SVEUČILIŠTE U RIJECI ODJEL ZA BIOTEHNOLOGIJU Diplomski sveučilišni studij Biotehnologija u medicini Franka Rigo Utjecaj tirosola i kvercetina na indik

SVEUČILIŠTE U RIJECI ODJEL ZA BIOTEHNOLOGIJU Diplomski sveučilišni studij Biotehnologija u medicini Franka Rigo Utjecaj tirosola i kvercetina na indikatore starenja i redoks statusa u period cirkadijalnih mutanata Drosophile Diplomski rad Rijeka, 2016. godina

SVEUČILIŠTE U RIJECI ODJEL ZA BIOTEHNOLOGIJU Diplomski sveučilišni studij Biotehnologija u medicini Franka Rigo Utjecaj tirosola i kvercetina na indikatore starenja i redoks statusa u period cirkadijalnih mutanata Drosophile Diplomski rad Rijeka, 2016. godina

Mentor rada: doc. dr. sc. Rozi Andretić Waldowski Diplomski rad obranjen je dana, pred povjerenstvom: 1. 2. 3. Rad ima 68 stranica, 20 slika, 13 tablica i 74 literaturnih navoda.

SAŢETAK Ciklusi svjetla i mraka reguliraju cirkadijalne gene koji diktiraju ritmove metabolizma i antioksidativnih enzima koji su usko povezani sa stvaranjem slobodnih radikala (ROS) u organizmu. Prema jednoj od teorija starenja, nakupljanje slobodnih radikala uzrokuje smanjenje funkcionalnog kapaciteta organizma, što je vidljivo na bihevioralnoj (smanjenje lokomotorne aktivnosti, poremećeno spavanje) i biokemijskoj razini (oštećenja proteina, DNA i lipida). Poznato je da su mutacije u period (per) cirkadijalnom genu povezane s prijevremenim starenjem. Polifenoli su poznati po svojim antioksidativnim svojstvima, što znači da smanjuju i usporavaju oksidativna oštećenja stanica izazvana slobodnim radikalima. Istraţili smo potencijalan blagotvorni učinak polifenola kvercetina i tirosola na indikatore starenja kod period cirkadijalnih mutanata (per 01 ) Drosophile melanogaster. Testovi su provedeni na per 01 mutantima Drosophile oba spola. Mušice su od roďenja hranjene hranom s dodatkom različitih koncentracija kvercetina ili tirosola. Testirali smo njihov bihevioralni i biokemijski fenotip nakon 2, 4 i 6 tjedana tretmana polifenolima te smo rezultate usporedili s mladim i starim netretiranim mušicama. Od bihevioralnih indikatora starenja mjerili smo negativnu geotaksiju (sposobnost vertikalnog penjanja), količinu lokomotorne aktivnosti i spavanja tijekom 24 sata, otpornost na stres izgladnjivanjem i isušivanjem, preţivljenje i teţinu. Mjerili smo i biokemijske indikatore u koje spadaju aktivnost antioksidativnih enzima katalaze (CAT) i superoksid dismutaze (SOD), nakupljanje AGE biomarkera starenja te količina mono-di-triglicerida i reduktivnih šećera. Rezultate testova na per 01 mutantima usporedili smo s rezultatima mušica divljeg tipa. Potvrdili smo da postoje razlike u procesu starenja mušica divljeg tipa i period mutanata. Polifenoli kvercetin i tirosol pozitivno su djelovali na neke od bihevioralnih i biokemijskih indikatora starenja, a taj učinak ovisio je o spolu, genotipu i starosti mušica, te koncentraciji polifenola. Točan mehanizam djelovanja

polifenola nije još razjašnjen, a postoji mogućnost da na smanjenje oksidativnog stresa djeluje direktno (uklanjanjem ROS ili čak sprječavanjem njihova nastajanja) i indirektno (potičući djelovanje endogenih antioksidativnih enzima). Vaţno otkriće ovog istraţivanja je postojanje interakcije per gena s mehanizmom djelovanja polifenola. Ključne riječi: starenje, ROS, per gen, polifenoli, Drosophila melanogaster

SUMMARY Circadian genes regulate metabolic changes closely connected with ageing. Ageing is caused by accumulation of Reactive Oxidative Species (ROS) which leads to changes in behaviour (decrease in locomotor activity, disrupted sleep) and physiology (damaged proteins, DNA and lipides). It was reported that mutation in period (per) circadian gene influences ageing by shortening lifespan. Polyphenols quercetin and tyrosol are known antioxidants, so we tested their beneficial effect on indicators of ageing and redox state in per 01 circadian mutant. Tests were performed on flies of both sexes. They were fed on food containing different concentrations of polyphenols from eclosion and compared to flies fed on regular food. We tested their behavioral and biochemical phenotypes after 2, 4 and 6 weeks of treatment. We measured negative geotaxis (vertical climbing ability), amount of locomotor activity and sleep during 24 h, resistance to starvation and dehydration stress, longevity and weight. We also measured biochemical phenotypes such as CAT (catalase) and SOD (superoxide dismutase) activity, AGE biomarker, amount of reductive sugars and mono-di-tri-glycerides. We confirm difference in ageing process of wt and per 01 flies. Polyphenols quercetin and tyrosol had positive effect on several behavioral and biochemical indicators of ageing. This effect was dependent on sex, genotype and age of flies and concentration of polyphenols. Exact mechanism of action of polyphenols is still not clear, and they could act directly (by removing ROS or preventing its generation) and indirectly (by stimulating the activity of the endogenous antioxidative enzymes). An important finding of this work is the interaction between per circadian gene and the mechanism of action of polyphenols. Key words: ageing, ROS, per gene, polyphenols, Drosophila melanogaster

SADRŢAJ 1. UVOD... 1 1.1 Starenje... 1 1.2 Teorija oksidativnog stresa... 2 1.3 Slobodni radikali... 3 1.4 Antioksidativni sustav... 5 1.5 Enzimski antioksidansi... 7 1.6 Polifenoli i njihov učinak... 8 1.6.1 Kvercetin... 9 1.6.2 Tirosol... 10 1.7 Genska teorija starenja... 11 1.8 Povezanost cirkadijalnog sata i ROS-a... 12 1.9 Drosophila melanogaster... 14 1.10 Cirkadijalni sat kod Drosophile i per mutanti... 15 2. CILJ RADA... 18 3. MATERIJALI I METODE... 20 3.1 Uzgoj, prikupljanje i manipuliranje Drosophile... 20 3.2 Bihevioralni testovi... 21 3.2.1 Test negativne geotaksije... 21 3.2.2 Aktivnost i spavanje tijekom 24 h... 22 3.2.3 Stres izgladnjivanjem... 24 3.2.4 Stres isušivanjem... 24 3.2.5 Ţivotni vijek (preţivljenje)... 24 3.2.6 Teţina mušica... 24 3.3 Biokemijski testovi... 25 3.3.1 Mjerenje aktivnosti enzima katalze... 25 3.3.2 Mjerenje postotka inhibicije enzima SOD... 25 3.3.3 OdreĎivanje AGE markera... 26 3.3.4 OdreĎivanje mono-di-tri glicerida... 26 3.3.5 OdreĎivanje reduktivnih šećera... 26

3.4 Analiza i statistička obrada podataka... 27 4. REZULTATI... 28 4.1 Bihevioralni testovi... 28 4.1.1 Negativna geotaksija... 28 4.1.2 Ukupna lokomotorna aktivnost tijekom 24 h... 30 4.1.3 Ukupno spavanje tijekom 24 h... 32 4.1.4 Stres isušivanjem... 34 4.1.5 Stres izgladnjivanjem... 36 4.1.6 Preţivljenje... 38 4.1.7 Prosječna teţina... 40 4.2 Biokemijski testovi... 41 4.2.1 CAT aktivnost... 41 4.2.2 SOD aktivnost... 43 4.2.3 AGE biomarker... 46 4.2.4 Mono-di-trigliceridi... 48 4.2.5 Reduktivni šećeri... 50 4.3 Tablica statističkih značajnosti... 52 5. RASPRAVA... 54 6. ZAKLJUČAK... 60 7. LITERATURA... 62

1. UVOD 1.1 Starenje Starenje je ireverzibilan biološki proces u ţivotnom ciklusu svake jedinke do kojeg dolazi meďudjelovanjem gena i okolišnih čimbenika. Ono podrazumijeva nakupljanje promjena u organizmu koje uzrokuju otkazivanje mehanizama za odrţavanje homeostaze tijekom vremena te je najveći rizični faktor za većinu ljudskih bolesti (1). Istraţivanje procesa starenja vaţno je za bolje razumijevanje niza promjena koje vode do slabljenja organizma i većoj podloţnosti bolestima (2). Starenje se očituje na staničnoj, tkivnoj i sistemskoj razini. Na biokemijskoj i staničnoj razini, starenje mijenja gensku ekspresiju i odgovor na staničnu signalizaciju. Poremećaji staničnih mehanizama koji reguliraju gensku ekspresiju, metabolizam, staničnu diobu i rast mogu dovesti do nastanka bolesti. Utjecaj starenja je tkivno specifičan i različit je kod pojedinih vrsta tkiva. Bolesti povezane sa starenjem koje se tiču odreďene vrste tkiva mogu imati i sistemski utjecaj (2). Taj sistemski utjecaj moţe biti vidljiv kao promjene u ponašanju (bihevioralni fenotip). Unatoč brojnim hipotezama, mehanizmi koji uzrokuju vremenski ovisno smanjenje funkcionalnog kapaciteta organizma nisu precizno objašnjeni. Oko 300 danas poznatih teorija starenja mogu se svrstati u dvije glavne skupine: teorije koje smatraju starenje genetički predodreďenim procesom i teorije koje tvrde da do starenja dolazi zbog nakupljanja oštećenja u stanici (3). U prvu skupinu spadaju tzv. programirane teorije prema kojima starenje nastaje kao posljedica promjena u kontrolnim mehanizmima vaţnim za odrţavanje homeostaze i obranu organizma. Primjerice, promjena u endokrinoj funkciji (hormonalna teorija) i razini ekspresije gena (genska teorija) te skraćivanje telomera (teorija replikativnog starenja) (4). Prema neprogramiranim teorijama starenja, smatra se da je starenje rezultat kumulativnog oštećenja na različitim razinama organizacije biološkog sustava, posebice oštećenjem proteina i DNA (nuklearne i mitohondrijske) zbog djelovanja slobodnih radikala (5). 1

Iako niti jedna od postojećih teorija ne objašnjava starenje u potpunosti, eksperimentalna istraţivanja pokazala su kako se neke od teorija preklapaju i meďusobno nadopunjavaju (3). Proces starenja je vrlo sloţen i najvjerojatnije je posljedica djelovanja različitih mehanizama (ne samo genetičkih, već i stečenih) koji vode trajnom gubitku proliferativnog kapaciteta, poremećaju homeostaze, smanjenoj otpornosti na stres i većem riziku za pojavu bolesti (5). 1.2 Teorija oksidativnog stresa Teorija slobodnih radikala i oksidativnog stresa jedna je od najprihvaćenijih teorija starenja. Smatra se da je nakupljanje slobodnih radikala kisika u organizmu glavni uzrok oštećenja tkiva i starenja (6). Procesom oksidacije u stanicama oslobaďa se energija potrebna za ţivot. U raznim metaboličkim procesima u tijelu za razgradnju tvari troši se kisik koji se udiše iz atmosfere. 95% udahnutog kisika se metabolizira tj. pretvori se u vodu aerobnim načinom razgradnje tvari, dok se preostalih 5% kisika pretvara u slobodne radikale koji stupaju u interakciju s molekulama u stanici narušavajući tako njihovu funkciju (7). Teorija slobodnih radikala povezana je s hipotezom o brzini življenja (eng. ''rate of living'') koja pretpostavlja da je brzina metabolizma povezana s produkcijom slobodnih radikala i dugovječnosti, te da se oksidativna oštećenja makromolekula u stanicama povećavaju tijekom godina (8,9). Dokazi koji podrţavaju teoriju slobodnih radikala pronaďeni su u eksperimentima na animalnim modelima. Ograničavanje kalorijskog unosa kod štakora uzrokovalo je produljenje ţivotnog vijeka, poboljšanje sustava obrane od slobodnih radikala i smanjilo oksidativna oštećenja. Tkiva ţivotinjskih vrsta koje imaju dulji ţivotni vijek manje su podloţna oksidativnim oštećenjaima od onih koje ţive kraće, što pokazuje da su uvijeti koji potiču nastajanje slobodnih radikala, kao što je npr. brzina metabolizma, povezani s kraćim ţivotnim vijekom (10). 2

1.3 Slobodni radikali Slobodni radikali kisika ili reaktivne kisikove vrste (ROS; reactive oxygen species) su nestabline i veoma reaktivne molekule koje oksidativnim stresom tijekom vremena sve više oštećuju stanične strukture (4). Slobodni radikali mogu biti endogenog (nastaju u stanici) i egzogenog podrijetla (nastaju u okolini). Endogeni slobodni radikali nastaju u mitohondrijima kao meďuprodukti stvaranja energije, dok egzogeni radikali nastaju djelovanjem zračenja (npr. UV, ionizirajuće) ili ih unosimo u organizam putem toksičnih tvari (npr. dim cigarete). Najbitniji slobodni radikali u biološkom sustavu jesu superoksidni anion (O - 2 ), vodikov peroksid (H 2 O 2 ), hidroksilni radikal (OH - ), dušični monoksid (NO) itd. (5) Po svojoj strukturi, to su različiti spojevi i oblici molekule kisika u kojima atom kisika ima jedan nespareni elektron u vanjskoj elektronskoj ljusci. Oni nastaju kemijskim reakcijama u kojima kisik prima ili otpušta jedan elektron. Primjer takve reakcije je svakodnevno nastajanje superoksidnog aniona (O - 2 ) u respiratornom lancu u mitohondrijima koji su glavni izvor slobodnih radikala u eukariotskim stanicama (11). Slobodni radikali vrlo su reaktivni i imaju tendenciju da svoj negativni naboj neutraliziraju u okolini kako bi postigli stabilnost. Poluţivot slobodnih radikala u organizmu je vrlo kratak (< 1 sekunde), no oni imaju sposobnost induciranja lančanih neenzimatskih reakcija kojima se stvaraju nove radikalne molekule. Stvaranje sve veće količine slobodnih radikala u organizmu i slabljenje mehanizama njihove eliminacije (antioksidativnog djelovanja) tijekom godina vodi ka sve većoj neuravnoteţenosti redoks stanja organizma ili tzv. oksidativnom stresu (5). Oksidativni stres je stanje u stanici do kojeg dolazi kada se naruši ravnoteţa izmeďu štetnih čimbenika (ROS) i sposobnosti popravka oštećenja. 3

Slika 1. Teorija oksidativnog stresa. Do stanja oksidativnog stresa u stanici dolazi narušavanjem ravnoteţe izmeďu slobodnih radikala (ROS) i antioksidanasa (AOX), bilo zbog prekomjernog nakupljanja ROS ili smanjene funkcije AOX. Izvor:https://openi.nlm.nih.gov/imgs /512/237/139384/PMC139384_gb-2002-3-7-reviews1019-1.png Slobodni radikali svojim vezanjem uzrokuju kumulativna i trajna oštećenja DNA, proteina i lipida u stanici. Radikali kisika oštećuju DNA u jezgri i mitohondrijima tako što stupaju u interakciju s dušičnim bazama, mijenjaju njihovu funkciju i strukturu DNA (12). Utjecajem slobodnih radikala dolazi do promjene strukture staničnih proteina, što uzrokuje njihovo propadanje ili nefunkcionalno povezivanje domena različitih proteina (13). ROS reagiraju s dvostrukim vezama u nezasićenim masnim kiselinama koje su vrlo osjetljive na njihovo djelovanje, posebice one s većim brojem dvostrukh veza. Interakcija s polinezasićenim masnim kiselinama stanične membrane uzrokuje povećanje propusnosti membrane i smanjenje njezine 4

funkcionalnosti (14). Zbog utjecaja slobodnih radikala nastaju i AGE (eng. advanced glycation end) produkti, specifični proteinski i ugljikohidratni adukti koji su biomarkeri oštećenja povezanih sa starenjem (15). AGE produkti nastaju kada šećeri reagiraju sa slobodnim radikalima i generiraju vrlo reaktivne karbonilne spojeve (npr. glioksal i metilglioksal). Te reaktivne karbonilne vrste zatim stvaraju stabilne adukte sa lizinom, argininom i cisteinom u proteinima. Mjerenje AGE biomarkera omogućuje uvid u redoks status niza proteina koji su vaţni za proces starenja. 1.4 Antioksidativni sustav Da bi se zaštitio od štetnih utjecaja slobodnih radikala, organizam je stvorio kompleksni antioksidativni zaštitni sustav. Svrha tog sustava je interakcija sa slobodnim radikalima kako bi se smanjila njihova količina u organizmu. Antioksidansi su molekule koje slobodne radikale pretvaraju u energetski stabilnije i netoksične metabolite tako što ih neutraliziraju davanjem elektrona (5). Antioksidativnu obranu stanice čini mreţa enzima, od kojih su najbitniji superoksid dismutaza (SOD), katalaza (CAT), glutation peroksidaza (GPx), glutation reduktaza, peroksiredoksini i tioredoksini itd (1). Najzastupljeniji antioksidativni enzim u stanici je SOD, a njegova koncentracija ovisi o metaboličkoj aktivnosti stanice (16). Osim enzimskih, vaţni su i neenzimski antioksidansi kao što su glutation (GSH), α- tokoferol (vitamin E), koenzim Q10 (CoQ10), askorbat (vitamin C), melatonin, karotenoidi, prirodni flavonoidi (polifenoli) itd. (5). 5

Slika 2. Prikaz nastajanja i utjecaja slobodnih radikala te mehanizama njihova uklanjanja pomoću enzimskih antioksidanasa. SOD - Superoksid dismutaza, GPx - Glutation peroksidaza Enzimski i neenzimski antioksidativni sustav sinergistički štite stanice i organe u tijelu od oštećenja izazvanih slobodnim radikalima (17). Antioksidansi mogu biti endogeni ili dobiveni iz okoline (egzogeni), npr. iz prehrane ili kao dodaci prehrani. Pojedini spojevi iz prehrane ne neutraliziraju slobodne radikale, ali pojačavaju endogenu antioksidativnu aktivnost, pa takoďer mogu biti klasificirani kao antioksidansi. Idealni antioksidans treba se lako apsorbirati, neutralizirati slobodne radikale i kelatirati redoks metale (17). Trebao bi funkcionirati u vodenoj i/ili membranskoj domeni te pozitivno utjecati na gensko izraţavanje. Endogeni antioksidansi imaju ključnu ulogu u odrţavanju optimalnog funkcioniranja stanice te time zdravlja i dobrobiti cijelog organizma. MeĎutim, u uvijetima pojačanog oksidativnog stresa, endogeni antioksidansi nisu dovoljni te su potrebni antioksidansi iz prehrane kako bi se odrţale normalne stanične funkcije. Neki antioksidansi mogu u interakciji s drugim antioksidansima poboljšati njihova originalna svojstva te se taj mehanizam 6

često naziva ''mreţom antioksidansa'' (18). Sve je više dokaza koji podrţavaju povezanost izmeďu povećane razine slobodnih radikala i poremećene aktivnosti enzimskih i neenzimskih antioksidansa kod bolesti koje su povezane sa starenjem. 1.5 Enzimski antioksidansi Superoksid dismutaza (SOD) je jedan od najučinkovitijih enzimskih antioksidansa. On katalizira pretvorbu superoksidnih aniona (O - 2 ) u vodikov peroksid ili molekulu kisika. SOD postoji u nekoliko izoformi, koje se razlikuju po središnjem metalu, slijedu aminokiselina, kofaktorima itd. Kod ljudi su prisutne 3 izoforme: citosolna Cu,Zn-SOD (SOD1), mitohondrijalna Mn-SOD (SOD2) i izvanstanična SOD (SOD3) (19). SOD neutralizira superoksidne ione prolazeći oksidacijske i redukcijske cikluse iona prijelaznih metala na svom aktivnom mjestu (20). SOD1 im dvije identične podjedinice, a svaka od njih kao aktivno mjesto sadrţi klaster iona bakra i cinka (21). Ona specifično katalizira dismutaicju superoksidnog aniona u kisik i vodu. Mitohondrijalna SOD2 je homotetramer i sadrţi jedan manganov atom u svakoj podjedinici, koji se mijenja iz Mn(III) u Mn(II), te natrag Mn(III) tijekom ciklusa dismutacije superoksidnog aniona. SOD3 sadrţi bakar i cink, ima veliki afinitiet za glikozaminoglikane (npr. heparin, heparin sulfat), a na njezinu regulaciju u tkivima sisavaca uglavnom utječu citokini, a ne oksidativni stres (21). Pojedine vrste nemaju SOD3, primjerice kod Drosophile su prisutne samo citosolna Cu/Zn SOD (SOD1) i mitohondrijalna Mn SOD (SOD2) (22). SOD1 Drosophile je dimer te ima 56-57% homologije sa sekvencom kodirajuće regije SOD1 prisutne kod štakora i ljudi. Katalaza je enzim prisutan u peroksisomima aerobnih stanica i vrlo je učinkovit u poticanju pretvorbe vodikovog peroksida u vodu i kisik. Ima jednu od najvećih stopa pretvorbe meďu enzimima: jedna molekula katalaze moţe pretvoriti oko 6 milijuna molekula vodikovog peroksida u vodu i kisik tijekom 1 minute (21). Pretvorba vodikovog peroksida vaţna je kako nebi došlo do njegovog prekomjernog nakupljanja ili Fentonove reakcije s ionima metala pri čemu nastaje štetan hidroksilni radikal (OH - ) (23). Činjenica je da mutacije u genu za katalazu kod 7

Drosophile melanogaster uzrokuju hiperosjetljivost na vodikov peroksid i smanjeno preţivljenje, što je potvrďeno i kod mutanata E. Coli i kvasaca (24). To ukazuje da je katalaza predstavlja jedan od ključnih putova za uklanjanje endogenog H 2 O 2 i osigurava značajnu zaštitu od toksičnih učinaka kisikovih slobodnih radikala. 1.6 Polifenoli i njihov učinak kvercetin tirosol Slika 3. Kemijske strukture kvercetina i tirosola. Polifenoli su prirodni spojevi koji se mogu naći u voću, povrću, ţitaricama i pićima. Namirnice iz mediteranske prehrane, npr. maslinovo ulje, crno vino, groţďe posebice su bogate polifenolima, a prisutni su i u jabukama, kruškama, trešnjama, bobičastom voću, čaju, kavi, čokoladi itd. (25). Polifenoli su sekundarni metaboliti biljaka i imaju veliku biološku aktivnost. Poznato je njihovo antioksidativno i antikancerogeno djelovanje, a epidemiološke studije su pokazale da dugotrajna konzumacija prehrane bogate polifenolima iz biljaka pomaţe u zaštiti protiv kardiovaskularnih bolesti, dijabetesa, osteoporoze i neurodegenerativnih bolesti. Polifenoli mogu djelovati tako da specifično inhibiraju ili aktiviraju odreďene enzime i enzimske sustave, omogućavaju specifična meďudjelovanja receptora i utječu na izraţenost gena (26). Polifenoli su poznati kao antioksidansi koji uklanjaju slobodne radikale i imaju sposobnost djelovanja na veliki broj mitohondrijskih procesa. Neki od njih mogu modulirati putove koji definiraju biogenezu mitohondrija (npr. potičući sirtuine), 8

mitohondrijski membranski potencijal (permeabilnost pora membrane), mitohondrijski transportni lanac elektrona i ATP sintezu (modulirajući aktivnost I-V kompleksa) te oksidativni status unutar mitohondrija (npr. inhibirajući/potičući enzime za stvaranje/uklanjanje slobodnih radikala) (27). Danas je okarakterizirano preko 8000 polifenolnih spojeva, a svima je zajednička fenolna jedinica. Većina biljnih fenolnih spojeva nastaju iz istog prekursora, fenilalanina (25). Polifenoli se mogu podjeliti u različite skupine, ovisno o broju fenolnih prstenova i elementima koji te prstenove povezuju. Glavne skupine polifenola su fenolne kiseline, flavonoidi, stilbeni i lignani. 1.6.1 Kvercetin Najvaţniji predstavnik skupine flavonoida je kvercetin čija je kemijska struktra skeletna osnova većine drugih bioflavonoida. On je najaktivniji od svih flavonoida i bitan je sastojak brojnih ljekovitih biljaka (28). Pokazano je da kvercetin jak antioksidans koji ima i protuupalno i anti-proliferativno djelovanje te sposobnost promjene ekspresije gena in vitro (28). Do sada su in vivo dokazana samo njegova antioksidativna i protuupalna svojstva. Zanimljivo je da su ta dva svojstva kvercetina izraţenija pri uvijetima jačeg oksidativnog stresa i upale. To pokazuje da je upotreba kvercetina kao dodatka prehrani učinkovitija kod osoba koje već boluju od bolesti povezanih s oba procesa, npr. hipertenzije ili kronične upale pluća. Kvercetin djeluje tako da štiti LDL (low-density lipoprotein) kolesterol od oksidacije i tako smanjuje opasnost od nakupljanja kolesterola na unutarnjim stijenkama krvnih ţila (29). U studijama na modelnim organizmima, pokazano je da kvercetin smanjuje markere oksidativnog stresa i produljuje ţivotni vijek za 60% kod kvasaca S. cerevisiae (30) i 15% kod C. elegans (31). Dobra učinkovitost kvercetina u uklanjanju slobodnih radikala moţe objasniti zapaţenu smanjenu aktivnost SOD u tim studijama. Antioksidativni kapacitet kvercetina smanjuje potrebu za odrţavanjem redoks homeostaze u stanici putem SOD (31). Do sada, toksični učinci kvercetina uočeni su u in vitro istraţivanjima (28). Ti učinci su najvjerojatnije povezani s formiranjem mogućih toksičnih produkata nakon oksidacije kvercetina pri njegovoj interakciji sa slobodnim radikalima. Najvaţniji od 9

tih produkata je orto-kinon (QQ) koji moţe ometati funkciju vaţnih enzima. Kod vinskih mušica je pokazana i mogućnost genotoksičnog djelovanja kvercetina (32). Prema tome, kod unosa kvercetina in vivo, bitno je obratiti paţnju na njegovu moguću toksičnost, pogotovo ako se primjenjuje kroz dulje vremensko razdoblje. Slika 4. Učinci kvercetina. Korisni i toksični učinci kvercetina dokazani u in vitro i in vivo istraţivanjima. Izvor: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/s00 14299908002884#gr9 1.6.2 Tirosol Tirosol je prirodni fenolni antioksidans čiji je glavni izvor maslinovo ulje, a prisutan je i u vinu, pivi, arganovom ulju, pelinkovcu (33). Iako nije moćan kao drugi antioksidansi prisutni u maslinovim ulju, njegova povišena koncentracija i dobra bioraspoloţivost mogu imati povoljan ukupni učinak. Tirosol se, ako i kvercetin, moţe vezati za ljudski LDL i biti učinkovit u prevenciji lipidne peroksidacije i procesa ateroskleroze (33). Na in vivo modelu štakora pokazano je da tirosol djeluje kardioprotektivno te inducira SIRT1 (SIRTUIN 1), protein dugovječnosti koji se moţe uzeti u obzir za terapiju protiv prijevremenog starenja (34). Tretman tirosolom produljio je ţivotni vijek oblića C. Elegans, povećao otpornost na toplinski i oksidativni stres te smanjio pojavu biomarkera starenja (35). 10

1.7 Genska teorija starenja Prema genskoj teoriji, starenje je posljedica promjene u genima i razini njihove izraţenosti (4). Ti geni uključeni su u regulaciju popravka DNA i staničnih struktura, a kada su mutirani uzrokuju ubrzano starenje (36). Neki od gena koji se smatraju odgovornim za starenje utječu na duljinu telomera, čije je skraćivanje povezano s kraćim ţivotnim vijekom. Još neki geni koji se povezuju sa starenjem uključuju mitohondrijsku DNA i gene koji reguliraju upalni odgovor. Sirtuini (SIRT) se ubrajaju u potencijalne gene dugovječnosti i evolucijski su konzervirani (4). To su histonske deacetilaze uključene u odgovor stanice na stres (npr. kalorijsku restrikciju) s ulogom zaštite i stabiliziranja genoma. Sirtuini utječu na gene za reprodukciju, stišavanje rdna, regulaciju metabolizma i sprečavaju apoptozu što produljuje ţivotni vijek stanice. Delecijom SIRT gena skraćuje se ţivotni vijek (37). Pokazano je da su SIRT jedna od poveznica starenja i regulacije dnevnih (cirkadijalnih) ritmova putem utjecaja na cirkadijalne gene (38). Karakteristične varijacije u količini stvaranja O - 2 i H 2 O 2 kod različitih vrsta pokazuju da je i količina stvaranja slobodnih kisikovih radikala genetski odreďena (9). I varijacije meďu vrstama u enzimatskoj antioksidativnoj obrani i duljini ţivotnog vijeka ukazuju da specifični geni utječu na oksidativni stres i starenje. Istraţivanje na oblićima C. elegans pokazalo je da se produljuje ţivotni vijek inaktivacijom Clk-1 gena, vaţnog za sintezu koenzima Q (39). Clk-1 konzerviran je kod mnogih vrsta i spada u skupinu cirkadijalno reguliranih gena koji reguliraju fiziološke ritmove na dnevnoj bazi. Kod mišjih embrionalnih matičnih stanica takoďer je pokazana jača otpornost na oksidativni stres nakon inaktivacije mišjeg mclk-1. Homolog Clk-1 gena kod ljudi i vinske mušice je COQ7 (coenzyme Q biosynthesis protein 7) (40). Kod Drosophile je pokazano da pojačana ekspresija gena antioksidativnih enzima, bilo same SOD ili SOD i katalaze u kombinaciji značajno produljuje ţivot (41). Ţivotni vijek i otpornost na stres kod Drosophile produljuje i pojačana ekspresija mth (methuselah) gena čiji je produkt transmembranski G-protein (42). 11

1.8 Povezanost cirkadijalnog sata i ROS-a Nedavna istraţivanja ukazala su na povezanost izmeďu genske teorije starenja i teorije oksidativnog stresa. Genomske studije pomoću mikročipova pokazale su da postoji vaţna uloga ritmičke ekspresije gena uključenih u regulaciju metaboličkih putova i otpornosti na stres kod vinskih mušica (43,44) i sisavaca (45). Ti ritmički eksprimirani geni nazivaju se cirkadijalni geni, a njihovo meďudjelovanje u organizmu čini kompleksnu mašineriju zvanu cirkadijalni sustav. Naziv circadian (cirkadijalni) potječe od latinskih riječi circa (oko, pribliţno) i dies (dan), te označava period koji iznosi pribliţno 24 sata. Cirkadijalni sustav diktira 24-satne cirkadijalne ritmove i prisutan kod gotovo svih ţivih bića, od jednostaničnih organizama do sisavaca. On je prilagoďen signalima iz okoliša i osigurava da se odreďeni fiziološki procesi odvijaju u optimalno doba dana i noći. Cirkadijalni sat utječe na gotovo sve aspekte fiziologije i ponašanja, uključujući cikluse sna i budnosti, tjelesnu temperaturu, apetit, lučenje enzima, diobu stanica itd., a starenjem se smanjuje amplituda cirkadijalnih varijacija (46). Cirkadijalni sat kontrolira i energetsku homeostazu regulirajući izraţenost gena ili aktivnost enzima i hormona uključenih u metaboličke putove (47). On osigurava vremensku organizaciju unutar organizma za usklaďivanje bioloških funkcija kako bi se spriječila aktivacija biokemijskih putova koji bi se meďusobno mogli ometati. Katabolički procesi tijekom dana olakšavaju meďudjelovanje organizma s okolinom, dok preko noći dominiraju anaboličke funkcije rasta, popravka i konsolidacije (47). Metabolički i stanični obrambeni mehanizmi u mitohondrijima paţljivo su regulirani na taj način. Poremećena funkcija cirkadijalnog sata moţe utjecati na funkciju mitohondrija, uzrokujući loše stanje u cijelom organizmu (48). Mitohondriji su organele vaţne za opskrbu stanice kisikom, te se moraju uskladiti s promjenama u dostupnosti hranjivih tvari i potrošnji energije tokom dana. PERIOD (PER) proteini, koji su vaţne komponente cirkadijalnog sustava organizma, reguliraju produkciju i nakupljanje enzima (npr. kompleksa piruvat dehidrogenaze) koji utječu na brzinu metabolizma u mitohondrijima (eng. rate-limiting enzymes). Dostupnost tih enzima u točno odreďeno doba dana uzrokuje svakodnevne 12

oscilacije staničnog disanja u mitohondrijima (49). PERIOD proteini na taj način reguliraju dnevno iskorištavanje različitih hranjivih tvari i optimiziraju funkciju mitohondrija prema dnevnim promjenama opskrbe i potraţnje energije. Cirkadijalna organizacija aktivnosti i spavanja ukazuje na povezanost promjene u razini ROS koji nastaju kao nusprodukti promjena u aktivnosti i brzini metabolizma. Studije na mikročipovima pokazale su da postoje dnevni ritmovi ekspresije antioksidativnih enzima (CAT, SOD). Smatra se da bi ti ritmovi mogli štititi organizam od pretjerane količine ROS i oštećenja bioloških makromolekula, ali trenutno za to postoje samo oskudni eksperimentalni dokazi. Istraţivanje laboratorija Krishnan et al. pokazalo je da smrtnost kod Drosophile melanogaster, nakon akutnog izlaganja vodikovom peroksidu, značajno varira ovisno o vremenu aplikacije peroksida tj. da mušice umiru brţe u kasnoj fazi svjetla. Pokazali su i da mutacija u per cirkadijalnom genu čini mušice još podloţnijima oksidativnom stresu uzrokovanom vodikovim peroksidom (50). Kod per 01 mutanata, dokazano je pojačano stvaranje H 2 O 2 u mitohondrijima i pojačano nakupljanje karbonilirane katalaze u usporedbi s mušicama koje imaju funkcionalan cirkadijalni sat. Razina karbonilacije proteina inače se povećava tijekom starenja. Ukratko, ciklusi svijetla i mraka reguliraju cirkadijalne gene (npr. per) koji diktiraju ritmove metabolizma i antioksidativnih enzima koji su usko povezani sa stvaranjem slobodnih radikala (ROS) u organizmu. Starenje je povezano s promjenama u metabolizmu koje nastupaju zbog nakupljanja ROS-a i oksidativnog oštećenja lipida, proteina i DNA (Slika 5.). 13

Slika 5. Prikaz povezanosti starenja, oksidativnog stresa, metabolizma i cirkadijalnog sata 1.9 Drosophila melanogaster Iako se starenje aktivno istraţuje na ljudima, mogućnosti za izučavanje mehanizama i bioloških procesa u podlozi starenja su ograničene te se vrlo često koriste ţivotinjski modelni organizmi (2). Velik broj gena koji utječu na starenje i dugovječnost kod modelnih organizama kao što su miševi, vinske mušice i crvi, imaju svoje homologe kod ljudi (36). Drosophila melanogaster (vinska mušica) jedan je od najčešće korištenih i najbolje proučenih modelnih organizama u biomedicinskim istraţivanjima. Početkom 20. stoljeća Drosophila je imala glavnu ulogu u ranom razvoju genetike, posebice proučavanju zakona nasljeďivanja i veze meďu genima i proteinima. Posljednjih godina napopularnija je kao modelni sustav u razvojnoj i molekularnoj biologiji 14

(51). Do danas je proučena na mnogim razinama, uključujući genetiku, ponašanje, razvoj, ekologiju, sistematiku, populacijsku biologiju itd. Prednosti korištenja Drosophile u istraţivanjima jesu jeftin uzgoj i jednostavnost odrţavanja u kontroliranim laboratorijskim uvjetima. Kratak razvojni ciklus od jajašca do odrasle jedinke (oko 10 dana) omogućuje dobivanje velikog broja jedinki u kratkom razdoblju. Ţenke tijekom ţivota mogu poloţiti na stotine jajašca i imati veliki broj potomaka što povećava pouzdanost i olakšava statističku obradu. Postoji velika sličnost genoma Drosophile s ljudskim, te je čak 70% gena konzervirano. Genom vinske mušice sekvenciran je u cijelosti, a razvoj tehnologije omogućio je jednostavnu manipulciju genoma, npr. utišavanje (knock-out) odreďenih gena kako bi se istraţila njihova funkcija (52). Danas je na trţištu dostupno nekoliko tisuća mutanata i velika količina informacija o Drosophili. Odrasle mušice pokazuju mnoge manifstacije staničnog starenja koje su vidljive i kod sisavaca. Drosophila melanogaster često je korištena u istraţivanju povezanosti slobodnih radikala i starenja te cirkadijalnih ritmova (53). Jedan od dobrih fenotipnih pokazatelja starenja kod Drosophile je sposobnost negativne geotaksije, tj. okomitog penjanja u smjeru suprotnom od sile teţe. Pokazano je da se starenjem značajno smanjuje motorička sposobnost i brzina penjanja vinskih mušica (54). Drosophila pokazuje više različitih i lako mjerljivih cirkadijalnih obrazaca ponašanja. Primjer ponašanja pod cirkadijalnom organizacijom je lokomotorna aktivnost, čiji se vrhunac kod vinskih mušica dostiţe 2 puta dnevno - rano ujutro i navečer (55). Takva ritmička aktivnost opstaje u konstantnim uvijetima, kao što je konstantni mrak. Cirkadijalni sat regulira i osjetljivost njuha i okusa, vrijeme polaganja jajašca, udvaranja te učenje i pamćenje. 1.10 Cirkadijalni sat kod Drosophile i per mutanti Kao i većina organizama, Drosophila melanogaster prilagoďena je 24-satnim dnevnim ciklusima (56). Molekularna osnova cirkadijalnog sata temelji se na oscilacijama akivacije odreďenih gena ovisno o tome koje je doba dana. Osnovno 15

obiljeţje tih oscilacija su negativne povratne petlje u kojima proteinski produkti gena reguliraju vlastitu proizvodnju. Ti procesi su mogući u svim vrstama stanica, ali cirkadijalni geni kod Drosophile najjače su izraţeni u oko 150 lateralnih neurona u mozgu (50). Lateralni neuroni kod Drosophile ekvivalent su neuronima u suprahijazmatskoj jezgri (SCN) koja predstavlja središnji cirkadijalni sat kod sisavaca. Cirkadijalni geni izraţeni su i u glia stanicama, senzornim neuronima i mnogim perifernim organima Drosophile (npr. u očima, Malpigijevim cjevčicama, surlici). Periferni cirkadijalni satovi mogu funkcionirati neovisno o neuronima u mozgu i samoodrţivi su u izoliranim organima, a utječu lokalno na fiziologiju stanica (57). Slika 6. PER cirkadijalna povratna petlja kod Drosophile. CLOCK (CLK) i CYCLE (CYC) su dva transaktivatora koja se veţu na E-box domene promotora tim i per gena. PER i TIM proteini se najprije nakupljaju u citoplazmi, a zatim kao heterodimer ulaze u jezgru kako bi blokirali transkripciju vlastitih gena. izvor: http://what-when-how.com/wp-content/uploads/2011/09/tmpd621.jpg Osnovni povratni mehanizam koji čini cirkadijalni sat kod Drosophile uključuje Clock (Clk) i Cycle (Cyc) gene koji kodiraju proteine CLK i CYC, transkripcijske faktore koji stvaraju heterodimer CLK/CYC (58). Kompleks CLK/CYC potiču transkripciju period (per) i timeless (tim) gena tako što se veţu na njihove E-box promotorske 16

regije. Novonastali PER i TIM proteini nakupljaju se najprije u citoplazmi stanice gdje stvaraju heterodimere, a zatim ulaze u jezgru gdje blokiraju CLK/CYC aktivatore, a time i transkripciju vlastitih per i tim gena. Još jedna vaţna komponenta cirkadijalnog sata Drosophile je Cryptochrome (CRY), protein osjetljiv na svjetlost, koji inhibira TIM u prisutnosti svjetla (59). U tom slučaju TIM ne stvara kompleks s PER proteinom, pa protein Doubletime (DBT) fosforilira PER koji postaje meta za degradaciju. Na taj način se endogeni cirkadijalni sat sinkronizira s vanjskim promjenama svjetla i mraka. Preko izlaznih putova cirkadijalnog sata (output) proteini koji su produkti cirkadijalnih gena reguliraju brojne stanične procese modulirajući ekspresiju drugih gena ili aktivnost proteina. Uspješan pristup za otkrivanje mehanizama cirkadijalnog sata je korištenje mutanata u cirkadijalnim genima. Prvi otkriveni cirkadijalni mutanti kod Drosophile jesu mušice s mutiranim period genom (per 01 ) (60). Period je gen lociran na x kromosomu Drosophile i njegova transkripcija oscilira u pribliţno 24-satnim ciklusima. Razina PER proteina dostiţe maksimum sredinom noći, a izlaskom sunca, PER molekule postaju podloţne degradaciji. Kada, nakon nekoliko sati, PER protein nestane, ponovno započinje transkripcija per gena (61). Mutacije per gena mogu skratiti (per S ), produljiti (per L ) ili čak ukinuti (per 01 ) period cirkadijalnih ritmova. (60) Kao što je ranije spomenuto, mušice s per 01 mutacijom, osim aritmičnosti, pokazuju i znakove prijevremenog starenja te smanjenu aktivnost antioksidativnog enzima katalaze (50). To ukazuje da per gen, osim svoje cirkadijalne uloge, ima vaţnu ulogu u regulaciji odgovora na oksidativni stres i produljenju ţivotnog vijeka. TakoĎer, postoji molekularna poveznica izmeďu ekspresije PER proteina i gena uključenih u apoptozu i regulaciju staničnog ciklusa (62). Stoga je učinak poremećaja cirkadijalnih gena na starenje kombinacija poremećaja u njihovoj cirkadijalnoj funkciji i njihovoj ne-cirkadijalnoj ulozi u drugim staničnim procesima i putovima. 17

2. CILJ RADA U ovom istraţivanju ispitan je potencijalan blagotvorni učinak polifenola kvercetina i tirosola na indikatore starenja kod period cirkadijalnih mutanata (per 01 ) Drosophile melanogaster. Polifenoli su poznati po svojim antioksidativnim svojstvima, no točan mehanizam njihovog djelovanja na procese povezane sa starenjem još nije u potpunosti razjašnjen. Kao modelni organizam u našem istraţivanju koristili smo Drosophilu s mutacijom u period cirkadijalnom genu zato jer je poznato da su promjene u cirkadijalnoj regulaciji metabolizma povezane s prijevremenim starenjem. Kako bi bolje razumijeli mehanizam djelovanja polifenola na starenje, mjerili smo bihevioralne i biokemijske parametre nakon 2, 4 i 6 tjedana hranjenja mušica prehranom s dodatkom različitih koncentracija kvercetina ili tirosola. U bihevioralnim testovima odredili smo sposobnost negativne geotaksije, količinu lokomotorne aktivnosti i spavanja tijekom 24 sata, otpornost na stres isušivanjem i izgladnjivanjem, preţivljenje mušica te njihovu teţinu. Od biokemijskih parametara mjerena je aktivnost antioksidativnih enzima katalaze (CAT) i superoksid dismutaze (SOD), nakupljanje AGE biomarkera starenja te količina moni-di-triglicerida i reduktivnih šećera u tijelu mušica. Rezultate testova treiranih per 01 mušica usporedili smo s mladim i starim netretiranim mušicama kako bi utvrdili učinak polifenola. Kod pojedinih parametara (negativna geotaksija, teţina, AGE biomarker, aktivnost SOD i CAT) rezultate per 01 mušica usporedili smo s prethodnim rezultatima testova iz našeg laboratorija na mušicama divljeg tipa, jer je jedan od ciljeva bio istraţiti i modulatornu ulogu cirkadijalnih gena (u ovom slučaju period gena) kod starenja. Za ostale parametre (lokomotornu aktivnost, spavanje, izgladnjivanje, isušivanje, preţivljenje te količinu mono-di-trigliceria i reduktivnih šećera) interpretirali smo samo rezultate testova na per 01 mušicama jer nismo imali dostupnih podataka o wt mušicama. 18

Cilj ovog rada bio je povezati fenotipne karakteristike starenja s njihovom biokemijskom i genetskom pozadinom te istraţiti utjecaj pojedinih koncentracija kvercetina i tirosola na te indikatore s obzirom na dob i spol mušica. 19

3. MATERIJALI I METODE 3.1 Uzgoj, prikupljanje i manipuliranje Drosophile U eksperimentima je korišten soj Drosophile s genetskom pozadinom Canton-S (CS) koji ima mutaciju u Period genu (Per 01 ). U pojedinim rezultatima prikazana je usporedba s rezultatima iz prethodnih eksperimenata na CS mušicama divljeg tipa (wt). Štokovi su uzgajani u bocama od mutne plastike na temperaturi 25ºC u 12- satnim ciklusima svjetla i mraka. Svaka boca sadrţavala je po 35 ml hrane sljedećih sastojaka: voda, agar, kukuruzno brašno, šećer i suhi inaktivni kvasac. U hranu su dodani nipagin i propionska kiselina kako bi se spriječio razvoj plijesni. Jedan dan prije početka eksperimenta prazne se štokovi kako bi se sljedeći dan mogle prikupiti samo mlade, novoizlegle mušice. Mušice se prikupljaju pod svetlosnim mikroskopom, na podlozi za uspavljivanje koja otpušta CO 2. Za svaki eksperiment (u trajanju 2, 4 i 6 tjedana) sortirano je po 700 muţjaka i 700 ţenki. Slika 7. Prikupljanje, sortiranje i manipuliranje Drosophile. 20

Sortirane mušice prebačene su u nove boce sa 10 ml svjeţe hrane koja je sadrţavala vodu, agar, melasu, šećer, suhi inaktivni kvasac, nipagin i propionsku kiselinu te odreďenu koncentraciju polifenola. Po 100 muţjaka podijeljeno je u svaku od 7 boca - 3 s dodatkom kvercetina (u koncentracijama od 0,6 mm, 3,2 mm i 4,8 mm), 3 boce s dodanim tirosolom (7,6 µm, 12,45 µm i 17,6 µm) i jednu kontrolnu bocu s hranom bez dodatka polifenola. Ţenke su podijeljene u ukupno 14 boca (50 mušica u svaku), tj. 2 boce za svaku koncentraciju polifenola i 2 kontrolne boce. Razlog za podjelu ţenki u dvostruko veći broj boca je razvoj velikog broja larvi u kratkom vremenu koje mogu učiniti hranu previše tekućom. Eksperimentalne boce sa sortiranim mušicama takoďer su čuvane na 25ºC, u kontroliranim svjetosnim uvjetima (12h svjetlo/12h mrak). Svakih 2-3 dana mušice su prebacivane na svjeţu hranu s polifenolima. Kada su mušice dosegle starost od 2, 4 odnosno 6 tjedana, provedeni su fenotipni i biokemijski testovi. Pet dana prije početka provedbe testova, prazne se boce sa štokovima mušica kako bi se dan prije testova prikupile mlade kontrole (5 dana stare mušice). 3.2 Bihevioralni testovi 3.2.1 Test negativne geotaksije Mušice imaju uroďenu tendenciju penjanja u smjeru suprotnom od sile teţe što se naziva negativna geotaksija. Nakon udaranja tube s mušicama o podlogu, one padaju na dno tube, a zatim se penju prema gore po stijenkama tube. Dan prije testa negativne geotaksije, na podlozi s CO 2 odvaja se po 50 mušica iz eksperimentalnih boca za svaku koncentraciju polifenola i kontrolnu skupinu te 50 muških i 50 ţenskih mladih mušica iz boca sa štokovima. Po 10 mušica stavlja se u 5 tuba s 3 ml svjeţe hrane. Odvajanje se obavlja dan prije kako bi se mušice mogle oporaviti od anestezije. Na dan pokusa, sve se mušice iz tuba s hranom prebaciju u prazne tube s oznakom na sredini (3 cm od dna tube). Potrebno je pričekati 20 minuta da se mušice umire 21

od prebacivanja. Nakon 20 minuta, 5 tuba s mušicama iz jedne eksperimentalne skupine stavlja se u drveni okvir i učvrsti vijcima (Slika 8.). Kamera priključena na računalo postavlja se 30 cm ispred okvira s tubama. Drvenim okvirom se 3 puta lupi o podlogu kako bi sve mušice pale na dno tuba i uključi se štoperica. Nakon 5 sekundi kamerom se slikaju tubice tako da bude vidljivo koliko je mušica prešlo oznaku. Nakon 1 minute ponovo se udari 3 puta okvirom o podlogu i slikaju se mušice nakon 5 sekundi. Taj postupak se ponavlja 5 puta za svaku od 16 skupina mušica (mlade kontrole, stare kontrole i po 3 različite koncentracije tirosola i kvercetina, za oba spola). Slika 8. Skica aparature za mjerenje negativne geotaksije. Nakon provoďenja pokusa analiziraju se fotografije (5 fotografija za svaku eksperimentalnu grupu) tako što se prebroje mušice koje su se popele iznad crte te se izračuna srednja vrijednost koja se izrazi kao postotak. 3.2.2 Aktivnost i spavanje tijekom 24 h Aktivnost i spavanje mušica praćeno je pomoću sustava DAMS (Drosophila Activity Monitoring System) (Slika 9.). U svakom eksperimentu (nakon 2, 4 i 6 tjedana tretmana polifenolima) korišteno je 8 DAMS monitora u koje je ukupno stalo 256 mušica (16 eksperimentalnih skupina, 2 skupine po monitoru). Pojedinačne mušice 22

upuhane su pomoću aspiratora u staklene cjevčice koje su na jednom kraju kraju imale hranu i vosak, a na drugom bile zatvorene spuţvicom. Za svaku eksperimentalnu skupinu korišteno je 16 mušica. Staklene cjevčice postavljene su u monitore koji su povezani s računalom i stavljeni u inkubator u uvijetima 12 h svjetla i 12 h mraka pri konstantnoj temperaturi (25ºC). Aktivnost je praćena pomoću infracrvene (IR) zrake koja je prolazila sredinom cjevčica. Prelaskom mušica po sredini cjevčice, prekida se infracrvena svjetlost te se ti prekidi biljeţe na računalu. Mušica spava kada ne prijeďe sredinu cjevčice više od 5 minuta. Akivnost i spavanje praćeni su kroz 5 uzastopnih dana te su izračunati ukupna prosječna aktivnost (broj prelazaka cjevčice u 24 sata) i ukupno spavanje (u minutama tijekom 24 sata). a) b) http://sites.sinauer.com/animalphys3e/boxex15.03.html Slika 9. DAMS (Drosophila Activity Monitoring System). 23

3.2.3 Stres izgladnjivanjem Kako bi se utvrdila otpornost mušica sa i bez tretmana na stres izgladnjivanjem korišteno je po 16 mušica iz svake eksperimentalne skupine. Mušice su pomoću aspiratora upuhane u staklene cjevčice koje su pripremljene tako da se s jedne strane nalazio 1% agar za hidrataciju i vosak kao zaštita, a s druge strane spuţvica. Pomoću DAMS monitora spojenih na računalo praćena je duljina ţivotnog vijeka mušica tako da je prestanak kretanja mušice na dulje od 3 sata značio da je uginula. 3.2.4 Stres isušivanjem Kako bi se utvrdila otpornost mušica sa i bez tretmana na stres isušivanjem korišteno je po 16 mušica iz svake eksperimentalne skupine. Mušice su pomoću aspiratora upuhane u staklene cjevčice koje su s obje strane imale spuţvicu. Pomoću DAMS monitora spojenih na računalo praćena je duljina ţivotnog vijeka mušica tako da je prestanak kretanja mušice na dulje od 3 sata značio da je uginula. 3.2.5 Životni vijek (preživljenje) Za praćenje ţivotnog vijeka tretiranih i netretiranih mušica, prikupljeno je 350 muških i 350 ţenskih jedinki. Po 50 mušica rasporeďeno je u boce s hranom s dodatkom kvercetina (u koncentracijama od 0,6 mm, 3,2 mm i 4,8 mm), tirosola (7,6 µm, 12,45 µm i 17,6 µm) i kontrolne boce s hranom bez dodatka polifenola. Boce su čuvane u inkubatoru u uvijetima 12 sati svjetlo/12 sati mrak na temperaturi 25 ºC. Svjeţa hrana osigurana im je svaka 2-3 dana, a pri prebacivanju je biljeţen broj mušica koje nisu preţivjele. 3.2.6 Težina mušica Nakon 2,4 i 6 tjedana eksperimenta izdvojeno je 11 mušica iz svake eksperimentalne skupine i prikupljeno 11 mladih mušica koje su zatim smrznute. Pomoću analitičke vage izmjerena je teţina 11 mušica u miligramima te je izračunata prosječna vrijednost za 1 mušicu. 24

3.3 Biokemijski testovi 3.3.1 Mjerenje aktivnosti enzima katalze Enzimski ekstrakti za svaku eksperimentalnu skupinu pripremljeni su homogenizacijom 5 odraslih mušica u 800 µl hladne homogenizacijske otopine (0.05 M kalijev fosfat [ph 6.9], 0.1% Triton X-100). Uzorci su centrifugirani (4ºC, 14000 rpm, 20 min) te su dobiveni supernatanti razrijeďeni s homogenizacijskom otopinom u omjeru 1:2. Reakcijska otopina pripremljena je miješanjem 0.05 M fosfatnog pufera (ph 6.9) and 15 mm H 2 O 2. Zatim je 450 µl reakcijske otopine pipetirano u svaku jaţicu na mikrotitarskoj pločici te je snimljena apsorbancija reakcijske otopine pri 240 nm (valna duljina detekcije H 2 O 2 ). Za početak reakcije dodano je po 10, 15, 20 i 25 µl enzimskih ekstrakata iz mušica u jaţice s reakcijskom otopinom. Apsorbancija je mjerena spektrofotometrom (infinite 200Pro) na valnoj duljini 240 nm, tijekom 5 min. Promjena apsorbancije (optičke gustoće) po minuti linearno je ovisna o vremenu i o količini dodanog ekstrakta. Aktivnost katalaze prikazana je kao promjena apsorbancije po minuti po µg ekstrakta. Uzorci su mjereni u triplikatima (isti uzorak pipetiran je u 3 jaţice) te su izračunate srednje vrijednosti. 3.3.2 Mjerenje postotka inhibicije enzima SOD Enzimski ekstrakti mušica pripremljeni su na isti način kao u eksperimentu mjerenja aktivnosti katalaze. Reakcijska otopina pripremljena je miješanjem 20 mm fosfatnog pufera (ph 10), 0.8 mm TEMED-a (N9,N9,N9,N9-tetrametiletilendiamin), 0.8 mm EDTA i 0.5 mm kvercetina. 450 µl reakcijske otopine pipetirano je u svaku jaţicu na mikrotitarskoj pločici te je snimljena apsorbancija pri 406 nm (valna duljina detekcije kvercetina). U jaţice je zatim dodano po 10, 15, 20 i 25 µl ekstrakta za početak reakcije. Spektrofotometrom je mjerena promjena apsorbancije kroz 10 minuta pri valnoj duljini od 406 nm. Aktivnost SOD proporcionalna je postotku u kojem enzimski ekstrakt inhibira oksidaciju kvercetina u prisutnosti TEMED-a, te je linearno ovisna o vremenu i količini ekstrakta. Uzorci su mjereni u triplikatima (isti uzorak pipetiran je u 3 jaţice) te su izračunate srednje vrijednosti. 25

3.3.3 Određivanje AGE markera Po 5 mušica iz svake eksperimentalne skupine homogenizirano je u 900 µl PBS koji je sadrţavao 10 mm EDTA te je u svaku epicu s homogenatom dodano 100 µl tripsina. Uzorci su inkubirani 24 h na temperaturi 37 ºC i zatim centrifugirani (4ºC, 14000 rpm, 20 min). Supernatanti uzoraka su zatim pipetirani na mikrotitarsku pločicu u triplikatima po 150 µl u svakoj jaţici. Izmjerena je fluorescencija na ekscitacijskoj i emisijskoj valnoj duljini od 365 nm i 440 nm te je izračunat prosječni relativni intenzitet fluorescencije. 3.3.4 Određivanje mono-di-tri glicerida Uzorci su pripremljeni homogenizacijom jedne mušice u 50 µl PBS-a i 450 µl mješavine kloroforma i metanola (1:2). U staklene epruvete dodano je po 200 µl uzorka i 50 µl 20% NaOH. Sadrţaj epruveta je prokuhan te je dodano 600 µl vode u svaku epruvetu. Nakon hlaďenja, uzorci su centrifugirani (4ºC, 14000 rpm, 20 min) te su supernatanti svakog uzorka pipetirani na mikrotitarsku pločicu u triplikatima po 150 µl. Apsorbancija je izmjerena pri valnoj duljini od 230 nm. Za odreďivanje kalibracijske krivulje korišteni su standardi glicerola (koncentracije 0, 5, 10, 50 i 100 mm). 3.3.5 Određivanje reduktivnih šećera Uzorci su pripremljeni homogenizacijom jedne mušice u 50 µl PBS-a i 450 µl mješavine kloroforma i metanola (1:2). U staklene epruvete dodano je po 200 µl uzorka, 100 µl 25 N HCl i 600 µl Benedictovog reagensa. Sadrţaj epruveta je prokuhan, ohlaďen i centrifugiran (4ºC, 14000 rpm, 20 min). Supernatanti svakog uzorka su pipetirani na mikrotitarsku pločicu u triplikatima po 150 µl. Apsorbancija je izmjerena pri valnoj duljini od 735 nm. Za odreďivanje kalibracijske krivulje korišteni su standardi glukoze (koncentracije 0, 5, 10, 15 i 20 µg/ml). 26

3.4 Analiza i statistička obrada podataka Za analizu podataka o aktivnosti, spavanju, izgladnjivanju i isušivanju korišteni su programi Actogram J i MS Excel. Sirovi podaci za sve biokemijske testove prikupljeni su pomoću Tecan i-control programa te su analizirani u Excel programu. Za satističku analizu korišteni su programi Statistica i Excel. Kao statistički značajne prihvaćene su vrijednosti za koje vrijedi p<0.05. 27

4. REZULTATI 4.1 Bihevioralni testovi 4.1.1 Negativna geotaksija a) Kvercetin b) Tirosol Slika 10. Prehrana s dodatkom kvercetina (a) i tirosola (b) poboljšava negativnu geotaksiju kod starih wt i per 01 muţjaka i 2 tjedna starih per 01 ţenki. Negativna geotaksija mjerena je kod 5 dana te 2,4,6 tjedana starih mušica hranjenih običnom hranom (netretirane) i tretiranih hranom s dodatkom različitih koncentracija kvercetina (0,6 mm, 3,2 mm i 4,8 mm) ili tirosola (7,6 µm, 12,45 µm i 17,6 µm). Za svaku eksperimentalnu grupu (spol, starost i koncentracije polifenola) n=50 mušica, s 5 ponavljanja po eksperimentu. Prikazan je prosječni postotak mušica koje su prešle 3 cm u 5 sekundi. 28

Test negativne geotaksije često se koristi za mjerenje promjena u lokomotornoj aktivnosti povezanih sa starenjem koje mogu biti uzrokovane degeneracijom ţivčanog i mišićnoskeletnog sustava. Iz prethodnih istraţivanja je poznato da sposobnost vertikalnog penjanja mušica starenjem opada, (54) te da mušice s mutacijom u per cirkadijalnom genu (per 01 ) brţe pokazuju znakove starenja (63). Kako su polifenoli kvercetin i tirosol poznati kao dobri antioksidansi, testirano je dali hranjenje s dodatkom polifenola poboljšava negativnu geotaksiju kod 2, 4 i 6 tjedana starih per 01 i wt muţjaka te per 01 ţenki. Rezultati potvrďuju da netretirani mladi (5 dana stari) muţjaci divljeg tipa imaju najbolju sposobnost penjanja. Oko 58% 5 dana starih mušica popelo se iznad crte nakon 5 sekundi, dok je sposobnost penjanja per 01 mladih muţjaka neznatno manja (Slika 10.a i 10.b). Starenjem kroz 2, 4 i 6 tjedana se sposobnost penjanja netretiranih wt i per 01 muških mušica značajno smanjuje, a drastičniji pad vidljiv je kod per 01 u odnosu na wt, što potvrďuje prethodne nalaze (63). Kvercetin (Slika 1.a) i tirosol (Slika 10.b) su pokazali pozitivan učinak i poboljšali sposobnost negativne geotaksije kod muţjaka wt i per 01 mutanata (t-test, p<0.05). Kod muţjaka starih 2 i 4 tjedna pokazalo se da su oba polifenola učinkovitija kod per 01, kod kojih je nakon tretmana sposobnost penjanja bila bolja čak i od tretiranih wt mušica. Kod per 01 ţenskih mušica, negativna geotaksija takoďer opada starenjem. Kvercetin i tirosol su učinkoviti samo kod ţenki starih 2 tjedna, kod kojih je postotak tretiranih mušica koje su prešle crtu do 2x veći od netretiranih. Kod starijih tretiranih mušica (4 i 6 tjedana) polifenoli su imali suprotan učinak te je došlo do pada sposobnosti negativne geotaksije u odnosu na kontrole. Vidljivo je i da je učinak polifenola u većini slučajeva jači s povećanjem njihove koncentracije. Postoji mogućnost da kod 4 i 6 tjedana starih ţenki nema pozitivnog učinka zbog premalih koncentracija polifenola. Eksperiment bi trebalo ponoviti s optimiziranim koncentracijama polifenola. Testom generalne regresije pokazano je da postoje statistički značajne razlike u negativnoj geotaksiji ovisno o spolu i starosti mušica (p<0.05), odnosno utjecaj 29

polifenola na negativnu geotaksiju je djelomično spolno ovistan, a kod ţenki je pozitivno djelovanje prisutno samo kod 2 tjedna starih jedniki. Negativna geotaksija Stupnjevi slobode Kvercetin F p Stupnjevi slobode Tirosol spol 1 5.8417 0.022415 1 7.4604 0.010792 koncentracija 3 1.6659 0.196914 3 1.7468 0.180252 starost 2 35.0442 0.000000 2 57.0112 0.000000 genotip 1 1.8625 0.183200 1 0.0275 0.869435 F p Tablica 1. Rezultati statističke analize modelom generalne regresije 4.1.2 Ukupna lokomotorna aktivnost tijekom 24 h Kao pokazatelj starenja, mjerena je i lokomotorna aktvnost pojedinačnih mušica tijekom 5 dana pomoću DAMS monitora i prikazana kao suma broja prelazaka sredine cjevčice u 5 minuta tijekom 24 sata. Od prije je poznato je da se lokomotorna aktivnost smanjuje starenjem kod ţenki Drosophile, a kod muţjaka počinje opadati tek nakon 5 tjedana starosti. (64) Odlučili smo testirati kako dodavanje tirosola i kvercetina u prehranu djeluje na aktivnost kod 2, 4 i 6 tjedana starih per 01 muţjaka i ţenki. Podaci o lokomotornoj aktivnosti 6 tjedana starih muţjaka nedostaju zbog tehničkih problema u DAMS sustavu prilikom eksperimenta. Rezultati pokazuju da se lokomotorna aktivnost netretiranih per 01 mušica smanjuje starenjem (Slika 11.). Kod 5 dana i 2 tjedna starih mušica potvrdili smo da postoje spolno-specifične razlike, tj. da su ţenke aktivnije od muţjaka. Aktivnost 2 tjedna starih muţjaka hranjenih kvercetinom i tirosolom značajno je smanjena kod svih koncentracija kvercetina i tirosola u odnosu na netretirane (ttest, p<0.05). Kod muţjaka starih 4 tjedna kvercetin je značajno povećao aktivnost mušica (t-test, p<0.05), dok je samo najmanja koncentracija tirosola (7.6 µm) imala značajan učinak (t-test, p<0.05) na povećanje aktivnosti. Kod ţenki starih 2 tjedna sve koncentracije polifenola uzrokovale su značajno smanjenje lokomotorne aktivnosti, a kod 4 tjedna starih ţenki značajno povećanje 30

aktivnosti (t-test, p<0.05). Na aktivnost 6 tjedana starih ţenki polifenoli nisu imali specifičan utjecaj. a) Kvercetin b) Tirosol Slika 11. Lokomotorna aktivnost mušica starenjem se smanjuje, a prehrana s kvercetinom (a) i tirosolom (b) ima starosno-ovistan utjecaj. Aktivnost je mjerena kod muţjaka i ţenki starih 5 dana te 2,4 (muţjaci) i 2,4,6 (ţenke) tjedana hranjenih običnom hranom (netretirane) i tretiranih hranom s različitim koncentracijama kvercetina (0,6 mm, 3,2 mm i 4,8 mm) ili tirosola (7,6 µm, 12,45 µm i 17,6 µm). Za svaku eksperimentalnu grupu (spol, starost i koncentracije polifenola) n=16 mušica. Aktivnost je praćena 5 dana u intervalima od 5 min. Prikazan je ukupan broj prelazaka sredine cjevčice u 5-minutnim epizodama tijekom 24 sata. 31

Generalna regresija pokazala je da nema značajnog ukupnog utjecaja spola, dobi i koncentracija polifenola na aktivnost tretiranih i netretiranih mušica, no gore je pokazano da postoje spolno i dobno specifični utjecaji polifenola na spavanje mušica: ţenke su aktivnije od muţjaka, aktivnost kod oba spola opada starenjem, a kvercetin i tirosol smanjuju aktivnost kod mladih i povećavaju kod starih mušica. Lokomotorna aktivnost (24 h) Stupnjevi slobode Kvercetin F p Stupnjevi slobode Tirosol spol 1 0.8511 0.373054 1 2.1433 0.166950 koncentracija 3 0.4133 0.746264 3 0.1063 0.954893 starost 2 1.1904 0.335171 2 0.5414 0.594482 F p Tablica 2. Rezultati statističke analize modelom generalne regresije 4.1.3 Ukupno spavanje tijekom 24 h Starenjem dolazi do promjena u ciklusima budnosti i spavanja, spavanje postaje fragmentirano i odvija se u više kraćih epizoda. Kod Drosophile, kao i kod sisavaca, mlade jedinke spavaju više od starih (65). Kod mušica je prisutan i spolni dimorfizam jer ţenke danju spavaju manje od muţjaka, dok tijekom noći spavaju jednako. Odlučili smo provjeriti kako kvercetin i tirosol djeluju na spavanje kod 2 i 4 tjedana starih per 01 muţjaka te 2, 4 i 6 tjedana starih per 01 ţenki. Rezultati su prikazani kao ukupna količina spavanja u minutama tijekom 24 sata. Podaci o količini spavanja 6 tjedana starih muţjaka nedostaju zbog tehničkih problema u DAMS sustavu prilikom eksperimenta. Ţenke spavaju značajno kraće od muţjaka (Slika 12.a i 12.b), a iz literature znamo da je to zbog kraćeg dnevnog spavanja (66). Spavanje netretiranih muţjaka Drosophile ne razlikuje se značajno s obzirom na starost mušica, meďutim treba uzeti u obzir da podaci o 6 tjedana starim muţjacima nisu poznati. Kod netretiranih ţenki, količina spavanja povećava se do 4 tjedna starosti, a ţenke stare 6 tjedana spavaju najkraće 32

Polifenoli su pokazali blagi učinak na povećanje spavanja kod mušica oba spola starih 2 tjedna i smanjenje spavanja kod mušica starih 4 tjedna, no taj se učinak nije pokazao statistički značajnim (provjereno t-testom). a) Kvercetin b) Tirosol Slika 12. Količina spavanja mušica hranjenih s kvercetinom (a) i tirosolom (b) smanjuje se starenjem, a ţenke spavaju manje od muţjaka. Spavanje je mjereno kod muţjaka i ţenki starih 5 dana te 2,4,6 tjedana hranjenih običnom hranom (netretirane) i tretiranih različitim koncentracijama kvercetina (0,6 mm, 3,2 mm i 4,8 mm) ili tirosola (7,6 µm, 12,45 µm i 17,6 µm). Za svaku eksperimentalnu grupu (spol, genotip, starost i koncentracije polifenola) n=16 mušica. Spavanje je procjenjeno na osnovu odsutstva aktivnosti u 5 minutnim epizodama tijekom 24 sata, mjereno tijekom 5 dana, prikazane su prosječne vrijednosti ukupnog spavanja tijekom 24 sata. 33

Generalna regresija pokazala je da spol i starost značajno utječu na spavanje mušica neovisno o tome dali su one tretirane polifenolima. Spavanje (24 h) Stupnjevi slobode Kvercetin F p Stupnjevi slobode Tirosol spol 1 9.379 0.009079 1 19.285 0.000729 koncentracija 3 0.139 0.935087 3 0.591 0.631741 starost 2 20.123 0.000105 2 17.515 0.000205 F p Tablica 3. Rezultati statističke analize modelom generalne regresije 4.1.4 Stres isušivanjem Prethodna istraţivanja pokazala su da se starenjem smanjuje postotak vode u organizmu, a time i otpornost mušica na stres isušivanjem. (67) Odlučili smo testirati dali 2, 4 i 6 tjedana stare per 01 mušice tretirane kvercetinom i tirosolom preţivaljavaju dulje bez hrane i vode u odnosu na mušice tretirane običnom hranom. Test isušivanja proveli smo tako da smo individualne mušice stavili u staklene cjevčice bez hrane i vode te pomoću DAMS monitora pratili vrijeme njihova ugibanja. Radi bolje preglednosti na Slici 13. prikazana je samo po jedna koncentracija kvercetina i tirosola za koje smo utvrdili najveći pozitivni utjecaj. Naši rezultati su pokazali da se otpornost mušica na stres isušivanjem značajno smanjuje ovisno o starosti mušica te da postoje značajne razlike meďu spolovima (test generalne regresije, p<0.05 za utjecaj dobi i spola ), a samo pojedine koncentracije kvercetina i tirosola imale su pozitivan učinak na preţivljenje mušica u uvjetima stresa. Stres isušivanjem Stupnjevi slobode Kvercetin F p Stupnjevi slobode Tirosol spol 1 12.0280 0.001245 1 14.1137 0.000536 koncentracija 3 0.9961 0.404295 3 1.3033 0.286307 starost 2 16.6952 0.000005 2 20.1202 0.000001 F p Tablica 4. Rezultati statističke analize modelom generalne regresije 34

Spol Starost Muţjaci Ţenke a) b) 2 tjedna c) d) 4 tjedna e) f) 6 tjedana Slika 13. Kvercetin i tirosol povećavaju otpornost na stres isušivanjem kod mušica starih 6 tjedana. Prikazane su krivulje preţivljenja muških i ţenskih mušica starih 2 (a,b), 4 (c,d) i 6 (e,f) tjedana. Netretirane mušice hranjene su običnom hranom, a eksperimentalne skupine hranjene su hranom s dodatkom različitih koncentracija kvercetina (0,6 mm, 3,2 mm i 4,8 mm) ili tirosola (7,6 µm, 12,45 µm i 17,6 µm) od roďenja. Za eksperiment isušivanja individualne mušice su prebačene u staklene cjevčice u DAMS monitore bez hrane i vode do ugibanja. Prikazana je samo po jedna koncentracija kvercetina i tirosola koje su dovele do najznačajnije promjene. Za svaku eksperimentalnu grupu n=16 mušica. QUE - kvercetin, TYR - tirosol. 35

Spolne razlike vidljive su kod mušica svih starosnih skupina (Slika 13.). Ţenke bez hrane i vode preţivljavaju dulje (izmeďu 11 i 24 h) od muţjaka (5-18 h). Netretirane mušice stare 6 tjedana pokazale su najmanju otpornost na stres isušivanjem kod oba spola. Na povećanje otpornosti na stres isušivanjem statistički značajno (p<0.05) je utjecao tirosol (u koncentraciji 7.6 µm) kod 6 tjedana starih muţjaka (Slika 13.e) i kvercetin (u koncentraciji 4.8 mm) kod 6 tjedana starih ţenki (Slika 13.f). Kod 2 tjedna starih muţjaka vidi se pozitivan utjecaj polifenola na maksimalno preţivljenje, ali nije statistički značajan zbog malog broja preţivjelih mušica (manje od 20%). Polifenoli povećavaju otpornost na isušivanje, ali samo kod 6 tjedana starih mušica i samo u odreďenim koncentracijama: 7.6 µm tirosol i 4.8 mm kvercetin. 4.1.5 Stres izgladnjivanjem Ispitano je dali kvercetin i tirosol poboljšavaju otpornost na stres izgladnjivanjem. Testirane su 2,4 i 6 tjedana starie per 01 mušice kojima nije bila dostupna hrana, već samo voda u podlozi od 1% agara. Radi bolje preglednosti na Slici 14. prikazana je samo po jedna koncentracija kvercetina i tirosola koje su pokazale najbolji učinak. Otpornost mušica na stres izgladnjivanjem smanjuje se starenjem (generalna regresija - utjecaj dobi: p<0.05 ), a ţenke bolje preţivljavaju izgladnjivanje (utjecaj spola: p<0.05 ). Generalnom regresijiom pokazano je da tirosol (utjecaj koncentracije: p<0.05) statistički značajno utječe na otpornost mušica na stres izgladnjivanjem. Učinak polifenola je slabiji što su mušice starije. Stres izgladnjivanjem Stupnjevi slobode Kvercetin F p Stupnjevi slobode Tirosol spol 1 13.9405 0.000574 1 1.6182 0.210513 koncentracija 3 0.7251 0.542882 3 3.8367 0.016444 starost 2 40.7782 0.000000 2 46.7006 0.000000 F p Tablica 5. Rezultati statističke analize modelom generalne regresije 36

Spol Starost Muţjaci Ţenke a) b) 2 tjedna c) d) 4 tjedna e) f) 6 tjedana Slika 14. Tirosol značajno povećava otpornost na stres izgladnjivanjem kod 2 tjedna starih per 01 muţjaka. Prikazane su krivulje preţivljenja mušica oba spola starih 2 (a,b), 4 (c,d) i 6 (e,f) tjedana. Netretirane mušice hranjene su običnom hranom, a eksperimentalne skupine hranjene su hranom s dodatkom različitih koncentracija kvercetina (0,6 mm, 3,2 mm i 4,8 mm) ili tirosola (7,6 µm, 12,45 µm i 17,6 µm) od roďenja. Za mjerenje otpornosti na izgladnjivanje mušice su čuvane u individualnim staklenim cjevčicama u DAMS monitoru bez hrane, na podlozi od 1% agara da se spriječi isušivanje. Radi bolje preglednosti prikazana je samo po jedna koncentracija kvercetina i tirosola koje su dovele do najznačajnije promjene. Za svaku eksperimentalnu grupu n=16 mušica. QUE - kvercetin, TYR - tirosol. 37

Tirosol u koncentraciji 12.45 µm statistički značajno (t-test, p<0.05) produljuje ţivotni vijek 2 tjedna starih muţjaka (Slika 14.a). Maksimalno preţivljenje netretiranih mušica iznosilo 25 sati, a 50%-tno 11.5 sati, dok je maksimalno preţivljenje mušica tretiranih tirosolom iznosilo je 38 sati, a 50% njih je ostalo ţivo nakon 27 sati. Vidljivo je povećanje maksimalnog broja dana preţivljenja 2 tjedna (Slika 14.b) i 4 tjedna starih ţenki (Slika 14.d) tretiranih kvercetinom i tirosolom, no ti rezultati nisu uspjeli doseći statističku značajnost. Kod 4 tjedna starih muţjaka (Slika 14.c) i 6 tjedana starih mušica oba spola (Slika 14.e i 14.f ) polifenoli nisu pokazali značajan učinak. 4.1.6 Preživljenje Vodeći se prethodnim rezultatima iz našeg laboratorija, interesiralo nas je da li će dodavanje kvercetina i tirosola u hranu, u odsutnosti stresa, produljiti ţivotni vijek per 01 mušica u usporedbi s per 01 mušicama hranjenim običnom hranom. Iako je na grafovima vidljivo produljenje maksimalnog preţivljenja mušica kod nekih koncentracija polifenola, niti jedna koncentracija nije imala statistički značajan utjecaj na produljenje ţivotnog vijeka mušica (Slika 15.). Najbolji učinak na maksimalno preţivljenje imao je kvercetin u koncentraciji 4.8 mm kod ţenskih mušica koje su preţivjele do 84 dana, u usporedbi s netretiranim mušicama koje su preţivjele 56 dana (Slika 15.b). Niti jedna koncentracija polifenola nije uzrokovala skraćenje ţivotnog vijeka mušica. Rezultati ukazuju na to da je potrebno optimizirati dozu polifenola i eksperiment napraviti na većem broju mušica kako bi se postigla statistička značajnost. 38

Tirosol Kvercetin Spol Polif. Muţjaci a) b) Ţenke c) d) Slika 15. Kvercetin i tirosol nemaju značajan učinak na duljinu ţivotnog vijeka per 01 mušica. Mjerena je duljina ţivotnog vjeka mušica oba spola hranjenih običnom hranom (netretirane) i tretiranih različitim koncentracijama kvercetina (0,6 mm, 3,2 mm i 4,8 mm) i tirosola (7,6 µm, 12,45 µm i 17,6 µm). Početni broj mušica u svakoj eksperimentalnoj skupini iznosio je 50 (100%). 39

ŢENKE MUŢJACI 4.1.7 Prosječna težina Odlučili smo provjeriti dali kvercetin i tirosol imaju utjecaj na teţinu mušica. Prosječna teţina mušica izračunata je na temelju 11 izvaganih mušica za svaku eksperimentalnu skupinu. PROSJEČNA TEŢINA MUŠICA U MILIGRAMIMA 5 dana stare 2 tjedna 4 tjedna 6 tjedana wt per 01 wt per 01 wt per 01 wt per 01 Netretirane 0.88 0.76 0.68 0.81 0.39 0.80 0.35 0.70 QUE 0,6 mm 0.70 0.62 0.68 0.76 0.67 0.66 QUE 3,2 mm 0.80 0.69 0.83 0.65 0.80 0.69 QUE 4,8 mm 1.12 0.76 0.59 0.65 0.90 0.77 TYR 7,6 µm 0.79 0.68 0.38 0.75 0.87 0.66 TYR 12,45 µm 0.48 0.71 0.65 0.75 0.90 0.61 TYR 17,6 µm 0.72 0.66 0.59 0.78 1.03 0.68 Netretirane 1.01 1.00 0.91 1.13 QUE 0,6 mm 0.97 1.07 0.88 QUE 3,2 mm 0.95 1.13 0.86 QUE 4,8 mm 1.13 1.15 1.07 TYR 7,6 µm 0.98 1.14 0.92 TYR 12,45 µm 1.12 1.19 0.94 TYR 17,6 µm 1.07 1.11 0.88 Tablica 6. Prosječna teţina mušica. n=11 za svaku eksperimentalnu skupinu. wt - divlji tip, per 01 - Period mutanti, QUE - kvercetin, TYR - tirosol Teţina Stupnjevi slobode Kvercetin F p Stupnjevi slobode Tirosol spol 1 31.3647 0.000005 1 25.2638 0.000026 koncentracija 3 2.1905 0.111363 3 0.4822 0.697322 starost 2 0.7377 0.487287 2 0.0725 0.930263 genotip 1 0.0070 0.933724 1 1.0336 0.318012 F p Tablica 7. Rezultati statističke analize modelom generalne regresije Generalna regresija pokazala je da kvercetin i tirosol nemaju značajan učinak na teţinu mušica. Postoji samo statistički značajna razlika u teţini kod muţjaka i ţenki, čime potvrďujemo spolni dimorfizam u veličini i teţini mušica (ţenke su veće od muţjaka). 40

4.2 Biokemijski testovi 4.2.1 CAT aktivnost a) Kvercetin b) Tirosol Slika 16. Kvercetin (a) značajno smanjuje aktivnost katalaze kod wt muţjaka i per 01 mušica oba spola, a tirosol (b) samo kod per 01 ţenki. Aktivnost katalaze kvantificirana je iz ekstrakata cijelih mušica, muţjaka i ţenki starih 5 dana te 2,4,6 tjedana hranjenih običnom hranom (netretirane) i tretiranih različitim koncentracijama kvercetina (0,6 mm, 3,2 mm i 4,8 mm) ili tirosola (7,6 µm, 12,45 µm i 17,6 µm). Aktivnost je proporcionalna promjeni apsorbancije na valnoj duljini detekcije H 2 O 2 (240 nm). Apsorbancija je mjerena spektrofotometrom tijekom 5 min. n=5 mušica po uzorku, uzorci su mjereni u triplikatima (isti uzorak pipetiran je u 3 jaţice) te su izračunate srednje vrijednosti. 41

Katalaza (CAT) je endogeni antioksidaivni enzim koji cijepa H 2 O 2 na molekulu vode i molekulu kisika. Iz prethodnih studija na Drosophili poznato je da se CAT aktivnost poveća u prva 3 tjedna ţivota, a zatim slijedi oštar pad aktivnosti pri kraju ţivota mušica (68). Testirali smo kako dodavanje kvercetina i tirosola u hranu 2, 4 i 6 tjedana starih per 01 i wt muških te per 01 ţenskih mušica utječe na aktivnost katalaze kako bi dobili saznanja o mehanizmu antioksidativnog djelovanja polifenola. Rezultati pokazuju da kvercetin (Slika 16.a) značajno smanjuje aktivnost CAT kod wt i per 01 mušica (generalna regresija, p<0.05 za utjecaj koncentracija kvercetina), a kod utjecaja tirosola nema specifične značajnosti (Slika 16.b). CAT aktivnost Stupnjevi slobode Kvercetin F p Stupnjevi slobode Tirosol spol 1 0.3310 0.569682 1 0.0264 0.872097 koncentracija 3 5.9960 0.002737 3 1.9958 0.137452 starost 2 0.8858 0.423638 2 0.5703 0.571807 genotip 1 0.9791 0.330884 1 1.3121 0.261712 F p Tablica 8. Rezultati statističke analize modelom generalne regresije Kod netretiranih muških mušica divljeg tipa tokom prva 2 tjedna se najprije poveća CAT aktivnost, a daljnjim starenjem se smanjuje, dok kod per 01 muţjaka starenjem dolazi do povećanja CAT aktivnosti (Slika 16.). Kod netretiranih per 01 ţenki CAT aktivnost povećava se u prva 4 tjedna ţivota, a nakon 6 tjedana se smanjuje. Kvercetin ima slabiji učinak na smanjenje CAT aktivnosti kod 2 i 4 tjedna starih per 01 muţjaka, u usporedbi s 2 i 4 tjedna starim wt muţjacima gdje je pad aktivnosti značajniji. U nekim slučajevima, kvercetin čak uzrokuje povećanje CAT aktivnosti kod per 01 muţjaka. Kod 6 tjedana starih muţjaka, smanjenje aktivnosti katalaze pod utjecajem sve tri koncentracije kvercetina značajnije je kod per 01 muţjaka, u usporedbi s divljim tipom. Najučinkovitiji je bio kvercetin u koncentraciji 0.6 mm koji je smanjio CAT aktvnost 3 puta u odnosu na netretirane per 01 muţjake. Iz toga moţemo zaključiti da, kod per 01 muţjaka, kvercetin ima jači učinak što su mušice starije. 42

Kvercetin smanjuje CAT aktivnost i kod 2, 4 i 6 tjedana starih per 01 ţenki, a učinkovitost koncentracija različita je i ovisi o dobi. Najučinkovitija koncentracija kvercetina kod 2 i 4 tjedna starih per 01 ţenki je 0.6 mm kod koje je aktivnost CAT dvostruko manja u usporedbi s netretiranim per 01 ţenkama. Tirosol nema specifičan učinak kod wt i per 01 muških mušica, dok kod per 01 ţenki smanjuje aktivnost CAT. Najbolji učinak pokazala je koncentracija tirosola od 7.6 µm koja smanjuje CAT aktivnost 9 puta kod 4 tjedna starih i 2 puta kod 2 tjedna starih per 01 ţenki. 4.2.2 SOD aktivnost Superoksid dismutaza (SOD) je endogeni enzimski antioksidans koji katalizira pretvaranje štetnog superoksidnog aniona u molekulu kisika ili vodikovog peroksida, a poznato je da se njena aktivnost kod Drosophile povećeva starenjem (68). Testirali smo kako dodavanje kvercetina i tirosola u hranu 2, 4 i 6 tjedana starih per 01 i wt muških te per 01 ţenskih mušica utječe na aktivnost SOD s ciljem dobivanja novih saznanja o mehanizmu antioksidativnog djelovanja polifenola. Aktivnost SOD proporcionalna je prikazanom postotku inhibicije. Rezultati pokazuju da postoji značajna razlika u učinku kvercetina na % inhibicije SOD ovisno o genotipu kod wt i per 01 mušica (generalna regresija, p<0.05 za utjecaj genotipa), a kod utjecaja tirosola postoje značajne spolne razlike (generalna regresija, p<0.05 za utjecaj spola). SOD aktivnost Stupnjevi slobode Kvercetin F p Stupnjevi slobode Tirosol spol 1 0.00105 0.974390 1 6.8254 0.014291 koncentracija 3 0.02897 0.993205 3 0.6451 0.592561 starost 2 0.92033 0.410106 2 2.0689 0.145211 genotip 1 5.24522 0.029746 1 1.0384 0.316918 F p Tablica 9. Rezultati statističke analize modelom generalne regresije 43

a) Kvercetin b) Tirosol Slika 17. Utjecaj kvercetina na aktivnost SOD ovisi o genotipu, a djelovanje tirosola je spolno specifično. SOD aktivnost kvantificirana je iz ekstrakata cijelih mušica kod muţjaka i ţenki starih 5 dana te 2,4,6 tjedana hranjenih običnom hranom (netretirane) i tretiranih različitim koncentracijama kvercetina (0,6 mm, 3,2 mm i 4,8 mm) ili tirosola (7,6 µm, 12,45 µm i 17,6 µm). Spektrofotometrom je mjerena promjena aposorbancije na valnoj duljini detekcije kvercetina (406 nm) tijekom 10 min te je izračunat prikazani % inhibicije. Aktivnost SOD proporcionalna je prikazanom % u kojem enzimski ekstrakt inhibira oksidaciju kvercetina u prisutnosti TEMED-a. n=5 mušica po uzorku, uzorci su mjereni u triplikatima (isti uzorak pipetiran je u 3 jaţice) te su izračunate srednje vrijednosti. Kod netretiranih muških mušica starenjem se javlja značajna razlika u aktivnosti SOD kod divljeg tipa i per 01 mutanata (Slika 17.). U slučaju wt mušica vidljiv je 44

učinak dobi te se aktivnost SOD povećava starenjem. Kod per 01 mušica, aktivnost SOD najprije se povećava, a nakon 2 tjedna starosti se smanjuje. Razlike u genotipu vide se i kod muţjaka tretiranih kvercetinom (Slika 17.a). Aktivnost SOD veći je kod per 01 muških mušica hranjenih kvercetinom u odnosu na wt muţjake tretirane kvercetinom, a starenjem je ta razlika sve veća. Što su mušice starije, kvercetin kod wt muţjaka utječe tako da smanjuje aktivnost SOD, a kod per 01 muških mušica aktivnost SOD se povećava u usporedbi s netretiranim mušicama. Kod per 01 ţenki starih 2 i 4 tjedna kvercetin povećava aktivnost SOD u odnosu na netretirane, a kod 6 tjedana starih per 01 ţenki nema značajnog utjecaja. Kod per 01 mušica tretiranih tirosolom vidljiva je značajna razlika u aktivnosti SOD meďu spolovima (Slika 17.b). Kod per 01 ţenki aktivnost SOD je u većini slučajeva dvostruko manja nego kod muţjaka. Tirosol kod 2 i 4 tjedna starih per 01 muških mušica smanjuje aktivnost SOD u usporedbi s netretiranim mušicama, a kod 6 tjedana starih per 01 muţjaka tirosol povećava aktivnost SOD. Ispitivanjem aktivnosti SOD nismo dobili jednoznačne rezultate, kako kod netretiranih mušica pod utjecajem starenja, tako ni kod mušica tretiranih polifenolima. Pokazalo se da postoje odreďeni specifični efekti ovisno o spolu i genotipu mušica te koncentraciji polifenola. 45

4.2.3 AGE biomarker a) Kvercetin b) Tirosol Slika 18. Kvercetin i tirosol značajno smanjuju nakupljanje AGE produkata kod wt i per 01 muţjaka. Akumulacija AGE produkata mjerena kod muţjaka i ţenki starih 5 dana te 2,4,6 tjedana hranjenih običnom hranom (netretirane) i tretiranih različitim koncentracijama kvercetina (0,6 mm, 3,2 mm i 4,8 mm) ili tirosola (7,6 µm, 12,45 µm i 17,6 µm). Fluorescencija je mjerena iz ekstrakta cijelih mušica na ekscitacijskoj i emisijskoj valnoj duljini od 365 nm i 440 nm, te je izračunat relativni intenzitet. n=5 mušica po uzorku, svaki uzorak mjeren je u triplikatu (isti uzorak pipetiran u 3 jaţice) te su izračunate srednje vrijednosti. 46

AGE (advanced glycation end) produkti formiraju se neenzimskim reakcijama reduktivnih šećera s proteinima, lipoproteinima i nukleinskim kiselinama, a poznato je da se nakupljaju starenjem. Testirali smo dali kvercetin i tirosol imaju učinak na smanjenje nakupljanja AGE produkata kod kod 2, 4 i 6 tjedana starih per 01 i wt muţjaka te per 01 ţenki. Generalna regresija pokazala je da kvercetin i tirosol značajno smanjuju nakupljanje AGE produkata kod wt i per 01 mušica, te da postoji značajna razlika u količini AGE produkata meďu genotipovima. AGE produkti Stupnjevi slobode Kvercetin F p Stupnjevi slobode Tirosol spol 1 0.8060 0.376951 1 0.6150 0.439479 koncentracija 3 3.4799 0.028962 3 3.1410 0.040902 starost 2 2.0862 0.143034 2 1.7713 0.188652 genotip 1 5.1919 0.030519 1 6.9879 0.013291 F p Tablica 10. Rezultati statističke analize modelom generalne regresije Nakupljanje AGE produkata starenjem je značajno kod netretiranih wt muţjaka, dok kod netretiranih per 01 mušica akumulacija starenjem nije vidljiva, iako je početna koncentracija kod 5 dana starih mušica veća kod per 01 nego wt (Slika 18.). Kvercetin i tirosol značajno smanjuju nakupljanje AGE produkata kod svih wt i per 01 muţjaka, osim kod per 01 starih 6 tjedana gdje gube učinak. Sve koncentracije polifenola imaju podjednako djelovanje na smanjenje AGE-a, osim tirosola koncentracije 7.6 µm koji nema značajan učinak. Kod per 01 ţenki nema jasnog učinka polifenola i dobi na nakupljanje AGE produkata. Za muţjake smo pokazali da je nakupljanje AGE produkata jače kod wt u odnosu na per 01 mutante. Kod per 01 muţjaka, učinak polifenola je ovisan o dobi i slabiji kod starijih mušica. Kod per 01 ţenki nije pokazan značajan učinak. 47

4.2.4 Mono-di-trigliceridi Izmjerili smo količinu mono-di-triglicerida u organizmu per 01 mušica, kako bi istraţili dali postoji povezanost izmeďu količine lipida (zaliha energije) i veće otpornosti mušica na stres izgladnjivanjem. a) Kvercetin b) Tirosol Slika 19. Količina mono-di-triglicerida kod per 01 mušica oba spola starenjem se najprije poveća, a zatim smanji nakon 6 tjedana. Mono-di-trigliceridi kvantificirani su iz ekstrakata cijelih mušica mjerenjem apsorbancije na valnoj duljini detekcije glicerola (230 nm). n=1 mušica po 1 uzorku, svaki uzorak mjeren je u triplikatu (isti uzorak pipetiran u 3 jaţice) te su izračunate srednje vrijednosti. 48

Generalna regresija pokazala je da postoji statistički značajna razlika u količini mono-di-triglicerida kod različitih dobnih skupina mušica (5 dana i 2,4,6 tjedana stare). Lipidi Stupnjevi slobode Kvercetin F p Stupnjevi slobode Tirosol spol 1 1.4230 0.249300 1 0.0068 0.935230 koncentracija 3 0.6966 0.566832 3 0.2523 0.858656 starost 2 28.5910 0.000004 2 25.5470 0.000006 F p Tablica 11. Rezultati statističke analize modelom generalne regresije Količina mono-di-triglicerida najmanja je kod mladih Per 01 muţjaka i ţenki (u prosjeku oko 25 µg), kod 4 tjedna starih mušica se povećava (oko 60 µg), a nakon 6 tjedana smanjuje se na prosječnih 40 µg u organizmu jedne mušice (Slika 19.). Dodavanje polifenola u prehranu značajno je smanjilo količinu mono-di-triglicerida samo kod 2 tjedna starih mušica (t-test, p<0.05), a kod ostalih nije imalo statistički značajan utjecaj. 49

4.2.5 Reduktivni šećeri Izmjerili smo količinu reduktivnih u organizmu Per 01 mušica, kako bi istraţili dali postoji povezanost izmeďu količine šećera (za koje je poznato da veţu vodu) i veće otpornosti mušica na stres isušivanjem. a) Kvercetin b) Tirosol Slika 20. Per 01 ţenke u organizmu sadrţe veću količinu reduktivnih šećera od per 01 muţjaka. Reduktivni šećeri kvantificirani su iz ekstrakata cijelih mušica mjerenjem apsorbancije na valnoj duljini detekcije Cu 2 O (735 nm). n=1 mušica po 1 uzorku, svaki uzorak mjeren je u triplikatu (isti uzorak pipetiran u 3 jaţice) te su izračunate srednje vrijednosti. 50

Generalna regresija pokazala je da postoji statistički značajna razlika u količini reduktivnih šećera kod Per 01 muţjaka i Per 01 ţenki. Šećeri Stupnjevi slobode Kvercetin F p Stupnjevi slobode Tirosol spol 1 13.2398 0.002031 1 24.1410 0.000131 koncentracija 3 1.1470 0.358641 3 1.4034 0.276127 starost 2 1.7696 0.200385 2 2.2386 0.137087 F p Tablica 12. Rezultati statističke analize modelom generalne regresije Per 01 ţenke u svom organizmu sadrţe dvostruko veću količinu reduktivnih šećera nego Per 01 muţjaci (Slika 20.). Dodavanje polifenola u prehranu zančajno je smanjilo količinu reduktivnih šećera kod 4 tjedna starih ţenki (t-test, p<0.05), dok kod ostalih skupina nije pokazan značajan utjecaj. 51

4.3 Tablica statističkih značajnosti BIHEVIORALNI TESTOVI BIOKEMIJSKI TESTOVI BIHEVIORALNI TESTOVI BIOKEMIJSKI TESTOVI a) Kvercetin Spol (m/ž) Genotip (wt/per) Starost (2/4/6 tjedana) Koncentracija polifenola (netretirane, 0.6 mm, 3.2 mm, 4.8 mm) Negativna geotaksija + - + * Aktivnost tijekom 24 h - - * Spavanje tijekom 24 h + + - Stres isušivanjem + + * Stres izgladnjivanjem + + - Preživljenje - - Prosječna težina + - - - CAT aktivnost - - - + SOD aktivnost - + - * AGE biomarker - + - + Mono-di-tri gliceridi - + * Reduktivni šećeri + - * b) Tirosol Spol (m/ž) Genotip (wt/per) Starost (2/4/6 tjedana) Koncentracija polifenola (netretirane, 7.6 µm, 12.45 µm, 17.6 µm) Negativna geotaksija + - + * Aktivnost tijekom 24 h - - * Spavanje tijekom 24 h + + - Stres isušivanjem + + * Stres izgladnjivanjem - + + Preživljenje - - Prosječna težina + - - - CAT aktivnost - - - + SOD aktivnost + - - - AGE biomarker - + - + Mono-di-tri gliceridi - + * Reduktivni šećeri + - * Tablica 13. Sistematičan prikaz rezultata statističke analize. Statistička analiza podataka provedena je korištenjem modela generalne regresije kako bi se utvrdila značajnost ukupnog utjecaja spola, genotipa, starosti i koncentracije polifenola na svaki od 52

mjerenih parametara (+ označava statistički značajan utjecaj, a - pokazuje da nema značajnosti). Utjecaj pojedinih koncentracija polifenola unutar skupina provjeren je t- testom. Znak * u tablici označava da postoji statistički značajan utjecaj pojedinačne koncentracije unutar pojedinih starosnih i spolnih skupina. Statistički model generalne regresije uključuje brojne statističke modele: ANOVA, ANCOVA, MANOVA, MANCOVA, linearnu regresiju, t-test i F-test, a pogodan je kad pratimo utjecaj više nezavisnih kategoričkih varijabli na neki parametar. Dobivena p-vrijednost prikazuje ukupni utjecaj kategoričke varijable. U Tablici 14. prikazane su statističke značajnosti svake varijable dobivene modelom generalne regresije. Ukupni utjecaj koncentracija polifenola primjenom tog modela nije pokazao značajnost (osim u slučaj stresa izgladnjivanjem, CAT aktivnost i AGE biomarkera), a razlog tome je što su u ostalim testovima polifenoli kod nekih starosnih skupina prouzročili smanjenje, a u drugima povećanje vrijednosti parametara. Zato je dodatno t-testom provjeren utjecaj koncentracija unutar starosnih i spolnih skupina, gdje se pokazalo da ipak postoje značajne razlike, pa je tablica nadopunjena i tim podacima o značajnosti (*). Dio podataka za genotip nedostaje u tablici zbog nedostupnosti podataka o wt mušicama,no ti će se podaci nadopuniti kada bude proveden ostatak istraţivanja. Iz tablice je vidljivo da spol i starost mušica imaju jači utjecaj kod testova ponašanja, a genotip mušica i koncentracije polifenola imaju značajniji utjecaj na biokemijske parametre. 53

5. RASPRAVA U ovom radu istraţeno je djelovanje polifenola kvercetina i tirosola, administriranih putem hrane, na indikatore starenja i redoks statusa kod per 01 vinskih mušica starih 2, 4 i 6 tjedana. Do sada je djelovanje kvercetina i tirosola na ţivotni vijek i otpornost na oksidativni stres istraţeno kod oblića C. elegans (31,35), a u ovom istraţivanju se ti polifenoli prvi put ispituju na per 01 cirkadijalnim mutantima Drosophile. Korišteni su bihevioralni testovi (mjerenje negativne geotaksije, aktivnosti i spavanja, otpornosti na stres isušivanjem i izgladnjivanjem, preţivljenja i teţine) i biokemijski testovi (mjerenje aktivnosti enzima koji reguliraju staničnu oksidaciju, AGE biomarkera, količine lipida i šećera). Rezultati testova negativne geotaksije, teţina, aktivnost antioksidativnih enzima CAT i SOD te mjerenja AGE biomarkera starenja kod per 01 mutanti usporeďeni su s rezulatima mušica divljeg tipa. Pokazali smo da u nekim slučajevima cirkadijalni per 01 mutanti brţe i u većem obimu pokazuju obiljeţja starenja u usporedbi s wt mušicama (npr. smanjena sposobnosti negativne geotaksije), čime su potvrďeni nalazi iz prethodnih studija (63). MeĎutim, u AGE testu per 01 mušice pokazale su manje nakupljanje biomarkera starenja od wt iako je naša pretpostavka na temelju rezultata prethodnih testova bila da će AGE produkata biti više kod mutiranih mušica. Pokazano je da postoji blagotovorni učinak polifenola na neke od fenotipnih i biokemjskih indikatora starenja. Polifenoli su povećali sposobnost negativne geotaksije te otpornost na izgladnjivanje i isušivanje kod starih mušica. TakoĎer, smanjili su nakupljanje AGE biomarkera starenja i aktivnost enzima CAT čime pokazuju da postoji odreďeni mehanizam njihovog protektivnog djelovanja na stanice u kojima starenjem dolazi do poremećaja homeostaze i oštećenja DNA, proteina i lipida. Iako je točan mehanizam djelovanja kvercetina i tirosola još uvijek nepoznat, mi smo pretpostavili 3 moguća mehanizma djelovanja: 1. polifenoli usporavaju metabolizam te tako sprečavaju nakupljanje ROS 2. polifenoli imaju vlastiti mehnizam direktnog uklanjanja ROS 54

3. polifenoli djeluju tako da potiču endogene antioksidativne enzime. Test negativne geotaksije osjetljiv je na promjene u funkcioniranju ţivčanog sustava do kojih dolazi zbog starenja i odumiranja neurona u mozgu. Starije mušice i mušice s neurodegenerativnim promjenama u mozgu pokazuju slabiju sposobnost penjanja od mladih mušica, što je potvrďeno i našim testom. U prethodnim istraţivanjima pokazano je neuroprotektivno djelovanje kvercetina u mozgu miševa (69) te pozitivno djelovanje drugih polifenola (npr. epikatehina, galne, kafeinske i kumarisnke kiseline...) na povećanje sposobnosti negativne geotaksije i produljenje ţivotnog vijeka nakon izlaganja mušica parakvatu (pesticidnom spoju iz kojeg lako nastaju slobodni radikali) (70). Mi smo pokazali da stari wt i per 01 muţjaci tretirani polifenolima imaju bolju sposobnost okomitog penjanja u odnosu na netretirane. MeĎutim, polifenoli su povećali negativnu geotaksiju samo kod 2 tjedna starih per 01 ţenki, dok kod starijih nisu imali učinka. Iz toga moţemo pretpostaviti postojanje spolno-specifičnog učinka koncentracija polifenola koje u našem slučaju nisu bile dovoljno visoke da bi djelovale kod starijih ţenki, iako su bile djelotvorne kod muţjaka. Koncentracije kvercetina i tirosola bi trebalo optimizirati te ponovo provesti istraţivanje. Starenjem se lokomotorna aktivnost mušica smanjuje zbog sve većeg oštećenja stanica ţivčanog sustava i sustava za kretanje. Pokazali smo da polifenoli smanjuju lokomotornu aktivnost kod 2 tjedna starih mušica, a manjom potrošnjom energije smanjuje se i metabolička aktivnost. Prema hipotezi o brzini življenja (eng. ''rate of living'') manja metabolička aktivnost znači i sporije nakupljanje slobodnih radikala (8,9). Na temelju tih rezultata, moţemo zaključiti da je jedan od potencijalnih mehanizama djelovanja polifenola usporavanje metabolizma u mlaďoj dobi. Na taj način usporava se nastanak oštećenja, pa su i mušice u starijoj dobi otpornije na stres. Spavanje ima funkciju obnavljanja i usporavanja metabolizma nakon intenzivne aktivnosti tijekom budnog razdoblja. Vaţno je za odrţavanje sinaptičke homeostaze, očuvanje energije i smanjenje razine štetnih reaktivnih kisikovih vrsta (66). TakoĎer je poznato da oksidativni stres, do kojeg dolazi starenjem ili utjecajem parakvata, uzrokuje fragmentaciju i poremećaj ritmova spavanja i 55

budnosti tako što utječe na ekspresiju cirkadijalnih gena koji reguliraju te ritmove (71). Mi smo pokazali da, osim što su manje aktivne, mušice starenjem sve manje spavaju. To znači da starije mušice više vremena provode budne, ali u stanju mirovanja. Pokazali smo i da ţenke spavaju manje od muţjaka, a iz prijašnjih istraţivanja znamo da je razlog tome njihovo kraće spavanje po danu zbog aktivnosti traganja za hranom i polaganja jajašca (66). Kvercetin i tirosol nisu pokazali značajan utjecaj na spavanje mušica. Pokazalo se i da su ţenske mušice daleko otpornije i imaju dulje preţivljenje u uvjetima stresa izgladnjivanjem i isušivanjem u odnosu na muţjake. U slučaju izgladnjivanja, kada se energetske potrebe ne mogu zadovoljiti prehranom, razlaţu se lipidi koji sluţe kao energetske zalihe organizma. Postoji mogućnost na količina lipida utječe na preţivljenje prilikom izgladnjivanja, dok količina šećera u tijelu, za koje je poznato da lako veţu vodu zahvaljujući brojnim hidroksilnim skupinama, moţe utjecati na rezultate testa isušivanja. Neovisno o tretmanu polifenolima, pokazano je da su ţenske mušice teţe i sadrţe veću količinu šećera pa tome moţemo pripisati njihovo dvostruko dulje preţivljenje prilikom isušivanja. U količini lipida nisu pokazane značajne razlike meďu spolovima. Tretman kvercetinom i tirosolom ima značajan učinak na produljenje ţivota mušica u uvjetima stresa isušivanjem i izgladnjivanjem, meďutim u normalnim uvjetima bez stresa nije bilo značajnog učinka na preţivljenje. Polifenoli su najznačajnije povećali otpornost na stres isušivanjem kod starih mušica (6 tjedana), dok je otpornost na stres izgladnjivanjem povećana kod mlaďih (2 tjedna starih) tretiranih mušica. Provjerili smo kako polifenoli djeluju na količinu lipida te da li je veća količina lipida u tijelu jedan od razloga duljeg preţivljenja mušica prilikom stresa izgladnjivanjem. Naši rezultati pokazali su se suprotnima od očekivanih te su 2 tjedna stare mušice tretirane polifenolima, koje su najdulje preţivjele izgladnjivanje, sadrţavale najmanju količinu mono-di-triglicerida u tijelu. Testirali smo i da li postoji povezanost izmeďu rezultata testa isušivanja i količine šećera u tijelu mušica tretirnaih polifenolima. Polifenoli su povećali otpornost na isušivanje 6 tjedana starih mušica, no nisu imali specifičan utjecaj na količinu šećera u tijelu mušica. To pokazuje da nema povezanosti izmeďu veće količine lipida i/ili šećera i 56

otpornosti na izgladnjivanje i isušivanje zbog utjecaja polifenola. Polifenoli, iako su povećali otpornost, nisu povećali količinu mono-di-triglicerida i šećera. Moţemo pretpostaviti da je za njihov pozitivan učinak na otpornost na stres izgladnjivanjem i isušivanjem odgovoran drugi mehanizam. Polifenoli su povećali maksimalno preţivljenje mušica u normalnim uvjetima, no ipak nije pokazan statistički značajan utjecaj na duljinu ţivotnog vijeka. Razlog tome mogu biti premale koncentracije polifenola koje bi trebalo optimizirati te ponoviti eksperiment. Dalje nas je zanimalo da li je antioksidativno djelovanje polifenola povezano s njihovim utjecajem na aktivnost endogenih antioksidativnih enzima CAT i SOD. Prema podacima iz literature, CAT aktivnost kod divljeg tipa (Oregon R soja) Drosophile poveća se za 50% kroz prva tri tjedna u odnosu na mlade mušice, a kasnije slijedi oštar pad aktivnosti te je ona slična kao kod mladih jedinki. (68) Naši rezultati testa aktivnosti katalaze kod wt CS mušica su u potpunosti potvrdili taj obrazac promjena CAT aktivnosti tijekom starenja. Novost u našem istraţivanju je da period mutanti pokazuju drukčije promjene aktivnosti katalaze starenjem. Kod per 01 mušica se CAT aktivnost konstantno povećava starenjem te do njezinog pada nije došlo ni kod najstarijih mušica. To nam ukazuje na vaţnu ulogu per gena u regulaciji aktivnosti katalaze. Moguće je da se zbog njegovog nedostatka proizvode veće količine tog enzima. Postoji i mogućnost da je aktivnost katalaze povećana zbog većeg nakupljanja slobodnih radikala kod per 01 mušica, za koje je poznato da brţe nakupljaju oksidativna oštećenja i stare. Mi smo pokazali da polifenoli djeluju tako da smanjuju aktivnost katalaze kod wt i per 01 mušica, no točan mehanizam njihovog djelovanja još je nejasan. Moguće je da direktno stupaju u interakciju s CAT ili da svojim djelovanjem smanjuju količinu slobodnih radikala te se tako smanjuje CAT aktivnost zbog smanjene potrebe za djelovanjem endogenih antioksidativnih enzima. Iz literature je poznato da se aktivnost enzima SOD kod Oregon R mušica linearno povećava starenjem (68). Naši rezultati potvrďuju te navode za mušice divljeg tipa CS. Kod netretiranih per 01 mušica nismo pokazali specifičan utjecaj starenja na aktivnost SOD. Kvercetin je značajnije povećao aktivnost SOD kod per 01 mutanata 57

u usporedbi s mušicama divljeg tipa. Pokazalo se da je djelovanje kvercetina ovisno o genotipu, a djelovanje tirosola je spolno-specifično. Ispitivanjem aktivnosti SOD nismo dobili jednoznačne rezultate već samo pojedinačne učinke različitih koncentracija polifenola koji su ovisni o genotipu i spolu mušica. Za donošenje konkretnijih zaključaka trebalo bi provesti daljnja istraţivanja. Vaţna stvar koju smo za sada pokazali je da jačina djelovanja kvercetina na aktivnost SOD ovisi o prisutnosti per gena. Kod mušica s per 01 mutacijom, kvercetin je pokazao jače djelovanje. To nam potvrďuje da postoji povezanost izmeďu redoks statusa, cirkadijalnih gena i mehanizma djelovanja polifenola. Kvercetin i tirosol smanjuju aktivnost katalaze kod starih mušica, a njihov učinak na SOD nije toliko jasan i ovisi o genotipu, spolu, dobi i koncentraciji. Iz naših rezulatata moţemo pretpostaviti da polifenoli imaju različit mehanizam djelovanja djelovanje na CAT i SOD. AGE produkti su biomarkeri molekularnih oštećenja vezanih uz starenje, a nastaju reakcijom šećera s proteinima, lipidima i nukleinskim kiselinama u stanicama. U prethodnim istraţivanjima je pokazano je da se njihova akumulacija povećava starenjem (15). TakoĎer je poznato da polifenoli mogu utjecati na smanjenje formiranja AGE produkata in vitro i in vivo (72). Naši rezultati su potvrdili da se starenjem povećava nakupljanje AGE produkata kod wt mušica. Zanimljivo je da se kod per 01 mutanata količina AGE-a starenjem smanjila, pa moţemo zaključiti da per gen ima ulogu u nastajanju i nakupljanju AGE produkata. Kvercetin i tirosol značajno smanjuju nakupljanje AGE produkata kod wt i per 01 muţjaka, a kod per 01 ţenki nije pokazan značajan učinak. U literaturi je navedeno da je nakupljanje AGE produkata u mozgu značajka starenja i neurodegeneracije, posebice kod Alzheimerove bolesti (73). Rezultate naših testova AGE biomarkera moţemo na temelju toga povezati sa sposobnošću negativne geotaksije koja se starenjem smanjuje zbog neurodegenerativnig promjena. Polifenoli su u našem istraţivanju pokazali pozitivan učinak na negativnu geotaksiju te su istovremeno smanjili količinu AGE produkata kod muških mušica, dok kod ţenki nisu imali utjecaj na oba parametra. Manju količinu AGE-a nakon tretmana polifenolima moţemo povezati i s duljim preţivljenjem tretiranih mušica 58

prilikom stresa izgladnjivanjem. Time je pokazano da polifenoli pozitivno utječu na biokemijske indikatore starenja (AGE) što je vidljivo i na bihevioralnoj razini (negativna geotaksija,otpornost na stres). Rezultati netretiranih mušica na našim testovima, kao i djelovanje polifenola, često se razlikuju ovisno o spolu. Primjerice, stare netretirane ţenke pokazale su bolje rezultate na testu negativne geotaksije, izgladnjivanja i isušivanja od netretiranih muţjaka te je količina njihove lokomotorne aktivnosti bila značajno veća nego kod muţjaka. U nekim testovima, polifenoli su pokazali učinak kod muţjaka, a ne i kod ţenki (negativna geotaksija, AGE biomarker). Te rezultate moţemo povezati s činjenicom da muţjaci većine vrsta brţe stare i nakupljaju oksidativna oštećenja. Pokazano je da kod ţenki postoji protektivno djelovanje estrogena koji vezanjem na estrogene receptore pokreću odreďene signalne putove (MAPK i NFkappaB), što rezultira povećanom proizvodnjom antioksidativnih enzima (74). Drosophila nema estrogen, no moţda ima neki slični hormonalni tj. peptidni spolno-specifični mehanizam. To upućuje na mogućnost da polifenoli djeluju tek kada se nakupi veća količina oštećenja u organizmu. Neka istraţivanja su pokazala da na sličan način djeluju CAT i SOD, čija je minimalna aktivnost dovoljna kod normalnog procesa starenja, dok su veće količine korisne tek u uvjetima jačeg oksidativnog stresa (53). Pokazali smo da kvercetin i tirosol imaju pozitivna djelovanja na neke od bihevioralnih i biokemijskih indikatora starenja, koja ovise o spolu, genotipu i starosti mušica, te koncentraciji polifenola. Mehanizam tog djelovanja moţemo trenutno samo pretpostaviti, a iz rezultata se da naslutiti da postoji povezanost s ekspresijom per cirkadijalnog gena. Rezultati pojedinih mjerenja nisu se pokazali konzistentnima (npr. aktvnost SOD) te moramo uzeti u obzir mogućnost pogreške prilikom izvoďenja eksperimaneta te činjenicu da ne znamo količinu hrane s dodatkom polifenola koju su mušice pojele. To nam otvara prostor za daljnja istraţivanja kako bi provjerili te rezultate i dobili nove uvide. 59

6. ZAKLJUČAK Ovim istraţivanjem pokazali smo da postoje razlike u procesu starenja mušica divljeg tipa i period mutanata te da polifenoli kvercetin i tirosol imaju pozitivan učinak na neke od bihevioralnih i biokemijskih indikatora starenja. Taj učinak ovisi o spolu, genotipu i starosti mušica, te koncentraciji polifenola. Naše glavno otkriće, koje do sada nije objavljeno, je postojanje interakcije per gena s mehanizmom djelovanja polifenola. Potvrdili smo rezultate prethodnih istraţivanja vezanih uz starenje wt mušica, npr. smanjene motoričke sposobnosti kod starih mušica, obrazac promjena aktivnosti CAT i SOD te nakupljanje AGE biomarkera tijekom starenja. Pokazali smo da u nekim slučajevima obiljeţja starenja izraţenija kod cirkadijalnih per 01 mutanata u usporedbi s wt mušicama (npr. smanjena sposobnosti negativne geotaksije), čime su isto potvrďeni nalazi iz prethodnih studija. Neočekivan rezultat je da su u AGE testu per 01 mušice pokazale manje nakupljanje biomarkera starenja od wt. Polifenoli su povećali sposobnost negativne geotaksije i otpornost na izgladnjivanje i isušivanje te smanjili nakupljanje AGE biomarkera starenja i aktivnost enzima CAT kod starih mušica. Time je pokazano da postoji odreďeni mehanizam njihovog protektivnog djelovanja na stanice koje su starenjem podloţne sve većem oksidativnom stresu i oštećenjima. Moguće djelovanje polifenola u borbi protiv oksidativnog stesa moţe biti sprječavanje nastajanja ROS-a usporavanjem metabolizma, direktno uklanjanje ROS ili utjecaj na poboljšanje endogene antioksidativne obrane organizma (npr. enzime CAT i SOD). Značajne razlike meďu genotipovima u djelovanju kvercetina i tirosola na aktivnost SOD i nakupljanje AGE produkata mušica upućuju na ulogu per gena u mehanizmu djelovanja polifenola. Kako nebi došlo do ubrzanog starenja, u stanicama je bitna ravnoteţa izmeďu nakupljanja oksidativnih oštećenja i sposobnosti njihova popravka, a polifenoli pomaţu odrţavanje te ravnoteţe. Iako smo na temelju rezultata zaključili da 60

polifenoli djeluju na oksidativni stres u stanici i utvrdili povezanost tog djelovanja s per genom, tek će naredna istraţivanja utvrditi točan mehanizam djelovanja polifenola. Drosophila melanogaster kao modelni organizam omogućava nam vaţane uvide u sloţenost kontrole procesa starenja, a s vremenom će ti uvidi moći posluţiti kao temelj daljnjih istraţivanja na ljudima. 61

7. LITERATURA 1. Sohal RS, Orr WC. The Redox Stress Hypothesis of Aging. Free Radic Biol Med. 2012 Feb 1;52(3):539 55. 2. Anderson RM, Colman RJ. Prospects and Perspectives in Primate Aging Research. Antioxid Redox Signal. 2011 Jan 15;14(2):203 5. 3. Macieira-Coelho A. Biology of Aging. Springer Science & Business Media; 2012. 198 p. 4. Ostojid S, Pereza N. Genetički pogled na teorije starenja. Medicina. 2006;42:4 14. 5. Vrndid O, Kostid I, Jeftid I, Stanojevid M, Živančevid-Simonovid S. Patofiziološki mehanizmi procesa starenja. Medicinski Časopis. 2010;3:30 6. 6. Viña J, Borrás C, Miquel J. Theories of ageing. IUBMB Life. 2007 May;59(4 5):249 54. 7. Xi L, Serebrovskaya TV. Intermittent Hypoxia and Human Diseases. Springer Science & Business Media; 2012. 310 p. 8. Ku HH, Brunk UT, Sohal RS. Relationship between mitochondrial superoxide and hydrogen peroxide production and longevity of mammalian species. Free Radic Biol Med. 1993 Dec;15(6):621 7. 9. Sohal RS, Weindruch R. Oxidative Stress, Caloric Restriction, and Aging. Science. 1996 Jul 5;273(5271):59 63. 10. Agarwal S, Sohal RS. Relationship between susceptibility to protein oxidation, aging, and maximum life span potential of different species. Exp Gerontol. 1996 Jun;31(3):365 72. 11. Cadenas E, Davies KJA. Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging1. Free Radic Biol Med. 2000 Aug;29(3 4):222 30. 12. Beckman KB, Ames BN. The free radical theory of aging matures. Physiol Rev. 1998 Apr;78(2):547 81. 13. Harman D. The aging process: major risk factor for disease and death. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Jun 15;88(12):5360 3. 14. Bailey JW, Walker E, Beauchene RE. Fatty acid composition of adipose tissue in aged rats: effects of dietary restriction and exercise. Exp Gerontol. 1993 Jun;28(3):233 47. 15. Jacobson J, Lambert AJ, Portero-Otín M, Pamplona R, Magwere T, Miwa S, et al. Biomarkers of aging in Drosophila. Aging Cell. 2010 Aug;9(4):466 77. 16. Choi JH, Yu BP. Brain synaptosomal aging: free radicals and membrane fluidity. Free Radic Biol Med. 1995 Feb;18(2):133 9. 62

17. Rahman K. Studies on free radicals, antioxidants, and co-factors. Clin Interv Aging. 2007 Jun;2(2):219 36. 18. Sies H, Stahl W, Sevanian A. Nutritional, dietary and postprandial oxidative stress. J Nutr. 2005 May;135(5):969 72. 19. Landis GN, Tower J. Superoxide dismutase evolution and life span regulation. Mech Ageing Dev. 2005 Mar;126(3):365 79. 20. Chaudière J, Ferrari-Iliou R. Intracellular antioxidants: from chemical to biochemical mechanisms. Food Chem Toxicol Int J Publ Br Ind Biol Res Assoc. 1999 Oct;37(9 10):949 62. 21. Matés JM, Pérez-Gómez C, Núñez de Castro I. Antioxidant enzymes and human diseases. Clin Biochem. 1999 Nov;32(8):595 603. 22. On Drosophila Aging: Lifespan Plasticity, Social-behavioral Influences, and Neurophysiological Indices. ProQuest; 2008. 164 p. 23. Robert K. Murray, David A. Bender, Kathleen M. Botham, Peter J. Kennelly, Victor W. Rodwell, P. Anthony Weil. Harperova ilustrirana biokemija. Zagreb: Medicinska naklada; 24. Mackay WJ, Bewley GC. The Genetics of Catalase in Drosophila Melanogaster: Isolation and Characterization of Acatalasemic Mutants. Genetics. 1989 Jul;122(3):643 52. 25. Pandey KB, Rizvi SI. Plant polyphenols as dietary antioxidants in human health and disease. Oxid Med Cell Longev. 2009;2(5):270 8. 26. Prof.dr.sc. Jasminka Giacometti. Korisnost polifenola u maslinovom ulju [Internet]. Medicinski fakultet Sveučilišta u Rijeci Zavod za kemiju i biokemiju. Available from: https://bib.irb.hr/datoteka/377399.korisnost_polifenola_u_maslinovom_ulju2.ppt 27. Sandoval-Acuña C, Ferreira J, Speisky H. Polyphenols and mitochondria: an update on their increasingly emerging ROS-scavenging independent actions. Arch Biochem Biophys. 2014 Oct 1;559:75 90. 28. Boots AW, Haenen GRMM, Bast A. Health effects of quercetin: from antioxidant to nutraceutical. Eur J Pharmacol. 2008 May 13;585(2 3):325 37. 29. de Oliveira MR, Nabavi SM, Braidy N, Setzer WN, Ahmed T, Nabavi SF. Quercetin and the mitochondria: A mechanistic view. Biotechnol Adv. 2016 Oct;34(5):532 49. 30. Belinha I, Amorim MA, Rodrigues P, de Freitas V, Moradas-Ferreira P, Mateus N, et al. Quercetin increases oxidative stress resistance and longevity in Saccharomyces cerevisiae. J Agric Food Chem. 2007 Mar 21;55(6):2446 51. 31. Kampkötter A, Timpel C, Zurawski RF, Ruhl S, Chovolou Y, Proksch P, et al. Increase of stress resistance and lifespan of Caenorhabditis elegans by quercetin. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 2008 Feb;149(2):314 23. 63

32. Sotibrán ANC, Ordaz-Téllez MG, Rodríguez-Arnaiz R. Flavonoids and oxidative stress in Drosophila melanogaster. Mutat Res Toxicol Environ Mutagen. 2011 Nov 27;726(1):60 5. 33. Covas MI, Miró-Casas E, Fitó M, Farré-Albadalejo M, Gimeno E, Marrugat J, et al. Bioavailability of tyrosol, an antioxidant phenolic compound present in wine and olive oil, in humans. Drugs Exp Clin Res. 2003;29(5 6):203 6. 34. Samuel SM, Thirunavukkarasu M, Penumathsa SV, Paul D, Maulik N. Akt/FOXO3a/SIRT1-mediated cardioprotection by n-tyrosol against ischemic stress in rat in vivo model of myocardial infarction: switching gears toward survival and longevity. J Agric Food Chem. 2008 Oct 22;56(20):9692 8. 35. Cañuelo A, Gilbert-López B, Pacheco-Liñán P, Martínez-Lara E, Siles E, Miranda-Vizuete A. Tyrosol, a main phenol present in extra virgin olive oil, increases lifespan and stress resistance in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 2012 Aug;133(8):563 74. 36. Browner WS, Kahn AJ, Ziv E, Reiner AP, Oshima J, Cawthon RM, et al. The genetics of human longevity. Am J Med. 2004 Dec 1;117(11):851 60. 37. Kaeberlein M, McVey M, Guarente L. The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms. Genes Dev. 1999 Oct 1;13(19):2570 80. 38. Wang R-H, Zhao T, Cui K, Hu G, Chen Q, Chen W, et al. Negative reciprocal regulation between Sirt1 and Per2 modulates the circadian clock and aging. Sci Rep. 2016 Jun 27;6:28633. 39. Rodríguez-Aguilera JC, Gavilán A, Asencio C, Navas P. The role of ubiquinone in Caenorhabditis elegans longevity. Ageing Res Rev. 2005 Jan;4(1):41 53. 40. Liu X, Jiang N, Hughes B, Bigras E, Shoubridge E, Hekimi S. Evolutionary conservation of the clk-1- dependent mechanism of longevity: loss of mclk1 increases cellular fitness and lifespan in mice. Genes Dev. 2005 Oct 15;19(20):2424 34. 41. Sun J, Tower J. FLP recombinase-mediated induction of Cu/Zn-superoxide dismutase transgene expression can extend the life span of adult Drosophila melanogaster flies. Mol Cell Biol. 1999 Jan;19(1):216 28. 42. Lin YJ, Seroude L, Benzer S. Extended life-span and stress resistance in the Drosophila mutant methuselah. Science. 1998 Oct 30;282(5390):943 6. 43. Ceriani MF, Hogenesch JB, Yanovsky M, Panda S, Straume M, Kay SA. Genome-wide expression analysis in Drosophila reveals genes controlling circadian behavior. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 2002 Nov 1;22(21):9305 19. 44. McDonald MJ, Rosbash M. Microarray analysis and organization of circadian gene expression in Drosophila. Cell. 2001 Nov 30;107(5):567 78. 45. Miller BH, McDearmon EL, Panda S, Hayes KR, Zhang J, Andrews JL, et al. Circadian and CLOCKcontrolled regulation of the mouse transcriptome and cell proliferation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Feb 27;104(9):3342 7. 64

46. Schneider EL, Rowe JW. Handbook of the Biology of Aging. Academic Press; 2013. 508 p. 47. Hastings MH, Reddy AB, Maywood ES. A clockwork web: circadian timing in brain and periphery, in health and disease. Nat Rev Neurosci. 2003 Aug;4(8):649 61. 48. Langmesser S, Albrecht U. Life time-circadian clocks, mitochondria and metabolism. Chronobiol Int. 2006;23(1 2):151 7. 49. Neufeld-Cohen A, Robles MS, Aviram R, Manella G, Adamovich Y, Ladeuix B, et al. Circadian control of oscillations in mitochondrial rate-limiting enzymes and nutrient utilization by PERIOD proteins. Proc Natl Acad Sci. 2016 Mar 22;113(12):E1673 82. 50. Krishnan N, Davis AJ, Giebultowicz JM. Circadian regulation of response to oxidative stress in Drosophila melanogaster. Biochem Biophys Res Commun. 2008 Sep 19;374(2):299 303. 51. Powell JR. Progress and Prospects in Evolutionary Biology: The Drosophila Model. Oxford University Press; 1997. 577 p. 52. Liu J, Li C, Yu Z, Huang P, Wu H, Wei C, et al. Efficient and specific modifications of the Drosophila genome by means of an easy TALEN strategy. J Genet Genomics Yi Chuan Xue Bao. 2012 May 20;39(5):209 15. 53. Le Bourg E null. Oxidative stress, aging and longevity in Drosophila melanogaster. FEBS Lett. 2001 Jun 8;498(2 3):183 6. 54. Rhodenizer D, Martin I, Bhandari P, Pletcher SD, Grotewiel M. Genetic and environmental factors impact age-related impairment of negative geotaxis in Drosophila by altering age-dependent climbing speed. Exp Gerontol. 2008 Aug;43(8):739 48. 55. Helfrich-Förster C. The locomotor activity rhythm of Drosophila melanogaster is controlled by a dual oscillator system. J Insect Physiol. 2001 Jul 15;47(8):877 87. 56. Peschel N, Helfrich-Förster C. Setting the clock by nature: Circadian rhythm in the fruitfly Drosophila melanogaster. FEBS Lett. 2011 May 20;585(10):1435 42. 57. Allada R, Emery P, Takahashi JS, Rosbash M. STOPPING TIME: The Genetics of Fly and Mouse Circadian Clocks. Annu Rev Neurosci. 2001;24(1):1091 119. 58. Ishida N, Kaneko M, Allada R. Biological clocks. Proc Natl Acad Sci. 1999 Aug 3;96(16):8819 20. 59. Ceriani MF, Darlington TK, Staknis D, Más P, Petti AA, Weitz CJ, et al. Light-Dependent Sequestration of TIMELESS by CRYPTOCHROME. Science. 1999 Jul 23;285(5427):553 6. 60. Konopka RJ, Benzer S. Clock Mutants of Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci. 1971 Sep 1;68(9):2112 6. 61. The Drosophila Molecular Clock Model HHMI s BioInteractive [Internet]. [cited 2016 Sep 15]. Available from: http://www.hhmi.org/biointeractive/drosophila-molecular-clock-model 65

62. Yu EA, Weaver DR. Disrupting the circadian clock: gene-specific effects on aging, cancer, and other phenotypes. Aging. 2011 May;3(5):479 93. 63. Krishnan N, Kretzschmar D, Rakshit K, Chow E, Giebultowicz JM. The circadian clock gene period extends healthspan in aging Drosophila melanogaster. Aging. 2009 Nov 19;1(11):937 48. 64. Le Bourg E. The rate of living theory. Spontaneous locomotor activity, aging and longevity in Drosophila melanogaster. Exp Gerontol. 1987;22(5):359 69. 65. Shaw PJ, Cirelli C, Greenspan RJ, Tononi G. Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster. Science. 2000 Mar 10;287(5459):1834 7. 66. Isaac RE, Li C, Leedale AE, Shirras AD. Drosophila male sex peptide inhibits siesta sleep and promotes locomotor activity in the post-mated female. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 2009 Sep 30;rspb20091236. 67. Gibbs AG, Markow TA. Effects of age on water balance in Drosophila species. Physiol Biochem Zool PBZ. 2001 Aug;74(4):520 30. 68. Sohal RS, Arnold L, Orr WC. Effect of age on superoxide dismutase, catalase, glutathione reductase, inorganic peroxides, TBA-reactive material, GSH/GSSG, NADPH/NADP+ and NADH/NAD+ in Drosophila melanogaster. Mech Ageing Dev. 1990 Dec;56(3):223 35. 69. Costa LG, Tait L, de Laat R, Dao K, Giordano G, Pellacani C, et al. Modulation of paraoxonase 2 (PON2) in mouse brain by the polyphenol quercetin: a mechanism of neuroprotection? Neurochem Res. 2013 Sep;38(9):1809 18. 70. Jimenez-Del-Rio M, Guzman-Martinez C, Velez-Pardo C. The effects of polyphenols on survival and locomotor activity in Drosophila melanogaster exposed to iron and paraquat. Neurochem Res. 2010 Feb;35(2):227 38. 71. Koh K, Evans JM, Hendricks JC, Sehgal A. A Drosophila model for age-associated changes in sleep:wake cycles. Proc Natl Acad Sci. 2006 Sep 12;103(37):13843 7. 72. Bengmark S. Advanced glycation and lipoxidation end products--amplifiers of inflammation: the role of food. JPEN J Parenter Enteral Nutr. 2007 Oct;31(5):430 40. 73. Münch G, Thome J, Foley P, Schinzel R, Riederer P. Advanced glycation endproducts in ageing and Alzheimer s disease. Brain Res Rev. 1997 Feb;23(1 2):134 43. 74. Vina J, Gambini J, Lopez-Grueso R, Abdelaziz KM, Jove M, Borras C. Females live longer than males: role of oxidative stress. Curr Pharm Des. 2011 Dec 1;17(36):3959 65. 66

Curriculum vitae Franka Rigo OSOBNE INFORMACIJE Franka Rigo Trošti 64N, Heki, Pazin, 52 000, Republika Hrvatska 097 772 1999 frigo0708@gmail.com, frigo@uniri.hr Spol ženski Datum roďenja 31.03.1993.. Državljanstvo hrvatsko RADNO ISKUSTVO studeni 2015.- srpanj 2016. Izrada diplomskog rada,laboratorij za genetiku ponašanja,odjel za biotehnologiju Tema: Utjecaj tirosola i kvercetina na indikatore starenja i redoks statusa u period cikadijalnih mutanata Drosophile, mentor: doc. Dr. Sc. Rozi Andretić Waldowski srpanj 2014. Stručna praksa, Jadran Galenski Laboratorij (JGL) d.d., odjel za proizvodnju Detaljno upoznavanje sa svim postupcima u proizvodnji. Tema: Izrada, doziranje i opremanje sterilnih otopina OBRAZOVANJE I OSPOSOBLJAVANJE 2014.- 2016. Sveučilišni diplomski studij Biotehnologija u medicini Sveučilište u Rijeci, Odjel za biotehnologiju 2011.- 2014. Sveučilišni preddiplomski studij Biotehnologija i istraživanje lijekova Sveučilište u Rijeci, Odjel za biotehnologiju molekularna biologija, biokemija, medicinska mikrobiologija, farmakologija, farmakognozija i prirodni produkti, bioeseji u istraživanju lijekova, osnove molekularne medicine, toksikologija, kemoinformatika Završni rad: Povezanost pretilosti s cirkadijurnom regulacijom metabolizma, mentor: doc. Dr. Sc. Rozi Andretić Waldowski 2008.- 2011. Opća gimnazija Gimnazija i strukovna škola Jurja Dobrile, Pazin hrvatski, latinski, engleski, talijanski, matematika, kemija, fizika, biologija, glazbena i likovna umjetnost, logika, filozofija, politika i gospodarstvo, sociologija, psihologija, povijest, geografija aktivnosti: rukomet, kros, atletika (sudjelovanje na raznim županijskim i državnim natjecanjima) 67 Europska unija, 2002-2013 http://europass.cedefop.europa.eu Stranica 1 / 2