BIOLOŠKI FAKULTET UNIVERZITET U BEOGRADU Doktorska disertacija UTICAJ ANTIDEPRESIVA NA PONAŠANJE I AKTIVNOST SIMPATOADRENALNOG SISTEMA KOD NESTRESIRANIH I STRESIRANIH PACOVA Spasojević Nataša Beograd, 2010
SADRŽAJ: I UVOD 1 1.1. Definicija stresa 2 1.2. Simpato-adrenomedularni sistem 6 1.2.1. Biosinteza kateholamina 8 1.2.2. Otpuštanje kateholamina 10 1.2.3. Inaktivacija kateholamina 12 1.2.4. Degradacija kateholamina 13 1.2.5. Transkripcioni mehanizmi kontrole nivoa irnk za enzime koji učestvuju u biosintetezi kateholamina 14 1.3. Hipotalamo-hipofizno-adrenokortikalni sistem 19 1.4. Kardiovaskularni sistem u stresu 23 1.4.1. Keteholaminergičke ćelije srca 23 1.4.2. Prenos signala adrenoreceptora u srcu 25 1.5. Studije o ponašanju životinja 28 1.5.1. Izdignuti plus lavirint 29 1.5.2. Prinudni test plivanja 31 1.6. Animalni model depresije 33 1.7. Depresija 36 1.5.1. Da li postoji veza između stresa i depresije? 37 1.5.1.1. Glukokortikoidna teorija depresije 38 1.5.1.2. Monoaminska teorija depresije 39 1.5.1.3. Noradrenergički sistem u mozgu 40 1.5.1.4. Serotonergički sistem u mozgu 42 1.5.2. Depresija kao faktor rizika za pojavu kardiovaskularnih oboljenja 44
1.5.3. Antidepresivi 45 1.5.3.1. Inhibitori ponovnog preuzimanja monoamina iz sinapse 46 1.5.3.2. Triciklični i tetraciklični antidepresivi 48 1.5.3.3. Selektivni inhibitori preuzimanja serotonina (SSRI) 49 II CILj RADA 51 III MATERIJAL I METODE 53 3.1. Životinje 54 3.2. Lekovi i protokol tretmana 54 3.3. Hronični nepredvidivi blagi stres (NBS) 55 3.4. Testovi ponašanja životinja 57 3.4.1. Test prinudnog plivanja (FST-Forced Swimming Test) 57 3.4.2. Procedura izdignutog plus lavirinta (EPM Elevated Plus Maze) 58 3.5. Metoda uzimanja krvi kod pacova 59 3.6. Metoda određivanja noradrenalina i adrenalina u plazmi 60 3.6.1. Izolacija COMT 62 3.7. Metoda određivanja ACTH u plazmi 63 3.8. Metoda određivanja kortikosterona u plazmi 63 3.9. Izolacija RNK 64 3.10. Sinteza komplementarne DNK (cdnk) 65 3.11. Real-time PCR 66 3.12. Statistička analiza rezultata 68 IV REZULTATI 69 4.1. Fiziološki parametri ponašanja pacova hronično izloženih NBS 70 4.1.1. Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na parametre anksioznosti u testu izdignutog plus lavirinta
nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS 70 4.1.2. Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na parametre u testu prinudnog plivanja nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS 73 4.2. Koncentracija hormona u plazmi pacova hronično izloženih NBS 76 4.2.1. Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na koncentraciju ACTH u plazmi nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS 76 4.2.2. Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na koncentraciju CORT u plazmi nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS 77 4.2.3. Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na koncentraciju NA u plazmi nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS 78 4.2.4. Dejstvo hroničnog maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na koncentraciju A u plazmi nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS 79 4.3. Ekspresija enzima koji učestvuju u biosintezi kateholamina u srži nadbubrežne žlezde pacova hronično izloženih NBS 81 4.3.1. Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na relativnu gensku ekspresiju enzima TH nestresiranih i i pacova hronično izloženih NBS 81 4.3.2. Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na relativnu gensku ekspresiju enzima DBH nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS 82
4.3.3. Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na relativnu gensku ekspresiju enzima PNMT kod nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS 83 4.4. Ekspresija enzima koji učestvuju u biosintezi kateholamina u srcu pacova hronično izloženih NBS 85 4.4.1. Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na relativnu gensku ekspresiju enzima TH u desnoj i levoj pretkomori srca nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS 85 4.4.2. Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na relativnu gensku ekspresiju enzima TH u desnoj i levoj komori srca nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS 87 4.4.3. Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na relativnu gensku ekspresiju enzim DBH u desnoj i levoj pretkomori srca nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS 89 4.4.4. Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na relativnu gensku ekspresiju enzima DBH u desnoj i levoj komori srca nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS 91 4.4.5. Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na relativnu gensku ekspresiju enzima PNMT u desnoj i levoj pretkomori srca nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS 93 4.4.6. Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na relativnu gensku ekspresiju enzima PNMT u desnoj i levoj komori srca nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS 95 4.5. Ekspresija β 1 i β 2 adrenoreceptora u srcu pacova hronično izloženih NBS 97 4.5.1. Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na relativnu gensku ekspresiju β 1 -AR u desnoj i levoj
pretkomori srca nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS 97 4.5.2. Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na relativnu gensku ekspresiju β 1 -AR u desnoj i levoj komori srca nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS 99 4.5.3. Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na relativnu gensku ekspresiju β 2 -AR u desnoj i levoj pretkomori srca nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS 101 4.5.4. Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na relativnu gensku ekspresiju β 2 -AR u desnoj i levoj komori srca nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS 103 V DISKUSIJA 105 5.1. Efekti antidepresiva na fiziološke parametre ponašanja 106 5.1.1. Test izdignutog plus lavirinta 107 5.1.2. Test prinudnog plivanja 112 5.2. Dejstvo antidepresiva na hipotalamo-hipofizno-adrenokortikalni sistem 117 5.3. Efekat antidepresiva na aktivnost simpato-adrenomedularnog sistema 122 5.4. Efekat NBS na aktivnost kardiovaskularnog sistema 127 5.5. Efekat hroničnog tretmana antidepresivima na aktivnost kardiovaskularnog sistema 133 VI ZAKLJUČCI 142 VII LITERATURA 146
SKRAĆENICE KORIŠĆENE U TEKSTU 5-HIAA - 5-hidroksi-indol-sirćetna kiselina 5-HT serotonin 5-HTT serotoninski transporter A adrenalin AAAD aromatična L-aminokiselinska dekarboksilaza AC adenilatna ciklaza ACTH adrenokortikotropni hormon AK aminokiselina AMPT α-metil para tirozin AP1 transkripcioni faktor aktivator proteina 1 ATP adenozin-tri-fosfat AV atrioventrikularni čvor camp ciklični adenozin monofosfat AVP arginin-vazopresin AR adrenoreceptor BDNF neurotrofni faktor u mozgu BH 4 - tetrahidrobiopterin BZD benzodiazepin CA kateholamini cdnk komplementarna DNK CNS centralni nervni sistem CORT kortikosteron COMT katehol-o-metiltransferaza
CRE camp responsivni element CREB CRE vezujući element CREM - modulatorni element zavisan od camp CRH kortikotropin-oslobađajući hormon NBS - nepredvidivi blagi stres DA - dopamin DAT dopaminski transporter DHMA 3,4-dihidroksimandelična kiselina DHPG dihidroksifenilglikol DBH dopamin- beta-hidroksilaza DOPA dihidroksifenilalanin DOPAC dihidroksifenilacetat EDTA etilen-diamin-tetrasirćetna kiselina EGTA etilen-glikol-tetrakarboksilna kiselina EMT ekstra neneuronski monoaminski transporter EPM test izdignutog plus lavirinta SR sarkoplazmatični retikulum ERE - estrogen responsivni element ERK signalna ekstracelularna regulatorna protein kinaza FST test prinudnog plivanja GABA gama-aminobuterna kiselina GAS - generalni adaptacioni sindrom GC glukokortikoid GR glukokortikoidni receptor GRE glukokortikoid responsivni element
GTP guanozin-tri-fosfat H1 histaminski receptor 1 HHA - hipotalamo-hipofizna-adrenokortikalni sistem HR srčana frekvencija HRV - varijabilnosti u srčanoj frekvenciji ICA - unutarsrčane adrenergične ćelije ICER - inducibilni camp represorni element IMO stres imobilizacije irnk informativna nukleinska kiselina JNK c-jun NH 2 -terminalna kinaza LC locus ceruleus L-DOPA L-dihidroksifenilalanin MAO monoamino oksidaza MAOI inhibitori monoamino oksidaze MAP mitogen aktivirajuća protein kinaza MC-2 - melanokortikotropni receptor MHPG 3-metoksi-4-hidroksifenil glikol NA noradrenalin NET noradrenalinski transporter NGF faktor rasta nerva NMT - N-metiltransferaza NPY neuropeptid Y NRE - nikotin responsivni element NRI - antidepresivi koji inhibiraju preuzimanje noradrenalina PCR lančana reakcija polimeraze
PKA protein kinaza A PKC protein kinaza C POMC proopiomelanokortin PNMT feniletanolamin N-metiltransferaza PTSD - posttraumatski stresni poremećaj PVN paraventrikularni nukleus RNK ribonukleinska kiselina RD - raphe dorsalis RM - raphe medianus RP rafa palidus SA sinoatrijalni čvor SAM simpato-adrenomedularni sistem Sam S-adenozil-metionin SAMe - 3 H S-adenozil-L-( 3 H-metil)-metionin SNS simpatoneuralni sistem SSRI - antidepresivi koji inhibiraju preuzimanje serotonina TCA triciklični antidepresivi TH tirozin hidroksilaza TPH triptofan hidroksilaza U1 uptake1, neuronsko pruzimanje U2 uptake2, neneuronsko pruzimanje VMA vanil-mandelična kiselina VMAT vezikularni monoaminski transporter VIP vazoaktivni intestinalni polipeptid
ZAHVALNICA Pojedinim osoba dugujem naročitu zahvalnost: Iskreno se zahvaljujem svom mentoru dr. Slađani Dronjak-Čučaković, višem naučnom saradniku Instituta Vinča, na podršci, posvećenosti našem zajedničkom radu i stalnoj spremnosti da mi pomogne i prenese svoje znanje. Posebnu zahvalnost dugujem članovima Komisije dr. Gordani Cvijić i dr. Jeleni Đorđević, profesorima Biološkog fakulteta Univerziteta u Beogradu, na konstruktivnim kritikama i smernicama tokom pisanja ove disertacije. Želela bih da se zahvalim i dr. Ljubici Gavrilović za stručnu pomoć i savete koje mi je davala o eksperimenatalnim tehnikama. Zahvaljujem se Mirjani Šućur koja je doprinela da radna atmosfera u laboratoriji bude lepša i zanimljivija. Na kraju, želela bih da se zahvalim prijateljima i porodici na njihovom ohrabrenju i strpljenju koje su mi pružali sve ovo vreme. Ove stranice posvećujem svom ocu.
I UVOD I UVOD 1
I UVOD 1.1 DEFINICIJA STRESA Koncept stresa je predmet istraživanja brojnih studija, u kojima su korišćeni različiti pristupi u cilju što boljeg objašnjenja ovog fenomena. Literaturni podaci često povezuju stres sa psihološkim terminima kao što su patnja, emotivnost i anksioznost. Pošto je većina ovih pojmova subjektivne prirode koji se ne mogu direktno izmeriti, istraživači su morali da povežu takvo stanje sa merljivim fiziološkim, endokrinološkim i bihevioralnim promenama. Cannon je prvi predložio termin homeostaze da bi opisao koordinisane fiziološke procese koji održavaju uravnoteženo stanje u organizmu (Cannon, 1929). Međutim nije koristio izraz stres. Hans Selye je prvi uveo i popularizovao stres kao medicinski i naučni termin. Primetio je da je fiziološki proces akomodacije na stres sličan kod svih organizama. Definisao je stres kao nespecifičan, univerzalni odgovor, sastavljen iz 3 faze, koji je nazvao generalni adaptacioni sindrom (GAS). Kada su opasnost ili stresor identifikovani, prepoznati, organizam se alarmira. Oslobađa se adrenalin i razvija se fight-or-flight (bori se ili beži) odgovor. Ako je stresor prisutan više sati neophodno je da se organizam prilagodi na tu situaciju. Reakcija uzbune iščezava i funkcije brojnih sistema u organizmu se vraćaju u ravnotežu. Glukokortikoidi su tada dominantani hormoni. Poslednju fazu karakteriše iscrpljenost, kada normalne funkcije organizma više ne mogu da se održe. Dolazi do otkazivanja jednog ili više organskih sistema. Javlja se ponovo 2
I UVOD reakcija alarma, ali je sada ireverzibilna i fatalna. Hronično izlaganje stresorima ima patofiziološke posledice u vidu hipertrofije nadbubrežne žlezde, smanjenja timusa i pojave ulceracija u gastrointestinalnom traktu (Selye, 1936). Ramos i Mormede su opisali stres detaljnije. Po njima je stres odgovor organizma na stimulus iz spoljne sredine - stresor, koji remeti unutrašnju ravnotežu (homeostazu) organizma (Ramos i Mormede, 1998). Stresori se dele u četiri osnovne kategorije: 1) fizičke stresore kao što je bol, buka, toplota 2) psihološke stresore koji odražavaju stečen odgovor na prethodna neprijatna iskustva (strah, nervoza) 3) socijalni stresori koji odražavaju poremećenu interakciju među jedinkama 4) stresori koji remete kardiovaskularnu i metabolitičku homeostazu (krvarenje, vežbanje, toplota) (Pacak i saradnici, 1998). U odgovoru na stres različiti regulatorni sistemi su uključeni da bi omogućili organizmu da se prilagodi na unutrašnje i spoljne izazove. Adekvatan odgovor na stres je neophodan u cilju očuvanja homeostaze organizma. On ne zavisi samo od intenziteta stresora već i od nasleđenih sposobnosti ovih sistema da ostvare i održe adekvatan nivo i trajanje odgovora na stresore. Neadekvatan, prejak ili prekratak odgovor je jako štetan za organizam. Čak i jednoćelijski organizami su izloženi spoljnom izazovu u vidu promene u temperaturi i kiselosti sredine. Većina stresora sa kojima se životinja susreće odnosi se na nalaženje hrane, postojanje predatora i socijalne hijerarhije. Kod ljudi reč je više o mentalnim brigama, nego o fizičkim izazovima. Tako odgovor na pritisak u društvu, prevelik broj informacija, prevelike kulturne promene sličan je odgovoru na fizički stres ili opasnost. 3
I UVOD Nisu svi stresovi nepovoljni, da se poslužimo terminologijom Hansa Selyea, mučni. Neki oblici stresa su neverovatno stimulativni. Selye je uveo termin eustres da bi opisao konstruktivan i ugodan stres, koji pozitivno utiče na emotivni i intelektualni razvoj jedinke (Selye, 1936; Selye i saradnici, 1950), Sportisti ili padobranci, izlažu se stresu stres je nerazdvojni deo pobedničkog zanosa, doživljavanja jednog od temeljnih životnih osećaja. To je ona vrsta kratkotrajnih stresora koje smo, zahvaljujući evoluciji u stanju da podnesemo. Pokazano je da takav stres može imati i zaštitnu ulogu, npr. protiv demijelinizacije oligodendrita do kojih dolazi imunološkim oštećenjem kod multiple skleroze (Lees i Cross, 2007). Distres ili negativan stres je stanje dugotrajne napetosti usled koje se javljaju fiziološke, psihosomatske reakcije čija je posledica pogoršavanje zdravstvenog stanja, osećaj frustracije, mentalna i fizička iscrpljenost. Predstavlja način na koji mentalno, fizički i emocionalno reagujemo na različita stanja, promene i zahteve u našem životu. Distres je termin za stres koji ima štetan ili neprijatan učinak: klonulost, iznurenost, iscrpljenost, opasnost, bol, jad (Selye, 1976a; Selye, 1976b; Van de Kar i Blair, 1999). Neuroendokrini sistem igra važnu ulogu u prilagođavanju organizma na stres. U normalnim, povoljnim okolnostima ima ulogu u rastu, razvoju i razmnožavanju. Međutim, svaki dovoljno jak stresor koji predstavlja pretnju u održanju homeostaze, stavlja organizam u stanje stesa i aktivira nespecifičan, adaptivan odgovor koji omogućava individui da preživi stresno okruženje, dok se ne pojave povoljnije okolnosti (Van de Kar i Blair, 1999, McEwen, 2000a). Dva sistema su uključena u odgovoru na stres: kortikotropin oslobađajući hormon (CRH)/arginin-vazopresin u hipotalamusu i neuroni autonomnog nervnog sistema u lokus ceruleus-u (LC). Oni regulišu perifernu aktivnost hipotalamo- 4
I UVOD hipofizno-adrenokortikalnog sistema (HHA) i simpato-adrenomedularnog sistema (SAM) oslobađajući kortikosteroide i kateholamine u cirkulaciju. Kateholamini vrlo brzo stižu do ciljnih organa postižući efekat za svega nekoliko sekundi/minuta. Za razliku od njih kortikosteroidi deluju na receptore koji su smešteni u nukleusu ćelije i utiču na transkripciju brojnih gena. To zahteva vreme, pa je potrebno mnogo duže da bi se uočili efekti aktivacije HPA ose. Slika 1. Fight-or-Flight odgovor organizma na stres. Aktivacija SAM ubrzava srčani rad i respiraciju, povećava krvni pritisak, mišićni potencijal (Koh i saradnici, 2005). Krvotok je preusmeren prevashodno u mozak i skeletno-mišićni sistem. Rast i reprodukcija su tada suprimirani radi očuvanja energije. Pod dejstvom glukokortikoida pojačan je katabolizam radi stvaranja energije u cilju povišenja nivoa glukoze neophodne mozgu, srcu i mišićima. Ova fizička priprema je adekvatna u slučaju fight-or-flight odgovora na stres, npr. kada miš ugleda lisicu omogućena mu je dodatna energija da bi pobegao. 5
I UVOD Iako je fizička spremnost bitan deo tipičnog odgovora na stres, uporedo dolazi i do kognitivnih promena. Koncentracija, pažnja, memorija su poboljšani tokom blagog stresa (De Kloet i Holsboer, 2005). Ove karakteristike omogućavaju jedinki da bude svesna mogućih opasnosti i da razmisli kako da izbegne pretnju. Brzo rešavanje problema je bitno u preživljavanju. Poboljšanje memorije omogućava da organizam koristi stečena iskustva i u budućnosti i tako uči iz grešaka (Korte i saradnici, 2005). Emotivni ženski filmovi podižu više nivoe kortizola nego gledanje nekih drugih filmova. Nejtek (2002) je pokazala da se skok kortizola javlja tek pošto posmatrač ima priliku da razmisli o filmu, a ne tokom filma. Naime, emotivne slike dovode do aktivacije limbičkog sistema, odakle kreću brojne projekcije u druge delove mozga, koji aktiviraju stresni sistem. Ovo nam ukazuje na postojanje emotivne komponente pri percepciji stresa. Ekscesivna ili konstantna aktivacija sistema uključenih u odgovoru na stres može ostaviti trajne efekte na njeno funkcionisanje. Stresori tada nemaju prolazan, već trajan efekat na formiranje odgovora HPA ose na stres i po prestanku dejstva (Habib i saradnici, 2001; Charmandari i saradnici, 2005). Dolazi do oštećenja koja se manifestuju u vidu bolesti kao što je dijabetes, kardiovaskularna oboljenja i kancer. Stres menja aktivnost u moždanim strukturama, pa se javlja i predispozicija za brojna mentalna oboljenja, kao što su anksioznost i depresija (Maughan i McCarthy, 1997). 1.2. SIMPATO-ADRENOMEDULARNI SISTEM Zahvaljujući radu Walter B. Cannon-a početkom ovog veka, simpatički nervi i srž nadbubrežne žlezde su prepoznati kao ključne komponente fiziološkog odgovora životinja u održanju unutrašnje homeostaze tokom akutog izlaganja brojnim 6
I UVOD stresorima (Cannon, 1929). Odgovor simpato-adrenalnomedularnog sistema (SAM) je pod kontrolom nervnih impulsa iz preganglijskih holinergičnih neurona lociranih u intermediolateralnoj sivoj masi torakalnih i gornjih lumbalnih segmenata kičmene moždine. Aktivnost ovih neurona je regulisana vlaknima koja se descedentno pružaju iz produžene moždine i moždanog stabla, kao i lokalnom spinalnom inervacijom. Cerebralni korteks, limbički sistem, hipotalamus, i moždano stablo regulišu aktivnost ovog puta. Akutna aktivacija SAM sistema dovodi do ubrzanja respiracije, povećanja broja otkucaja srca, povećanja koncentracije glukoze u krvi i smanjenja peristaltike creva. Međutim, u zavisnosti od vrste i intenziteta akutnog stresora postoji razlika u intezitetu odgovora ovog sistema koja se detektuje određivanjem smanjenjem koncentracije kateholamina (CA) u tkivima, povećanjem u cirkulaciji, pojačanom ekskrecijom u urinu i njihovim oslobađanjem iz kateholaminskih neurona u raznim delovima mozga. Čak i manje smetnje pri rukovanju sa životinjom ili prenos u novu sredinu može dovesti do vrlo značajanog povećanja nivoa adrenalina (A) i noradrenalina (NA) u krvi (Kvetnansky i saradnici, 1978). Mnogi stresori brzo povećavaju ne samo nivoa CA u plazmi, već i njihove prekursore i metabolite. Tokom prvih 20 minuta imobilizacije (IMO) nivo A u plazmi dostiže vrednost oko 40 puta veću nego kod kontrolnih pacova, a potom se smanjuje na trećinu od maksimalne vrednosti. Nivo NA u plazmi je povećan oko 6 puta tokom IMO (Kvetnansky i saradnici, 1978). To nam pokazuje da stres ne samo da brzo dovodi do povećanja u nivoima CA u plazmi, već brzo povećava i sintezu, otpuštanje i razgradnju CA. Regulacija oslobađanja A i NA zavisi od vrste stresora. Hipoglikemija, glukopenija, IMO i emocionalni stresori uglavnom aktiviraju oslobađanje A, dok hladnoća ili bol uglavnom stimulišu 7
I UVOD oslobađanje NA iz simpatičkih krajeva (Kvetnansky i saradnici, 1998, Pacak i saradnici, 1998). 1.2.1. BIOSINTEZA KATEHOLAMINA Aktivnost enzima koji učestvuju u sintezi CA može biti vrlo visoka tokom dugotrajnog izlaganja stresu dovodeći do značajnog povećanja biosinteze kateholamina (Kvetnansky i saradnici, 1971a; Kvetnansky i saradnici, 1971b; Thoenen, 1970). Limitirajući enzim u sintezi kateholamina je tirozin hidroksilaza (TH), solubilni enzim nađen u svim ćelijama koje sintetišu kateholamine (Nagatsu, 1995). Kateholamini se sintetišu iz aminokiseline L-tirozina. Postoje dva osnovna izvora tirozina, hrana i hidroksilacija aminokiseline fenilalanina u jetri. U nadbubrežnoj žlezdi je prvi put dokazano prevođenje L-tirozina u NA (Blaschko, 1939), dok je kasnije uočeno i u mozgu, simpatičkoj gangliji i u svim tkivima inervisanim simpatičkim vlaknima. Zato je ovaj enzim dobar marker ćelija koje produkuju CA u centralnom i perifernom nervnom sistemu. Po hemijskoj strukturi TH je tirozin 3-monooksigenaza. Koristi molekul kiseonika i biopterin (BH 4 ) kao kofaktor. Katalizuje dodavanje hidroksilne grupe na meta poziciju tirozina formirajući 3,4-dihidroksi-L-fenilalanin (L- DOPA). Takođe, prevodi fenilalanin u tirozin kao alternativni sintetski put. Kofaktor, biopterin, može postići saturirajuću koncentraciju u neuronima koji sadrže kateholamine i tako ima važnu ulogu u regulaciji sinteze noradrenalina (Nagatsu i Ichinose, 1999). Analog tirozinu, npr. α-metil-para-tirozin (AMPT), je kompetitivni inhibitor TH. DOPA se pretvara u dopamin (DA) dejstvom nespecifičnog enzima, aromatične L-aminokiselinske dekarboksilaze (AAAD). Ovaj enzim je u formi 8
I UVOD solubilnog homodimera. Aktivnost AAAD zavisi od nivoa njegovog kofaktor, piridoksal 5'-fosfata (vitamina B6) (Moore i saradnici, 1996). AAAD učestvuje i u dekarboksilaciji 5-hidroksitriptofana, prekursora serotonina. Široko je rasprostranjen i u kateholaminergičkim i serotonergičkim neuronima, ali i u neneuralnom tkivu, kao što su bubrezi i krvni sudovi. Slika 2. Put biosinteze kateholamina Hagen i Welch (1956) su pokazali da se u mozgu, simpatičkim ganglijama i nadbubrežnim žlezdama može transformisati DA u NA hidroksilacijom, ali je tek 1965. enzim odgovoran za ovaj proces izolovan iz goveđe nadbubrežne žlezde (Friedman i Kaufman, 1965). Dopamin se preuzima iz citoplazme u vezikule i pretvara u NA aktivnošću dopamin-β-hidroksilaze (DBH). Ovaj enzim je pronađen u 9
I UVOD solubilnoj i membranski vezanoj formi unutar vezikula. Obe forme su kodirane istom irnk (Feng i saradnici, 1992; Lewis i Asnani, 1992). Za reakciju neophodni su mu askorbinska kiselina i molekul kiseonika. U formi je homotetramera koji u strukturi sadrži Cu 2+ koji je uključen u transfer elektrona u reakciji. Bakarni helati, kao što je dietilditiokarbamat, su potentni inhibitori ovog enzima. Enzim je koncentrisan u vezikulama u kojima se pakuju kateholamini. Pri tome se oslobađa zajedno sa kateholaminima zbog čega je detektovan i u plazmi i u cerebrospinalnoj tečnosti (Weinshilboum i Axelrod, 1971; Weinshilboum i saradnici, 1971). Solubilni enzim feniletanolamin N-metiltransferaza (PNMT) pretvara NA u A. Pri tome koristi S-Adenozil-metionin kao kofaktor. PNMT se aktivira pod dejstvom glukokortikoida. Uglavnom je smešten u srži nadbubrega, međutim, organi inervisani simpatičkim vlaknima, kao i neka područja mozga takođe su u mogućnosti da sintetišu male količine A (Diaz Borges i saradnici, 1978). Posebne populacije hromafinih ćelija sadrže NA i A kao konačni proizvod biosinteze CA (Winkler i saradnici, 1986). PNMT je pronađen i kod nekih neneuronskih ćelija pluća, srca, kože (Huang i saradnici, 2005; Kennedy i saradnici, 1990; Kennedy i saradnici, 1993; Kvetnansky i saradnici, 2004, Pullar i saradnici, 2006, Ziegler i sardnici, 1998). U srcu i plućima je pronađena i nespecifična forma N-metiltransferaze (NMT) (Kennedy i saradnici, 1990). 1.2.2. OTPUŠTANJE KATEHOLAMINA Proces otpuštanja CA je sličan u nadbubrežnim žlezdama i u simpatičkim nervnim završecima. Acetilholin otpušten iz simpatičkog preganglijskog nervnog završetka vezuje se za nikotinske holinergičke receptore dovodeći do depolarizacije ćelijske membrane, što povećava propustljivost membrane za natrijum. To pokreće 10
I UVOD niz događaja koji dovode do povećanja ulaska kalcijuma neophodnog za proces ugrađivanja vezikula koje sadrže CA u membranu hromafine ćelije ili simpatičkog nervnog završetka. Nekoliko proteina igraju važnu ulogu u tom procesu, npr., sinapsin, sineksin, sinaptofisin, sintaksin i drugi membranski proteini (Pollard i saradnici, 1998). Procesom egzocitoze vezikule otpuštaju svoj sadržaj CA zajedno s hromograninima, ostalim neuropeptidima, ATP-om i delom slobodne DBH (Golstein, 2001; Jahn i Sudhof, 1994; Nagatsu i Stjarne, 1998; Yin i Tully, 1996). Tačan mehanizam Ca 2+ iniciranog oslobađanja, međutim, nije jasan. Adrenomedularne ćelije luče kateholamine direktno u krvotok. Simpatički nervni završeci takođe mogu otpustiti NA i kalcijum nezavisnim, neegzocitotskim mehanizmom, npr., obrnutim transportom preko neuralnog transportera (Kurz i saradnici, 1996; Schomig i saradnici, 1987; Stjarne, 1989). Međutim, taj proces se javlja u in vivo uslovima uglavnom u posebnim okolnostima kao što su npr. za vreme ishemije (Kurz i saradnici, 1996, Schomig i saradnici, 1987). Kateholamini u vezikulama simpatičkog vlakna mogu i difundovati na okolna tkiva zbog razlike u volumenu (Sykova, 2004). Nakon oslobađanja, CA koji izbegnu ponovno preuzimanje difunduju u cirkulaciju. U plazmi se kateholamini brzo razgrađuju. Poluvreme razgradnje je oko 2,5 min (Esler i saradnici, 1979). U mirovanju, nizak nivo CA se ispušta u krv iz nadbubrežne žlezde i simpatičkih krajeva. Tokom stresne stimulacije, međutim, velika količina A ( 95%) i značajna količina NA (i do 30% od ukupnog NA u cirkulaciji) se 11
I UVOD oslobodi iz nadbubrežne žlezde. Preostalih 70% NA poreklom je iz simpatičkih nerava (Kvetnansky i saradnici, 1979). 1.2.3. INAKTIVACIJA KATEHOLAMINA Simpatički nervni završeci preuzimaju CA iz ekstracelularnog prostora procesom koji se naziva uptake 1 (Eisenhofer, 2001), dok neneuronalna tkiva vrše preuzimanje uptake 2 procesom (Iversen, 1965). Uptake 1 (U1) ima ulogu da lokalno otpušten NA ili A u ekstracelularni prostor preuzme, magacionira unutar neurona radi ponovnog korišćenja. Za ovaj proces je neophodna energija. Transporter može preneti CA nasuprot gradijentu koncentracije. Ovaj unos ima manje važnu ulogu u inaktivaciji cirkulišućeg A. Oko 90% oslobođenog NA se ponovo preuzima od strane neurona (Eisenhofer i saradnici, 1990; Eisenhofer i saradnici, 1991a). Preuzimanje je posredovano transporterom noradrenalina (NET) i dopamina (DAT). Transport putem NET i DAT zavisi od koncentracije Na + i temperature, pokazujući pri tom visoki afinitet, ali relativno niski kapacitet za CA. Stopa ponovnog preuzimanja NA raste paralelno s povećanjem NA oslobađanja (Eisenhofer i saradnici, 1990; Eisenhofer i saradnici, 1991a). NA je od strane NET translocira dvostruko efikasnije nego A. Ova dva transportera pokazuju blisku homologiju u strukturi. Poseduju 12 transmembranskih domena, nekoliko slično konfigurisanih intracelularnih i ekstracelularnih petlji ili regija s odgovarajućim mestima za fosforilaciju i glikozilaciju (Bonisch i Eiden, 1998; Eisenhofer, 2001). Dok se DAT nalazi uglavnom u dopaminergičkim neuronima u mozgu, NET je lociran i u centralnim i perifernim noradrenergičkim neuronima (Eisenhofer, 2001). Uptake NA od strane NET se, takođe, odvija i u hromafinim ćelijama nadbubrežnih žlezda, u nekim neneuronalim ćelijama pluća, placente, srca itd. 12
I UVOD Ekstraneuralni uptake 2 (U2) je proces aktivnog transporta u neneuronskim ćelijama. Ekstraneuralni monoaminski transporter U2 (EMT), je prvi opisao Iversen (1965), Ima malu stereospecifičnost i nizak afinitet za CA. U2 favorizuje A u odnosu na NA, Na + i Cl - nezavisnim procesom (Eisenhofer, 2001; Goldstein, 2001). U2 je osetljiv na inhibiciju O-metil metabolitima kateholamina kao što su normetanefrin, metanefrin (Bonish, 1980), glukokortikoidima (Trendelenburg, 1988) i odgovoran je za formiranje CA metabolita u jetri, bubrezima i plućima. 1.2.4. DEGRADACIJA KATEHOLAMINA Kateholamini se nakon preuzimanja vraćaju u vezikule ili se podvrgavaju hemijskoj degradaciji. Oksidativnu deaminaciju vrši monoaminooksidaza (MAO) u citoplazmi neurona, dok katehol-o-metiltransferaza (COMT) u neneuronskim ćelijama vrši 3-O-metilaciju. Kateholamini se dezaktiviraju i konjugacijom sa sulfatima i glukuronidima. Otpušteni kateholamini iz neurona se inaktiviraju preuzimanjem U1 transportom u kombinaciji s enzimskom razgradnjom MAO, flavoproteinom koji se nalazi na spoljnoj mitohondrijalnoj membrani presinaptičnkog neurona. On vrši deaminaciju kateholamina u njihove aldehide, koji dalje mogu enzimom aldehidnom dehidrogenazom biti prevedeni u kiseline ili aldehidnom reduktazom u glikole (Blaschko i saradnici, 1937). 13
I UVOD Zbog svoje intracelularne lokacije ima stratešku ulogu u razgradnji slobodnih kateholamina u nervnom završetku koji nisu zaštićeni vezikularnom membranom. Kateholamini se u cirkulaciji inaktiviraju U2 transportom i enzimskom razgradnjom od strane COMT, koji se nalazi u efektornoj ćeliji. COMT je nađen u skoro svim tkivima, uključujući eritrocite. Vrši razgradnju ekstracelularnih kateholamina i blisko je vezan za adrenergični receptor (Eisenfeld i saradnici, 1967). Enzim u prisustvu Mg 2+ vrši transfer metil grupe sa kosubstrata S-adenozilmetionina na 3-hidroksi grupu kateholaminskog prstena. Ovaj enzim metiluje svaki katehol prsten bez obzira na bočne lance. Smanjena aktivnost COMT u nadbubrežnim žlezdama kod pacova koji su izloženi dugotrajnoj imobilizaciji, ukazuju na ulogu ovog enzima u povećanju sadržaja kateholamina u žlezdama tokom hroničnog stresa (Kvetnansky i saradnici, 1975) 1.2.5. TRANSKRIPCIONI MEHANIZMI KONTROLE NIVOA irnk ZA ENZIME KOJI UČESTVUJU U SINTEZI KATEHOLAMINA U STRESU Prvi dokazi o povećavaju aktivnosti TH, DBH i PNMT enzima posle hroničnog izlaganja imobilizaciji i hladnoći uočeni su sedamdesetih godina (Kvetnansky i 14
I UVOD saradnici, 1970; Kvetnansky i saradnici, 1971a; Chuang i Costa, 1974), a nakon 15 godina i povećanje ekspresije irnk za te enzime (Baruchin i saradnici, 1990). Ekspresija ovih enzima je regulisana kompleksnim mehanizmima koji uključuju više promotorskih mesta koji interaguju sa različitim transkripcionim faktorima. Izlaganjem pacova hladnoći povećava se nivo TH irnk, dostižući maksimalne vrednosti između 3. i 6. sata i ostaje konstantno povišen do kraja izlaganja stresu. Iako je transkripcija povećana, maksimalan nivo TH proteina se detektuje tek posle 3 dana konstantne izloženosti hladnoći, a maksimalna enzimska aktivnost 6 do 7 dana (Baruchin i saradnici, 1990; Miner i saradnici, 1992). TH protein se aktivira fosforilacijom na poziciji Ser8, Ser19, Ser31, Ser40 dejstvom protein kinaza A, C i Ca 2+ / kalmodulin zavisne protein kinaze II (Dunkley i saradnici, 2004). To je kratkotrajna regulacija. Dugotrajna aktivacija se postiže dejstvom na nivou transkripcije, alternativnom obradom irnk, povećanom stabilnošću irnk i translacijom. Sabban je sa saradnicima (1995) potvrdila korišćenjem transkripcionog inhibitora aktinomicina D da se porast ekspresije TH nakon jedne imobilizacije postiže povećanjem stepena transkripcije. Potrebno je svega 30 minuta IMO da bi TH dosegla maksimalni nivo. Hronično izlaganje ovom stresu uzrokuje da ove vrednosti ostanu i nakon 24h (Nankova i saradnici, 1994). Dakle regulacija ekspresije je drugačija u odgovoru na akutni i hronični stres, a jedan od uzroka je porast u aktivnosti transkripcije. Dijagram proksimalnog promotorskog regiona gena za TH enzim kod pacova je prikazana na Slici 3. Mutacija u ovom promotorskom regionu sprečava ekspresiju ovog gena u kateholaminergičkim neuronima odraslih transgenih životinja (Trocme i saradnici, 1998). Tako, na poziciji -45 lociran je camp responsivni element (engl. CRE - camp response element), dok je AP1 element na - 205 poziciji. Ekspresija ovog gena menja se u odgovoru na camp, hipoksiju, i 15
I UVOD promenu u nivou intracelularnog kalcijuma (Hiremagalur i saradnici, 1993; Kim i saradnici, 1993; Lewis-Tuffin i saradnici, 2004; Nagamoto-Combs i saradnici, 1997). Za CRE region može se vezati CREB (cyclic adenosine monophosphate response element binding protein) kao homodimer. Stepen fosforilacije CREB-a naglo raste kao odgovor na stres, što utiče na funkciju ovog transkripcionog elementa. Takođe, detektovan je estrogen zavisni element (ERE) (Maharjan i saradnici, 2005) koji može imati ulogu u razlikama između polova u nivou TH transkripcije tokom stresa. TH promotor sadrži funkcionalni Sp1/Egr1 region (Papanikolaou i Sabban, 1999; Yang i saradnici, 1998). Porast u ekspresiji Egr1 je dovoljna da se aktivira transkripcija TH gena u ćelijskoj kulturi (Papanikolaou i Sabban, 2000). Ovaj region je takođe uključen u odgovoru na stres. Transkripcija TH gena regulisana je i glukokortikoidima (Fossom i saradnici, 1992), Glukokortikoid zavisni element do sada samo je identifikovan kod miša (Hagerty i saradnici, 2001) i u promotorskom regionu pacova (Rani i saradnici, 2009). Transkripcija TH i DBH gena se uporedo povećava vezivanjem acetil holina na nikotinske i muskarinske receptore povećavajući nivo sekundarnog glasnika camp. Praćenjem nivoa irnk za DBH tokom izlaganja IMO uočeno je da je neophodno minimum dva ponovljena izlaganja stresu da bi se postigle maksimalne vrednosti (McMahon i saradnici, 1992). Pokazano je da se kod knock-out miševa, kojima je uklonjen gen za c-fos ne povećava ekspresija DBH gena u mozgu (Sabban i saradnici, 1996). Ovaj faktor pripada ranim regulatorima, za koji je pokazano da mu se irnk povećava samo 7 minuta od početka delovanja stresa IMO,a posle 1 h dostiže maksimalni nivo. Još jedan od faktora koji je pokazan kao značajan u regulaciji ekspresije DBH gena je i c-jun čija se aktivnost povećava 5 minuta od početka delovanja IMO (Nankova i Sabban, 1999). 16
I UVOD Za sada iz nepoznatih razloga je uočeno da dugotrajnim dejstvom antipsihotika dolazi do promena u nivou irnk za AAAD u mozgu, ali ne i irnk za TH (Cumming i saradnici, 1995). Ovo je izolovan slučaj, jer nasuprot povećanju aktivnosti TH i DBH u superiornoj cervikalnoj gangliji pacova nakon stimulacije, AAAD se ne menja (Chalazonitis i saradnici, 1980). Slično, ne uočava se značajna promena u aktivnosti ovog enzima ni nakon stimulacije ganglije rezerpinom (Hendry, 1976). Nije detektovana promena u ekspresiji ovog gena tokom stresa. Za sada nije utvrđen fiziološki značaj ove pojave. PNMT enzim se prvi aktivira tokom stresa. Njegova irnk dostiže maksimalni nivo 5 minuta od početka IMO. Glukokortikoidi imaju važnu ulogu u regulaciji ekspresije gena za ovaj enzim (Wong i saradnici, 1992). Glukokortikoid responsivni element (GRE) je utvrđen na -533 poziciji i na još dve preklapajuće pozicije upstream u promotorskom regionu gena za PNMT kod pacova (Ross i saradnici, 1990; Tai i saradnici, 2002). Posttranskripciono GC regulišu nivo kofaktora S- adenozilmetionina (Jeong, 2000; Wong, 2002) PNMT promotor takođe sadrži nekoliko Sp1/Egr1 i AP2 regulatornih elemenata koji sinergistički interaguju sa dva bliska GRE elementa (Tai i saradnici, 2002; Wong i saradnici, 1998). Sp1/Egr1 region je važan za regulaciju PNMT ekspresije od strane protein kinaze A i protein kinaze C (Tai i saradnici, 2007; Tai i saradnici, 2003;Wong i Tank, 2007). Nedavno je otkriven dodatni element nikotin responsivni element (NRE) na PNMT genu koji je odgovoran za stimulaciju transkripcije ovog gena nikotinom (Evinger i saradnici, 2005). Uočeno je da transkripcija nije isto regulisana u svim tkivima. Tako je primećeno da se imobilizacijom podiže ekspresija TH i u srži nadbubrežne žlezde i u stelatnoj gangliji. IMO, stres hladnoće, hipoksija i insulin sporije povećavaju ekspresiju TH i DBH gena u stelatnoj gangliji u poređenju sa srži nadbubrežne 17
I UVOD žlezde. Konstantno osvetljenje u trajanju od 20 dana smanjuje nivo irnk za TH i DBH u cervikalnoj gangliji, ali ih povećava u meduli (Gallara i saradnici, 2004). Slika 3. Dijagram regulatornih elementa na promotorima gena za TH, DBH, i PNMT Aplikacija ACTH povećava nivo irnk za ove enzime u stelatnoj gangliji ali ne i u meduli (Nankova i saradnici, 1996). Različita kombinacija pozitivnih i negativnih transkripcionih faktora su odgovorni za tkivnu specifičnost regulacije ovih enzima (Trocme i saradnici, 2001). Pokazano je npr., da se za CRE region na promotoru gena za TH vezuju drugačiji transkripcioni faktori u meduli i u gangliji. Tretman rezerpinom povećava ekspresiju i sposobnost vezivanja inducibilnog camp represornog elementa (engl. ICER - Inducible CAMP early repressor) u adrenalnoj meduli, dok u stelatnoj gangliji povećava vezivanje modulatornog elementa zavisnog od camp (engl. CREM - camp-responsive element modulator) (Trocme i saradnici, 2001). 18
I UVOD Takođe stepen porasta ekspresije zavisi i od vrste stresora. IMO u trajanju od 2h značajno povećava irnk za TH u locus ceruleusu, pri čemu se maksimalne vrednosti dostižu 3 do 6 h posle izlaganja stresu. Udvostručene vrednosti su detektovane 4 dana posle hroničnog izlaganja hladnoći, dok aplikacija insulina nema efekta. Imobilizacija podiže nivo irnk za TH u meduli čak i kod životinja kojima je denervisana žlezda što pokazuje da je mehanizam tokom ovog stresa daleko kompleksniji (Richard i saradnici, 1988; Rusnak i saradnici, 1998). 1.3. HIPOTALAMO-HIPOFIZNO-ADRENOKORTIKALNI SISTEM Još je Seley fokusirao svoju pažnju na hipotalamo-hipofizno-adrenokortikalni sistem (HHA) kao ključni efektorni sistem u stanju stresa. Moždana regija koja je uključena u kontrolu HHA su parvocelularni neuroni, jedara srednjeg i dorzalnog dela hipotalamusa. Morfološki i funkcionalno je podeljen na: magnocelularna, srednja parvocelularna, submagnocelularna regija i dorzalnu kapu. Magnocelularni region poseduje neurone koji sintetišu arginin-vazopresin (AVP) i oksitocin. Oni pružaju svoje aksone ka neurohipofizi i uključeni su u kontrolu važnih fizioloških funkcija. Dorzalna kapa i submagnocelularni region su uključeni u kontrolu vegetativnih funkcija preko projekcija ka moždanom stablu i spinalnim jedrima, vršeći tako kontrolu simpatičke i parasimpatičke aktivnosti. 19
I UVOD Medijalni parvocelularni neuroni pružaju aksone do hipofiznog portnog sistema gde u primarne kapilare oslobađaju hipofiziotropne hormone. Ovako oslobođeni hipotalamični hormone deluju na kortikotropne ćelije i učestvuju u kontroli sinteze i oslobađanja adrenokortikotropnog hormona (ACTH). Saffran i saradnici (1955) su regulatora oslobađanja ACTH prvi nazvali kortikotropin-oslobađajući faktor (CRF), koji je okarakterisan kao kortikotropin-oslobađajući hormon (CRH). CRH je protein sa 41. aminokiselinom koju je prvi izolovao Vale 1981. godine (Jones i Gillham, 1988). Ovaj hormon i njegovi receptori su nađeni u brojnim delovima mozga: limbičkom sistemu, centralnom noradrenergičkom sistemu locus ceruleusa i u kičmenoj moždini (Engler i saradnici, 1999; Nomura i saradnici, 2003). Centralna administracija CRH izaziva brojne fiziološke i bihevioralne promene koje se javljaju tokom odgovora na stres (Amico i saradnici, 2004, Uvnas- Moberg, 1998). Arginin-vasopresin (AVP) je peptidni produkt magnocelularnih neurona neurohipofize. Značajan je jer sinergistički sa CRH stimuliše oslobađanje ACTH (Jones i Gillham, 1988). Pokazano je da se, nakon adrenalektomije i kod hroničnog izlaganja jakim stresorima, povećava broj neurona koji koeksprimiraju CRH i AVP (Aguilera i Rabadan-Diehl, 2000). CRH deluje na kortikotropne ćelije vezujući se za CRH-1 receptor. CRH utiče na transkripciju gena za prekursor proopiomelanokortin (POMC) i sintezu POMC srodnih proteina (Levin i saradnici, 1989; Scott i Dinan, 1998). S druge strane, AVP se vezuje za V1b 20
I UVOD receptore koji su kuplovani sa fosfolipazom C i stimuliše oslobađanje ACTH (Schlosser i saradnici, 1994). Amplituda oslobađanja CRH i AVP povečana je u jutarnjim časovima i povećava amplitudu i frekvenciju oslobađanja ACTH i CORT (Diorio i saradnici, 1993, van Haarst i saradnici, 1997). ACTH oslobođen u cirkulaciju deluje na ćelije zona fascikulata kore nadbubrežne žlezde i aktivira enzime uključene u sintezu glukokortikoida (GC) iz holesterola (Sewer i Waterman, 2003), tako što se vezuje za melanokortin 2 (MC2-R) receptor, koji je kuplovan sa G proteinom i aktivira PKA signalni put (Galo-Payet i Payet, 2003). Tokom hroničnog stresa se uočava da su CRH i AVP drugačije regulisani. Ekspresija CRH je smanjena, dok je AVP povećana što omogućava organizmu da na novi stres odgovori adekvatnim oslobađanjem ACTH. Putem kratke povratne sprege ACTH inhibira produkciju CRH (Aguilera, 1994). Postoji i ultra kratka negativna sprega kao oblik autoregulacije aktivnosti PVN-a preko CRH i putem presinaptičkih CRH receptora. Uočeno je da postoji stimulatorna inervacija PVN-a od strane serotonergičkog i holinergičkog sistema (Herman i saradnici, 2003, Kovacs, 1998), kao i inhibitorni uticaj (GABA)/benzodiazepin (BZD) i opioidnog neuralnog sistema u mozgu (Pacak i Palkovits, 2001, Swanson i Sawchenko, 1983). Glukokortikoidi su produkti aktivacije HHA sistema. Ovi hormoni su plejotropni i ostvaruju svoj efekat preko intracelularnih receptora (Liu i saradnici, 1997). Neaktivni glukokortikoidni receptor (GR) smešten je u citosolu u formi heterooligomera sa heat shock proteinom i imunofilinom (Andres i saradnici, 1999). Po vezivanju liganda, dolazi do disocijacije od ostatka heteromera, dimerizacije i translokacije homodimera u nukleus gde interaguje sa specifičnim glukokortikoid responsivnim elementom (engl. GRE - glucocorticoid responsive element) koji je lociran na promotorskom regionu DNK molekula dovodeći do aktivacije transkripcije 21
I UVOD (Dal-Zotto i saradnici, 2003) ili ređe do transrepresije preko inhibitornog glukokortikoid responsivnog elementa (engl. igre- inhibitory glucocorticoid responsive element) (Gass i saradnici, 2001). Aktivirani receptori takođe mogu delovati na transkripcione faktore proteinprotein interakcijom, npr. na c- jun/c-fos heterodimer, koji podstiče transkripciju nekoliko gena uključenih u aktivaciju imunskog odgovora (Jacobson i Sapolsky, 1993; Ratka i saradnici, 1989), kao i faktora CREB i AP1 (Diamond i saradnici, 1990). Nivoi ACTH i kortikosterona u plazmi imaju nizak prag reakcije, tako da su dobri markeri za minimalne promene u homeostazi usled dejstva stresora (Armario i saradnici, 1986). Uočena je razlika i u zavisnosti od intenziteta stresa. Marquez (2002) je sa saradnicima merio vrednosti ovih hormona nakon elektrošoka stopala i imobilizacije. Vrednosti u plazmi su im bile slične. Koncentracija ovih hormona je bila slična 60-og minuta izlaganja stresorima, ali se uočava razlika nakon 90. minuta izlaganja stresu. Kod elektrošoka nivo ACTH i CORT naglo se smanjuje, dok nakon imobilizacije koncentracija ACTH u krvi postepeno opada, a CORT ostaje konstantno visok. Upravo ova razlika je rezultat razlike u intezitetu stresora. Pacak i Palkovits (2001) su pacove izlagali različitim stresorima od manjeg do najvećeg inteziteta: hladnoća, krvarenje i insulinom indukovana hipoglikemija. Merili su nivo ACTH, adrenalina i noradrenalina u plazmi. Pokazali su da se uporednim posmatranjem više 22
I UVOD stresnih markera uočava, da svaki stresor ima odgovarajući kvalitativni i kvantitativni profil. 1.4. KARDIOVASKULARNI SISTEM U STRESU Tokom klasičnog bori se ili beži odgovora dolazi do povećane aktivnosti kardiovaskularnog sistema. Srce mora da poveća svoju produktivnost da bi, tokom izlaganja stresu, obezbedio dovoljan protok krvi kroz koronarnu cirkulaciju i skeletne mišiće. Tako, srce uvećava frekvenciju i tri puta, da bi se efikasnost mišićne kontrakcije upetostručila (Vatner i saradnici, 1972). Dizajn kardiovaskularnog sistema se razvijao u smeru očuvanja metaboličkih potreba miokarda, a samim tim i povećanja protoka krvi, uz mogućnost brzog odgovora na pojačane potrebe tokom stresa. Postoje brojni, dodatni oblici prilagođavanja, uključujući metaboličke promene i promene u kinetici, koje mogu biti aktivirane u odgovoru na stres. 1.4.1. KATEHOLAMINERGIČKE ĆELIJE SRCA Smatra se da je odgovor kardiovaskularnog sistema na stres, primarno, rezultat oslobađanja kateholamina sa krajeva postganglijskih vlakana i iz nadbubrežne žlezde (Vatner i saradnici, 1972). Međutim, primećeno je da se ova promena u srčanom radu javlja i tokom treninga pasa, kojima je izvršena srčana denervacija i adrenalektomija (Donald i Shepherd, 1963). Posle denervacije srca, nivo NA pada na 5% od normalne vrednosti, a koncentracije A je dva puta manja (Spurgeon i saradnici, 1974). Kod pacijenata sa transplatiranim srcem, takođe se ostvaruje adekvatna funkcija miokarda, iako još nije došlo do reinervacije (Shaver i saradnici, 1969; Rowan i Billingham, 1988). Osim toga, miševi sa ciljanim oštećenjem 23
I UVOD u genu za enzime koji učestvuju u biosintezi kateholamina, umiru prenatalno usled otkazivanja srca. Sve to ukazuje da je jedna od ključnih uloga kateholamina i u razviću miokardijuma, još na nivou fetusa, kada još uvek nije došlo do ostvarivanja simpatičke inervacije (Thomas i saradnici, 1995; Zhou i saradnici, 1995). Kod pacijenata kod kojih je došlo do otkazivanja srca uočeni su ekstremno visok nivo A u koronarnoj cirkulaciji koji se ne mogu povezati sa aktivacijom simpatoadrenomedularnog sistema (Kaye i saradnici, 1995). Svi ovi rezultati sugerišu na postojanje drugog izvora gde se vrši sinteze kateholamina, a koji učestvuju u regulaciji srčanog rada. Upravo srčane ćelije su taj izvor i poseduje, biosintetsku, enzimsku aktivnost i nakon simpatektomije (Elayan i saradnici, 1990). Huang i saradnici (1996) su prvi identifikovali, u srcu sisara, do tada neopisan tip srčane ćelije sa parakrinim, adrenergičnim svojstvima. One su nazvane unutarsrčane adrenergične ćelije (engl. ICA - intrinsic cardiac adrenergic). Poseduju jedinstvenu morfologiju i sposobne su za biosintezu kateholamina in vitro. ICA ćelije se detektuju i u fetalnom miokardijumu, pre postojanja simpatičke inervacije. Kod odraslih pacova ove ćelije spontano oslobađaju NA i A in vitro u odnosu 7,5:1. Ove ćelije su specijalizovane kardiomiocite koje su alternativni izvor kateholamina, u cilju održanja kontraktilnosti miokarda u stanju mirovanja i tokom stresa u odsustvu simpatičke inervacije (Zhuang i saradnici, 2005). Prvi put je detektovana irnk za PNMT u srcu fetusa pacova (Ebert i saradnici, 1996). Krizanova je sa saradnicima (2001) potvrdila da se irnk za PNMT eksprimira u pretkomorama i komorama srca odraslih pacova. Mi smo 2009. godine koristeći osetljiviju metodu Real-time PCR potvrdili da se osim PNMT, eksprimiraju i geni za TH i DBH enzime u srcu pacova i da se mogu detektovati promene u nivou irnk ovih enzima tokom stresa (Gavrilović i saradnici, 2009). 24
I UVOD 1.4.2. PRENOS SIGNALA ADRENOCEPTORA U SRCU U normalnom, zdravom srcu prisutni su α- i β-adrenoceptori, ali se smatra da α receptori imaju manji značaj u regulaciji rada srca kod ljudi (Steinfath i saradnici, 1992). Postoje tri tipa β-adrenoceptora (β 1, β 2 i β 3 ), pri čemu se β 1 smatraju najznačajnijim. Procenat u kome se eksprimira β 1 (60-80%) je najveći, dok je gustina β 2 receptora 20-40%, a β 3 svega 2% u zdravom srcu ljudi (Rozec i Gauthier, 2006). Odnos između β 1 i β 2 receptora zavisi od vrste životinje i modifikovan je u patološkim stanjima (Brodde i Michel, 1999). Sva tri tipa su kuplovana sa adenilatnom ciklazom (AC) preko G proteina. β 1 - i β 2 AR pri tome se vezuju za stimulatorni G (Gs), a β 3 -AR za inhibitorni G (Gi) protein. Poznata je i aktivacija Gi signalnog puta β 2 receptorom (Kuschel i saradnici, 1999). Stimulacijom Gs proteina aktivira se membranski vezan enzim adenilatna ciklaza (AC), koja katalizuje ATP u ciklični AMP (camp). Sekundarni glasnik camp, potom, aktivira protein kinazu A (PKA), koja fosforiliše brojne proteine, kao što su L kanali za Ca 2+ (Gerhardstein i saradnici, 1999), fosfolamban (Simmerman i Jones, 1998) i troponin (Sulakhe i Vo, 1995). Fosforilacijom L kanala za Ca 2+ povećava se stepen ulaska ovog jona u ćelije miokarda preko sarkomere i T tubula, kojim se potom inicira dalje oslobađanje Ca 2+ iz sarkoplazmatičnog retikuluma (SR) preko kanala indukovanih oslobađanjem Ca 2+ (Castellano i Böhm, 1997) inicirajući pozitivan, inotropni efekat (povećanje kontraktilnosti). S druge strane, fosforilacijom inhibitornih, regulatornih proteina troponina I i fosfolambana inicira se preuzimanje Ca 2+ natrag u SR i uporedo smanjuje se afinitet ovog jona za troponin C dovodeći do negativno inotropnog efekta. Osim toga, preko β 1 - i β 2 AR se ostvaruje i pozitivan hronotropni (povećavaju frekvenciju srca), dromotropni (povećavaju konduktivnost), i batmotropni efekat 25
I UVOD (povećavaju plato ekscitacije) (Opie, 1998). Pokazano je da stimulacija β 1 -receptora, takođe, ostvaruje efekte i nezavisno od PKA signalnog puta (Zhu i saradnici, 2003). Kada se CA vežu za β 3 - i β 2 -AR u određenim uslovima aktiviraju Gi protein, proizvode suprotni efekat od β 1 receptora. Milano i saradnici (1994a) su pokazali da kod pacova kojima je ekstemno eksprimiran gen za β 2 receptor, stepen kontraktilnosti je ipak limitiran, jer Gi inhibira AC. Xiao i saradnici (1999) su potvrdili ovu činjenicu povećavši kontraktilnost kod ovako genetički modifikovanih pacova, inaktiviranjem Gi proteina pertusis toksinom. S druge strane, Gi učestvuje i u drugim, značajnim signalnim putevima, kao što je veza sa MAP kinazama (Daaka i saradnici, 1997). Srčani β 1 i β 2 AR pokazuju različite efekte na kontraktilnost, na koncentraciju i promet Ca 2+ jona u ćelijama izolovanim iz komore pacova (Xiao i saradnici, 1994). Upravo se iz njihove molekularne strukture mogu predvideti različiti obrasci u signalizaciji. Oba su heptaheliksa, tj. receptor sa sedam transmembranskih regiona. U transmembranskm regionima je najveća homologija (~71%) u aminokiselinskom (AK) sastavu i oni su ključni u određivanju specifičnosti liganda koji će se vezati (Frielle i saradnici, 1987). Međutim, citoplazmatični regioni ovih receptora, koji su u interakciji sa drugim ćelijskim proteinima koji posreduju u signalizaciji, odlikuju se značajnom divergencijom (Frielle i saradnici, 1987). U stvari, smatra se da je poliprolinski region u trećoj citoplazmatičnoj petlji vrlo značajan, jer se zamenom AK u ovom regionu, značajno menjaju osobine signalizacije (Green i Liggett, 1994). Nedavno su, Rybin i saradnici (2000) opisali postojanje razlika u β-ar i adenilatnim ciklazama i po specifičnim unutarćelijskim kompartmanima kardiomiocita pacova. Pošto su β 2 -AR, Gαi i PK povezane sa kaveolinom-3, one tako ostaju vezane za male invaginacije ćelijske membrane - kaveole i deluju samo lokalno. Nasuprot tome, β 1 -AR, Gαs i AC V i VI su ravnomerno raspoređeni između kaveola i 26
I UVOD Slika 4. β-adrenergična aktivacija i fosforilacija proteina odgovornih za indukciju kontrakcija. AC- adenilatna ciklaza; Ach- acetil-holin; AKAP - A kinazni ukotvljujući protein; β-ar - β-adrenergični receptor; M-Rec - M-muskarinski receptor; PLB - fosfolamban; Reg - PKA regulatorna subjedinica; SR - sarkoplazmatični retikulum. Bers, D.M. Cardiac excitation-contraction coupling. 2002. Nature. 415(10) 198-205. Slika 5. Šematski prikaz signalnih puteva aktivacije β-adrenergičkih receptora Steinberg, S. F. Circ Res 1999;85:1101-1111 27
I UVOD unutarćelijskog prostora i šire signal kroz celu ćeliju. U ovakvoj raspodeli, stimulacija agonistima smanjuje β 2 -AR u nivou kaveole bez uticaja na distribuciju β 1 -AR. Različitom distribucijom β 1 i β 2 -AR može se značajno uticati na različitu signalizaciju (npr. camp distribucija i signalizacija, vezivanje za različite AC isoforme, vezivanje za određene kinazne kaskade, jonske kanale i apoptotske putanje) među svakim od receptora. Za promotorski region β 1 i β 2 -AR vezuju se brojni regulatorni elemenati, vršeći pozitivnu i negativnu kontrolu transkripcije. Na primer, u ćelijskoj kulturi, izlaganje β- AR agonistima obično daje prolazan pozitivni skok nivoa irnk za β-ar putem vezivanja camp za camp responsivni element (CRE) (Collins i saradnici, 1990). Druge regulatore transkripcije gena za ove receptore uključuju GRE preko kog glukokortikoidi smanjuju ekspresiju β 1 -AR (Kiely i saradnici, 1994), a povećavaju ekspresiju β 2 -AR (Cornett i saradnici, 1998). Postoje dokazi da je povećanje irnk za β-ar regulisano i posle transkripcije, na nivou irnk stabilnosti. Direktne korelacije su uočene između smanjenja irnk receptora kod ljudi posredovane dejstvom agonista i opadanja stabilnosti irnk za β 1 i β 2 -AR (Danner i saradnici, 1998; Mitchusson i saradnici, 1998). Interesantan je relativno jedinstven oblik post-translatorne regulacije β 2 -AR gena. U okviru 5' regiona gena za β 2 -AR je lociran i kod za kratak peptid. Direktni biohemijski dokazi su pokazali da prisustvo ovog peptida smanjuje transkripciju celog β 2 -AR gena (Parola i Kobilka, 1994). 1.5. STUDIJE O PONAŠANJU ŽIVOTINJA Ponašanje živih organizama je vidljiva manifestacija aktivnosti centralnog nervnog sistema. U savremenoj neuronauci proučavanje ponašanja je jedna od 28
I UVOD centralnih oblasti istraživanja kod životinja. U nekim studijama, ističe se istraživanje ponašanja samog po sebi, a primarni cilj je da se okarakteriše ponašanje i osobine okolne sredine koje su uzrok tome. U drugim, ponašanje životinja može se dovesti u vezu sa merenjem električne ili hemijske aktivnosti mozga da bi se shvatili mehanizmi koji su u osnovi ponašanja. Promene u ponašanju se često koriste za otkrivanje i merenje promena moždane funkcije koje mogu biti rezultat bolesti, neuronske povrede, genetske modifikacije ili izlaganje raznim drogama i tretmanima. Osim toga, animalni model je neophodan za ispitivanje mehanizama psihijatrijskih oboljenja i razvijanje novog pristupa lečenju, s obzirom na veoma ograničenu dostupnost ljudskog mozga. Ovi modeli treba da uključe ponašanje koje liči na ljudsko stanje, uz očekivane odgovore na kliničku terapiju i da se zasniva na poznatim etiološkim faktorima. 1.5.1. IZDIGNUTI PLUS LAVIRINT Strepnja ili anksioznost je nejasan strah bez očiglednog spoljnjeg povoda i uglavnom bez fizioloških znakova koji uobičajeno prate strah proizašao iz realne spoljne pretnje. U ovom neprijatnom osećanju dominira iščekivanje neke neodređene nesreće. Kada se strepnja događa često, ometa afektivni život i osećanje dobrobiti ili je na drugi način maladaptivno, postaje anksiozni poremećaj (Davis i Shi, 1999; Gray i McNaughton, 2000). Anksiozni poremećaji predstavljaju skup različitih medicinskih stanja u kojima dominiraju zabrinutost, strah, teskoba, strepnja, napetost ili nemir. Ovde se ubrajaju tzv. primarni anksiozni poremećaji kao što su: fobični anksiozni poremećaji, panični poremećaj, posttraumatski stresni poremećaj, i sekundarni anksiozni poremećaji kao što su anksiozni poremećaj zbog opšteg zdravstvenog stanja i anksiozni poremećaji 29
I UVOD prouzrokovani psihoaktivnim supstancama. Anksiozna osoba je konstantno u stanju "iščekivanja", stalno je na oprezu, kao da joj se sprema neka opasnost. Ispočetka retko, a onda sve češće. Anksioznost se pretvara u napade panike koji se manifestuju u vidu jakog straha, brzog lupanja srca, gušenja, znojenja. Anksioznost i panični napadi su rezultat akumuliranog negativnog stresa u životu te osobe. Kay Montgomery je šezdesetih godina pokazao da istraživanje životinje zavisi od ravnoteže između dve suprotstavljene motivacije - istraživačkog nagona (radoznalosti) i straha izazvanog novom sredinom. Istraživački nagon se razlikuje od ostalih (homeostatskih) nagona jer je izazvan novom spoljnom stimulacijom (a ne unutrašnjim stanjem organizma, kao što su glad) i podsticaj se brzo smanjuje stalnom izloženosti istoj situaciji (O'Keefe i Nadel, 1978). Ovaj oblik istraživanja je inhibiran anksioznošću, zbog čega može predstavljati njenu indirektnu meru (Ohl, 2005). Izdignut plus-lavirint (engl. EPM - elevated plus maze) je jedan od najpopularnijih in vivo testova trenutno u upotrebi koji se bazira na utvrđivanju stepena anksioznosti u zavisnosti od istraživačkih karakteristika životinje. Iako se često koristi kao alat za utvrđivanje anksiolitičkih efekata lekova (Pellow i saradnici, 1985; Lister, 1990), danas se koristii u razumevanju biološke osnove emocionalnosti vezane za učenje i pamćenje, bol, nivo hormona, kao i različitih podtipova anksioznih poremećaja, kao što su generalizovane anksioznosti, fobije i post-traumatski stres (Lamprea i saradnici, 2000; Carobrez i saradnici, 2001; Rasmussen i saradnici, 2001; Bannerman i saradnici, 2004). Upravo, primarni indikatori anksioznosti u ovom testu je mera 30
I UVOD izbegavanja otvorenih krakova lavirinta kao značajan parametar ponašanja, usko povezan sa strahom i anksioznošću (Rodgers i saradnici, 1997). Ovo odbrambeno ponašanje osetljivo je na anksiogene droge (Griebel i saradnici, 1997; Setem i saradnici, 1999). Pouzdanost i osetljivost EPM testa su progresivno poboljšani u cilju boljeg razumevanja etiologije anksioznosti. Istraživači su zahvaljujući ovom testu utvrdili i nove potencijalne tretmane koji su efikasani koliko i benzodiazepini, tradicionalni lekovi protiv anksioznosti više od 40 godina (Nutt i Malizia, 2001; Kent i saradnici, 2002; Millan, 2003). GABA sistem je odavno ciljano mesto lečenja anksioznosti putem benzodiazepina, ali bolje razumevanje njene uloge u anksioznim poremećajima je dovelo do finog podešavanja lekova koji deluju na tačno određene subjedinice na GABA-A receptoru (Nutt i Malizia, 2001; Gorman, 2003). U međuvremenu, skorija istraživanja su potvrdila neurotransmiter glutamat kao značajan element u anksioznosti i anksioznom ponašanju (Javitt, 2004). Osim toga, saznanje da je hroničan tretman antidepresivima, kao što su SSRI, efikasan kod anksioznih poremećaja (Argyropoulos i saradnici, 2000; Millan, 2003; Vaswani i saradnici, 2003) podstaklo je istraživače da razviju anksiolitike koji utiču na serotonergički i/ili noradrenergički sistem (Kent i saradnici, 2002; Gorman, 2003; Vaswani i saradnici, 2003). 1.5.2. PRINUDNI TEST PLIVANJA Porsolt je 1977. god opisao novu metodu za podsticanje depresivnog stanja kod miševa. Ideja se javila iz eksperimenta vezanog za učenje koji su radili sa pacovima u lavirintu koji je u vodi. Najviše pacova pronalaze izlaz u roku od 10 minuta, ali su primetili da se jedni bore pokušavajući da izađu, a ostali plutaju pasivno (Porsolt i 31
I UVOD saradnici, 1978). U istom radu Porsolt je testirao širok spektar antidepresiva i pokazao smanjenje nepokretnosti tokom testa kojoj prethodi aplikacija ovih lekova. Glodari prisiljeni da plivaju u uskom prostoru iz koga nema mogućnosti bekstva će nakon početnog perioda energične aktivnosti, zauzeti karakterističan nepokretni položaj, koristeći samo pokrete potrebne da bi njihove glave ostale iznad vode. Pretpostavka je da je nepokretnost rezultat saznanja životinje da je bekstvo nemoguće i da gube nadu. Nepokretnost je zbog toga dobila naziv "ponašanje očajanja". Nekoliko studija su pokazale da prethodno izlaganje stresu povećava pasivno ponašanje tokom ovog testa (Molina i saradnici,1994). Ova jednostavna procedura testiranja ponašanja je postala koristan screening test za efikasnost novih lekova sa antidepresivnim svojstvima (Borsini i saradnici, 1991; Healy i saradnici, 1999; Porsolt i saradnici, 1977; Wong i saradnici, 2000). Efekti različitih vrsta antidepresiva lekova se odnedavno preispituju u testu prinudnog plivanja (engl. FST - Forced swimming test) koristeći novi postupak za merenje aktivnih oblika ponašanja: plivanje i penjanje, a ne samo nepokretnosti (Detke i saradnici, 1995). Korišćenje ove procedure, uočene su razlike u ponašanja tokom FST između tretmana antidepresivima koji selektivno inhibiraju preuzimanja noradrenalin i onih koji inhibiraju preuzimanja serotonina. NRI smanjuju nepokretnost i selektivno povećanje penjanje bez efekata na plivanje. Nasuprot tome, SSRI smanjuju nepokretnost, ali povećavaju plivanje bez uticaja na penjanje. Ove preciznije analize oblika ponašanja tokom testa mogu se koristiti za razlikovanje 32
I UVOD lekova sa zajedničkim terapijskim ishodom, ali koji deluju na različite neurotransmiterske sisteme (Detke i Lucki, 1996). 1.6. ANIMALNI MODEL DEPRESIJE Efekat redukcije centralnih neurotransmitera na ponašanje i uticaj antidepresiva je teško ispitivati na ljudima iz etičkih razloga. Zato su razvijeni brojni animalni modeli depresije, zasnovani na hroničnom izlaganju eksperimentalnih životinja stresu. Ovi modeli su značajni i zbog mogućnosti utvrđivanja neurobiologije i patofiziologije depresije. Jedan od široko rasprostranjenih modela je hronični nepredvidivi blagi stres -NBS (engl. CUMS chronic unpredictable mild stress). Katz i Hersh (1981) su izlagali pacove konstantno tokom dužeg vremenskog perioda brojnim, jakim stresorima. Prateći ponašanje takvih životinja uočili su promene u testu otvorenog polja, koje su eliminisane hroničnim tretmanom antidepresivima. Takođe, uočili su da ovi pacovi imaju smanjenu želju za zaslađenom vodom. Willner (1997) je 1987. godine modifikovao ovaj model tako što je koristio blaže oblike stresora, izbacio je npr. električni šok stopala i ubacivanje u hladnu vodu. Stresori su bili blagi i trajali su nekoliko sati u periodu od nekoliko nedelja. Utvrdio je da kod ovog modela životinja ne može da se prilagodi na stresni stimulus. Ove životinje pokazuju znake depresije: gubitak težine (Willner i saradnici, 1996), povećanu aktivnost HHA sistema, uključujući hipertrofiju nadbubrežnih žlezda (Muscat i Willner, 1992) i pojačano oslobađanje kortikosterona (Ayensu i saradnici, 1995). Kao što se vidi na Slici 10. jedinke izložene CUMS proceduri ne pokazuju samo one simptome depresije koje se uočavaju kod ljudi, a koje se mogu utvrditi samo direktnim verbalnim ispitivanjem pacijenta (Willner, 1991). 33
I UVOD Kod životinja, hronični nepredvidi stres indukuje brojne bihevioralne promene, koje uključuju promene u istraživačkom ponašanju, lokomotornim karakteristikama, poremećaj u ishrani i seksualnom ponašanju (Willner, 1991). Ovakve promene su često detektovane i kod ljudi koji imaju psihijatrijske poremećaje. Layne i saradnici (1980) su vršeći ispitivanje depresivnih studenata, uočio da većina potcenjuje pohvale profesora ili novac kao nagradu za korektne postupke. Glavna odlika hronično stresiranih životinja je pojava ahedonije, smanjenog hedonističkog odgovora na nagradu u vidu zaslađene vode. Gronli i saradnici (2004) su pokazali da NBS kod pacova smanjuje želju za uzimanjem šećera, pri čemu su najjači simptomi detektovani 2 nedelje nakon izlaganja stresu. Osim toga, uočili su da dolazi i do poremećaja sna. D Aquila i saradnici (1994) su utvrdili da ovaj model stresa smanjuje seksualnu aktivnost. Steiner i saradnici (1993) su ispitivali sposobnost depresivnih pacijenta da detektuju i procene stimulus i njihov facijalni refleks kao odgovor na određene ukuse i zvuke. Pokazali su da je njihova facijalna reakcija mnogo blaža i kraća nego kod kontrolne grupe. Facijalni refleks je reguliše moždano stablo, ukazujući na neurološke promene u ovom regionu tokom depresije. Smatra se da je i ahedonija rezultat smanjenja transmisije dopamina u nucleus accumbens-u (Willner i saradnici, 1992; Keitz i saradnici, 2003). Postoje i kritike na račun ovog modela zbog činjenica da ne dolazi do konstantne pojave ahedonije tokom stresa. Tako su Strekalova i saradnici (2004) pokazali da je svega 61% miševa koji su hronično stresirani imali znake ahedonije. Ova varijabilnost bi mogla biti rezultat individualne procene jedinke i njenog načina prevladavanja situacije. Gronli (2005) je sa saradnicima, takođe, pokazao da kada se stave u novu sredinu CUMS pacovi imaju povećanu spontanu aktivnost u testu otvorenog polja, koja ukazuje na povećanu motornu aktivnost i anksioznost. 34
I UVOD DEPRESIJA Trajanje Najmanje 2 nedelje Glavni simptomi Depresivno raspoloženje Značajno smanjeno interesovanje i zadovoljstvo Drugi simtomi Značajan gubitak težine Nesanica ili produženo spavanje Depresija najizraženija ujutru Psihomotorna usporenost ili uzbuđenost Osećaj beznačajnosti i bezrazložne krivice Smanjena sposobnost koncentracije i donošenja odluke Stalne misli o smrti i samoubistvu NBS Efekti NBS traju i do 3 meseca Nemogućnost analiziranja Smanjeno seksualno i istraživačko ponašanje i slab odgovor na dobijenu nagradu Gubitak težine oko 5% Poremećaj sna Najizraženiji efekat na početku tamne faze Smanjenje lokomotorne aktivnosti Nemogućnost analiziranja Nije testirano Nemogućnost analiziranja Slika 6. Simptomi depresije koji se detektuju kod životinja izloženih hroničnom, nepredvidivom, blagom stresu. Pijlman je sa saradnicima (2003) utvrdio da za razliku od fizičkog stresa koji dovodi do inaktivacije, emotivni stres dovodi do hiperaktivnosti. Ovo ukazuje da je izražena emotivnost, takođe, karakteristika ove stresne procedure. Grippo (2002) je uočila da pacovi izloženi NBS imaju, takođe, povišen pritisak i tahikardiju, čime je ovaj model pogodan kod istraživanja kardiovaskularnih oboljenja izazavanih stresom. Lekovi koji su efikasni u lečenju simptoma izazvanih izlaganjem NBS uključuju triciklične antidepresive: imipramin, desipramin, amitriptilin (Velverde i saradnici, 1997, Papp i Moryl, 1996), zatim specifičan inhibitor pruzimanja noradrenalina (NRI) maprotilin (Muscat i Willner, 1992), MAO inhibitore (Papp i Moryl, 1996) i SSRI lekove: fluoksetin i citalopram (Muscat i Willner, 1992). Da bi došlo do poboljšanja 35
I UVOD simptoma izlaganja NBS, potrebno je 3-4 nedelje aplikacije, što vremenski odgovara rezultatima kliničkih tretmana antidepresivima. 1.7. DEPRESIJA Depresiju karakterišu promene u vegetativnim i psihomotornim funkcijama. Ključni simptomi su gubitak želje za zadovoljstvima i poremećaj u raspoloženju. Prvi pisani prikazi depresije datiraju još iz starog Egipta, gde Eber opisuje bolest koju karakteriše izražena bezvoljnost. U Starom Zavetu, opisano je kako Saul pati od ozbiljne depresije. Ova bolest se prvo obeležavala kao melanholija, termin koji se prvi put pojavio u zapisima Hipokrata u 4. veku pre nove ere. Dakle, poremećaji u raspoloženju su među prvim poznatim psihijatrijskim bolestima (Andreasen i Black, 1995). Depresija se kao termin generalno koristi u svakodnevnom životu da bi se opisao dugotrajni osećaj lošeg raspoloženja. Medicinski, termin depresija, odnosi se na stanje koje karakteriše nemogućnost osetiti zadovoljstvo, gubitak ranijih interesovanja, ali i promene slične distresu, koje negativno utiču na psihološko i fizičko zdravlje. To dovodi do poremećaja u funkcionisanju osobe na poslu, u socijalnim i međuljudskim odnosima (Andreasen i Black, 1995). Depresija je hronična, uporna bolest, potencijalno opasna po život, koja pogađa 20% populacije u svetu (Gillespie i Nemeroff, 2005), i u prvih je deset uzroka smrtnosti u svetu. Smatra se da je u 40 do 50% slučajeva uzrok nasledni faktor, iako do danas nije utvrđen gen koji je uzročnik ovog poremećaja, a ostalih 50 do 60% čine emocionalni stres, fizička bolest, trauma u detinjstvu, čak i virusna infekcija. Depresija obuhvata brojne, raznovrsne simptome i ona se nalazi u osnovi brojnih bolesti, koje su različite etiologije i patofiziologije (Berton i Nestler, 2006). Simptomi uključuju tri osnovne kategorije: 36
I UVOD - promene u raspoloženju (osećaj tuge, smanjena želja za prijatnim aktivnostima, nesposobnost da se oseti zadovoljstvo - ahedonija, iritiranost) - osnovna motivacija (nesanica ili hipersomnija, značajan gubitak ili dobitak na težini - >5% promene/mesečno) - kognitivni poremećaji (gubitak koncentracije, osećaj krivice, osećaj bezvrednosti, neodlučnost, konstantne misli o samoubistvu) Sve je više dokaza koji ukazuju da postoje čak i razlike među polovima, jer je kod žena češća nego kod muškaraca i to u odnosu 2:1 (Altemus, 2006). Postoje brojni razlozi, uključujući razliku u doživljavanju stresa, smanjena sposobnost prilagođavanja na stresore, uticaj seksualnih hormona, psihosocijalni i personalni faktori koji podstiču razvoj depresije (Matheson i Anisman, 2003). 1.7.1. DA LI POSTOJI VEZA IZMEĐU STRESA I DEPRESIJE? Kliničke studije su potvrdile korelaciju između stresnih događaja i pojave patofiziologije uočene u depresiji (Kendler i saradnici, 1999; Kendler i saradnici, 1997) To ne iznenađuje, uzimajući u obzir činjenicu da hronični stres izaziva bihevioralne, endokrine, imunske promene, kao i promene u prometu neurotransmiterima mozga sličnim onima u depresiji (Bremner, 1999; McEwen, 1999; Pani, 2000). Bez obzira na godine istraživanja, biološku osnovu depresije i precizan mehanizam kako stres utiče na njenu pojavu je slabo utvrđen. Tokom godina razvijeno je nekoliko teorija koje pokušavaju da objasne na koji način nastaje ovo oboljenje. 37
I UVOD 1.7.1.1. GLUKOKORTIKOIDNA TEORIJA DEPRESIJE Nekoliko kliničkih studija ukazale su da je kod pacijenata sa dijagnozom depresije detektovani su znaci hiperaktivnosti HHA sistema i hipersekrecije glukokortikoida (Gold i saradnici, 1995; Sapolsky, 2000; Arborelius i saradnici, 1999; Duval i saradnici, 2006). Osim toga, kod ovih pacijenata dolazi i do strukturnih promena u mozgu, prevashodno hipokampusu (Colla i saradnici, 2007). Mnogi istraživači su fokusirani na hipokampus kao deo mozga u kome dolazi do najznačajnijih promena tokom stresa (Sapolsky, 2000; McEwen, 2000a; Sairanen i saradnici, 2005). Kod odraslih pacova, hronični stres ili aplikacija glukokortikoida dovodi do smanjenja broja i dužine apikalnih dendrita CA3 piramidalnih neurona hipokampusa (McEwen, 2000a; Radley i saradnici, 2006). Osim ovih promena stres i hormoni stresa smanjuju proliferaciju ćelija u hipokampusu odraslih jedinki za sada neutvrđenim mehanizmom (Gould i saradnici, 1992; Gould i saradnici, 1997; Dranovsky i Hen, 2006). Slika 7. Promene u mozgu detektovane kod pacijenata sa dijagnozom depresije. 38
I UVOD Oštećenja u hipokampusu smanjuju osetljivost neurona na glukokortikoide, a na taj način smanjuju i efikasnost negativne povratne sprege vodeći ka još većem oslobađanju ovih hormona u krv i neuralnih oštećenja. Ove promene mogu obezbediti ćelijsku osnovu za promene koje se uočavaju u mozgu pacijenata sa depresijom. Naime, kod depresivnih pacijenata su uočene patološke promene u hipokampusu, bazalnoj gangliji, amigdali i kori mozga (Manji i saradnici, 2001). Postmortem studije kod ovih pacijenata ukazuju na smanjenje veličine ovih regiona (Manji i saradnici, 2001; Ongur i saradnici, 1998; Rajkowska i saradnici, 1999; Rajkowska i saradnici, 2000; Cotter i saradnici, 2001; Videbech i Ravnkilde, 2004). (Slika 7.) Skorije studije su ukazale da povećana količina glukokortikoida tokom akutnog i hroničnog stresa smanjuje neurogenezu (Miller i McEwen, 2006; Dranovsky i Hen, 2006). Takođe, tokom starenja povećava se nivo glukokortikoida, što je razlog za smanjenje nivoa neurogeneze kod starijih osoba. Dokazano je da antagonista receptora za CRH mogu poboljšati simptome depresije kod starijih pacijenata (Cameron i McKay, 1999). 1.7.1.2. MONOAMINSKA TEORIJA DEPRESIJE Još se 1960. godine, na osnovu do tada prikupljenih informacija, došlo do zaključka da je depresija uzrokovana nedostatkom kateholamina, prvenstveno noradrenalina u mozgu (Schildkraut, 1965). Naime, jedan od najranijih dokaza da NA sistem ima ključnu ulogu u patofiziologiji depresije uočen je sredinom pedesetih. Rezerpin je prirodni alkaloid koja dovodi do smanjenja nivoa amina u centralnom i u perifernom nervnom sistemu. Široko je primenjivan u lečenju hipertenzije, početkom 1950. godine, zbog svoje efikasnosti u smanjenju aktivnosti simpatičkog nervnog 39
I UVOD sistema. Međutim, uočeno je da tretirani pacijenti ispoljavaju i znake izraženog depresivnog stanja (Muller i saradnici, 1955). Po prestanku davanja leka pacijentima bi se popravljalo stanje. Životinje koje su njime tretirane pokazivale su znake depresivnog stanja, sedaciju i hipolokomociju. Ovaj lek je dovodio do smanjenja nivoa kateholamina u mozgu, a u manjem nivou i serotonina i dopamina. Iproniazid, jedinjenje sintetisano pedesetih godina u terapiji tuberkuloze, izaziva euforiju i hiperaktivno ponašanje kod pacijenata. Pokazano je da povećava koncentraciju NA i serotonina (5-HT) u mozgu inhibirajući metabolitički enzim MAO. MAO inhibitori su se uskoro pokazali kao efikasni u lečenju depresije. Još specifičniji dokaz ovoj teoriji je dobijeno korišćenjem AMPT, inhibitora TH, limitirajućeg enzima u sintezi kateholamina. Pokazano je da izaziva poremećaj u motornoj aktivnosti i sedaciju kod eksperimentalnih životinja (Spector i saradnici, 1965). Delgado (1993) je sa saradnicima pokazao da AMPT dovodi do pogoršanja stanja depresije kod pacijenata koji su bili uspešno lečeni inhibitorima preuzimanja NA. 1.7.1.3. NORADRENERGIČNI SISTEM U MOZGU Noradrenalin je uključen u širok spektar fizioloških procesa koji su važni u psihijatriji: učenje i memorija, spavanje, uzbuđenje (Leonard, 1997). Noradrenergični neuroni su locirani u dve glavne moždane strukture, locus ceruleusu (LC) i lateralnom tegmentumu (Racagni i Brunello, 1999). Ove moždane 40
I UVOD regije su bitne u razumevanju anatomske osnove nastanka psihijatrijskih oboljenja, posebno depresije i bolesti izazvanih dugotrajnim stresom (Leonard, 1997). Funkcionalnu vezu LC sa anksioznošću prvi je sugerisao Redmond sa saradnicima još 1976. godine. Oni su vršeći električnu stimulaciju LC kod majmuna uočili karakterističnu promenu u ponašanju koja se u prirodnom okruženju javlja kada je jedinka uplašena ili ugrožena. Itoi i saradnici (2007) su koristili izdignuti plus lavirint kao test za ispitivanje efekta ablacije LC regiona na nivo anksioznosti kod miševa. Životinje kojima su bilateralno uništeni LC neuroni imaju manji strah od otvorenog prostora i provode mnogo više vremena na otvorenom kraku u odnosu na kontrole. Brojni aksoni se ascedentno pružaju iz LC ka regijama mozga koje se povezuju sa strahom, kao što je talamus, korteks, amigdale, hipokampus i hipotalamus. Descedentno, aksoni formiraju sinapsu u nivou torakalnog dela kičmene moždine. Na taj način LC predstavlja oblik alarmnog sistema koji određuje da li će, pod dejstvom stresora, doći do stimulacije senzornih receptora ili aktivacije vegetativnog sistema (Nakamura i Sakaguchi, 1990). Lateralni tegmentum (medularni NA nukleusi) pruža brojne projekcije ka hipotalamusu i prefrontalnom korteksu. A2 nukleus je glavni stimulator CRH neurone u PVN, povezujući noradrenergički sistem sa HHA sistemom u odgovoru na stres (Cunningham, 1988). Postoje brojni dokazi da je aktivnost LC značajno promenjena u stanju depresije. Johimbin, antagonist α2 receptora, uslovljava porast koncentracije NA u sinapsi, što rezultira pojavom paničnih napada u 60% obolelih od paničnog poremećaja (Boehnlein i Kinzie, 2007). Suprotno, korišćenjem antagoniste α 2 receptora, johimbina, simptomi se popravljaju (Bremner i saradnici, 1996a). Arango i saradnici (1996) su utvrdili da dolazi do smanjenja gustine neurona LC kod obolelih od depresije u odnosu na zdrave kontrole. Takođe, nađeno je i da kod ovih 41
I UVOD pacijenata dolazi do povećanja broja α 2 receptora (Ordway i saradnici, 1994), kao i smanjenja nivoa transportnih proteina za NA (Klimek i saradnici, 1997). Povećanje gustine β-adrenoreceptora je, takođe, indikator depresije (Mann i saradnici, 1996), što je potvrđeno hroničnim davanjem antidepresiva, koji su doveli do smanjenja gustine ovih receptora (Vetulani i Sulser, 1975). Svi ovi rezultati potvrđuju da je oslobađanje NA smanjeno u stanju depresije. 1.7.1.4. SEROTONERGIČKI SISTEM U MOZGU Rapport je 1947. godine našao u humanom serumu jedinjenje koje ima svojstvo vazokonstriktora i nazvao ga serotonin. Uskoro je okarakterisan kao neurotransmiter u mozgu (Bogdansky i saradnici, 1956). Sintetiše se iz L- triptofana, koji se unosi hranom i svega 4% unete aminokoseline prođe krvnomoždanu barijeru. Razgradnju vrši MAO prevodeći 5-hidroksi-triptofan u 5-hidroksi-indol-acetaldehid koji se dalje oksiduje do 5-hidroksiindol-sirćetne kiseline (5-HIAA). Moždana struktura koja ima najviše seratonergičkih ćelija je nuclei raphe koji su podeljeni u 9 grupa od B1 do B9. Prve 4 grade caudal raphe nucleus, a ostali dorsal raphe nucleus (Dahlstrom i Fuxe, 1964). Dorzalni nukleus ima 50% od ukupnog broja 5-HT nukleusa i zato je najveći i najznačajniji serotoninski centar u mozgu. Serotonin je uključen u regulaciju ponašanja jedinke kao što su agresija, seksualno ponašanje, senzomotorna aktivnost, osetljivost na bol i učenje. Upravo zato ne iznenađuje da je kontrolom nivoa serotonina moguće uticati na većinu 42
I UVOD psihijatrijskih oboljenja, kao što su depresija, anksiozni poremećaji (socijalna fobija, opsesivno-kompulzivna stanja), shizofrenija i anorexia nervosa. Postoje oprečni rezultati o ulozi serotonina u agresiji. Miczek (1994) je pokazao da inhibicijom oslobađanja 5-HT dolazi do smanjenja predatorskog ponašanja kod pacova, smanjujući njegovu agresivnost prema mišu. Suprotno tome, primati pokazuju povećanu agresivnost sa smanjenjem ovog neurotransmitera. Kod majmuna, jedinka sa povišenim nivoima seratonina je socijalno dominantna u koloniji (Raleigh i saradnici, 1991). Određena grupa depresivnih pacijenata imaju sniženu koncentraciju 5-HIAA, produkta metabolizma seratonina u cerebro-spinalnoj tečnosti (Asberg, 1994; Tuinier i saradnici,1995). Ovi pacijenti su pokazali impulsivno i destruktivno ponašanje i izraženu agresiju prema sebi u vidu pokušaja samoubistva (Brown i Linnoila, 1990). Antiaksiozni lekovi npr. benzodiazepini smanjuju aktivnost neurona raphe snižavajući nivo serotonina. Ako se pacijentima uspešno lečenim od depresije u ishrani ukine L- triptofan, prekursor serotonina, pogoršava im se klinička slika (Delgado i saradnici, 1991). Price (1998) je sa saradnicima pokazao da je neuropeptid CRH kritični medijator u regulaciji smanjenja ekstracelularne koncentracije 5-HT u stresu. Ovo je verovatno jedan od dejstava negativne povratne sprege pod dejstvom CORT. CRH vlakna inervišu dorzalne nukleuse rafe i tako koordiniraju autonomne i bihevioralne promene tokom stresa (Valentino i saradnici, 1993). S druge strane, pokazano je da povećanje nivoa 5-HT u mozgu povećava koncentraciju ACTH i CORT u krvi (Fuller, 1996). Oslobađanje CORT izazavano akustičnim i vizuelnim stimulusom je sprečen ukoliko se neurotoksinom unište hipotalamični 5-HT neuroni (Feldman i saradnici, 1991). Ovo je rezultat seratonergične inervacije CRH neurona u PVN (Bagdy i Makara, 1994). 43
I UVOD 1.7.2. DEPRESIJA KAO FAKTOR RIZIKA ZA POJAVU KARDIOVASKULARNIH OBOLJENJA Postoje brojni dokazi da su psihosocijalni faktori, kao što su depresija i hronični stres, česti uzročnici nastanka kardiovaskularnih oboljenja (Rozanski i saradnici, 2005; Rozanski i saradnici, 1999). Studije su potvrdile da depresija podstiče nastanak arterioskleroze (Rozanski i saradnici, 2005; Rozanski i saradnici, 1999; Matsumoto i saradnici, 1993) i faktor je rizika u nastanku bolesti srca koje dovode do smrtnih ishoda (Carney i saradnici, 2003; Carney i saradnici, 1995; Lett i saradnici, 2004; Rugulies, 2002; Wulsin i Singal, 2003). Istraživanje koje su sproveli Barth, Schumacher i Herrmann-Lingen (2004) pokazalo je da je dvostruko veća verovatnoća, da 2 godine po utvrđivanju dijagnoze, dođe do smrtnog ishoda kod pacijenata sa kardiovaskularnim oboljenjima i znacima depresije u odnosu na nedepresivne. Električnom stimulacijom srčanog, simpatičkih nerava ili vagusa dolazi do promene u srčanom radu (Buckworth i Dishman, 2002). Aktivnost simpatičkih nerava koji inervišu srce se utvrđuje merenjem varijabilnosti u srčanoj frekvenciji (engl. HRVheart rate variability), perioda između dve depolarizacije komora. Smanjena vrednost HRV-a može ukazati na bolesti srca u naizgled zdravoj populaciji (Dekker i saradnici, 1997; Tsuji i saradnici, 1994). Naučnici su pokazali, takođe, da je depresija povezana sa nižim vrednostima HRV (Carney i saradnici, 2005; Carney i saradnici, 2001; Carney i saradnici, 1995; Huang i saradnici, 1995; Hughes i Stoney, 2000; Stein i saradnici, 2000). Poremećaj u aktivnosti autonomnog nervnog sistema se demonstrira i povećanjem srčane frekvencije (HR), kako kod depresivnih, tako i kod nedepresivnih srčanih bolesnika (Carney i saradnici, 1999; Frasure-Smith i saradnici, 44
I UVOD 1993) kao i dužim periodima vremena potrebnim da se HR vrati na bazalne vrednosti posle vežbanja (Cole i saradnici, 2000; Hughes i saradnici, 2006). Pošto je depresija povezana sa kardiovaskularnim oboljenjima postavilo se pitanje o efikasnosti antidepresiva u lečenju bolesti srca. Nekoliko studija su ispitale efekat farmakoloških i nefarmakoloških tretmana na HR i HRV. Oni su pokazali da tretman tricikličnim antidepresivima (TCA) dovodi do porasta HR, ali smanjenja HRV zbog antiholinergičnog efekta (Jakobsen i saradnici, 1984; Rechlin i saradnici, 1995; Yeragani i saradnici, 1992). Zbog toga se generalno, ne preporučuje njihova upotreba kod srčanih bolesnika sa simptomima depresije. Selektivni inhibitori preuzimanja serotonina (IPS) nemaju naizgled štetnih efekata na srčani rad i preporučuju se u lečanju depresije srčanih bolesnika. (Carney i saradnici, 2005; Glassman i saradnici, 2002; Swenson i saradnici, 2003). Neke studije potvrđuju da SSRI lekovi popravljaju HRV (Balogh i saradnici, 1993; McFarlane i saradnici, 2001), dok su drugi, pak, utvrdili da nema efekat ili je kratkotrajan (Rechlin i saradnici, 1995; Roose i Miyazaki, 2005). 1.7.3. ANTIDEPRESIVI Antidepresivi su psihoaktivni lekovi koji se koriste u lečenju depresije. Dvojica lekara, Irving Selikoff i Edward Robitzek, su 1951. godine ispitujući dejstvo dva leka sa antituberkuloznim dejstvom isoniazid i iproniazid uočili da se pacijentima popravlja vidno raspoloženje. Ernst Zeller je utvrdio da je iproniazid vrlo potentan inhibitor monoamino oksidaze (Loomer i saradnici, 1957; López-Muñoz i saradnici, 2007). Inhibitori monoamino oksidaze (MAOI) sprečavaju razgradnju monoamina (dopamina, seratonina, i noradrenalina) inhibicijom enzima odgovornog za njihov intraneuralni katabolizam. Ubrzo potom, Kuhn (1958) je utvrdio da imipramin 45
I UVOD predstavlja vrlo efikasan antidepresiv, a da pritom nije bilo poznato njegovo farmakološko dejstvo. Axelrod i saradnici su 1961. godine utvrdili da deluje tako što inhibira preuzimanje NA iz sinaptičke pukotine. 1.7.3.1. INHIBITORI PONOVNOG PREUZIMANJA MONOAMINA IZ SINAPSE U mozgu, signal između dve ćelije se prenosi putem hemijskih sinapsi, koje predstavljaju male pukotine između ćelija. Presinaptička ćelija šalje informaciju tako što otpušta neurotransmitere, kao što su noradrenalin, serotonin, dopamin, u pukotinu. Neurotransmiteri prepoznaju odgovarajuće receptore na površini postsinaptičke ćelije i vezivanjem za njih aktiviraju kaskadno širenje signala, najčešće preko G proteina. Oko 10% neurotransmitera se razgradi tokom ovog procesa, a ostatak oslobođenih sa receptora se ponovo monoaminskim transporterima vraćaju u presinaptičku ćeliju. Ovaj proces se naziva ponovno preuzimanje reuptake. Ova grupa lekova inhibicijom ovog procesa, omogućava da monoamini duže ostanu u sinaptičkoj pukotini i tako mogu ponovo biti prepoznati od strane receptora i produžiti stimulaciju postsinaptičke 46
I UVOD ćelije. Međutim, postoji i suprotan efekat. Velika koncentracija monoamina ne aktivira samo postsinaptičke receptore, već preplavljuje i presinaptičke receptore koji aktivacijom šalju signal ćeliji da zaustavi dalju produkciju monoamina. Ovo predstavlja oblik negativne povratne sprege. Ovako nastali nedostatak monoamina postoji određeni period, jer inhibicija transportera se smanjuje usled nedostatka neurotransmitera i nije moguće nadoknaditi njihov deficit. Proces postepenog prilagođavanja podrazumeva smanjivanje senzitivnosti autoreceptora (Gobbi i saradnici, 1997). Upravo promena u senzitivnosti ovih receptora je važna u lečenju depresije. Po ovoj hipersenzitivnoj hipotezi supersenzitivni α 2 adrenergični receptori smanjuju ukupnu aktivnost noradrenergičkih neurona u LC dovodeći do depresivnog fenotipa. Obdukcijom tela samoubica sa dijagnozom depresije, nađena je povećana gustina ovih receptora i time je potvrđena ova hipoteza. (Meana i saradnici, 1992) Osim toga, dolazi i do desenzitizacije, odnosno do smanjenja broja receptora na površini postsinaptičke ćelije, smanjujući tako njenu sposobnost da reaguje na pojavu neurotransmitera. Do ovog dolazi jer povećanje količine monoamina često ne odgovara brzini nastanka novih receptora, dok se uporedo zbog konstantne aktivacije postojeći receptori troše. Zbog toga je dugotrajno davanje ove grupe lekova često praćeno prekidom u dejstvu, koje se manifestuje kao još jači oblik depresije. Ovo neurofiziološko prilagođavanje moždanog tkiva su razlog zbog koga je potrebna konstantna terapija od nekoliko nedelja da bi se efekat antidepresiva u potpunosti manifestovao. Takođe, to objašnjava i pojavu izražene anksioznosti, uobičajnog neželjenog efekta koji se uočava prvih par dana upotrebe leka. 47
1.7.3.2. TRICIKLIČNI I TETRACIKLIČNI ANTIDEPRESIVI I UVOD Između 1960. i 1980. godine triciklični antidepresivi (engl. TCA - Tricyclic antidepressant) su predstavljali najvažniji tretman u lečenju depresije. Prvi put su opisani sedamdesetih godina, a ime su dobili po hemijskoj strukturi koja sadrži 3, odnosno 4 prstena. Smatraju se homogenom grupom lekova, koji se razlikuju jedino po potentnosti inhibicije preuzimanja NA dejstvom na transporter (engl. NRI noradrenaline reuptake inhibitor). Posebno su efikasni kod umerene i teške endogene depresije sa poremećajem spavanja i apetita. U kombinaciji sa antipsihoticima, koriste se u terapiji psihotičnih depresija. Mogu se okvirno podeliti na sedativne i aktivirajuće. Anksiozni pacijenti bolje reaguju na preparate sa sedativnom komponentom (amitriptilin, klomipramin, doksepin, maprotilin, mianserin, trazodon), dok kod povučenih, apatičnih pacijenata, bolje efekte daju manje sedativni preparati (amoksapin, imipramin, nortriptilin). Slika 8. Hemijska struktura tetracikličnog antidepresiva maprotilina Zajednički su im i veliki broj neželjenih efekata koji prate dugotrajno lečenje ovom grupom lekova. Naime, ovi antidepresivi poseduju i afinitet ka histaminskim H1 i muskarinskim receptorima. Neželjena dejstva, poput aritmije i srčani blok, nekada prate primenu tricikličnih antidepresiva, pre svega, amitriptilina. Triciklici i srodni lekovi snižavaju kovulzivni prag; maprotilin se posebno, često, vezuje za pojavu konvulzija. Ostali neželjeni efekti su rezultat aktivacije muskarinskih holinergičnih receptora: pospanost, sušenje usta, zamućen vid (poremećaji akomodacije), 48
I UVOD opstipaciju i otežano mokrenje, problemi sa pamćenjem. Aktivacijom H1 histaminskih receptora dovode do sedacije i povećanja telesne mase, dok vezivanjem za α1 adrenergični receptor dolazi do ortostatske hipotenzije i vrtoglavice. Ovoj grupi pripadaju: imipramin, amitriptilin, maprotilin, amoksapin, doksapin, desipramin, klomipramin. 1.7.3.3. SELEKTIVNI INHIBITORI PREUZIMANJA SEROTONINA (SSRI) Iako su saznanja o ulozi serotonina u depresiji bila poznata još sedamdesetih godina, tek je početkom 1980. godine švedski naučnik Arvid Carlsson prvi sintetisao jedinjenje iz ove klase zimelidin. (Barondes, 2003). Sedam godina kasnije na tržištu se pojavljuje fluoksetin koji je postao vrlo popularan u lečenju depresije, bulimije i anoreksije, kao i kod opsesivno-kompulzivnih poremećaja (Wong i saradnici, 2005). Slika 9. Hemijska struktura fluoksetina Ova klasa antidepresiva (engl. SSRI -serotonin-specific reuptake inhibitor) inhibira preuzimanje serotonina iz sinaptičke pukotine u aksonalni završetak. Ne deluju značajno na preuzimanje NA, DA i Ach, što ih čini lekovima sa znatno manje neželjenih dejstava u odnosu na druge grupe antidepresiva. Ova grupa lekova ispoljava manji sedativni potencijal od TCA kao i manje antiholinergičkih i kardiotoksičnih efekata. Najčešća neželjena dejstva uključuju gastrointestinalne 49
I UVOD smetnje (mučnina, povraćanje, dispepsija, abdominalni bol, dijareja ili konstipacija), anoreksiju sa gubitkom težine i reakcije preosetljivosti (crvenilo, urtikarija, angioedem i fotosenzitivnost). Većina ovih efekata nestaje posle faze prilagođavanja, kada efekat leka postane naglašen. Da li će doći do ovih neželjenih dejstva i u kom obimu je krajnje individualno i zavisi od vrste leka. Kardiovaskularne smetnje su ređa pojava tokom tretmana ovom klasom lekova. Primećeno je da SSRI inhibiraju kanale za Na +, Ca ++ i Cl - u srcu i krvnim sudovima produžavajući QT intervale (Pacher i Kecskemeti, 2004). Veće doze fluoksetina mogu dovosti do tahikardije i infarkta miokarda (Pacher i saradnici, 1999). Anderson (2000) je posmatrajući 102 nasumično odabrana pacijenta sa dijagnozom depresije, utvrdio da nema značajne razlike u efikasnosti između NRI i SSRI, već samo u činjenici da se zbog neželjenih efekata, kojih ima u manjem broju i blažem obliku, SSRI lekovi bolje podnose. Takođe, vrlo važna prednost je što je toksična doza SSRI antidepresiva jako visoka, što otežava mogućnost samoubistva. Lekovi ove grupe osim fluoksetina su i citalopram, dapoksetin, escitalopram, fluvoksamin, paroksetin, sertralin. 50
II CILJ RADA II CILJ RADA 51
II CILJ RADA Na osnovu pregleda literature utvrdili smo da je malo podataka o mogućem efekatu antidepresiva na aktivnost simpato-adrenomedularnog sistema. S druge strane, brojni autori su ukazali na postojanje veze između ove vrste lekova i kardiovaskularnih oboljenja. Cilj ove disertacije je da se utvrdi dejstvo dve različite vrste antidepresiva na fiziološke parametre ponašanja i promene u aktivnosti simpatoadrenalnog sistema kod nestresiranih pacova i pacova izloženih hroničnom blagom nepredvidivom stresu (NBS). Konkretni cilj rada bio je da se ispita uticaj NBS u trajanju od 28 dana i dugotrajnog tretmana antidepresivom maprotilinom, koji inhibira ponovno preuzimanje noradrenalina, i fluksilanom, koji inhibira ponovno preuzimanje serotonina, na: - fiziološke parametre anksioznosti kod pacova u testu izdignutog plus lavirinta i parametre depresije u testu prinudnog plivanja - koncentraciju ACTH, kortikosterona, adrenalina i noradrenalina u plazmi ispitivanih životinja - ekspresiju gena za enzime koji učestvuju u biosintezi kateholamina tirozin hidroksilaze, dopamin β-hidroksilaze i feniletanolamin N- metiltransferaze u srži nadbubrežne žlezde i levoj i desnoj pretkomori i komori srca - ekspresiju gena za β 1 i β 2 adrenoreceptore u levoj i desnoj pretkomori i komori srca 52
III MATERIJAL I METODE III MATERIJAL I METODE 53
3.1. ŽIVOTINJE III MATERIJAL I METODE U eksperimentu su korišćeni pacovi Wistar soja, muškog pola. Jedinke su bile 11 nedelja stare, mase od 280-320 g. Pre izvođenja eksperimenta životinje su uzgajane i čuvane u kontrolisanim uslovima, u klimatizovanoj prostoriji, sa pravilnom smenom svetla i mraka 12 h : 12 h. Pacovi su bili grupisani po četiri u kavezu. Hranu i vodu su uzimali ad libitum. Životinje su bile podeljene na nestresirane kontrole i životinje izložene NBS u trajanju od 28 dana. Nakon četiri nedelje, prva grupa životinja je bila podvrgnuta testu izdignutog plus lavirinta ili testu prinudnog plivanja. Uzorci krvi druge grupe laboratorijskih životinja su uzeti preko katetera, koji je 29. dana od početka tretmana, ugrađen u repnu arteriju. Treća grupa je dekapitovana i disekcijom su uzete nadbubrežne žlezde i četiri dela srca. U svakoj od ovih grupa je bilo 6 do 8 pacova. Sve hirurške i eksperimentalne procedure u ovom eksperimentu bile su u skladu sa etičkim principima o radu sa eksperimentalnim životinjama, po preporukama etičkog komiteta Instituta "Vinča", koje su sadržane u protokolu o brizi i upotrebi laboratorijskih životinja SLASA (Serbian Laboratory Animal Science Association) Biološkog fakulteta, Univerziteta u Beogradu. 3.2. LEKOVI I PROTOKOL TRETMANA Nestresirana, kontrolna grupa životinja i pacovi izloženi NBS su podeljene na tri podgrupe u zavisnosti od tretmana koji su primale. Lekovi su bili pripremani neposredno pre davanja, tako što su bili rastvarani u sterilnoj vodi, a zatim sonifikovani 10 minuta. Prvoj podgrupi pripadale su životinje 54
III MATERIJAL I METODE koje su svakodnevno primale IPS - fluksilan (Aeigis LTD, Cyprus), drugoj grupi je aplikovan IPN - maprotilin (Sigma-Aldrich Chemie, Germany), dok je treća primala placebo (sterilna voda). Aplikacija leka je započeta uporedo sa stresnom procedurom i trajala je 28 dana. Lek je intraperitonealno aplikovan u dozi od 10 mg/kg telesne mase jedinke. 3.3. HRONIČNI NEPREDVIDIVI BLAGI STRES (NBS) Procedura koju smo koristili je modifikovana metoda po Grippo-u (Grippo i saradnici, 2002), dizajnirana da predstavi nepredvidivu prirodu stresora. Životinje su bile izložene kombinaciji sledećih stresora, po protokolu prikazanom u Šemi 1., u periodu od 28 dana: - jedinke su bile lišene vode u periodu od 7 h - gladovanju u trajanju od 17 h - 24 h u konstantno osvetljenoj prostoriji - 24 h u konstantnom mraku - kavez je bio položen pod uglom od 40º u odnosu na vertikalnu osu u vremenskom intervalu od 17 h. - pacovi su držani 17 h u mokrom kavezu u kome je bilo posuto 300 ml vode po prostirci - tokom 24 h je po 8 životinja stavljeno u kavez dimenzija 27x37x13 cm i time bile izlagane stresu agregacije - tokom 24 h su stavljene u kavez po jedna životinja i time bilo izlagane stresu izolacije 55
III MATERIJAL I METODE - tokom 1 h su stavljene u male, uzane, drvene kutije po jedna životinja i time bile izlagane restrain stresu - izlaganje hladnoći na temperature od 4 ºC u periodu od 5 h. - prinudno trčanje na pokretnoj traci 15 min, pri brzini od 20 m/s. - u periodu od petka uveče do ponedeljka ujutru menjana im je smena noći i dana. PONEDELJAK UTORAK SREDA ČETVRTAK PETAK SUBOTA/ NEDELJA PRINUDNO TRČANJE 15 min -20 m/s AGREGACIJA 8:00 8:00 24 h KONSTANTAN MRAK MOKAR KAVEZ ODUZIMANJE VODE ODUZIMANJE HRANE IZOLACIJA RESTRAIN NAGNUT KAVEZ (40 ) 24 h KONSTANTNO OSVETLJENJE HLADNA SOBA ( 4 C ) 8:00 8:00 15:00 8:00 8:00-15:00 15:00 8:00 8:00 8:00 15:00 8:00 1 h 8:00 8:00 9:00-14:00 REVERZAN CIKLUS SVETLO/MRAK ŠEMA 1. : Procedura hroničnog nepredvidivog blagog stresa (NBS) 56
3.4. TESTOVI PONAŠANJA ŽIVOTINJA III MATERIJAL I METODE 3.4.1. TEST PRINUDNOG PLIVANJA (FST-FORCED SWIMMING TEST) Test se bazira na originalnoj metodi po Porsolt u (1978). Pacov se uranja individualno u stakleni cilindar, visine 35 cm i dijametra 24 cm, u kome je sipana voda optimalne temperature (25 0 C) do visine od 20 cm. Voda je menjana između bihevioralnih testova, jer je uočeno da je voda u kojoj je prethodno plivao jedan pacov uticala na ponašanje drugog pacova. Test se vrši u trajanju od 2 dana. Životinje se premeštaju u individualne kaveze 24 h pre izvođenja testa. Prvog dana su životinje ostavljane da plivaju u vodi 15 minuta, a zatim su vađene iz vode, prosušene papirnim ubrusom i vraćene u svoj prvobitni kavez. Dvadeset četiri sata kasnije procedura se ponavlja, ali u trajanju od 5 minuta. Tokom tog perioda beleži se nekoliko parametara. Zapažena su tri oblika ponašanja: - Imobilnost životinja pluta na površini vode praveći samo pokrete neophodne da održi glavu iznad vode. - Plivanje životinja vrši namerne pokrete kroz vodu u horizontalnom položaju - Penjanje borbeni, intezivni pokreti sa sva četiri ekstremiteta i to prednjim šapama iznad vode ili direktno se naslanjajući na zid cilindra. Nekontrolisani pokreti kao što je drhtanje ili brisanje očiju od vode šapama se ignorišu. Umesto da merimo trajanje svakog od tri oblika ponašanja tokom 5 57
III MATERIJAL I METODE minuta, merili smo njihovu frekvenciju, tako što smo beležili koji oblik ponašanja je dominirao u vremenskom intervalu od 5 s. 3.4.2. PROCEDURA IZDIGNUTOG PLUS LAVIRINTA (EPM ELEVATED PLUS MAZE) Lavirint u obliku plusa se sastoji od 4 kraka dužine 50 cm i širine 10 cm. Dva naspramna kraka su otvorena, a druga dva poseduju zidove visine 15 cm. Lavirint je izdignut pola metra od poda. Pacov se stavlja individualno u centar lavirinta tako da je okrenut glavom ka jednom od zatvorenih krakova i pušta se da slobodno istražuje u periodu od 5 minuta. Ponašanje svake jedinke se analizira, uzimajući u obzir standardna merenja: o o ukupan broj ulaza u krakove procenat ulazaka u otvoren krak (broj ulaza u otvoreni krak / ukupan broj ulaza u krakove) o vreme koje je životinja provela u otvorenom kraku (broj sekundi provedenih u otvorenom kraku / 300 s) Ulazak životinje u krak podrazumeva da su sve 4 šape locirane na tom kraku, a izlazak da je sa dve šape van kraka. 58
III MATERIJAL I METODE 3.5. METODA UZIMANJA KRVI KOD PACOVA Uzorci krvi od laboratorijskih životinja uzimani su preko polietilenskog katetera koji je ugrađen u ventralnu repnu arteriju. Operacije su rađene u pentobarbitolskoj anesteziji. Pentobarbitol je aplikovan intraperitonealno 40mg/kg. Prohodnost katetera je održavana povremenim ubrizgavanjem 0,5 ml hepariniziranog fiziološkog rastvora. Stalno ugrađeni kateter u repnoj arteriji omogućava nam da bez ikakvog kontakta sa životinjom uzimamo uzorke krvi u različitim vremenskim intervalima. Tehnika se sastoji u tome što je anesteziranoj životinji na ventralnoj strani repa, i to 1 cm od baze repa, pravljen rez dužine od 1 cm, pri čemu je uočavana repna arterija, koja je preparirana, a zatim u nju ubaćen centimetar polietilenskog katetera (VEB- Poliplast Halberstadt). Kateter je punjen hepariniziranim fiziološkim rastvorom koji je sadržao 300 jedinica heparina u 1 ml. Kateter se podvezivanjem učvrsti, potom podvuče do dorzalne strane repa, a zatim ispod kože do vrata gde je izuvlačen napolje. Na kateter je navlačen metalni štitnik u dužini od 30 cm koji je učvršćen leukoplastom oko vrata. Na kateteru se nalazila igla sa špricem koji je napunjen hepariniziranim fiziološkim rastvorom. Posle operacije je pacovu u toku dana davan dva puta 0,5 ml hepariniziranog fizioločkig rastvora (50 IJ). Preko ovako ugrađenog katetera moguće je bez ikakvog kontakta sa životinjom uzimati uzorke krvi u različitim vremenskim intervalima. Posle 24 h od operacije životinjama je uzimano 0,5 ml krvi. 59
III MATERIJAL I METODE 3.6. METODA ODREĐIVANJA NORADRENALINA I ADRENALINA U PLAZMI Za određivanje kateholamina u plazmi korišćena je modifikovana metoda Peulera i Johnsona (1977). Princip metode se sastoji u promeni kateholamina prisutnih u analiziranom uzorku u odgovarajuće O-metil derivate kataličkim putem u prisustvu delimično prečišćenog enzima COMT-a i radioaktivnog S-adenozil-L-( 3 H- metil)-metionina (SAMe- 3 H). Nastali O-metil derivati se oksidišu u 3 H-vanilin, čija se radioaktivnost meri. Krv je sakupljana u heparinizovane epruvete koje su držane na ledu. Uzorci su centrifugirani na 5000 obrtaja/min 15 min, posle čega je 200 µl plazme bilo deprotenizirano sa 200 µl 0,6N HClO 4 koji je sadržao 2% etilen glikol tetra acil acid (EGTA) i 0,2% MgCl 2 x 6 H 2 O. Dobro izmiksiran uzorak je ponovo bio centrifugiran (5000 obrtaja/min). 200 µl supernatanta je korišćeno za inkubaciju u trajanju od 90 min na temperaturi od 37 ºC u prisustvu 200 µl miksa koji je imao sledeći sastav (količina po uzorku): - 0,5 mg ditiotretiola - 5,0 µl 3M MgCl 2 x 6 H 2 O - 162,5 µl 2M TRIS.HCl pufera koji sadrži 31,8 mm EGTA, ph 9,6-10,0 µl mm inhibitora benzilhidroksilamina. HCl - 2,5 µl SAMe- 3 H - 0,5 mg COMT Uzorci su potom preneti u hladno kupatilo gde je vršen proces zaustavljanja inkubacije dodavanjem 400 µl sveže pripremljenog rastvora: - 350 µl 1M boratnog pufera, ph 8,0 60
III MATERIJAL I METODE - 50 µl neradioaktivnog nosača (normetadrenalina, metadrenalina i 3- metoksitiramina) Stvoreni 3 H-metilovani kateholamini su ekstrahovani u organsku fazu sa 9 ml smeše toluol-izoamilalkohol (3:2). Posle centrifugiranja, 5 min na 1500 obrtaja/min, odvojile su se 2 faze. Nakon zamrzavanja na suvom ledu gornja organska faza je dekantovana u druge pripremljene epruvete koje su sadržale 500 µl 0,1 M sirćetne kiseline. Zatim je usledio postupak vraćanja kateholamina iz organske u neorgansku fazu ekstrakcijom i centrifugiranjem. Posle centrifugiranja organska faza je bačena, a neorganska faza isprana sa 2 ml smeše toluola i izoamil-alkohola (3:2), posle čega je opet usledilo centrifugiranje, zamrzavanje, a potom i odstranjivanje organske faze. Epruvete sa zamrznutim uzorcima su zatvarane sa parafilmom i prenošene u liofilizator na liofilizaciju preko noći. Nakon liofilizacije osušeni uzorci u epruvetama su rastvoreni sa 70 µl smeše metanola i 0,001N HCl (4:1) i cela količina je naneta pasterovom pipetom na silikogelsku ploču (Silikol, Kavalier). Postupak je ponavljen dva puta. Po nanošenju ploče su bile sušene, a zatim držane 30 min u sistemu opisanom od strane DaPrada i Zurcherom (1976): - 80 ml hloroforma - 15 ml etanola (96%) - 10 ml etilamina (70%) Svrha hromatografije je bila odvajanje metadrenalina od normetadrenalina. Nakon što su ploča bile dobro osušene, pomoću UV lampe sa maksimumom od 254 nm, određene su male mrlje na pločama koje u predstavljale te razdvojene amine. One su bile isečene i prenete u scintilacione bočice. Oba amina su se odvajila od silikogela rastvaranjem u 1 ml 0,005N amonijum-hidroksida uz miksiranje od 15 sec. 61
III MATERIJAL I METODE Uzorci A i NA su oksidisani sa 50 µl 4% NaJO 4, a nakon 5 min rekcija je zaustavljena sa 50 µl 10% glicerola i zakišeljena sa 200 µl 1N CH 3 COOH i u svaku bočicu je dodato 10 ml Fosfor only (smeša PPO, POPOP i toluola). 3.6.1. IZOLACIJA COMT Izolacija COMT-a je vršena iz jetre pacova po metodi opisanoj od strane Axelroda i Tomchicka (1958). Sto grama jetre pacova je homogenizovano u izotoničnom rastvoru KCl u odnosu 1:4. Homogenat je centrifugiran 45 min na 1500 obrtaja/min. Supernatant je po centrifugiranju zakišeljen do ph 5,0 sa 1M CH 3 COOH. Rastvor je ponovo centrifugiran 15 min na 1500 obrtaja/min. Po centrifugiranju je ph supernatanta doteravan do ph 6,2 sa 1mM Na 3 PO 4, pa je vršeno isoljavanje zasićenjem do koncentracije 33% amonijum sulfata u tokom jednog sata. Ponovo je centrifugiran 15 min na 1500 obrtaja/min, a dobijeni supernatant ponovo isoljavan do koncentracije 55% amonijum sulfata u toku jednog sata. Zasićeni precipitat je rastvoren u 2 ml 1 mm fosfatnog pufera. Tako zasićeni, delimično izolovani enzim, je dijaliziran 12 h. Po dijaliziranju enzima, uzorci su centrifugirani 20 min na 1500 obrtaja/min. Dobijeni supernatant je liofiliziran. Ovako dobijeni enzim je aktivan u periodu od jedne godine. 62
III MATERIJAL I METODE 3.7. METODA ODREĐIVANJA ACTH U PLAZMI ACTH u plazmi je meren hemiluminiscentnom metodom uz pomoć automatskog analizatora Immulite Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, CA., U.S.A. Krv je sakupljana u posebnim epruvetama sa EDTA i centrifugirana 10 min na 3500 obrtaja/min na + 4 C. Uzorak je stavljan u serumsku čašicu analizatora, a na nju stavljena reakciona čašica sa anti-acth antitelom i puferom. Nakon toga u frižideru aparata, u reakcionoj čašici, dodata su dva reagensa LACA (proteinski pufer/serum) i LACB (alkalna fosfataza) i hemiluminiscentni supstrat. Aparat je očitavao vrednost ACTH u pg/ml seruma. 3.8. METODA ODREĐIVANJA KORTIKOSTERONA U PLAZMI Kortikosteron u serumu je meren radioimunološkom metodom uz pomoć RIA komercijalnog kita (ICN Biochemicals, Costa Mese, CA). Vrednost je određivana u ng/ml plazme. Zapremina od 10 µl seruma rastvorena je sa 1990 µl steroidnog rastvora. Nakon toga dodato je 200 µl 125 J kortikosterona i 200 µl antikortikosteroida. Sadržaj je promešan na vorteksu i ostavljen na sobnoj temperaturi 2 h. Posle inkubacije je dodato 500 µl precipitatnog rastvora i promešano na vorteksu. Potom je vršeno centrifugiranje 15 min na 2500 obrtaja/min. Supernatant je dekantovan, a talogu koji je ostao na dnu epruvete merena radioaktivnost na gama brojaču. 63
3.9. IZOLACIJA RNK III MATERIJAL I METODE Totalna RNK je izolovana korišćenjem Trizol reagensa (Invitrogen, CA, U.S.A). Ovaj reagens je monofazni rastvor fenola i guanidin izotiocianat, koji održava integritet RNK molekula, a razlaže pri tom ćelijske komponente. Izolacija je vršena u sterilnim uslovima. Pre početka rada potrebno je napraviti DPC H 2 O. U sterilnoj redestilovanoj vodi dodato je 0,1 ml dietilpirokarbonat 97% NMR (Sigma, Germany), pa je rastvor autoklaviran i raspipetovan u sterilne epruvete. Tkivo je preneto u epruvete u kojima je dodato u zavisnosti od veličine tkiva 500-600 µl Trizola (+ 4ºC). Homogenizacija je vršena električnim homogenizerom (IKA-WERKE, GmbH & Co, Germany). Pre rada sa uzorkom homogenizer je ispran sa redestilovanom vodom 1 minut, a zatim sa autoklaviranom DPC vodom, pa u Trizolu. Tkivo je homogenizovano u trajanju od 20 do 30 sec, pa je uzorak držan na ledu da bi se sprečilo uništavanje RNK toplotom koju proizvodi aparat pri radu. Postupak je ponovljen 3 puta. Supernatant je, potom, inkubiran 5 minuta na + 30 ºC da bi došlo do potpune disocijacije nukleoproteinskih kompleksa. U epruvete je dodan hloroform u količini od 1/5 zapremine dodatog Trizola. Uzorci su ručno promućkani, pa inkubirani 2-3 minuta na +30 ºC. Potom su centrifugirani na 12000 RPM 20 min na +4 ºC. Ovako dolazi do razdvajanja 3 faze: najniže crvene fenol-hloroform faze, srednje proteinske faze i gornje opalescentne faze, koja sadrži totalnu RNK. Gornja faza je preneta u pripremljene čiste, sterilne epruvete, koje su držane sve vreme na ledu. Uzorku je dodat 3M CH 3 COONa ph 5,0 (+ 4 ºC) i to 1/10 od količine dobijenog volumena supernatanta, izmešano, pa dodato 96% etanol (- 20 ºC), u količini od 2 zapremine ukupnog volumena u epruvetama, promešano na votreksu i ostavljeno preko noći. 64
III MATERIJAL I METODE Sutradan je uzorak vorteksovan, pa centrifugiran 10 min na 12000 RPM. Gornja faza je odlivena, dodan 1 ml 75% etanola (- 20 ºC), a potom centrifugiran 20 min na 12000 RPM. Ponovo je odlivena gornja faza i dodan 1 ml 96% etanola (- 20 ºC). Uzorci su čuvani na 20 ºC. 3.10. SINTEZA KOMPLEMENTARNE DNK (cdnk) Reverzna transkripcija je vršena korišćenjem Ready-To-Go You-Prime First- Strand Bead (Amersham pharmacia, Biotech) i pd (N) 6 prajmera po protokolu proizvođača. Uzorci RNK koji smo čuvali u etanolu je centrifugiran 15 min na 12000 RPM, potom je odliven etanol i epruvete su ostavljene na čistom filter papiru da se prosuše. U epruvete je dodata DPC voda i dobro je izmešano da bi se sva nataložena RNK rastvorila. Koncentracija uzorka merena je na Nano Drop aparatu (Applied Biosystems, USA). Za prepis uzorci su pripremani u sterilnim RNK-aze free epruvetama tako da je u 12 µl bilo 1500 ng irnk. Korićen je termostat (Eppendorf Termostat plus, Germany) u kome su uzorci inkubirani 10 minuta na + 65 ºC. Uzorci su držani na hladnom, a za to vreme 2 kuglice reakcione smeše su rastvarane sa 40 µl DPC vode i dodavano je 2 µl pd (N) 6 prajmera rastvorenog u koncentraciji od 0,2 µg/ml. Svakom uzorku je dodavano po 21 µl reakcione smeše. Uzorak je blago izmešan, a zatim inkubiran 60 minuta na + 37 ºC. Dobijena cdnk čuvana je na - 20 ºC. 65
3.11. REAL-TIME PCR III MATERIJAL I METODE Pripremana je reakciona smeša za Taqman PCR reakciju koja je sadržala: - Esej za kvantitativno utvrđivanje genske ekspresije sa specifičnim prajmerima za amplifikaciju ciljanog gena obeleženim 6-FAM bojom i Taqman MGB (Minor groove binder) probu koja je locirana između dva prajmera i koja sadrži nefluorescentni prigušivač. Korišćeni su eseji Assay-on-Demand Gene Expression Products (Applied Biosystems, USA) za TH (ID:Rn00562500-m1), DBH (ID:Rn 00565819-m1), PNMT gen (ID:Rn 01495589-g1), β 1 -AR (ID: Rn00824536_s1) i β 2 -AR (ID: Rn00560650_s1). - Master miks - TaqMan Universal Master Mix with AmpErase UNG (Applied Biosystems, USA), koji u svom sastavu ima Taqman polimerazu, dntp, puffer, MgCl 2 i pasivnu boju ROX. Odnos zapremine master miksa u odnosu na zapreminu eseja je 10:1. Dopunjavan je DPC vodom do volumena od 15 µl i dodavan u svaki bunarić mikrotitarske ploče. Na kraju je smeši dodavan cdnk uzorak (10 ng prepisane cdnk). PCR reakcija je izvođena korišćenjem aparata ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, USA). Protokol reakcije je bio: 2 minuta na 50 o C, zatim 10 minuta na 95 o C, praćeno sa 40 ciklusa na 95 o C po 15 sekundi i 60 s na 60 o C. Kvantifikacija je vršena korišćenjem kvantitativne C T metode po Livak-u i Schmittgen-u (2001). Dobijeni rezultati analizirani su softverom RQ Study Add ON software za 7000 v 1.1 SDS instrument (ABI Prism Sequence Detection System) sa pouzdanošću od 95% (p<0.05). Kod ove metode vrednost uzorka je normalizovana u odnosu na endogenu kontrolu i u relativnom odnosu na kalibrator. Vrednost relativne 66
III MATERIJAL I METODE ekspresije uzorka je dobijen korišćenjem formule N uzorka =2 C T. Kod relativne kvantifikacije analizira se promena u genskoj ekspresiji u odnosu na referentni uzorak. U tu svrhu se koristi endogena kontrola, odnosno housekeeping gen čiji nivo ekspresije treba da je visok i konstantan tokom eksperimenta. Korišćenjem odgovarajuće kontrole koriguju se i greške spektrofotometrijskog merenja koncentracije RNK i efikasnost reverzne transkripcije, a takođe i regulišu razlike u efikasnosti amplifikacije među esejima. Svi transkripti su normalizovani u odnosu na ekspresiju gena za ciklofilin A (ID:Rn 00690933). Proveravani su prethodno nivoi ekspresije ovog gena u uzorcima uzetih od životinja različito tretiranih, da bi se utvrdilo da sami tretmani nemaju efekta na njegovu ekspresiju. Svaki uzorak je meren u triplikatima i utvrđivana C T vrednosti. Ova vrednost predstavlja broj ciklusa na kome je kriva amplifikacije presekla prag detekcije aparata i ona je obrnuto proporcionalna broju kopija u datom uzorku. Zbog individualnih razlika među životinjama, kao kalibrator je uziman kontrolni uzorak čija je vrednost ekspresije blizu srednje vrednosti svih uzoraka iz grupe i sa najmanjom greškom merenja. 67
3.12. STATISTIČKA ANALIZA REZULTATA III MATERIJAL I METODE Svi rezultati su izraženi kao srednja vrednost ± standardna greška. Rezultati eksperimenta su analizirani statistički korišćenjem analize varijansi sa dva faktora (ANOVA 2) sa ciljem da se utvrdi da li postoje razlike između srednjih vrednosti različitih eksperimentalnih grupa. Post-hoc analizom je utvrđen efekat hroničnog stresa u odnosu na nestresirane kontrole i efekat hroničnog tretmana noradrenergičkim i serotonergičkim antidepresivima, korišćenjem Tukey testa. Za graničnu značajnost uzimane su vrednosti p<0,05, p<0,01 i p<0,001. 68
IV REZULTATI IV REZULTATI 69
IV REZULTATI 4.1. FIZIOLOŠKI PARAMETRI PONAŠANJA PACOVA HRONIČNO IZLOŽENIH NBS 4.1.1. Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na parametre anksioznosti u testu izdignutog plus lavirinta kod nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS 9 ukupan broj ulaza u krakove lavirinta 8 7 6 5 4 3 2 1 ## ## PLACEBO MAPROTILIN FLUKSILAN ## 0 KONTROLA NBS 40 + frekvencija ulazaka u otvoreni krak (%) 35 30 25 20 15 10 5 ## ++ ## ## 0 KONTROLA NBS 70
IV REZULTATI vreme provedeno u otvorenom kraku (%) 45 40 35 30 25 20 15 10 5 +++ ## + ## PLACEBO MAPROTILIN FLUKSILAN ## 0 KONTROLA NBS SLIKA 1. Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom i fluksilanom na ukupni broj ulazaka u otvoreni krak, frekvenciju ulazaka u otvoreni krak i procenat vremena provedenog na otvorenom kraku nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS u testu izdignutog plus lavirinata. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost ± standardna greška za uzorak od 9 pacova. Statistička značajnost: ## p<0.01 nestresirane kontrole koje su primale placebo vs. grupa hronično izložena NBS koja je primala placebo; + p<0.05; ++ p<0.01; +++ p<0.001 maprotilin vs. placebo Rezultati prikazani na Slici 1. pokazuju da je NBS statistički značajno uticao na sva tri parametra posmatrana u testu izdignutog plus lavirinta (ukupan broj ulazaka - F (1.30) = 32,20, p<0,001; % ulazaka u otvoreni krak F (1.30) =47,70, p<0,001; % vremena provedenog u otvorenom kraku F (1.30) =73,95, p<0,001). Post-hoc analizom je utvrđeno da je pacovima izloženih NBS i tretiranih placebom ukupan broj ulazaka u krakove, kao i procenat ulaza u otvoreni krak za 70% manji (p<0,01, Tukey test) nego kod nestresiranih pacova. Stresirane životinje koje su primale placebo su vremenski za 82% kraće provele u otvorenom kraku u odnosu na kontrolne životinje tretirane placebom (p<0,01, Tukey test). 71
IV REZULTATI Hronična aplikacija antidepresivima nije imala uticaja na ukupan broj ulazaka, dok je imala značajan efekat na broj ulazaka u otvoreni krak (F (2.30) =11,04, p<0,001) i vreme provedeno u otvorenom kraku (F (2.30) =42,54, p<0,001) Na Slici 1. se može videti da je tretman maprotilinom povećao ulazak u otvoreni krak za 60% kod kontrola (p<0,05) i za 78% (p<0,01) kod pacova izloženih NBS. Dužina vremenskog intervala koji su pacovi proveli u otvorenom kraku takođe je povećana kod kontrola za 82% (p<0,001) i kod stresiranih pacova za 74% (p<0,05). Životinje tretirane fluksilanom pokazuju tendencije ka povećanju ovih parametara, ali bez statističke značajnosti. 72
IV REZULTATI 4.1.2. Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na parametre u testu prinudnog plivanja kod nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS frekvencija imobilnosti 40 35 30 25 20 15 ** ### +++ ### PLACEBO MAPROTILIN FLUKSILAN *** ### 10 +++ 5 0 KONTROLA NBS 40 +++ 35 30 frekvencija penjanja 25 20 15 10 ### +++ ### 5 0 KONTROLA NBS 73
IV REZULTATI 40 35 *** * PLACEBO MAPROTILIN FLUKSILAN 30 frekvencija plivanja 25 20 15 # ++ # 10 5 0 KONTROLA NBS SLIKA 2. Efekat hroničnog tretmana maprotilinom i fluksilanom na frekvenciju imobilnosti, penjanja i plivanja posmatrano svakih 5 s tokom 5 min FST testa. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM za uzorak od 9 pacova. Statistička značajnost: # p<0.05; ### p<0.001 nestresirane kontrole koje su primale placebo vs. grupa hronično izložena NBS koja je primala placebo; ++ p<0.01; +++ p<0.001 maprotilin vs. placebo; ** p<0.01; *** p<0.001 fluksilan vs. placebo. Rezultati predstavljeni na Slikama 2a, 2b i 2c pokazuju da je NBS imao značajan efekat na sva tri parametra posmatrana u FST testu (imobilnost - F (1.28) = 149,78, p<0,001; plivanje F (1.28) =9,68, p<0,01; penjanje F (1.28) =65,14, p<0,001). Pacovi izloženi NBS i tretirani placebom su u odnosu na nestresirane životinje značajno više (za 46%, p<0,001) vremena proveli nepokretni u vodi, dok im je smanjeno vreme provedeno u plivanju (21%, p<0,05) i penjanju (47%, p<0,001). Iz prikazanih rezultata se, takođe, vidi da antidepresivi značajno smanjuju imobilnost F (1.28) =53,52, p<0,001 (ANOVA sa dve varijanse). Post hoc analiza je pokazala da je kod nestresiranih životinja koje su primale maprotilin za 74% 74
IV REZULTATI (p<0,001) smanjеno vreme koje je pacov proveo nepokretan u vodi, a kod onih koji su primali fluksilan za 25% (p<0,01). Slično, kod pacova izloženih NBS, NRI je za 21%, a SSRI antidepresiv je za 38% umanjio trajanje ovog oblika ponašanja tokom testa (p<0,001). Uočeno je da je penjanje, kao oblik ponašanja, statistički značajno učestaliji kod životinja tretiranih maprotilinom (ANOVA sa dve varijanse- F (1.28) = 160,30, p<0,001). Maprotilin je kod nestresiranih pacova za 130% (p<0.001), a kod stresiranih za 163% (p<0,001) produžio borbeno ponašanje u odnosu na grupu koja je primala placebo. Kod životinja tretiranih fluksilanom nisu uočene značajne promene u ovom obliku ponašanja. Analiza varijansi je, s druge strane, pokazala da je fluksilan prevashodno uticao na plivanje (F (1.28) = 36,09, p<0,001). Pri tome je kod nestresiranih pacova plivanje učestalije za 42% (p<0,001), dok je kod stresiranih životinja za 66% (p<0,05) u odnosu na grupu koja je primala sterilnu vodu. Aplikacija maprotilina nije dovela do promene u učestalosti plivanja. 75
IV REZULTATI 4.2. KONCENTRACIJA HORMONA U PLAZMI PACOVA HRONIČNO IZLOŽENIH NBS 4.2.1. Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na koncentraciju ACTH u plazmi nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS 70 60 + * PLACEBO MAPROTILIN FLUKSILAN 50 conc. ACTH (ng/ml) 40 30 20 10 0 KONTROLA NBS SLIKA 3. Efekat hroničnog tretmana maprotilinom i fluksilanom na koncentraciju ACTH u plazmi nestresiranih kontrola i CUMS pacova. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM za uzorak od 6 pacova. Statistička značajnost: + p<0,05: maprotilin vs. placebo; * p<0,05: fluksilan vs. placebo. Na Slici 3. je prikazan efekat maprotilina (NRI) i fluksilana (SSRI) na koncentraciju ACTH u plazmi kod nestresiranih i pacova izloženih NBS u trajanju od 28 dana. NBS nije doveo do promene u količini ACTH u plazmi. Promene se ne uočavaju ni kod nestresiranih pacova tretiranih antidepresivima. Za razliku od njih, kod stresiranih životinja tretiranih lekovima dolazi do značajnog pada u koncentraciji 76
IV REZULTATI ACTH u plazmi i to kod tretiranih maprotilinom za 12% (p<0,05), dok je tretman fluksilanom snizio za 14% (p<0,05). 4.2.2. Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na koncentraciju kortikosterona u plazmi nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS 120 100 # PLACEBO MAPROTILIN FLUKSILAN conc. CORT (pg/ml) 80 60 40 + * 20 0 KONTROLA NBS SLIKA 4. Efekat hroničnog tretmana maprotilinom i fluksilanom na koncentraciju kortikosterona u plazmi nestresiranih i pacova izloženih NBS. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM za uzorak od 6 pacova. Statistička značajnost: # p<0.05, nestresirani pacovi vs. pacovi hronično izloženih NBS; + p<0.05, maprotilin vs. placebo; * p<0.05, fluksilan vs. placebo. Promene u nivou CORT u plazmi kod nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS su prikazane na Slici 4. Rezultati pokazuju da je NBS doveo do povećanja nivoa CORT u plazmi za 37% (p<0,05). S druge strane, maprotilin i fluksilan nemaju efekta na koncentraciju ovog hormona kod nestresiranih pacova, ali 77
IV REZULTATI je detektovano smanjenje nivoa CORT kod grupe životinja izložene NBS. Aplikacija maprotilina u trajanju od 28 dana je za 38%, a fluksilana za 35%, snizila koncentraciju CORT u odnosu na grupu koja je primala placebo (p<0,05). 4.2.3. Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na koncentraciju NA u plazmi nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS 1000 900 *** PLACEBO MAPROTILIN 800 ** FLUKSILAN 700 conc. NA (pg/ml) 600 500 400 ++ + 300 200 100 0 KONTROLA NBS SLIKA 5. Efekat hroničnog tretmana maprotilinom i fluksilanom na koncentraciju noradrenalina u plazmi nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM za uzorak od 6 pacova. Statistička značajnost: + p<0.05, ++ p<0.01 maprotilin vs. placebo; ** p<0.01, *** p<0.001 fluksilan vs. placebo. Efekat maprotilina i fluksilana na nivo NA u plazmi nestresiranih i pacova izloženih NBS je prikazan na Slici 5. NBS je uslovila statistički neznačajno povećanje nivoa NA u plazmi u odnosu na kontrole. Statističkom analizom koristeći ANOVA test sa dve varijanse (tretman i grupu) potvrđeno je da su lekovi imali statistički značajan 78
IV REZULTATI efekat (F (1.20) = 40,60, p<0,001). Maprotilin je povisio nivo NA za 100% (p<0,01) kod nestresiranih, a za 44% (p<0,05) kod stresiranih pacova u odnosu na grupu koja je primala sterilnu vodu. Koncentracija ovog hormona u plazmi posle aplikacije fluksilanom je značajno povećana i to za 245% (p<0,001) kod nestresiranih i za 174% kod pacova izloženih NBS (p<0,01) u odnosu na odgovarajuću grupu koja je primala placebo. 4.2.4. Dejstvo hroničnog maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na koncentraciju adrenalina u plazmi nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS 140 120 *** *** PLACEBO MAPROTILIN FLUKSILAN 100 conc. A (pg/ml) 80 60 40 20 0 KONTROLA NBS SLIKA 6. Efekat hroničnog tretmana maprotilinom i fluksilanom na koncentraciju adrenalina u plazmi nestresiranih kontrola i pacova hronično izloženih NBS. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM za uzorak od 6 pacova. Statistička značajnost: *** p<0.001, fluksilan vs. placebo. 79
IV REZULTATI Rezultati prikazani na Slici 6. pokazuju da ni hronični stres u trajanju od 28 dana, ni tretman maprotilinom ne dovode do povećanja nivoa A u plazmi. Takođe, hronična aplikacija fluksilana (SSRI) statistički značajno povećava nivo A kako kod nestresiranih životinja, tako i kod pacova izloženih NBS. ANOVA-analizom varijansi sa dva faktora (tretman i grupa) potvrđena je statistička značajnost tretmana fluksilanom (F (1.20) = 368,11, p<0,001). Koncentracija adrenalina u plazmi je za 174% veća kod nestresiranih pacova tretiranih fluksilanom (p<0,001), odnosno za 128% veća kod stresiranih jedinki tretiranih ovim antidepresivom (p<0,001) u poređenju sa grupom koja je primala placebo. 80
IV REZULTATI 4.3. EKSPRESIJA ENZIMA KOJI UČESTVUJU U BIOSINTEZI KATEHOLAMINA U SRŽI NADBUBREŽNIH ŽLEZDA PACOVA HRONIČNO IZLOŽENIH NBS 4.3.1. Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na relativnu gensku ekspresiju enzima TH nestresiranih i CUMS pacova relativna genska ekspresija TH enzima 2,5 2 1,5 1 0,5 * # # # * PLACEBO MAPROTILIN FLUKSILAN 0 KONTROLA NBS SLIKA 7. Efekat hroničnog tretmana maprotilinom i fluksilanom na nivo irnk za enzim TH u srži nadbubrežnih žlezda nestresiranih kontrola i pacova hronično izloženih NBS. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM za uzorak od 6 pacova. Statistička značajnost: # p<0,05; nestresirane kontrole vs. pacovi hronično izloženi NBS; * p<0,05; fluksilan vs. placebo. Promene u nivou irnk za TH u srži nadbubrežnih žlezda kod nestresiranih kontrola i pacova hronično izloženih NBS su prikazane na Slici 7. Analizom varijansi sa dva faktora (ANOVA 2) pokazano je da je NBS imao efekta na nivo irnk za TH (F (1.28)= 21,39, P<0,01) u srži nadbubrežnih žlezdi. Rezultati pokazuju da je nivo irnk za TH za 49% veći kod životinja izloženih NBS u odnosu na nestresirane. Takođe je 81
IV REZULTATI pokazano da tretman fluksilanom u trajanju od 28 dana značajno povećao nivo irnk za TH (F (2.28)= 12,29, p<0,05). Post-hoc analiza je pokazala da je ovaj tretman povećao vrednosti genske ekspresije ovog enzima za 43% kod nestresiranih, a za 34% kod hronično stresiranih. Maprotilin nije uticao na nivoe irnk TH enzima. 4.3.2. Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na relativnu gensku ekspresiju enzima DBH nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS 2,5 * # PLACEBO MAPROTILIN FLUKSILAN relativna genska ekspresija DBH enzima 2 1,5 1 0,5 * # # 0 KONTROLA NBS SLIKA 8. Efekat hroničnog tretmana maprotilinom i fluksilanom na nivo irnk za enzim DBH u srži nadbubrežnih žlezda nestresiranih kontrola i pacova hronično izloženih NBS.. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM za uzorak od 6 pacova. Statistička značajnost: # p<0.05; nestresirane kontrole vs. pacovi hronično izloženih NBS.; * p<0.05; fluksilan vs. placebo. Na Slici 8. grafički je prikazan efekat NBS (F (1.28) =20,39, P<0,001) i tretmana antidepresivima ( F (2.28) =9,95, P<0,001) na gensku ekspresiju DBH enzima u srži nadbubrežnih žlezda. Post hoc analiza je pokazala da je relativna genska ekspresija 82
IV REZULTATI ovog enzima kod stresiranih pacova za 39% veća u poređenju sa vrednostima dobijenim kod kontrolnih životinja koje su primale placebo (p<0.05). Dobijeni rezultati pokazuju da postoje značajne interakcije između dejstva stresa i tretmana fluksilanom na ekspresiju ovog gena. Tretman fluksilanom je u nadbubrežnim žlezdama kod nestresirane grupe životinja za 42% (p<0,05), a kod hronično stresiranih pacova za 40% (p<0,05) povećao vrednosti relativne genske ekspresije DBH. Tretman maprotilinom nije imao efekta na gensku ekspresiju DBH. 4.3.3. Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na relativnu gensku ekspresiju enzima PNMT nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS relativna genska ekspresija PNMT enzima 2,5 2 1,5 1 0,5 # # # PLACEBO MAPROTILIN FLUKSILAN 0 KONTROLA NBS SLIKA 9. Efekat hroničnog tretmana maprotilinom i fluksilanom na nivo irnk za enzim PNMT u srži nadbubrežnih žlezda nestresiranih kontrola i pacova hronično izloženih NBS. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM za uzorak od 6 pacova. Statistička značajnost: # p<0.05; nestresirane kontrole vs. pacovi hronično izloženi NBS. 83
IV REZULTATI Dobijeni rezultati prikazani na Slici 9. pokazuju da NBS ima značajan efekat na porast nivoa irnk PNMT enzima (F (1.28)= 12,44, p<0,01) u srži nadbubrežnih žlezda. Hronični stres je značajno povećao (za 26%, p<0,05) vrednosti relativne genske ekspresije ovog enzima. Tretman maprotilinom, kao i tretman fluksilanom nisu menjali nivo irnk za PNMT kako kod netresiranih, tako i kod stresiranih životinja. 84
IV REZULTATI 4.4. EKSPRESIJA ENZIMA KOJI UČESTVUJU U BIOSINTEZI KATEHOLAMINA U SRCU PACOVA HRONIČNO IZLOŽENIH NBS 4.4.1. Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na relativnu gensku ekspresiju enzima TH u desnoj i levoj pretkomori srca nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS relativna genska ekspresija TH enzima 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 +++ * DESNA PRETKOMORA ### + * ## PLACEBO MAPROTILIN FLUKSILAN 0 KONTROLA NBS relativna genska ekspresija TH enzima 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 ** LEVA PRETKOMORA # + * ## 0 KONTROLA NBS SLIKA 10. Efekat hroničnog tretmana maprotilinom i fluksilanom na nivo irnk za enzim TH u desnoj i levoj pretkomori srca nestresiranih kontrola i pacova hronično 85
IV REZULTATI izloženih NBS. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM za uzorak od 6 pacova. Statistička značajnost: # p<0.05, ## p<0,01, ### p<0,001 nestresirane kontrole vs. pacovi hronično izloženi NBS; + p<0.05, +++ p<0,001 maprotilin vs. placebo; * p<0.05, ** p<0.01 fluksilan vs. placebo. Na Slici 10. su prikazani rezultati relativne genske ekspresije enzima TH u pretkomorama kod nestresiranih kontrola i pacova izloženih NBS. Analizom varijansi sa dva faktora (ANOVA 2) pokazano je da je NBS imao značajan efekat na nivo irnk za TH u desnoj (F (1.23) =45,15, p<0,001) i levoj (F (1.24) =26,35, p<0,001) pretkomori srca. Pri tome postoji i statistički značajna razlika u efektu stresa između leve i desne strane (F (1.14) = 37,52, p<0,001). Post hoc analiza je pokazala da je hronični stres značajno smanjio nivo irnk za TH i to za 65% (p<0,001) u desnoj, odnosno za 32% (p<0,05) u levoj pretkomori. Tretman antidepresivima je značajno uticao na ekspresiju enzima TH u pretkomorama (u desnoj - F (2.23) =29,74, p<0,001; u levoj - F (2.24) =19,24, p<0,001). Hronična aplikacija maprotilinom uslovila je sniženje ekspresije ovog enzima u desnoj pretkomori, i to 58% (p<0,001) kod nestresiranih i 36% (p<0,05) kod stresiranih pacova. U levoj pretkomori tretman maprotilinom nije imao efekta kod nestresiranih pacova, dok je kod pacova hronično izloženih NBS povećao nivo irnk za TH za 25% (p<0,05). Nasuprot maprotilinu, fluksilan je značajno povećao vrednosti relativne genske ekspresije ovog enzima, i to kako u levoj, tako i u desnoj. Povećanje je bilo uočljivije kod nestresiranih pacova u poređenju sa pacovima izloženih NBS. 86
IV REZULTATI 4.4.2. Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na relativnu gensku ekspresiju enzima TH u desnoj i levoj komori srca nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS relativna genska ekspresija TH enzima 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 DESNA KOMORA + ## ** ## PLACEBO MAPROTILIN FLUKSILAN 0 KONTROLA NBS relativna genska ekspresija TH enzima 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 LEVA KOMORA ** ## 0 KONTROLA NBS SLIKA 11. Efekat hroničnog tretmana maprotilinom i fluksilanom na nivo irnk za enzim TH u desnoj i levoj komori srca nestresiranih kontrola i pacova hronično izloženih NBS. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM za uzorak od 6 87
IV REZULTATI pacova. Statistička značajnost: ## p<0,01, nestresirane kontrole vs. pacovi hronično izloženi NBS; + p<0,05 maprotilin vs. placebo; ** p<0.01 fluksilan vs. placebo Na Slici 11. prikazane su promene relativne genske ekspresije TH u komorama srca kod pacova izloženih NBS hronično tretiranih maprotilinom i fluksilanom. Izlaganje hroničnom stresu pacova koji su primali placebo nije imalo značajnog efekta na ekspresiju enzima TH u desnoj i levoj komori. Samo je tretman stresiranih pacova antidepresivom imao značajan efekat na porast nivoa irnk za TH. Maprotilin je povećao za 172% (p<0,01) vrednosti genske ekspresije TH enzima kod pacova hronično izloženih NBS u desnoj komori, dok u levoj komori nije menjao gensku ekspresiju ovog enzima. Tretman fluksilanom je povećao vrednosti ekspresije TH enzima u obe komore. Nivo irnk TH je povećan za 124% (p<0,01) u desnoj i za 198% (p<0,01) u levoj srčanoj komori hronično stresiranih životinja. 88
IV REZULTATI 4.4.3. Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na relativnu gensku ekspresiju enzim DBH u desnoj i levoj pretkomori srca nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS relativna genska ekspresija DBH enzima 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 +++ ** DESNA PRETKOMORA ### + * # PLACEBO MAPROTILIN FLUKSILAN 0 KONTROLA NBS 1,4 LEVA PRETKOMORA relativna genska ekspresija DBH enzima 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 ++ ** ### + # * ## 0 KONTROLA NBS SLIKA 12. Efekat hroničnog tretmana maprotilinom i fluksilanom na nivo irnk za enzim DBH u desnoj i levoj pretkomori srca nestresiranih kontrola i pacova hronično izloženih NBS. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM za uzorak od 6 89
IV REZULTATI pacova. Statistička značajnost: ### p<0.001; nestresirane kontrole vs. pacovi hronično izloženi NBS; + p<0,05, ++ p<0.01 maprotilin vs. placebo; ** p<0.01 fluksilan vs. placebo. Iz rezultata grafički prikazanih na Slici 12. uočavamo da je NBS uticao na nivo irnk DBH enzima u desnoj (F (1.22) =21,36, p<0,001) i levoj pretkomori (F (1.25) =8,23, p<0,01). Post hoc analiza je pokazala da je hronično izlaganje stresu značajno smanjilo ekspresija ovog enzima i to za 55% (p<0.001) u desnoj, a za 70% (p<0,001) u levoj pretkomori. Analizom varijansi (ANOVA 2) je potvrđeno da tretman antidepresivima različito utiče na ekspresiju DBH gena u obe pretkomore srca (u desnoj - F (2.22) =29,66, p<0,001; u levoj F (2.25) =4,60, p<0,05) Tretman maprotilinom dovodi do sniženja ekspresije proučavanog gena kod obe grupe životinja, ali se ne uočava statistički značajna razlika između grupa. Međutim, tretman fluoksilanom je povećao vrednosti relativne genske ekspresije DBH kod obe grupe životinja. Nivo genske ekspresije DBH je veći kod nestresirane grupe životinja i to za 72% u desnoj, odnosno za 157% u levoj pretkomori u odnosu na pacove uzložene NBS. 90
IV REZULTATI 4.4.4. Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na relativnu gensku ekspresiju enzima DBH u desnoj i levoj komori srca nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS relativna genska ekspresija DBH enzima 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 DESNA KOMORA PLACEBO MAPROTILIN FLUKSILAN 0 KONTROLA NBS 1,8 LEVA KOMORA relativna genska ekspresija DBH enzima 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 KONTROLA NBS SLIKA 13. Efekat hroničnog tretmana maprotilinom i fluksilanom na nivo irnk za enzim DBH u desnoj i levoj komori srca nestresiranih kontrola i pacova hronično izloženih NBS. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM za uzorak od 6 91
IV REZULTATI pacova. Statistička značajnost: # p<0,05 nestresirane kontrole vs. pacovi hronično izloženi NBS. Iz prikazanih rezultata na Slici 13. uočavamo da NBS i tretman antidepresivima.ne dovodi do značajnih promena relativne genske ekspresije DBH enzima u komorama srca. Vrednosti relativne genske ekspresije DBH kod stresirane grupe životinja koje su primale maprotilin i fluksilan, nije bilo moguće detektovati u levoj komori. 92
IV REZULTATI 4.4.5. Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na relativnu gensku ekspresiju enzima PNMT u desnoj i levoj pretkomori srca nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS relativna genska ekspresija PNMT enzima 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 DESNA PRETKOMORA PLACEBO MAPROTILIN FLUKSILAN 0 KONTROLA NBS 2 LEVA PRETKOMORA relativna genska ekspresija PNMT enzima 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 # # # 0 KONTROLA NBS SLIKA 14. Efekat hroničnog tretmana maprotilinom i fluksilanom na nivo irnk za enzim PNMT u desnoj i levoj pretkomori srca nestresiranih kontrola i pacova hronično izloženih NBS. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM za uzorak od 6 93
IV REZULTATI pacova. Statistička značajnost: # p<0.05; nestresirane kontrole vs. pacovi hronično izloženi NBS. Rezultati prikazani na Slici 14. ukazuju da je NBS imao značajan efekat na nivo irnk PNMT enzima (F (1.24) =8,76, p<0,01) samo u levoj pretkomori. Post hoc analiza je pokazala da je relativna genska ekspresija povećana kod stresiranih pacova za 39% (p<0,05). Tretman antidepresivima nije imao značajan efekat na ekspresiju gena za PNMT. 94
IV REZULTATI 4.4.6. Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na relativnu gensku ekspresiju enzima PNMT u desnoj i levoj komori srca nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS relativna genska ekspresija PNMT enzima 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 +++ ** DESNA KOMORA ## +++ *** ### PLACEBO MAPROTILIN FLUKSILAN 0 KONTROLA NBS 1,6 LEVA KOMORA relativna genska ekspresija PNMT enzima 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 # 0 KONTROLA NBS SLIKA 15. Efekat hroničnog tretmana maprotilinom i fluksilanom na nivo irnk za enzim PNMT u desnoj i levoj komori srca nestresiranih kontrola i pacova hronično izloženih NBS. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM za uzorak od 6 95
IV REZULTATI pacova. Statistička značajnost: ## p<0,01, ### p<0,001 nestresirane kontrole vs. pacovi hronično izloženi NBS; +++ p<0,001 maprotilin vs. placebo; ** p<0.01; *** p<0.001 fluksilan vs. placebo Sa Slike 15. možemo uočiti da NBS (F (1.22) =8,60, p<0,01) i tretman antidepresivima ( F (2.22) =13,19, p<0,001) ima značajan efekat na nivo irnk za enzim PNMT. Statistička analiza je pokazala da NBS dovodi do povećanja nivoa irnk za PNMT u obe komore, i to u desnoj za 42% (p<0.01), a u levoj za 19% (p<0.05). Tretman maprotilinom je povećao ekspresiju ovog enzima samo u desnoj komori kod kontrola za 133% (p<0,001), a kod stresiranih za 47% (p<0,001). Fluksilan je takođe povećao ekspresiju PNMT u desnoj komori srca kod nestresiranih pacova za 26% (p<0,01), a kod stresiranih za 52% (p<0.001). Aplikacija maprotilina i fluksilana nije menjala nivo genske ekspresije PNMT u levoj komori. 96
IV REZULTATI 4.5. EKSPRESIJA β 1 I β 2 ADRENORECEPTORA U SRCU PACOVA HRONIČNO IZLOŽENIH NBS 4.5.1. Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na relativnu gensku ekspresiju β 1 -AR u desnoj i levoj pretkomori srca nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS relativna genska ekspresija β1 adrenoreceptora 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 +++ DESNA PRETKOMORA *** +++ ### *** ### PLACEBO MAPROTILIN FLUKSILAN KONTROLA NBS relativna genska ekspresija β1 adrenoreceptora 2,5 2 1,5 1 0,5 LEVA PRETKOMORA ## # # 0 KONTROLA NBS SLIKA 16. Efekat hroničnog tretmana maprotilinom i fluksilanom na nivo irnk β 1 -AR u desnoj i levoj pretkomori srca nestresiranih kontrola i pacova hronično izloženih 97
IV REZULTATI NBS. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM za uzorak od 6 pacova. Statistička značajnost: ### p<0,001 nestresirane kontrole vs. pacovi hronično izloženi NBS; +++ p<0,001 maprotilin vs. placebo; *** p<0.001 fluksilan vs. placebo Na osnovu dobijenih rezultata prikazanih na Slici 16. može se zaključiti da izlaganje NBS ima značajan efekat na nivo irnk za β 1 -AR (F (1.26) =19,32, p<0,001) u levoj pretkomori. Post-hoc analiza je pokazala da je hronični stres povećao relativnu gensku ekspresiju ovog receptora za 75% (p<0,01). Tretman antidepresivima je značajno (F (2.26) =16.22, p<0,001) uticao na nivo irnk za β 1 -AR u desnoj pretkomori. Tretman maprotilinom je snizio vrednosti relativne genske ekspresije β 1 -AR kod kontrolnih životinja za 48%, a fluksilan je snizio za 53% (p<0,001). Međutim, kod stresiranih životinja, tretman maprotilinom je povećao nivo irnk ovog receptora za 209% (p<0,001), a fluksilanom za 139% (p<0,001) u desnoj pretkomori. 98
IV REZULTATI 4.5.2. Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na relativnu gensku ekspresiju β 1 -AR u desnoj i levoj komori srca nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS relativna genska ekspresija β1 adrenoreceptora 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 DESNA KOMORA PLACEBO MAPROTILIN FLUKSILAN KONTROLA NBS relativna genska ekspresija β1 adrenoreceptora 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 LEVA KOMORA ++ ## ** ## 0 KONTROLA NBS SLIKA 17. Efekat hroničnog tretmana maprotilinom i fluksilanom na nivo irnk za β 1 - AR u desnoj i levoj komori srca nestresiranih kontrola i pacova hronično izloženih NBS. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM za uzorak od 6 pacova. 99
IV REZULTATI Statistička značajnost: ## p<0,01 nestresirane kontrole vs. pacovi hronično izloženi NBS; ++ p<0.01 maprotilin vs. placebo; ** p<0.01 fluksilan vs. placebo. Na osnovu rezultat prikazanih na Slici 17. može se zaključiti da NBS i tretman antidepresivima nemaju značajan efekat na relativnu gensku ekspresiju β 1 -AR u desnoj komori. Međutim, u levoj komori i hronični stres (F (1.26) =39.61, p<0,001), kao i tretman antidepresivima ( F (2.25) =7,93, p<0,01) značajano utiču na nivo irnk za β 1 - AR. Aplikacija antidepresiva je kod pacova hronično izloženih NBS značajno povećala nivo irnk za β 1 -AR u levoj komori, i to maprotilin za 22% (p<0,01), a fluksilan za 62% (p<0,01). 100
IV REZULTATI 4.5.3. Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na relativnu gensku ekspresiju β 2 -AR u desnoj i levoj pretkomori srca nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS relativna genska ekspresija β2 adrenoreceptora 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 + *** DESNA PRETKOMORA PLACEBO MAPROTILIN FLUKSILAN KONTROLA NBS relativna genska ekspresija β2 adrenoreceptora 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 LEVA PRETKOMORA # KONTROLA NBS SLIKA 18. Efekat hroničnog tretmana maprotilinom i fluksilanom na nivo irnk za β 2 - AR u desnoj i levoj pretkomori srca nestresiranih kontrola i pacova hronično izloženih NBS. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM za uzorak od 6 pacova. 101
IV REZULTATI Statistička značajnost: + p<0,05 maprotilin vs. placebo; *** p<0.001 fluksilan vs. placebo Dobijeni rezultati grafički predstavljeni na Slici 18. pokazuju da nepredvidivi blagi stres povećava nivo irnk za β 2 -AR za 35% (p<0,05) u levoj pretkomori, dok antidepresivi nisu imali efekta kako kod nestresiranih tako i kod stresiranih pacova. Analizom varijansi sa dva faktora pokazano je da je tretman antidepresivima imao značajan efekat na nivo irnk za β 2 -AR (F (2.26) =4,19, p<0,05). Tretman maprotilinom, pri tome, kod nestresiranih životinja snizio vrednosti relativne genske ekspresije β 2 -AR za 21% (p<0,05), a fluksilan za 38% (p<0,001). 102
IV REZULTATI 4.5.4. Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na relativnu gensku ekspresiju β 2 -AR u desnoj i levoj komori srca nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS DESNA KOMORA relativna genska ekspresija β2 adrenoreceptora 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 KONTROLA NBS PLACEBO MAPROTILIN FLUKSILAN relativna genska ekspresija β2 adrenoreceptora 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 LEVA KOMORA ## # ## KONTROLA NBS SLIKA 19. Efekat hroničnog tretmana maprotilinom i fluksilanom na nivoe irnk za β 2 -AR u desnoj i levoj komori srca nestresiranih kontrola i pacova hronično izloženih NBS. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM za uzorak od 6 pacova. 103
IV REZULTATI Statistička značajnost: # p<0,05, ## p<0,01 nestresirane kontrole vs. pacovi hronično izloženi NBS. Rezultati prikazani na Slici 19. ukazuju da je hronični stres povećao ekspresiju β 2 -AR za 40% (p<0,05) u levoj komori, ali nije imao značajnog efekta na gensku ekspresiju ovog receptora u desnoj komori. Antidepresivi nisu imali efekta na ekspresiju gena za β 2 -AR kako kod nestresiranih tako i kod stresiranih pacova. 104
V DISKUSIJA V DISKUSIJA 105
V DISKUSIJA 5.1. EFEKTI ANTIDEPRESIVA NA FIZIOLOŠKE PARAMETRE PONAŠANJA Monoaminska hipoteza depresije predviđa da je patofiziološka osnova depresije smanjenje nivoa serotonina, noradrenalina i/ili dopamina u centralnom nervnom sistemu (Delgado, 2000). Serotonin je neurotransmiter najviše ispitivan u studijama o depresiji. Smanjenje serotonina u mozgu je povezan s lošim raspoloženjem, oslabljenom sposobnošću učenja i memorije, psihomotornim promenama i povećanoj osetljivosti na stres (Hasler i saradnici, 2004), potvrđujući verodostojnost monoaminske hipoteze. Smanjeni metabolizam noradrenalina, povećana aktivnost tirozin hidroksilaze, i smanjena gustina transportera za noradrenalin u lokusu ceruleusu (Charney i Manji, 2004) su dokazi o ulozi noradrenalina u patofiziologiji depresije. Dok su klasične teorije neurobiologije depresije uglavnom usmerena na serotonin i noradrenalin, postoji sve veći interes o ulozi i dopamina u nastanku depresije (Nutt, 2006). Uočeno je da je vezivanje dopamina za transporter smanjena u strijatumu depresivnih pacijenata. (Meyer i saradnici, 2001) Smanjena neurotransmisija dopamina u nucleus accumbens se povezuje i sa simptomima ahedonije. Dokazano je gotovo svako jedinjenje koje inhibira preuzimanje monoamina, što dovodi do povećanja njihove koncentracije u sinaptičkoj pukotini, je klinički delotvoran antidepresiv (Belmaker i Agam, 2008) Poznato je da su ljudi sa dijagnozom anksioznog poremećaja u detinjstvu imaju povećan rizik za razvoj depresije kasnije u životu. Robinson i saradnici (1990) 106