1

Транскрипт

1 BIOLOŠKI FAKULTET UNIVERZITET U BEOGRADU Doktorska disertacija UTICAJ ANTIDEPRESIVA NA PONAŠANJE I AKTIVNOST SIMPATOADRENALNOG SISTEMA KOD NESTRESIRANIH I STRESIRANIH PACOVA Spasojević Nataša Beograd, 2010

2 SADRŽAJ: I UVOD Definicija stresa Simpato-adrenomedularni sistem Biosinteza kateholamina Otpuštanje kateholamina Inaktivacija kateholamina Degradacija kateholamina Transkripcioni mehanizmi kontrole nivoa irnk za enzime koji učestvuju u biosintetezi kateholamina Hipotalamo-hipofizno-adrenokortikalni sistem Kardiovaskularni sistem u stresu Keteholaminergičke ćelije srca Prenos signala adrenoreceptora u srcu Studije o ponašanju životinja Izdignuti plus lavirint Prinudni test plivanja Animalni model depresije Depresija Da li postoji veza između stresa i depresije? Glukokortikoidna teorija depresije Monoaminska teorija depresije Noradrenergički sistem u mozgu Serotonergički sistem u mozgu Depresija kao faktor rizika za pojavu kardiovaskularnih oboljenja 44

3 Antidepresivi Inhibitori ponovnog preuzimanja monoamina iz sinapse Triciklični i tetraciklični antidepresivi Selektivni inhibitori preuzimanja serotonina (SSRI) 49 II CILj RADA 51 III MATERIJAL I METODE Životinje Lekovi i protokol tretmana Hronični nepredvidivi blagi stres (NBS) Testovi ponašanja životinja Test prinudnog plivanja (FST-Forced Swimming Test) Procedura izdignutog plus lavirinta (EPM Elevated Plus Maze) Metoda uzimanja krvi kod pacova Metoda određivanja noradrenalina i adrenalina u plazmi Izolacija COMT Metoda određivanja ACTH u plazmi Metoda određivanja kortikosterona u plazmi Izolacija RNK Sinteza komplementarne DNK (cdnk) Real-time PCR Statistička analiza rezultata 68 IV REZULTATI Fiziološki parametri ponašanja pacova hronično izloženih NBS Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na parametre anksioznosti u testu izdignutog plus lavirinta

4 nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na parametre u testu prinudnog plivanja nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS Koncentracija hormona u plazmi pacova hronično izloženih NBS Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na koncentraciju ACTH u plazmi nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na koncentraciju CORT u plazmi nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na koncentraciju NA u plazmi nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS Dejstvo hroničnog maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na koncentraciju A u plazmi nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS Ekspresija enzima koji učestvuju u biosintezi kateholamina u srži nadbubrežne žlezde pacova hronično izloženih NBS Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na relativnu gensku ekspresiju enzima TH nestresiranih i i pacova hronično izloženih NBS Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na relativnu gensku ekspresiju enzima DBH nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS 82

5 Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na relativnu gensku ekspresiju enzima PNMT kod nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS Ekspresija enzima koji učestvuju u biosintezi kateholamina u srcu pacova hronično izloženih NBS Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na relativnu gensku ekspresiju enzima TH u desnoj i levoj pretkomori srca nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na relativnu gensku ekspresiju enzima TH u desnoj i levoj komori srca nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na relativnu gensku ekspresiju enzim DBH u desnoj i levoj pretkomori srca nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na relativnu gensku ekspresiju enzima DBH u desnoj i levoj komori srca nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na relativnu gensku ekspresiju enzima PNMT u desnoj i levoj pretkomori srca nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na relativnu gensku ekspresiju enzima PNMT u desnoj i levoj komori srca nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS Ekspresija β 1 i β 2 adrenoreceptora u srcu pacova hronično izloženih NBS Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na relativnu gensku ekspresiju β 1 -AR u desnoj i levoj

6 pretkomori srca nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na relativnu gensku ekspresiju β 1 -AR u desnoj i levoj komori srca nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na relativnu gensku ekspresiju β 2 -AR u desnoj i levoj pretkomori srca nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS Dejstvo hroničnog tretmana maprotilinom (NRI) i fluksilanom (SSRI) na relativnu gensku ekspresiju β 2 -AR u desnoj i levoj komori srca nestresiranih i pacova hronično izloženih NBS 103 V DISKUSIJA Efekti antidepresiva na fiziološke parametre ponašanja Test izdignutog plus lavirinta Test prinudnog plivanja Dejstvo antidepresiva na hipotalamo-hipofizno-adrenokortikalni sistem Efekat antidepresiva na aktivnost simpato-adrenomedularnog sistema Efekat NBS na aktivnost kardiovaskularnog sistema Efekat hroničnog tretmana antidepresivima na aktivnost kardiovaskularnog sistema 133 VI ZAKLJUČCI 142 VII LITERATURA 146

7 SKRAĆENICE KORIŠĆENE U TEKSTU 5-HIAA - 5-hidroksi-indol-sirćetna kiselina 5-HT serotonin 5-HTT serotoninski transporter A adrenalin AAAD aromatična L-aminokiselinska dekarboksilaza AC adenilatna ciklaza ACTH adrenokortikotropni hormon AK aminokiselina AMPT α-metil para tirozin AP1 transkripcioni faktor aktivator proteina 1 ATP adenozin-tri-fosfat AV atrioventrikularni čvor camp ciklični adenozin monofosfat AVP arginin-vazopresin AR adrenoreceptor BDNF neurotrofni faktor u mozgu BH 4 - tetrahidrobiopterin BZD benzodiazepin CA kateholamini cdnk komplementarna DNK CNS centralni nervni sistem CORT kortikosteron COMT katehol-o-metiltransferaza

8 CRE camp responsivni element CREB CRE vezujući element CREM - modulatorni element zavisan od camp CRH kortikotropin-oslobađajući hormon NBS - nepredvidivi blagi stres DA - dopamin DAT dopaminski transporter DHMA 3,4-dihidroksimandelična kiselina DHPG dihidroksifenilglikol DBH dopamin- beta-hidroksilaza DOPA dihidroksifenilalanin DOPAC dihidroksifenilacetat EDTA etilen-diamin-tetrasirćetna kiselina EGTA etilen-glikol-tetrakarboksilna kiselina EMT ekstra neneuronski monoaminski transporter EPM test izdignutog plus lavirinta SR sarkoplazmatični retikulum ERE - estrogen responsivni element ERK signalna ekstracelularna regulatorna protein kinaza FST test prinudnog plivanja GABA gama-aminobuterna kiselina GAS - generalni adaptacioni sindrom GC glukokortikoid GR glukokortikoidni receptor GRE glukokortikoid responsivni element

9 GTP guanozin-tri-fosfat H1 histaminski receptor 1 HHA - hipotalamo-hipofizna-adrenokortikalni sistem HR srčana frekvencija HRV - varijabilnosti u srčanoj frekvenciji ICA - unutarsrčane adrenergične ćelije ICER - inducibilni camp represorni element IMO stres imobilizacije irnk informativna nukleinska kiselina JNK c-jun NH 2 -terminalna kinaza LC locus ceruleus L-DOPA L-dihidroksifenilalanin MAO monoamino oksidaza MAOI inhibitori monoamino oksidaze MAP mitogen aktivirajuća protein kinaza MC-2 - melanokortikotropni receptor MHPG 3-metoksi-4-hidroksifenil glikol NA noradrenalin NET noradrenalinski transporter NGF faktor rasta nerva NMT - N-metiltransferaza NPY neuropeptid Y NRE - nikotin responsivni element NRI - antidepresivi koji inhibiraju preuzimanje noradrenalina PCR lančana reakcija polimeraze

10 PKA protein kinaza A PKC protein kinaza C POMC proopiomelanokortin PNMT feniletanolamin N-metiltransferaza PTSD - posttraumatski stresni poremećaj PVN paraventrikularni nukleus RNK ribonukleinska kiselina RD - raphe dorsalis RM - raphe medianus RP rafa palidus SA sinoatrijalni čvor SAM simpato-adrenomedularni sistem Sam S-adenozil-metionin SAMe - 3 H S-adenozil-L-( 3 H-metil)-metionin SNS simpatoneuralni sistem SSRI - antidepresivi koji inhibiraju preuzimanje serotonina TCA triciklični antidepresivi TH tirozin hidroksilaza TPH triptofan hidroksilaza U1 uptake1, neuronsko pruzimanje U2 uptake2, neneuronsko pruzimanje VMA vanil-mandelična kiselina VMAT vezikularni monoaminski transporter VIP vazoaktivni intestinalni polipeptid

11 ZAHVALNICA Pojedinim osoba dugujem naročitu zahvalnost: Iskreno se zahvaljujem svom mentoru dr. Slađani Dronjak-Čučaković, višem naučnom saradniku Instituta Vinča, na podršci, posvećenosti našem zajedničkom radu i stalnoj spremnosti da mi pomogne i prenese svoje znanje. Posebnu zahvalnost dugujem članovima Komisije dr. Gordani Cvijić i dr. Jeleni Đorđević, profesorima Biološkog fakulteta Univerziteta u Beogradu, na konstruktivnim kritikama i smernicama tokom pisanja ove disertacije. Želela bih da se zahvalim i dr. Ljubici Gavrilović za stručnu pomoć i savete koje mi je davala o eksperimenatalnim tehnikama. Zahvaljujem se Mirjani Šućur koja je doprinela da radna atmosfera u laboratoriji bude lepša i zanimljivija. Na kraju, želela bih da se zahvalim prijateljima i porodici na njihovom ohrabrenju i strpljenju koje su mi pružali sve ovo vreme. Ove stranice posvećujem svom ocu.

12 I UVOD I UVOD 1

13 I UVOD 1.1 DEFINICIJA STRESA Koncept stresa je predmet istraživanja brojnih studija, u kojima su korišćeni različiti pristupi u cilju što boljeg objašnjenja ovog fenomena. Literaturni podaci često povezuju stres sa psihološkim terminima kao što su patnja, emotivnost i anksioznost. Pošto je većina ovih pojmova subjektivne prirode koji se ne mogu direktno izmeriti, istraživači su morali da povežu takvo stanje sa merljivim fiziološkim, endokrinološkim i bihevioralnim promenama. Cannon je prvi predložio termin homeostaze da bi opisao koordinisane fiziološke procese koji održavaju uravnoteženo stanje u organizmu (Cannon, 1929). Međutim nije koristio izraz stres. Hans Selye je prvi uveo i popularizovao stres kao medicinski i naučni termin. Primetio je da je fiziološki proces akomodacije na stres sličan kod svih organizama. Definisao je stres kao nespecifičan, univerzalni odgovor, sastavljen iz 3 faze, koji je nazvao generalni adaptacioni sindrom (GAS). Kada su opasnost ili stresor identifikovani, prepoznati, organizam se alarmira. Oslobađa se adrenalin i razvija se fight-or-flight (bori se ili beži) odgovor. Ako je stresor prisutan više sati neophodno je da se organizam prilagodi na tu situaciju. Reakcija uzbune iščezava i funkcije brojnih sistema u organizmu se vraćaju u ravnotežu. Glukokortikoidi su tada dominantani hormoni. Poslednju fazu karakteriše iscrpljenost, kada normalne funkcije organizma više ne mogu da se održe. Dolazi do otkazivanja jednog ili više organskih sistema. Javlja se ponovo 2

14 I UVOD reakcija alarma, ali je sada ireverzibilna i fatalna. Hronično izlaganje stresorima ima patofiziološke posledice u vidu hipertrofije nadbubrežne žlezde, smanjenja timusa i pojave ulceracija u gastrointestinalnom traktu (Selye, 1936). Ramos i Mormede su opisali stres detaljnije. Po njima je stres odgovor organizma na stimulus iz spoljne sredine - stresor, koji remeti unutrašnju ravnotežu (homeostazu) organizma (Ramos i Mormede, 1998). Stresori se dele u četiri osnovne kategorije: 1) fizičke stresore kao što je bol, buka, toplota 2) psihološke stresore koji odražavaju stečen odgovor na prethodna neprijatna iskustva (strah, nervoza) 3) socijalni stresori koji odražavaju poremećenu interakciju među jedinkama 4) stresori koji remete kardiovaskularnu i metabolitičku homeostazu (krvarenje, vežbanje, toplota) (Pacak i saradnici, 1998). U odgovoru na stres različiti regulatorni sistemi su uključeni da bi omogućili organizmu da se prilagodi na unutrašnje i spoljne izazove. Adekvatan odgovor na stres je neophodan u cilju očuvanja homeostaze organizma. On ne zavisi samo od intenziteta stresora već i od nasleđenih sposobnosti ovih sistema da ostvare i održe adekvatan nivo i trajanje odgovora na stresore. Neadekvatan, prejak ili prekratak odgovor je jako štetan za organizam. Čak i jednoćelijski organizami su izloženi spoljnom izazovu u vidu promene u temperaturi i kiselosti sredine. Većina stresora sa kojima se životinja susreće odnosi se na nalaženje hrane, postojanje predatora i socijalne hijerarhije. Kod ljudi reč je više o mentalnim brigama, nego o fizičkim izazovima. Tako odgovor na pritisak u društvu, prevelik broj informacija, prevelike kulturne promene sličan je odgovoru na fizički stres ili opasnost. 3

15 I UVOD Nisu svi stresovi nepovoljni, da se poslužimo terminologijom Hansa Selyea, mučni. Neki oblici stresa su neverovatno stimulativni. Selye je uveo termin eustres da bi opisao konstruktivan i ugodan stres, koji pozitivno utiče na emotivni i intelektualni razvoj jedinke (Selye, 1936; Selye i saradnici, 1950), Sportisti ili padobranci, izlažu se stresu stres je nerazdvojni deo pobedničkog zanosa, doživljavanja jednog od temeljnih životnih osećaja. To je ona vrsta kratkotrajnih stresora koje smo, zahvaljujući evoluciji u stanju da podnesemo. Pokazano je da takav stres može imati i zaštitnu ulogu, npr. protiv demijelinizacije oligodendrita do kojih dolazi imunološkim oštećenjem kod multiple skleroze (Lees i Cross, 2007). Distres ili negativan stres je stanje dugotrajne napetosti usled koje se javljaju fiziološke, psihosomatske reakcije čija je posledica pogoršavanje zdravstvenog stanja, osećaj frustracije, mentalna i fizička iscrpljenost. Predstavlja način na koji mentalno, fizički i emocionalno reagujemo na različita stanja, promene i zahteve u našem životu. Distres je termin za stres koji ima štetan ili neprijatan učinak: klonulost, iznurenost, iscrpljenost, opasnost, bol, jad (Selye, 1976a; Selye, 1976b; Van de Kar i Blair, 1999). Neuroendokrini sistem igra važnu ulogu u prilagođavanju organizma na stres. U normalnim, povoljnim okolnostima ima ulogu u rastu, razvoju i razmnožavanju. Međutim, svaki dovoljno jak stresor koji predstavlja pretnju u održanju homeostaze, stavlja organizam u stanje stesa i aktivira nespecifičan, adaptivan odgovor koji omogućava individui da preživi stresno okruženje, dok se ne pojave povoljnije okolnosti (Van de Kar i Blair, 1999, McEwen, 2000a). Dva sistema su uključena u odgovoru na stres: kortikotropin oslobađajući hormon (CRH)/arginin-vazopresin u hipotalamusu i neuroni autonomnog nervnog sistema u lokus ceruleus-u (LC). Oni regulišu perifernu aktivnost hipotalamo- 4

16 I UVOD hipofizno-adrenokortikalnog sistema (HHA) i simpato-adrenomedularnog sistema (SAM) oslobađajući kortikosteroide i kateholamine u cirkulaciju. Kateholamini vrlo brzo stižu do ciljnih organa postižući efekat za svega nekoliko sekundi/minuta. Za razliku od njih kortikosteroidi deluju na receptore koji su smešteni u nukleusu ćelije i utiču na transkripciju brojnih gena. To zahteva vreme, pa je potrebno mnogo duže da bi se uočili efekti aktivacije HPA ose. Slika 1. Fight-or-Flight odgovor organizma na stres. Aktivacija SAM ubrzava srčani rad i respiraciju, povećava krvni pritisak, mišićni potencijal (Koh i saradnici, 2005). Krvotok je preusmeren prevashodno u mozak i skeletno-mišićni sistem. Rast i reprodukcija su tada suprimirani radi očuvanja energije. Pod dejstvom glukokortikoida pojačan je katabolizam radi stvaranja energije u cilju povišenja nivoa glukoze neophodne mozgu, srcu i mišićima. Ova fizička priprema je adekvatna u slučaju fight-or-flight odgovora na stres, npr. kada miš ugleda lisicu omogućena mu je dodatna energija da bi pobegao. 5

17 I UVOD Iako je fizička spremnost bitan deo tipičnog odgovora na stres, uporedo dolazi i do kognitivnih promena. Koncentracija, pažnja, memorija su poboljšani tokom blagog stresa (De Kloet i Holsboer, 2005). Ove karakteristike omogućavaju jedinki da bude svesna mogućih opasnosti i da razmisli kako da izbegne pretnju. Brzo rešavanje problema je bitno u preživljavanju. Poboljšanje memorije omogućava da organizam koristi stečena iskustva i u budućnosti i tako uči iz grešaka (Korte i saradnici, 2005). Emotivni ženski filmovi podižu više nivoe kortizola nego gledanje nekih drugih filmova. Nejtek (2002) je pokazala da se skok kortizola javlja tek pošto posmatrač ima priliku da razmisli o filmu, a ne tokom filma. Naime, emotivne slike dovode do aktivacije limbičkog sistema, odakle kreću brojne projekcije u druge delove mozga, koji aktiviraju stresni sistem. Ovo nam ukazuje na postojanje emotivne komponente pri percepciji stresa. Ekscesivna ili konstantna aktivacija sistema uključenih u odgovoru na stres može ostaviti trajne efekte na njeno funkcionisanje. Stresori tada nemaju prolazan, već trajan efekat na formiranje odgovora HPA ose na stres i po prestanku dejstva (Habib i saradnici, 2001; Charmandari i saradnici, 2005). Dolazi do oštećenja koja se manifestuju u vidu bolesti kao što je dijabetes, kardiovaskularna oboljenja i kancer. Stres menja aktivnost u moždanim strukturama, pa se javlja i predispozicija za brojna mentalna oboljenja, kao što su anksioznost i depresija (Maughan i McCarthy, 1997) SIMPATO-ADRENOMEDULARNI SISTEM Zahvaljujući radu Walter B. Cannon-a početkom ovog veka, simpatički nervi i srž nadbubrežne žlezde su prepoznati kao ključne komponente fiziološkog odgovora životinja u održanju unutrašnje homeostaze tokom akutog izlaganja brojnim 6

18 I UVOD stresorima (Cannon, 1929). Odgovor simpato-adrenalnomedularnog sistema (SAM) je pod kontrolom nervnih impulsa iz preganglijskih holinergičnih neurona lociranih u intermediolateralnoj sivoj masi torakalnih i gornjih lumbalnih segmenata kičmene moždine. Aktivnost ovih neurona je regulisana vlaknima koja se descedentno pružaju iz produžene moždine i moždanog stabla, kao i lokalnom spinalnom inervacijom. Cerebralni korteks, limbički sistem, hipotalamus, i moždano stablo regulišu aktivnost ovog puta. Akutna aktivacija SAM sistema dovodi do ubrzanja respiracije, povećanja broja otkucaja srca, povećanja koncentracije glukoze u krvi i smanjenja peristaltike creva. Međutim, u zavisnosti od vrste i intenziteta akutnog stresora postoji razlika u intezitetu odgovora ovog sistema koja se detektuje određivanjem smanjenjem koncentracije kateholamina (CA) u tkivima, povećanjem u cirkulaciji, pojačanom ekskrecijom u urinu i njihovim oslobađanjem iz kateholaminskih neurona u raznim delovima mozga. Čak i manje smetnje pri rukovanju sa životinjom ili prenos u novu sredinu može dovesti do vrlo značajanog povećanja nivoa adrenalina (A) i noradrenalina (NA) u krvi (Kvetnansky i saradnici, 1978). Mnogi stresori brzo povećavaju ne samo nivoa CA u plazmi, već i njihove prekursore i metabolite. Tokom prvih 20 minuta imobilizacije (IMO) nivo A u plazmi dostiže vrednost oko 40 puta veću nego kod kontrolnih pacova, a potom se smanjuje na trećinu od maksimalne vrednosti. Nivo NA u plazmi je povećan oko 6 puta tokom IMO (Kvetnansky i saradnici, 1978). To nam pokazuje da stres ne samo da brzo dovodi do povećanja u nivoima CA u plazmi, već brzo povećava i sintezu, otpuštanje i razgradnju CA. Regulacija oslobađanja A i NA zavisi od vrste stresora. Hipoglikemija, glukopenija, IMO i emocionalni stresori uglavnom aktiviraju oslobađanje A, dok hladnoća ili bol uglavnom stimulišu 7

19 I UVOD oslobađanje NA iz simpatičkih krajeva (Kvetnansky i saradnici, 1998, Pacak i saradnici, 1998) BIOSINTEZA KATEHOLAMINA Aktivnost enzima koji učestvuju u sintezi CA može biti vrlo visoka tokom dugotrajnog izlaganja stresu dovodeći do značajnog povećanja biosinteze kateholamina (Kvetnansky i saradnici, 1971a; Kvetnansky i saradnici, 1971b; Thoenen, 1970). Limitirajući enzim u sintezi kateholamina je tirozin hidroksilaza (TH), solubilni enzim nađen u svim ćelijama koje sintetišu kateholamine (Nagatsu, 1995). Kateholamini se sintetišu iz aminokiseline L-tirozina. Postoje dva osnovna izvora tirozina, hrana i hidroksilacija aminokiseline fenilalanina u jetri. U nadbubrežnoj žlezdi je prvi put dokazano prevođenje L-tirozina u NA (Blaschko, 1939), dok je kasnije uočeno i u mozgu, simpatičkoj gangliji i u svim tkivima inervisanim simpatičkim vlaknima. Zato je ovaj enzim dobar marker ćelija koje produkuju CA u centralnom i perifernom nervnom sistemu. Po hemijskoj strukturi TH je tirozin 3-monooksigenaza. Koristi molekul kiseonika i biopterin (BH 4 ) kao kofaktor. Katalizuje dodavanje hidroksilne grupe na meta poziciju tirozina formirajući 3,4-dihidroksi-L-fenilalanin (L- DOPA). Takođe, prevodi fenilalanin u tirozin kao alternativni sintetski put. Kofaktor, biopterin, može postići saturirajuću koncentraciju u neuronima koji sadrže kateholamine i tako ima važnu ulogu u regulaciji sinteze noradrenalina (Nagatsu i Ichinose, 1999). Analog tirozinu, npr. α-metil-para-tirozin (AMPT), je kompetitivni inhibitor TH. DOPA se pretvara u dopamin (DA) dejstvom nespecifičnog enzima, aromatične L-aminokiselinske dekarboksilaze (AAAD). Ovaj enzim je u formi 8

20 I UVOD solubilnog homodimera. Aktivnost AAAD zavisi od nivoa njegovog kofaktor, piridoksal 5'-fosfata (vitamina B6) (Moore i saradnici, 1996). AAAD učestvuje i u dekarboksilaciji 5-hidroksitriptofana, prekursora serotonina. Široko je rasprostranjen i u kateholaminergičkim i serotonergičkim neuronima, ali i u neneuralnom tkivu, kao što su bubrezi i krvni sudovi. Slika 2. Put biosinteze kateholamina Hagen i Welch (1956) su pokazali da se u mozgu, simpatičkim ganglijama i nadbubrežnim žlezdama može transformisati DA u NA hidroksilacijom, ali je tek enzim odgovoran za ovaj proces izolovan iz goveđe nadbubrežne žlezde (Friedman i Kaufman, 1965). Dopamin se preuzima iz citoplazme u vezikule i pretvara u NA aktivnošću dopamin-β-hidroksilaze (DBH). Ovaj enzim je pronađen u 9

21 I UVOD solubilnoj i membranski vezanoj formi unutar vezikula. Obe forme su kodirane istom irnk (Feng i saradnici, 1992; Lewis i Asnani, 1992). Za reakciju neophodni su mu askorbinska kiselina i molekul kiseonika. U formi je homotetramera koji u strukturi sadrži Cu 2+ koji je uključen u transfer elektrona u reakciji. Bakarni helati, kao što je dietilditiokarbamat, su potentni inhibitori ovog enzima. Enzim je koncentrisan u vezikulama u kojima se pakuju kateholamini. Pri tome se oslobađa zajedno sa kateholaminima zbog čega je detektovan i u plazmi i u cerebrospinalnoj tečnosti (Weinshilboum i Axelrod, 1971; Weinshilboum i saradnici, 1971). Solubilni enzim feniletanolamin N-metiltransferaza (PNMT) pretvara NA u A. Pri tome koristi S-Adenozil-metionin kao kofaktor. PNMT se aktivira pod dejstvom glukokortikoida. Uglavnom je smešten u srži nadbubrega, međutim, organi inervisani simpatičkim vlaknima, kao i neka područja mozga takođe su u mogućnosti da sintetišu male količine A (Diaz Borges i saradnici, 1978). Posebne populacije hromafinih ćelija sadrže NA i A kao konačni proizvod biosinteze CA (Winkler i saradnici, 1986). PNMT je pronađen i kod nekih neneuronskih ćelija pluća, srca, kože (Huang i saradnici, 2005; Kennedy i saradnici, 1990; Kennedy i saradnici, 1993; Kvetnansky i saradnici, 2004, Pullar i saradnici, 2006, Ziegler i sardnici, 1998). U srcu i plućima je pronađena i nespecifična forma N-metiltransferaze (NMT) (Kennedy i saradnici, 1990) OTPUŠTANJE KATEHOLAMINA Proces otpuštanja CA je sličan u nadbubrežnim žlezdama i u simpatičkim nervnim završecima. Acetilholin otpušten iz simpatičkog preganglijskog nervnog završetka vezuje se za nikotinske holinergičke receptore dovodeći do depolarizacije ćelijske membrane, što povećava propustljivost membrane za natrijum. To pokreće 10

22 I UVOD niz događaja koji dovode do povećanja ulaska kalcijuma neophodnog za proces ugrađivanja vezikula koje sadrže CA u membranu hromafine ćelije ili simpatičkog nervnog završetka. Nekoliko proteina igraju važnu ulogu u tom procesu, npr., sinapsin, sineksin, sinaptofisin, sintaksin i drugi membranski proteini (Pollard i saradnici, 1998). Procesom egzocitoze vezikule otpuštaju svoj sadržaj CA zajedno s hromograninima, ostalim neuropeptidima, ATP-om i delom slobodne DBH (Golstein, 2001; Jahn i Sudhof, 1994; Nagatsu i Stjarne, 1998; Yin i Tully, 1996). Tačan mehanizam Ca 2+ iniciranog oslobađanja, međutim, nije jasan. Adrenomedularne ćelije luče kateholamine direktno u krvotok. Simpatički nervni završeci takođe mogu otpustiti NA i kalcijum nezavisnim, neegzocitotskim mehanizmom, npr., obrnutim transportom preko neuralnog transportera (Kurz i saradnici, 1996; Schomig i saradnici, 1987; Stjarne, 1989). Međutim, taj proces se javlja u in vivo uslovima uglavnom u posebnim okolnostima kao što su npr. za vreme ishemije (Kurz i saradnici, 1996, Schomig i saradnici, 1987). Kateholamini u vezikulama simpatičkog vlakna mogu i difundovati na okolna tkiva zbog razlike u volumenu (Sykova, 2004). Nakon oslobađanja, CA koji izbegnu ponovno preuzimanje difunduju u cirkulaciju. U plazmi se kateholamini brzo razgrađuju. Poluvreme razgradnje je oko 2,5 min (Esler i saradnici, 1979). U mirovanju, nizak nivo CA se ispušta u krv iz nadbubrežne žlezde i simpatičkih krajeva. Tokom stresne stimulacije, međutim, velika količina A ( 95%) i značajna količina NA (i do 30% od ukupnog NA u cirkulaciji) se 11

23 I UVOD oslobodi iz nadbubrežne žlezde. Preostalih 70% NA poreklom je iz simpatičkih nerava (Kvetnansky i saradnici, 1979) INAKTIVACIJA KATEHOLAMINA Simpatički nervni završeci preuzimaju CA iz ekstracelularnog prostora procesom koji se naziva uptake 1 (Eisenhofer, 2001), dok neneuronalna tkiva vrše preuzimanje uptake 2 procesom (Iversen, 1965). Uptake 1 (U1) ima ulogu da lokalno otpušten NA ili A u ekstracelularni prostor preuzme, magacionira unutar neurona radi ponovnog korišćenja. Za ovaj proces je neophodna energija. Transporter može preneti CA nasuprot gradijentu koncentracije. Ovaj unos ima manje važnu ulogu u inaktivaciji cirkulišućeg A. Oko 90% oslobođenog NA se ponovo preuzima od strane neurona (Eisenhofer i saradnici, 1990; Eisenhofer i saradnici, 1991a). Preuzimanje je posredovano transporterom noradrenalina (NET) i dopamina (DAT). Transport putem NET i DAT zavisi od koncentracije Na + i temperature, pokazujući pri tom visoki afinitet, ali relativno niski kapacitet za CA. Stopa ponovnog preuzimanja NA raste paralelno s povećanjem NA oslobađanja (Eisenhofer i saradnici, 1990; Eisenhofer i saradnici, 1991a). NA je od strane NET translocira dvostruko efikasnije nego A. Ova dva transportera pokazuju blisku homologiju u strukturi. Poseduju 12 transmembranskih domena, nekoliko slično konfigurisanih intracelularnih i ekstracelularnih petlji ili regija s odgovarajućim mestima za fosforilaciju i glikozilaciju (Bonisch i Eiden, 1998; Eisenhofer, 2001). Dok se DAT nalazi uglavnom u dopaminergičkim neuronima u mozgu, NET je lociran i u centralnim i perifernim noradrenergičkim neuronima (Eisenhofer, 2001). Uptake NA od strane NET se, takođe, odvija i u hromafinim ćelijama nadbubrežnih žlezda, u nekim neneuronalim ćelijama pluća, placente, srca itd. 12

24 I UVOD Ekstraneuralni uptake 2 (U2) je proces aktivnog transporta u neneuronskim ćelijama. Ekstraneuralni monoaminski transporter U2 (EMT), je prvi opisao Iversen (1965), Ima malu stereospecifičnost i nizak afinitet za CA. U2 favorizuje A u odnosu na NA, Na + i Cl - nezavisnim procesom (Eisenhofer, 2001; Goldstein, 2001). U2 je osetljiv na inhibiciju O-metil metabolitima kateholamina kao što su normetanefrin, metanefrin (Bonish, 1980), glukokortikoidima (Trendelenburg, 1988) i odgovoran je za formiranje CA metabolita u jetri, bubrezima i plućima DEGRADACIJA KATEHOLAMINA Kateholamini se nakon preuzimanja vraćaju u vezikule ili se podvrgavaju hemijskoj degradaciji. Oksidativnu deaminaciju vrši monoaminooksidaza (MAO) u citoplazmi neurona, dok katehol-o-metiltransferaza (COMT) u neneuronskim ćelijama vrši 3-O-metilaciju. Kateholamini se dezaktiviraju i konjugacijom sa sulfatima i glukuronidima. Otpušteni kateholamini iz neurona se inaktiviraju preuzimanjem U1 transportom u kombinaciji s enzimskom razgradnjom MAO, flavoproteinom koji se nalazi na spoljnoj mitohondrijalnoj membrani presinaptičnkog neurona. On vrši deaminaciju kateholamina u njihove aldehide, koji dalje mogu enzimom aldehidnom dehidrogenazom biti prevedeni u kiseline ili aldehidnom reduktazom u glikole (Blaschko i saradnici, 1937). 13

25 I UVOD Zbog svoje intracelularne lokacije ima stratešku ulogu u razgradnji slobodnih kateholamina u nervnom završetku koji nisu zaštićeni vezikularnom membranom. Kateholamini se u cirkulaciji inaktiviraju U2 transportom i enzimskom razgradnjom od strane COMT, koji se nalazi u efektornoj ćeliji. COMT je nađen u skoro svim tkivima, uključujući eritrocite. Vrši razgradnju ekstracelularnih kateholamina i blisko je vezan za adrenergični receptor (Eisenfeld i saradnici, 1967). Enzim u prisustvu Mg 2+ vrši transfer metil grupe sa kosubstrata S-adenozilmetionina na 3-hidroksi grupu kateholaminskog prstena. Ovaj enzim metiluje svaki katehol prsten bez obzira na bočne lance. Smanjena aktivnost COMT u nadbubrežnim žlezdama kod pacova koji su izloženi dugotrajnoj imobilizaciji, ukazuju na ulogu ovog enzima u povećanju sadržaja kateholamina u žlezdama tokom hroničnog stresa (Kvetnansky i saradnici, 1975) TRANSKRIPCIONI MEHANIZMI KONTROLE NIVOA irnk ZA ENZIME KOJI UČESTVUJU U SINTEZI KATEHOLAMINA U STRESU Prvi dokazi o povećavaju aktivnosti TH, DBH i PNMT enzima posle hroničnog izlaganja imobilizaciji i hladnoći uočeni su sedamdesetih godina (Kvetnansky i 14

26 I UVOD saradnici, 1970; Kvetnansky i saradnici, 1971a; Chuang i Costa, 1974), a nakon 15 godina i povećanje ekspresije irnk za te enzime (Baruchin i saradnici, 1990). Ekspresija ovih enzima je regulisana kompleksnim mehanizmima koji uključuju više promotorskih mesta koji interaguju sa različitim transkripcionim faktorima. Izlaganjem pacova hladnoći povećava se nivo TH irnk, dostižući maksimalne vrednosti između 3. i 6. sata i ostaje konstantno povišen do kraja izlaganja stresu. Iako je transkripcija povećana, maksimalan nivo TH proteina se detektuje tek posle 3 dana konstantne izloženosti hladnoći, a maksimalna enzimska aktivnost 6 do 7 dana (Baruchin i saradnici, 1990; Miner i saradnici, 1992). TH protein se aktivira fosforilacijom na poziciji Ser8, Ser19, Ser31, Ser40 dejstvom protein kinaza A, C i Ca 2+ / kalmodulin zavisne protein kinaze II (Dunkley i saradnici, 2004). To je kratkotrajna regulacija. Dugotrajna aktivacija se postiže dejstvom na nivou transkripcije, alternativnom obradom irnk, povećanom stabilnošću irnk i translacijom. Sabban je sa saradnicima (1995) potvrdila korišćenjem transkripcionog inhibitora aktinomicina D da se porast ekspresije TH nakon jedne imobilizacije postiže povećanjem stepena transkripcije. Potrebno je svega 30 minuta IMO da bi TH dosegla maksimalni nivo. Hronično izlaganje ovom stresu uzrokuje da ove vrednosti ostanu i nakon 24h (Nankova i saradnici, 1994). Dakle regulacija ekspresije je drugačija u odgovoru na akutni i hronični stres, a jedan od uzroka je porast u aktivnosti transkripcije. Dijagram proksimalnog promotorskog regiona gena za TH enzim kod pacova je prikazana na Slici 3. Mutacija u ovom promotorskom regionu sprečava ekspresiju ovog gena u kateholaminergičkim neuronima odraslih transgenih životinja (Trocme i saradnici, 1998). Tako, na poziciji -45 lociran je camp responsivni element (engl. CRE - camp response element), dok je AP1 element na poziciji. Ekspresija ovog gena menja se u odgovoru na camp, hipoksiju, i 15

27 I UVOD promenu u nivou intracelularnog kalcijuma (Hiremagalur i saradnici, 1993; Kim i saradnici, 1993; Lewis-Tuffin i saradnici, 2004; Nagamoto-Combs i saradnici, 1997). Za CRE region može se vezati CREB (cyclic adenosine monophosphate response element binding protein) kao homodimer. Stepen fosforilacije CREB-a naglo raste kao odgovor na stres, što utiče na funkciju ovog transkripcionog elementa. Takođe, detektovan je estrogen zavisni element (ERE) (Maharjan i saradnici, 2005) koji može imati ulogu u razlikama između polova u nivou TH transkripcije tokom stresa. TH promotor sadrži funkcionalni Sp1/Egr1 region (Papanikolaou i Sabban, 1999; Yang i saradnici, 1998). Porast u ekspresiji Egr1 je dovoljna da se aktivira transkripcija TH gena u ćelijskoj kulturi (Papanikolaou i Sabban, 2000). Ovaj region je takođe uključen u odgovoru na stres. Transkripcija TH gena regulisana je i glukokortikoidima (Fossom i saradnici, 1992), Glukokortikoid zavisni element do sada samo je identifikovan kod miša (Hagerty i saradnici, 2001) i u promotorskom regionu pacova (Rani i saradnici, 2009). Transkripcija TH i DBH gena se uporedo povećava vezivanjem acetil holina na nikotinske i muskarinske receptore povećavajući nivo sekundarnog glasnika camp. Praćenjem nivoa irnk za DBH tokom izlaganja IMO uočeno je da je neophodno minimum dva ponovljena izlaganja stresu da bi se postigle maksimalne vrednosti (McMahon i saradnici, 1992). Pokazano je da se kod knock-out miševa, kojima je uklonjen gen za c-fos ne povećava ekspresija DBH gena u mozgu (Sabban i saradnici, 1996). Ovaj faktor pripada ranim regulatorima, za koji je pokazano da mu se irnk povećava samo 7 minuta od početka delovanja stresa IMO,a posle 1 h dostiže maksimalni nivo. Još jedan od faktora koji je pokazan kao značajan u regulaciji ekspresije DBH gena je i c-jun čija se aktivnost povećava 5 minuta od početka delovanja IMO (Nankova i Sabban, 1999). 16

28 I UVOD Za sada iz nepoznatih razloga je uočeno da dugotrajnim dejstvom antipsihotika dolazi do promena u nivou irnk za AAAD u mozgu, ali ne i irnk za TH (Cumming i saradnici, 1995). Ovo je izolovan slučaj, jer nasuprot povećanju aktivnosti TH i DBH u superiornoj cervikalnoj gangliji pacova nakon stimulacije, AAAD se ne menja (Chalazonitis i saradnici, 1980). Slično, ne uočava se značajna promena u aktivnosti ovog enzima ni nakon stimulacije ganglije rezerpinom (Hendry, 1976). Nije detektovana promena u ekspresiji ovog gena tokom stresa. Za sada nije utvrđen fiziološki značaj ove pojave. PNMT enzim se prvi aktivira tokom stresa. Njegova irnk dostiže maksimalni nivo 5 minuta od početka IMO. Glukokortikoidi imaju važnu ulogu u regulaciji ekspresije gena za ovaj enzim (Wong i saradnici, 1992). Glukokortikoid responsivni element (GRE) je utvrđen na -533 poziciji i na još dve preklapajuće pozicije upstream u promotorskom regionu gena za PNMT kod pacova (Ross i saradnici, 1990; Tai i saradnici, 2002). Posttranskripciono GC regulišu nivo kofaktora S- adenozilmetionina (Jeong, 2000; Wong, 2002) PNMT promotor takođe sadrži nekoliko Sp1/Egr1 i AP2 regulatornih elemenata koji sinergistički interaguju sa dva bliska GRE elementa (Tai i saradnici, 2002; Wong i saradnici, 1998). Sp1/Egr1 region je važan za regulaciju PNMT ekspresije od strane protein kinaze A i protein kinaze C (Tai i saradnici, 2007; Tai i saradnici, 2003;Wong i Tank, 2007). Nedavno je otkriven dodatni element nikotin responsivni element (NRE) na PNMT genu koji je odgovoran za stimulaciju transkripcije ovog gena nikotinom (Evinger i saradnici, 2005). Uočeno je da transkripcija nije isto regulisana u svim tkivima. Tako je primećeno da se imobilizacijom podiže ekspresija TH i u srži nadbubrežne žlezde i u stelatnoj gangliji. IMO, stres hladnoće, hipoksija i insulin sporije povećavaju ekspresiju TH i DBH gena u stelatnoj gangliji u poređenju sa srži nadbubrežne 17

29 I UVOD žlezde. Konstantno osvetljenje u trajanju od 20 dana smanjuje nivo irnk za TH i DBH u cervikalnoj gangliji, ali ih povećava u meduli (Gallara i saradnici, 2004). Slika 3. Dijagram regulatornih elementa na promotorima gena za TH, DBH, i PNMT Aplikacija ACTH povećava nivo irnk za ove enzime u stelatnoj gangliji ali ne i u meduli (Nankova i saradnici, 1996). Različita kombinacija pozitivnih i negativnih transkripcionih faktora su odgovorni za tkivnu specifičnost regulacije ovih enzima (Trocme i saradnici, 2001). Pokazano je npr., da se za CRE region na promotoru gena za TH vezuju drugačiji transkripcioni faktori u meduli i u gangliji. Tretman rezerpinom povećava ekspresiju i sposobnost vezivanja inducibilnog camp represornog elementa (engl. ICER - Inducible CAMP early repressor) u adrenalnoj meduli, dok u stelatnoj gangliji povećava vezivanje modulatornog elementa zavisnog od camp (engl. CREM - camp-responsive element modulator) (Trocme i saradnici, 2001). 18

30 I UVOD Takođe stepen porasta ekspresije zavisi i od vrste stresora. IMO u trajanju od 2h značajno povećava irnk za TH u locus ceruleusu, pri čemu se maksimalne vrednosti dostižu 3 do 6 h posle izlaganja stresu. Udvostručene vrednosti su detektovane 4 dana posle hroničnog izlaganja hladnoći, dok aplikacija insulina nema efekta. Imobilizacija podiže nivo irnk za TH u meduli čak i kod životinja kojima je denervisana žlezda što pokazuje da je mehanizam tokom ovog stresa daleko kompleksniji (Richard i saradnici, 1988; Rusnak i saradnici, 1998) HIPOTALAMO-HIPOFIZNO-ADRENOKORTIKALNI SISTEM Još je Seley fokusirao svoju pažnju na hipotalamo-hipofizno-adrenokortikalni sistem (HHA) kao ključni efektorni sistem u stanju stresa. Moždana regija koja je uključena u kontrolu HHA su parvocelularni neuroni, jedara srednjeg i dorzalnog dela hipotalamusa. Morfološki i funkcionalno je podeljen na: magnocelularna, srednja parvocelularna, submagnocelularna regija i dorzalnu kapu. Magnocelularni region poseduje neurone koji sintetišu arginin-vazopresin (AVP) i oksitocin. Oni pružaju svoje aksone ka neurohipofizi i uključeni su u kontrolu važnih fizioloških funkcija. Dorzalna kapa i submagnocelularni region su uključeni u kontrolu vegetativnih funkcija preko projekcija ka moždanom stablu i spinalnim jedrima, vršeći tako kontrolu simpatičke i parasimpatičke aktivnosti. 19

31 I UVOD Medijalni parvocelularni neuroni pružaju aksone do hipofiznog portnog sistema gde u primarne kapilare oslobađaju hipofiziotropne hormone. Ovako oslobođeni hipotalamični hormone deluju na kortikotropne ćelije i učestvuju u kontroli sinteze i oslobađanja adrenokortikotropnog hormona (ACTH). Saffran i saradnici (1955) su regulatora oslobađanja ACTH prvi nazvali kortikotropin-oslobađajući faktor (CRF), koji je okarakterisan kao kortikotropin-oslobađajući hormon (CRH). CRH je protein sa 41. aminokiselinom koju je prvi izolovao Vale godine (Jones i Gillham, 1988). Ovaj hormon i njegovi receptori su nađeni u brojnim delovima mozga: limbičkom sistemu, centralnom noradrenergičkom sistemu locus ceruleusa i u kičmenoj moždini (Engler i saradnici, 1999; Nomura i saradnici, 2003). Centralna administracija CRH izaziva brojne fiziološke i bihevioralne promene koje se javljaju tokom odgovora na stres (Amico i saradnici, 2004, Uvnas- Moberg, 1998). Arginin-vasopresin (AVP) je peptidni produkt magnocelularnih neurona neurohipofize. Značajan je jer sinergistički sa CRH stimuliše oslobađanje ACTH (Jones i Gillham, 1988). Pokazano je da se, nakon adrenalektomije i kod hroničnog izlaganja jakim stresorima, povećava broj neurona koji koeksprimiraju CRH i AVP (Aguilera i Rabadan-Diehl, 2000). CRH deluje na kortikotropne ćelije vezujući se za CRH-1 receptor. CRH utiče na transkripciju gena za prekursor proopiomelanokortin (POMC) i sintezu POMC srodnih proteina (Levin i saradnici, 1989; Scott i Dinan, 1998). S druge strane, AVP se vezuje za V1b 20

32 I UVOD receptore koji su kuplovani sa fosfolipazom C i stimuliše oslobađanje ACTH (Schlosser i saradnici, 1994). Amplituda oslobađanja CRH i AVP povečana je u jutarnjim časovima i povećava amplitudu i frekvenciju oslobađanja ACTH i CORT (Diorio i saradnici, 1993, van Haarst i saradnici, 1997). ACTH oslobođen u cirkulaciju deluje na ćelije zona fascikulata kore nadbubrežne žlezde i aktivira enzime uključene u sintezu glukokortikoida (GC) iz holesterola (Sewer i Waterman, 2003), tako što se vezuje za melanokortin 2 (MC2-R) receptor, koji je kuplovan sa G proteinom i aktivira PKA signalni put (Galo-Payet i Payet, 2003). Tokom hroničnog stresa se uočava da su CRH i AVP drugačije regulisani. Ekspresija CRH je smanjena, dok je AVP povećana što omogućava organizmu da na novi stres odgovori adekvatnim oslobađanjem ACTH. Putem kratke povratne sprege ACTH inhibira produkciju CRH (Aguilera, 1994). Postoji i ultra kratka negativna sprega kao oblik autoregulacije aktivnosti PVN-a preko CRH i putem presinaptičkih CRH receptora. Uočeno je da postoji stimulatorna inervacija PVN-a od strane serotonergičkog i holinergičkog sistema (Herman i saradnici, 2003, Kovacs, 1998), kao i inhibitorni uticaj (GABA)/benzodiazepin (BZD) i opioidnog neuralnog sistema u mozgu (Pacak i Palkovits, 2001, Swanson i Sawchenko, 1983). Glukokortikoidi su produkti aktivacije HHA sistema. Ovi hormoni su plejotropni i ostvaruju svoj efekat preko intracelularnih receptora (Liu i saradnici, 1997). Neaktivni glukokortikoidni receptor (GR) smešten je u citosolu u formi heterooligomera sa heat shock proteinom i imunofilinom (Andres i saradnici, 1999). Po vezivanju liganda, dolazi do disocijacije od ostatka heteromera, dimerizacije i translokacije homodimera u nukleus gde interaguje sa specifičnim glukokortikoid responsivnim elementom (engl. GRE - glucocorticoid responsive element) koji je lociran na promotorskom regionu DNK molekula dovodeći do aktivacije transkripcije 21

33 I UVOD (Dal-Zotto i saradnici, 2003) ili ređe do transrepresije preko inhibitornog glukokortikoid responsivnog elementa (engl. igre- inhibitory glucocorticoid responsive element) (Gass i saradnici, 2001). Aktivirani receptori takođe mogu delovati na transkripcione faktore proteinprotein interakcijom, npr. na c- jun/c-fos heterodimer, koji podstiče transkripciju nekoliko gena uključenih u aktivaciju imunskog odgovora (Jacobson i Sapolsky, 1993; Ratka i saradnici, 1989), kao i faktora CREB i AP1 (Diamond i saradnici, 1990). Nivoi ACTH i kortikosterona u plazmi imaju nizak prag reakcije, tako da su dobri markeri za minimalne promene u homeostazi usled dejstva stresora (Armario i saradnici, 1986). Uočena je razlika i u zavisnosti od intenziteta stresa. Marquez (2002) je sa saradnicima merio vrednosti ovih hormona nakon elektrošoka stopala i imobilizacije. Vrednosti u plazmi su im bile slične. Koncentracija ovih hormona je bila slična 60-og minuta izlaganja stresorima, ali se uočava razlika nakon 90. minuta izlaganja stresu. Kod elektrošoka nivo ACTH i CORT naglo se smanjuje, dok nakon imobilizacije koncentracija ACTH u krvi postepeno opada, a CORT ostaje konstantno visok. Upravo ova razlika je rezultat razlike u intezitetu stresora. Pacak i Palkovits (2001) su pacove izlagali različitim stresorima od manjeg do najvećeg inteziteta: hladnoća, krvarenje i insulinom indukovana hipoglikemija. Merili su nivo ACTH, adrenalina i noradrenalina u plazmi. Pokazali su da se uporednim posmatranjem više 22

34 I UVOD stresnih markera uočava, da svaki stresor ima odgovarajući kvalitativni i kvantitativni profil KARDIOVASKULARNI SISTEM U STRESU Tokom klasičnog bori se ili beži odgovora dolazi do povećane aktivnosti kardiovaskularnog sistema. Srce mora da poveća svoju produktivnost da bi, tokom izlaganja stresu, obezbedio dovoljan protok krvi kroz koronarnu cirkulaciju i skeletne mišiće. Tako, srce uvećava frekvenciju i tri puta, da bi se efikasnost mišićne kontrakcije upetostručila (Vatner i saradnici, 1972). Dizajn kardiovaskularnog sistema se razvijao u smeru očuvanja metaboličkih potreba miokarda, a samim tim i povećanja protoka krvi, uz mogućnost brzog odgovora na pojačane potrebe tokom stresa. Postoje brojni, dodatni oblici prilagođavanja, uključujući metaboličke promene i promene u kinetici, koje mogu biti aktivirane u odgovoru na stres KATEHOLAMINERGIČKE ĆELIJE SRCA Smatra se da je odgovor kardiovaskularnog sistema na stres, primarno, rezultat oslobađanja kateholamina sa krajeva postganglijskih vlakana i iz nadbubrežne žlezde (Vatner i saradnici, 1972). Međutim, primećeno je da se ova promena u srčanom radu javlja i tokom treninga pasa, kojima je izvršena srčana denervacija i adrenalektomija (Donald i Shepherd, 1963). Posle denervacije srca, nivo NA pada na 5% od normalne vrednosti, a koncentracije A je dva puta manja (Spurgeon i saradnici, 1974). Kod pacijenata sa transplatiranim srcem, takođe se ostvaruje adekvatna funkcija miokarda, iako još nije došlo do reinervacije (Shaver i saradnici, 1969; Rowan i Billingham, 1988). Osim toga, miševi sa ciljanim oštećenjem 23

35 I UVOD u genu za enzime koji učestvuju u biosintezi kateholamina, umiru prenatalno usled otkazivanja srca. Sve to ukazuje da je jedna od ključnih uloga kateholamina i u razviću miokardijuma, još na nivou fetusa, kada još uvek nije došlo do ostvarivanja simpatičke inervacije (Thomas i saradnici, 1995; Zhou i saradnici, 1995). Kod pacijenata kod kojih je došlo do otkazivanja srca uočeni su ekstremno visok nivo A u koronarnoj cirkulaciji koji se ne mogu povezati sa aktivacijom simpatoadrenomedularnog sistema (Kaye i saradnici, 1995). Svi ovi rezultati sugerišu na postojanje drugog izvora gde se vrši sinteze kateholamina, a koji učestvuju u regulaciji srčanog rada. Upravo srčane ćelije su taj izvor i poseduje, biosintetsku, enzimsku aktivnost i nakon simpatektomije (Elayan i saradnici, 1990). Huang i saradnici (1996) su prvi identifikovali, u srcu sisara, do tada neopisan tip srčane ćelije sa parakrinim, adrenergičnim svojstvima. One su nazvane unutarsrčane adrenergične ćelije (engl. ICA - intrinsic cardiac adrenergic). Poseduju jedinstvenu morfologiju i sposobne su za biosintezu kateholamina in vitro. ICA ćelije se detektuju i u fetalnom miokardijumu, pre postojanja simpatičke inervacije. Kod odraslih pacova ove ćelije spontano oslobađaju NA i A in vitro u odnosu 7,5:1. Ove ćelije su specijalizovane kardiomiocite koje su alternativni izvor kateholamina, u cilju održanja kontraktilnosti miokarda u stanju mirovanja i tokom stresa u odsustvu simpatičke inervacije (Zhuang i saradnici, 2005). Prvi put je detektovana irnk za PNMT u srcu fetusa pacova (Ebert i saradnici, 1996). Krizanova je sa saradnicima (2001) potvrdila da se irnk za PNMT eksprimira u pretkomorama i komorama srca odraslih pacova. Mi smo godine koristeći osetljiviju metodu Real-time PCR potvrdili da se osim PNMT, eksprimiraju i geni za TH i DBH enzime u srcu pacova i da se mogu detektovati promene u nivou irnk ovih enzima tokom stresa (Gavrilović i saradnici, 2009). 24

36 I UVOD PRENOS SIGNALA ADRENOCEPTORA U SRCU U normalnom, zdravom srcu prisutni su α- i β-adrenoceptori, ali se smatra da α receptori imaju manji značaj u regulaciji rada srca kod ljudi (Steinfath i saradnici, 1992). Postoje tri tipa β-adrenoceptora (β 1, β 2 i β 3 ), pri čemu se β 1 smatraju najznačajnijim. Procenat u kome se eksprimira β 1 (60-80%) je najveći, dok je gustina β 2 receptora 20-40%, a β 3 svega 2% u zdravom srcu ljudi (Rozec i Gauthier, 2006). Odnos između β 1 i β 2 receptora zavisi od vrste životinje i modifikovan je u patološkim stanjima (Brodde i Michel, 1999). Sva tri tipa su kuplovana sa adenilatnom ciklazom (AC) preko G proteina. β 1 - i β 2 AR pri tome se vezuju za stimulatorni G (Gs), a β 3 -AR za inhibitorni G (Gi) protein. Poznata je i aktivacija Gi signalnog puta β 2 receptorom (Kuschel i saradnici, 1999). Stimulacijom Gs proteina aktivira se membranski vezan enzim adenilatna ciklaza (AC), koja katalizuje ATP u ciklični AMP (camp). Sekundarni glasnik camp, potom, aktivira protein kinazu A (PKA), koja fosforiliše brojne proteine, kao što su L kanali za Ca 2+ (Gerhardstein i saradnici, 1999), fosfolamban (Simmerman i Jones, 1998) i troponin (Sulakhe i Vo, 1995). Fosforilacijom L kanala za Ca 2+ povećava se stepen ulaska ovog jona u ćelije miokarda preko sarkomere i T tubula, kojim se potom inicira dalje oslobađanje Ca 2+ iz sarkoplazmatičnog retikuluma (SR) preko kanala indukovanih oslobađanjem Ca 2+ (Castellano i Böhm, 1997) inicirajući pozitivan, inotropni efekat (povećanje kontraktilnosti). S druge strane, fosforilacijom inhibitornih, regulatornih proteina troponina I i fosfolambana inicira se preuzimanje Ca 2+ natrag u SR i uporedo smanjuje se afinitet ovog jona za troponin C dovodeći do negativno inotropnog efekta. Osim toga, preko β 1 - i β 2 AR se ostvaruje i pozitivan hronotropni (povećavaju frekvenciju srca), dromotropni (povećavaju konduktivnost), i batmotropni efekat 25

37 I UVOD (povećavaju plato ekscitacije) (Opie, 1998). Pokazano je da stimulacija β 1 -receptora, takođe, ostvaruje efekte i nezavisno od PKA signalnog puta (Zhu i saradnici, 2003). Kada se CA vežu za β 3 - i β 2 -AR u određenim uslovima aktiviraju Gi protein, proizvode suprotni efekat od β 1 receptora. Milano i saradnici (1994a) su pokazali da kod pacova kojima je ekstemno eksprimiran gen za β 2 receptor, stepen kontraktilnosti je ipak limitiran, jer Gi inhibira AC. Xiao i saradnici (1999) su potvrdili ovu činjenicu povećavši kontraktilnost kod ovako genetički modifikovanih pacova, inaktiviranjem Gi proteina pertusis toksinom. S druge strane, Gi učestvuje i u drugim, značajnim signalnim putevima, kao što je veza sa MAP kinazama (Daaka i saradnici, 1997). Srčani β 1 i β 2 AR pokazuju različite efekte na kontraktilnost, na koncentraciju i promet Ca 2+ jona u ćelijama izolovanim iz komore pacova (Xiao i saradnici, 1994). Upravo se iz njihove molekularne strukture mogu predvideti različiti obrasci u signalizaciji. Oba su heptaheliksa, tj. receptor sa sedam transmembranskih regiona. U transmembranskm regionima je najveća homologija (~71%) u aminokiselinskom (AK) sastavu i oni su ključni u određivanju specifičnosti liganda koji će se vezati (Frielle i saradnici, 1987). Međutim, citoplazmatični regioni ovih receptora, koji su u interakciji sa drugim ćelijskim proteinima koji posreduju u signalizaciji, odlikuju se značajnom divergencijom (Frielle i saradnici, 1987). U stvari, smatra se da je poliprolinski region u trećoj citoplazmatičnoj petlji vrlo značajan, jer se zamenom AK u ovom regionu, značajno menjaju osobine signalizacije (Green i Liggett, 1994). Nedavno su, Rybin i saradnici (2000) opisali postojanje razlika u β-ar i adenilatnim ciklazama i po specifičnim unutarćelijskim kompartmanima kardiomiocita pacova. Pošto su β 2 -AR, Gαi i PK povezane sa kaveolinom-3, one tako ostaju vezane za male invaginacije ćelijske membrane - kaveole i deluju samo lokalno. Nasuprot tome, β 1 -AR, Gαs i AC V i VI su ravnomerno raspoređeni između kaveola i 26