti, ukljuĉujući i fiksaciju atmosferskog azota i njegovu konverziju do amonijaka. Njihov jedinstveni sistem posebnih enzima nitrogenaza, omogućava ovim bakterijama korišćenje u nauci, kako bi se bolje razumeo proces azotofiksacije i njeno korišćenje u poljoprivredi. Azotobacter sp. ima najveću metaboliĉku stopu od drugih organizama. One su zbog jedinstvenog naĉina metabolizma za aerobnu fiksaciju azota, privukle dosta interesovanja nauĉnika. Ćelije sa visokom stopom respiracije omogućavaju normalnu osetljivost nitrogenaza kada se izloţe kiseoniku. Azotobacter se moţe koristiti za produkciju proteina koji štite nitrogenaze od iznenadnog stresa izazvanim kiseonikom. Ove bakterije sintetišu tri nitrogenaze. Diazotrofni organizmi, kao što je i Azotobacter, imaju kljuĉnu ulogu u svakom ekosistemu, jer omogućavaju dostupnost azota svim organizmima. Oni procesom azotofiksacije pretvaraju azot u amonijak, nakon ĉega se amonijak redukuje do proteina, koji se ugraċuju u biljke. Azotofiksacija se koristi u poljoprivredi, gde se biofertilizacijom povećava plodnost zemljišta. Azotobacter vinelandii pored fiksacije azota, uĉestvuje u proizvodnji nekih biljnih hormona (auksina i giberilina), ali je bitan i u dobijanju nekih vitamina. 2.9.2. ROD BACILLUS Rod Bacillus pripada grupi Gram pozitivnih štapića i koka koje formiraju endospore. To su krupne, sporogene bakterije koje su aerobi ili fakultativni anaerobi. Mnoge vrste imaju sposobnost sinteze nekih antibiotika (gramicidin, bacitracin) i nekih ekstracelularnih enzima. Bacillus anthracis je vrsta koja je najznaĉajnija za medicinu, koja je patogena za ljude i ţivotinje, jer izaziva antraks (crni prišt). U poslednje vreme, veoma vaţnu ulogu zauzima i Bacillus thurigiensis, jer u toku sporulacije formira kristalni protein, odnosno parasporalno telo. To je veoma aktivan biološki insekticid. Ovaj kristalni protein se rastvara u crevima larvi, prelazi u krv i dovodi do smrti larve. Kako bi se zaštitila ţivotna sredina, ovaj pesticid je veoma znaĉajan, jer se hemijski pesticidi teško uklanjaju iz zemljišta. Kao biološki agens koji utiĉe na suzbijanje brojnosti fitopatogena, najveći znaĉaj ima Bacillus subtilis, mada se zadnjih godina skreće paţnja i na korišćenje Bacillus mycoides i Bacillus cereus. Bakterije 31

ovog roda sintetišu veliki broj jedinjenja kojima utiĉu na svoju okolinu, povećavajući tako pristupaĉnost potrebnih elemenata biljkama (Petrović et al., 2007). Bacillus subtilis Bacillus subtilis je Gram-pozitivna bakterija, koja je pokretna, štapićastog oblika. Prvenstveno je prisutna u zemljištu, ali i u vodi, vazduhu, na biljnom materijalu. U poĉetku se je ova bakterija zvala,,vibrio subtilis, ali joj je naziv promenjen 1872. godine. Tokom nutritivnog stresa stvara endospore koje joj omogućavaju preţivljavanje nepovoljnih uslova (visoke temperature, zraĉenja, otrovne supstance). U preţivljavanju glavnu ulogu imajuα i β proteini koji zasićuju molekul DNA i pri tome je štite. Ovi proteini prisutni su samo u endospori i nema ih u vegetativnim ćelijama. Spore Bacillus subtilis su rasprostranjene svuda u prirodi. Bacillus subtilis je mezofilna vrsta i moţe da raste na temperaturama od 20 0 C do 250 0 C, dok njene spore mogu da preţive i 1000 0 C 30 minuta. Tokom svoje aktivnosti stvara veliki broj enzima (Petrović et al., 2007). Bacillus subtilis nije patogena za ĉoveka, ali postoje podaci o infekcijama ovom bakterijom kod osoba sa oslabljenim imunitetom. Uglavnom su to oportunistiĉke infekcije. Bacillus subtilis je jedna od najĉešće korišćenih bakterija za produkciju enzima i drugih produkata koji imaju široku primenu u industriji. Ova vrsta izaziva koagulaciju mleka usled proteolitiĉke aktivnosti (slatko zgrušavanje). Bacillus subtilis razgraċuje kompleksne ugljenohidrate i proizvodi amilazu. Smatra se idealnim probiotikom, zbog svoje sposobnosti preţivljavanja na niskim ph u gastrointestinalnom traktu. Stvaranjem endospora moţe se odrţati veoma dugo. Bacillus subtilis stimuliše imuni sistem, tako da se dobije širok spektar antitela. Koristi se za produkciju velikog broja antibiotika. Pored enzima, ova bakterija produkuje i toksin subtilizin, koji je izazivaĉ mnogih alergijskih reakcija. Bacillus subtilis je uzet i kao zemljišni inokulant i koristi se za dobijanje mikrobioloških Ċubriva. Ova vrsta produkuje neke fungicidne komponente, pa se koristi i za zaštitu biljaka. Zbog lake genetiĉke manipulacije koristi se i kao model u laboratorijama. Koriste se i za prouĉavanje kolonija bakterija, jer dobro rastu na agru, u svim uslovima (Jemcev and Đukić, 2000). Bacillus megaterium Bacilllus megaterium je štapićasta, Gram-pozitivna bakterija, prisutna na razliĉitim staništima. Ĉesto se moţe javljati u parovima ili lancima. Bacillus megaterium raste na temperaturama od 3 0 C pa do 45 0 C, ali je optimalna temperature za njen rast 30 0 C. Uglavnom raste na biljkama i koristi se kao biokontrolni agens za zaštitu biljaka. Pre otkrića Bacillus 32

subtilis, ova bakterija je korišćena za prouĉavanje biohemijskih procesa, sporulacije i drugo. Najveću prednost dobija razvojem biotehnologije, gde se koristi u mnoge svrhe. Veoma je vaţan industrijski organizam. Produkuje razne penicillin amidaze koje se koriste za sintetiĉko dobijanje penicilina, amilaze koje se koriste u pekarskoj industriji i glukozo-dehidrogenaze koje se koriste za testove glukoze u krvi. Jedna od glavnih osobenosti Bacillus megateriuma je sposobnost fiksacije azota, a uĉestvuje i u transformaciji fosfora, nastanku hormona rasta biljaka i vitamina B12, kao i lekova sa fungicidnim i antiviralnim karakteristikama (Petrović et al., 2007). 33

3. CILJ RADA Rezultati mnogobrojnih istraţivanja su pokazali da odreċene vrste zemljišnih mikroorganizama imaju veliki znaĉaj u stimulaciji rasta biljaka, što se manifestuje kroz njihovu sposobnost solubilizacije, mobilizacije i sinteze biološki aktivnih materija koje povoljno deluju na biljni metabolizam. Shodno tome, ciljevi ovog rada su definisani u sledećem: 1. Optimizacija medijuma za gajenje odabranih sojeva korisnih zemljišnih bakterija sa sposobnošću sinteze aktivnih supstanci, solubilizacije fosfata i azotofiksacije, u kontrolisanim uslovima fermentatora, radi dobijanja najveće biomase; 2. Modifikacija sastava medijuma, sa ciljem da se postigne jednostavnija i jeftinija proizvodnja mikrobiološkog Ċubriva, dostupnog za široku, komercijalnu upotrebu. 34

4. MATERIJAL I METODE 4.1. MATERIJAL 4.1.1. BAKTERIJSKE KULTURE U radu su korišćene bakterijske kulture Bacillus subtilis (sintetiše aktivne supstance), Bacillus megaterium (solubilizacija fosfata) i Azotobacter vinelandii (azotofiksacija). Navedeni mikroorganizmi su nepatogeni izolati iz zemljišta. Štok kulture bakterijskih sojeva su ĉuvane u krioviala masa 15% glicerolom i odgovarajućom hranljivom podlogomna 85 0 C. 4.1.2. HRANLJIVE PODLOGE Podloge korišćene za zasejavanje mikroorganizama izvaċenih iz štoka su: - HA, hranljivi agar koji je gotova podloga (Bacillus subtilis, Bacillus megaterium) - Pikovskaya s agar, koristi se za fosfobakterije (Bacillus megaterium) - Jenson s agar, predstavlja bezazotnu podlogu za azotofiksatore (Azotobacter vinelandii). Tabela 1. Sastav podloga Podloge g/l PSB, Pikovskaya agar N-fiksirajući Јensenagar Dekstroza 10 Glukoza 20 ekstrakt.kvasca 0.5 K 2 HPO 4 1 MgSO 4 0.1 0.5 KCl 0.2 NaCl 0.5 (NH4) 2 SO 4 0.5 Na2MoO 4 0.001 FeSO 4 Tr 0.01 Ca 3 (PO 4 ) 2 5 CaCO 3 2 Agar 15 15 35

4.2. METODE 4.2.1. PRIPREMA BAKTERIJSKIH KULTURA Bacillus subtilis i Bacillus megaterium su presejani na petri ploĉe sa hranljivim agarom, a Azotobacter vinelandii na (Jenson agar) bezazotnoj podlozi. Ovako presejane kulture su inkubiranena 30 0 C, 3 dana Bacillus i 5 dana Azotobacter vinelandii, nakon ĉega su se jasno uoĉavale kolonije. Priprema bakterijske suspenzije,,revitalizovani mikroorganizmi su korišćeni za pravljenje suspenzija u 0,9 % rastvoru NaCl (fiziološki rastvor). Turbiditet suspenzija je uz upotrebu densitometra podešen na 0,5 McF, što odgovara 10 8 CFU/ml (colony formit unit). Solubilizacija fosfata Dokazivanje solubilizacije fosfata, od strane odabranih bakterijskih sojeva, je vršeno kvalitativnom metodom ĉvrstog agara na Pikovskaya podlozi (SIGMA-ALDRICH), ĉiji je sastav dat u tabeli 1. Pomenuta podloga je odmerena, sterilisana i razlivena u petri ploĉe, a nakon hlaċenja su na njoj ezom zasejani pomenuti sojevi. Usled prisustva nerastvornog kalcijumfosfata, boja podloge je mleĉnobela. Solubilizacija fosfata se manifestuje tokom inkubacije 5-7 dana na 30 0 C, kada se oko formiranih kolonija uoĉavaju providne zone. Efikasnost solubilizacije se moţe odrediti na osnovu dijametra kolonije i dijametra obezbojene zone (Karpagam and Nagalakshmi., 2014). Ovom metodom je potvrċena sposobnost solubilizacije od strane Bacillus megaterium. Azotofiksacija Sposobnost azotofiksacije soja Azotobacter vinelandii je potvrċena zasejavanjem soja na bezazotnoj podlozi Jensen agar (HIMEDIA), ĉiji je sastav dat u tabeli 1. Azot je neophodan element za rast mikroorganizama, tako da se ova podloga koristi za izolaciju i identifikaciju mikroorganizama koji imaju sposobnost vezivanja atmosferskog azota. 36

4.2.2. PRIPREMA STARTNE KULTURE (inokuluma) Startne kulture su pripremljene u erlenmajere i odgovarajućim sterilisanim teĉnim podlogama za izabrane sojeve (Tabela 2.,Tabela 3. i Tabela 4.). U sterilnim uslovima laminara (ESCO, USA) (Slika 5.) su inokulisane podloge sa po 1,5 ml odgovarajuće bakterijske suspenzije. Ovako zasejane kulture su stavljene na rotacioni mešaĉ (200 rpm) gde je svakog dana kontrolisana sterilnost i brojnost mikroorganizama. Mikroorganizmi su gajeni na 30 0 C 48h Bacillus i 72h Azotobacter vinelandii. Startne kulture su korišćene za inokulaciju teĉnog fermentora. Slika 5. Priprema inokuluma na rotacionom mešaĉu Tabela 2. Sastav podloga g/l za inokulum i fermentor za Bacillus subtilis. Bacillus subtilis Teĉna podloga GFM modifikovana. F1 F2 Glukoza 20 10 3 Pepton 5 5 Ekstrakt kvasca 1 1 1 Mesni ekstrakt 3 3 NH 4 NO 3 0.5 0.3 KH 2 PO 4 5 5 MgSO 4 0.5 0.5 NaCl 0.5 0.5 (NH 4 ) 2 MoO 4 u tragovima Ca 3 (NO 3 ) 2, 1M (ml) 1 1.45 MgSO 4 x7h 2 O 0.5 (NH 4 ) 2 SO 4 1 PVP-40 20 20 FeCl 3 0.03M (ml) 8.4 2 2 CaO 1.12 EDTA 2 Rastvor soli (ml) 10 10 NH 4 HPO 4 2 3 37

Tabela 3. Sastav podloge g/l za inokulum i fermentor za Bacillus megaterium. Bacillus megaterium Podloga Glukoza 10 Ekstrakt kvasca 1 NH 4 NO 3 0.5 KH 2 PO 4 5 MgSO 4 0.5 NaCl 0.5 Ca 3 (NO 3 ) 2, 1М (ml) 1 (NH 4 ) 2 SO 4 1 PVP-40 20 FeCl 3 0.03M (ml) 2 Rastvor soli (ml) 10 NH 4 HPO 4 5 Glicerol (ml) 15 Tabela 4. Sastav podloga g/l za inokulum i fermentor za Azotobacter vinelandii. teĉna podloga Azotobacter vinelandii Jenson - modif. LPM Šećer 20 10 K 2 HPO 4 1 0.583 MgSO 4 0.5 0.098 NaCl 0.5 0.058 Na 2 MoO 4 0.005 0.002 FeSO 4 0.1 0.005 glicerol (ml) 10 CH 3 CO 2 NH 4 1.2 1.2 PVP-40 20 CaSO 4 x2h 2 O 0.1 KH 2 PO 4 0.224 38

4.2.3. KONTROLA STERILNOSTI I ODREĐIVANJE BROJNOSTI MIKROORGANIZAMA Svakog dana inkubacije, iz erlenmajera i fermentora (Slika 6.) je uziman uzorak kako bi se ispitala brojnost mikroorganizama (metoda posrednog odreċivanja brojnosti) i potvrdilo odsustvo kontaminacije. U ove svrhe je korišćena metoda kapi ili drop plate method (Somasegaran P and Hoben JH., 1994). Serija razblaţenja uzorka je pripremljena prebacivanjem 1 ml uzorka u 9 ml sterilnog fiziološkog rastvora u pripremljenim sterilnim epruvetama. A zatim je iz svakog razblaţenja, od 10-1 do 10-10, uzimano po 20 mikrolitara i u vidu kapi izruĉeno u petri ploĉe sa hranljivim agarom, koje su prethodno podeljene u kvadrante. Svaki kvadrant je obeleţen i predstavlja odgovarajuće razblaţenje. Zasejani mikroorganizmi su inkubirani 24h-48h, na 30ᵒ C, a brojanje je vršeno u tri ponavljanja. Slika 6. Fermentor Ukupan broj ćelija u 1 ml poĉetnog uzorka je raĉunat po sledećoj formuli: N= n x 50 x10 x N ukupan broj ćelija u 1 ml uzorka 50 koeficijent ispravke do 1ml 10 x - razblaţenje 39