Univerzitet u Nišu Prirodno-matematički fakultet Departman za hemiju Master rad Odredjivanje antioksidativnih karakteristika odabranih gljiva roda Lactarius Mentor: dr Violeta Mitić Student: Ana Vitković
Eksperimentalni deo ovog master rada je urađen u istraživačkim labaratorijama katedre za Analitičku hemiju, Departmana za hemiju Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu. Veliku i iskrenu zahvalnost, ovom prilikom, upućujem svojoj mentorki profesorki dr Violeti Mitić na izboru teme, stručnim savetima, ukazanom strpljenju i razumevanju. Posebnu zahvalnost bih ovom prilikom iskazala divnoj doktorantkinji Mariji Dimitrijević na nesebičnoj pomoći i beskrajnom strpljenju, na celokupnom "vođenju" tokom svih faza izrade ovog master rada. Zahvaljujem se i asistentkinji Jeleni Nikolić, na sugestijama prilikom izrade eksperimentalnog dela ovog master rada. Takođe bih se zahvalila i svojoj drugarici, koleginici na neizmernoj podršci i ukazanim savetima tokom studiranja kao i pri izradi ovog master rada. Na kraju se zahvaljujem svojim roditeljima na svestranoj pomoći i na tome što su mi pomogli da shvatim da je u životu važno postavljati ciljeve i ne odustajati od započetog.
Sadržaj 1. Uvod 1 2. Nutritivni sastav gljiva 3 3. Vrste gljiva Lactarius 5 3.1. Lactarius piperatus 5 3.2. Lactarius volemus 6 3.3. Lactarius sanguifluus 8 3.4. Lactarius semisanguifluus 9 4. Antioksidativna aktivnost 11 4.1. Oksidativni stres 11 4.2. Slobodni radikali 13 4.3. Antioksidansi 17 4.3.1. Primarna antioksidativna zastita 19 4.3.2. Sekundarna antioksidativna zaštita 21 4.3.2.1. Fenolna jedinjenja 22 4.3.2.1.1. Fenolne kiseline 25 4.3.2.1.2. Flavonoidi 29 5. UV-VIS spektrofotometrija 32 5.1. Nastajanje UV-VIS spektara 32 5.2. Konstrukcija i funkcija UV-VIS spektrofotometra 35 6. Metode za određivanje antioksidativne aktivnosti 37 6.1. Metode koje ukjlučuju H-transfer reakcije 39 6.1.1. ORAC metoda (Oxygen radical absorbance capacity) 39 6.1.2. TRAP metoda (Total radical trapping antioxidant parameter) 40 6.2. Elektron transfer metode (ET) 40 6.2.1. ABTS metoda (Scavengig of 2,2 -azobis-(3-etillbenzotiazolin-6-sulfat) Radical Assay) 41 6.2.2. FRAP- metoda (Ferric Ion Reducing Antioxidant Power Assay) 41 6.2.3. DPPH metoda (Scavengig of 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil Radical Assay) 42 6.2.4. CUPRAC metoda (Copper (II) reduction capacity) 44
6.2.5. Metoda za određivanje ukupnog sadrţaja fenolnih jedinjenja (Total Phenolic Content- TPC) ili FCR metoda (Folin Ciocalteu Reducing Capacity Assay) 44 7. Ekstrakcija rastvaračima različite polarnosti 46 8. Priprema ekstrakta pečuraka 49 8.1. Aparatura i pribor 49 8.2. Korišćeni reagensi 49 9. Metode određivanja antioksidativne aktivnosti 50 9.2. CUPRAC metoda (Copper (II) reduction capacity) 50 9.3. Određivanje "scavenging" antioksidansnog slobodno radikalskog kapaciteta prema 2,2 -azobis-(3-etillbenzotiazolin-6-sulfat) (ABTS) radikalu 50 9.4. Određivanje "scavenging" antioksidansnog slobodno-radikalskog kapaciteta prema 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) radikalu 50 9.5. Odredjivanje antioksidacione aktivnosti merenjem ukupne redukcione moći 51 10. Hemometrijska analiza 52 11. Rezultati i diskusija 54 11.1. Određivanje ukupnog sadržaja fenolnih jedinjenja (Total Phenolic Content-TPC)54 11.2. CUPRAC metoda (Copper (II) reduction capacity) 55 11.3. Određivanje "scavenging" antioksidansnog slobodno radikalskog kapaciteta prema 2,2 -azobis-(3-etillbenzotiazolin-6-sulfat) (ABTS) radikalu 58 11.4. Određivanje "scavenging" antioksidansnog slobodno radikalskog kapaciteta prema 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) radikalu 60 11.5. Odredjivanje antioksidacione aktivnosti merenjem ukupne redukcione moći (TRP metoda) 62 11.6. Klaster analiza 64 12. Zaključak 67 13. Literatura 70
Uvod
1. Uvod Gljive su organizmi koji se svrstavaju u posebno carstvo carstvo gljiva, Fungi (lat.). One su pričvršćene za podlogu, kao i biljke, ali nemaju hlorofil i ne mogu da vrše fotosintezu. Hrane se heterotrofno, kao i ţivotinje, razlaţući gotovu hranu i upijajući hranljive materije. Zbog ovakvih karakteristika nisu mogle biti svrstane ni u carstvo biljaka, ni u carstvo ţivotinja, te su zato svrstane u posebno carstvo. Gljive po broju vrsta spadaju u organizme na Zemlji, i predstavljaju posebno carstvo eukariota. Zajedničko za gljive i biljke su biljni hormoni, a zajedničko za gljive i ţivotinje su hitinski ćelijski zid, pigment melanin i enzimi prisutni u mitohondrijama. Danas je poznato oko 100.000 vrsta gljiva, a pretpostavlja se da ih ima 15 puta više. Nauka o gljivama - mikologija (od grčkog μύκης - gljiva, λόγος - nauka) - prošla je dug razvojni put. Njenim rodonačelnikom smatra se grčki filozof Aristotel, koji je dao prve opise gljiva. (Simpson DP., 1979). Proučavanje lekovitosti gljiva je skorijeg datuma, bar kada je u pitanju naša, Zapadna civilizacija. Kinezima su ta svojstva poznata već oko 4000 godina, a pisani dokumenti o lekovitim dejstvima datiraju od pre 2000 godina. Najnovija istraţivanja, koja se danas sprovode u Japanu, Kini, SAD, Rusiji pokazuju da su gljive koje su do sada smatrane samo konzumnim delikatesima, ali i one druge, nejestive, tvrde i drvenaste izuzetno bitan faktor u podizanju imuniteta u organizmu sisara. Sve vrste gljiva, koje danas nauka svrstava među lekovite, imaju izrazito anti-bakterijsko, antioksidativno, antivirusno i antikancerogeno svojsto. Sva nabrojana svojstva gljivama daju polisaharidi, triterpeni, razne kiseline (npr. ganodermička kiselina), ß- glukan, vitamini, alkaloidi. Gljive kao reducenti imaju izuzetno značajnu ulogu u prirodi. Razlaţući organsku materiju, one dolaze u neposredni kontakt sa mnogim otrovima, koji su za ţive organizme veoma opasni. Kako bi uspešno mogle da ostvare svoju ulogu koju imaju u ţivom svetu, gljive su stvorile odbrambene mehanizme u odnosu na mnoge otrove iz prirodnog okruţenja u kome se nalaze. Gljive se u prirodi, razlaţući organsku materiju, a pre svega drvenaste otpatke, susreću sa velikim količinama slobodnih radikala. Danas nauka zna da su slobodni radikali, kojih ima u svakom ţivom organizmu odgovorni za mnoge procese starenja i brţeg propadanja tih organizama. U drvetu ih ima najviše, kreću se kroz ţivo stablo udarajući molekule lignina. Putem lančanih sudara među njma, brţe nastaju čvrsti delovi stabla, neophodni za rast u visinu, ka sunčevoj svetlosti. Dok razlaţu lignin, gljive se bore sa tim slobodnim radikalima i fenolnim jedinjenjima na koje se on raspada. Gljive imaju izrazito antioksidativno dejstvo i inhibiraju slobodne radikale (Marjana Davidović, 2006). Cilj ovog master rada je određivanje antioksidativnih karakteristika odabranih gljiva iz roda Lactarius (Lactarius volemus, Lactarius piperatus, Lactarius semisanguifluus i Lactarius sanguifluus) u rastvaračima različite polarnosti. Rastvarači različite polarnosti ekstrahuju različite aktivne komponente, tj. antioksidanse. 1
Teorijski deo 2
2. Nutritivni sastav gljiva Tokom čitave ljudske civilizacije, gljive su konzumirane uglavnom zbog dopadljivog i jedinstvenog ukusa (Wani i sar., 2010). Danas su gljive cenjene ne samo zbog toga već i zbog njihovih hemijskih i nutritivnih karakteristika (Ouzouni i sar., 2009). Pored visokokvalitetnih proteina gljive su dobar izvor hranljivih supstanci: masti, vlakana, fosfora, kalijuma, kalcijuma, gvoţđa (Manzi i sar., 2001; Mendil i sar., 2005; Soylak i sar., 2005) i vitamina prvenstveno B grupe (tiamin, riboflavin, niacin i ergosterol (provitamin D2)) (Barros i sar., 2008a, b). Gljive su izvor nezasićenih masnih kiselina, koje su bitne i značajne za ishranu i zdravlje, a koje čine najmanje 70% ukupnog sadrţaja masnih kiselina gljiva. Različite studije na različitim vrstama gljiva su opisane kao namirnice bogate vodom, mineralima, proteinima i ugljenim hidratima sa niskim nivoom masti koje ih iz tog razloga čine pogodnim za niskokaloričnu ishranu. Pored nutritivnog bogatstva, gljive se odlikuju bogatstvom specifične arome i teksture. Budućnost široke upotrebe gljiva bazira se upravo na ekonomski pristupačnoj proizvodnji, značajnoj nutritivnoj vrednosti gljiva i sadrţaju medicinski aktivnih materija koje povoljno utiču na ljudski organizam (Barros i sar., 2008b). Veoma su prilagodljive na različitim staništima, zbog izuzetnog metaboličkog potencijala, a pre svega zbog raznovrsnosti i brojnosti enzimskih reakcija koje se odvijaju u njima. Mogu da sintetišu različite sekundarne metabolite, među kojima su neki otrovni, a neki lekoviti za čoveka. Hemijski sastav gljiva određuje njihovu hranljivu vrednost i organoleptičke osobine, a razlikuje se u zavisnosti od vrste gljive, podloge na kojoj se razvija, atmosferskih uslova, starosti i faze sakupljanja (Miles i Chang, 2004). Smatra se da gljive sadrţe gotovo sve aminokiseline, a raspon ukupnih aminokiselina kreće se od 93,6 230 g/kg, i od 39,7 86,8 g/kg za esencijalne aminokiseline. Pored nutritivnog značaja aminokiseline u gljivama doprinose i ukusu gljiva. Sadrţaj proteina zavisi od vrste gljiva, od supstrata na kome se razvijaju i vremena sakupljanja. Sastav i sadrţaj proteina i aminokiselina se značajno menja sa procesom prezervacije i kuvanja. Sadrţaj proteina tokom sušenja gljiva pri temperaturi od 40 C je skoro stabilan, dok se procesom termičke obrade sveţih gljiva sadrţaj proteina značajno menja, odnosno smanjuje (Barros i sar., 2007). Sadrţaj ukupnih lipida u gljivama je nizak. Ukupni lipidi gljiva sadrţe predstavnike svih klasa lipidnih jedinjenja uključujući: slobodne masne kiseline, monogliceride, digliceride, trigliceride, sterole, sterolne estre i fosfolipide. Desetine masnih kiselina su identifikovane u lipidnim frakcijama gljiva. Visok udeo nezasićenih masnih kiselina u gljivama jeste značajan faktor u pogledu osobine koje ukazuju da gljive predstavljaju zdravu hranu (Miles i Chang, 2004). Procenat ugljenih hidrata je značajan i predstavlja od 50 do 65% sadrţaja gljiva (Wani i sar., 2010). Od ugljenih hidrata najviše su zastupljene pentoze (ksiloze, riboze) i heksoze 3
(glukoza, fruktoza, galaktoza, manoza), dominantan je šećerni alkohol manitol, šećerne kiseline, amino šećeri i hitin (Miles i Chang, 2004). Mineralne komponente gljiva mogu se podeliti na makroelemente i mikroelemente. Makroelementi su: K, Na, Mg, P i S, dok su mikroelementi: Cu, Co, Fe, J, Mn, Mo, Zn i Se. Mikroelementi, su esencijalni sastojci hrane, neophodni za normalno funkcionisanje organizma, a potrebni su u vrlo malim količinama. Sadrţaj makro konstituenata kao što su: natrijum, kalijum i fosfor je pribliţno konstantan, dok se sadrţaj kalcijuma, magnezijuma i sumpora menja u zavisnosti od sastava supstrata na kome se gljiva razvija (Rudawska i Laski, 2005). 4
3. Vrste gljiva Lactarius Mlečnice (Lactarius) imaju prljavo beo do bledo smedj šešir. Listići ne dopiru do drške. Sve vrste imaju u svim delovima mlečni sok (beo, ţuckast, narandţast, zelen, ljubičast, bezbojanu zavisnosti od vrste), koji pri minimalnoj povredi gljive curi u vidu kapljica. Mlečni sok se obično oksiduje u kontaktu sa vazduhom u zelenkastu ili tamno braon boju. Gljive sa belim sokom su ljute i slabijeg kvaliteta, one sa narandţastim su delikatesne. Krte su i lomljive. 3.1. Lactarius piperatus Među ljutim mlečnicama postoji jedna sekcija piperate - paprenjače, koja se smatra jestivom. To su bele, ne mnogo velike gljive, čiji su šeširi postavljeni na visokim i tankim drškama. Predstavnik je Lactarius piperatus (Slika 1 i 2). Lactarius piperatus Klasa Red Porodica Rod Vrsta Agaricomycetes Russulales Russulaceae Lactarius piperatus Slika 1. Taksonomija gljive Lactarius piperatus Klobuk je od 5-15cm. U mladosti je konveksan, kasnije se raširi i udubi poput levka. Koţica klobuka je glatka, moţe biti sa sitnim naborima bez sjaja. Klobuk je potpuno bele boje, vrlo mesnat i suv. Listići neobično gusti, uski, prema rubu klobuka mogu biti toliko stisnuti da se vijaju, račvaju i lagano se spuštaju niz stabljiku, U početku su bele boje, starenjem poprimaju krem - ţutu nijansu, a kasnije mogu biti smeđe sa zelenkastim mrljama. Stabljika je visoka do 12cm, debljine do 3cm, puna, tvrda, gola i glatka. Meso je prilično debelo, tvrdo, zrnasto i trošne strukture. Na povređenim mestima ispušta dosta belog mlečnog soka, koji obično oksiduje u kontaktu sa vazduhom u zelenkastu ili tamno braon boju. Mlečni sok i meso su jako ljutog ukusa, bez mirisa. 5
Njeno stanište je takvo da raste svuda po šumama od jula do kraja jeseni. Jestiva je ali zbog drastično ljutog ukusa koji zadrţava i nakon kuvanja, dosta istraţivača piše da je sumnjiva. Moţe se osušiti i samleti u prah pa se koristiti kao začin u jelima (Romano Božac, 1978). Slika 2. Lactarius piperatus 3.2. Lactarius volemus Presnac ili presna mlečnica ( Lactarius volemus) je vrsta jestive gljiva iz porodice Russulaceae (Slika 3 i 4). Slika 3. Lactarius volemu 6
Klobuk je narandţastosmeđ, kasnije svetliji, u sredini tamniji i udubljen. U početku ima uvijen gladak rub, podvijen, i širok od 5-12cm. Listići su bledoţuti, kasnije potamne. Jako su gusti i tanki. Stabljika je visine do 12 cm a debljine do 3cm. Ona je valjkastog i pravilnog oblika, čvrsta, puna, a pre svega glatke površine. Stabljika je sličnih boja kao i klobuk, ali obično svetlijih nijansi, a u vrhu klobuka blizu listića belkaste boje. U samoj bazi stabljika je obično malo suţena i na tom mestu je isto beličaste boje. Meso je prilično debelo, čvrsto, kompaktno, na jači pritisak lako puca i odvaja se u većim komadima. Na povređenim mestima ispušta beli mlečni sok, koji obično oksiduje u kontaktu sa vazduhom u blago smeđu boju. Mleko je lepljivo, i vrlo karakterističnog mirisa koji podseća na ribe (najviše na haringe), kuvane rakove ili školjke. Ukus mesa je sladak, blag i prijatan (Matija Josipović, 2012). Rasprostranjena je u Evropi, Aziji i Severnoj Americi. Raste pojedinačno ili u grupama. U Aziji se prodaje i na pijacama. Jestiva je, vrlo cenjena, moţe se jesti i sirova. Slabo podnosi zamrzavanje i sušenje. Lactarius volemus Klasa Red Porodica Rod Vrsta Agaricomycetes Russulales Russulaceae Lactarius volemus Slika 4. Taksonomija gljive Lactarius volemus 7
3.3. Lactarius sanguifluus Lactarius sanguifluus poznatija kao Krvna mlečnica ili Vrsovnica. Jedna je od najukusnijih gljiva iz porodice Russulaceae (Slika 5 i 6). Slika 5. Lactarius sanguifluus Klobuk je veličine od 6-15cm, širok. Pojedini primerci mogu biti bledo narandţasti, dok drugi mogu biti dosta tamniji. Kod starijih primeraka javljaju se zelenkaste mrlje, sa manje ili više vidljivim koncentričnim krugovima. Listići su vrlo gusti, lagano se spuštaju niz stabljiku. U mladosti su listići narandţaste boje, dok starenjem poprimaju srvenoljubičastu nijansu. Stabljika visine do 7cm a debljine do 3 cm, bela, sa narandţastom nijansom a često i boje mesa. Zrnaste strukture koja na povređenim mestima ispusta mleko crvene boje poput krvi, koje obično oksiduje u kontaktu sa vazduhom u smeđecrvenu boju. Raste tokom leta i jeseni, isključivo u borovoj šumi (Heilman-Clausen J. i sar., 1998). Na stabljici se nalaze nepravilne jame tamnije boje po kojima se razlikuje od vrste Lactarius semisanguifluus. Jestiva je, slatkog (voćnog) ukusa, mada za pojedince preslatka. Ne podnosi kuvanje, mogu se zamrznuti ali su najbolje ako se pripreme sveţe (pečenje, pohovanje ili ukiseljavanje). 8
Lactarius sanguifluus Klasa Red Porodica Rod Vrsta Agaricomycetes Russulales Russulaceae Lactarius sangifluus Slika 6. Taksonomija gljive Lactarius sanguifluus 3.4. Lactarius semisanguifluus Lactarius semisanguifluus je jestiva gljiva iako nema preterano lep ukus. Sinonim za nju je polukrvava mlečnica ili Brinovka (Slika 7 i 8). Spada u porodicu Russulaceae. Slika 7. Lactarius semisanguifluus Klobuk je širine od 3 do 6 cm, izrazito išaran koncentričnim krugovima. Udubljen, sa podvijenim ivicama. Boja klobuka je narandţasta, dok starenjem preovladava zelena boja. Listići 9
gusti, silaze niz stabljiku. Narandţaste su boje a prema osnovi crvenkasti. Stabljika je kratka 2-3cm, u nijansama klobuka. Meso je relativno tanko, pastelno narandţasto a prema ivicama narandţasto, a u jezgru stabljike bele boje. Na preseku meso ispusta naranđasto mleko, koje nakon par minuta postaje krvavo crveno, nakon toga prelazi u vinsko crveno, i na kraju pozeleni. Mleka ima najviše u donjem delu stabljike. Gorkog, ljutkastog ukusa, koje prilikom prţenja gubi ţestinu i dobija na kvalitetu. Njeno stanište je pvenstveno u planinskoj oblasti, kao i u jelinim i borovim šumama. Raste naročito sa spoljne strane šume, gde se moţe grupisati u linije i od nekoliko kilometara (Uzelac B., 2009). Lactarius semisanguifluus Klasa Red Porodica Rod Vrsta Agaricomycetes Russulales Russulaceae Lactarius semisangiufluus Slika 8. Taksonomija gljive Lactarius semisanguifluus 10
4. Antioksidativna aktivnost 4.1. Oksidativni stres Opstanak aerobnih organizama na Zemlji uslovljen je prisustvom molekulskog kiseonika (O 2 ). U metaboličkim procesima u ćelijama ovih organizama najveći deo kiseonika potpuno se redukuje do vode u respiratornom lancu ili se transformiše enzimskim reakcijama (Kojić, 2009). Međutim, jedan mali deo (2-3 %) ukupnog kiseonika u ćeliji se transformiše u reaktivne kiseonične oblike (ROS - Reactive Oxygen Species, Slika 9), koji su u stanju da reaguju sa osnovnim ćelijskim biomolekulima i strukturama i da izazovu njihovu inaktivaciju (Halliwell i Gutteridge, 1985, Mimica - Dukić, 1997). To su metaboliti nastali iz moleklula kiseonika, sadrţe atome kiseonika i poseduju veću reaktivnost od kiseonika u osnovnom molekulskom stanju (Hu, 2001). Slika 9. Uzrok nastajanja ROS-a i njegovo dejstvo Produkcija kiseoničnih radikala u organizmu odvija se u nizu kataboličkih i anaboličkih procesa: u respiratornom lancu, oksidacijom ćelijskih biomolekula (tiola, hidrohinona, kateholamina, oksihemoglobina), dejstvom enzima (ksantin oksidaze, lipooksigenaze, prostaglandin sintetaze i dr.), dejstvom dvovalentnih metalnih jona. (Sayre i sar., 1999; Cadenas 11
i Davies, 2000; Božin, 2009). Hiperprodukcija reaktivnih kiseoničnih oblika moţe biti indukovana različitim endogenim (process respiracije, aktivnost fagocita, autooksidacija biomolekula) i egzogenim (jonizujuće i UV-zračenje, kontaminirani vazduh, alkohol, ksenobiotici, pojedini lekovi, itd.) faktorima (Gutteridge i sar., 1985; Arai i sar., 1987). Nekoliko jakih oksidanasa se formira u toku odvijanja metaboličkih procesa, u krvnim i drugim ćelijama oranizma: superoksidni anjon radikal (O 2 - ), vodonik peroksid (H 2 O 2 ), peroksil radikal (ROO ) i hidroksil radikal (OH ). Hemijska jedinjenja koja mogu da se transormišu u potencijalno toksične kiseonične vrste u organizmu nazivaju se pro-oksidansi. Sa druge strane, jedinjenja koja smanjuju štetan uticaj pro-oksidanasa, njihovo stvaranje i reakcije su antioksidansi (NADPH, GSH, vitamin C i vitamin E). Tokom evolucije razvijeni su zaštitni mehanizmi koji sprečavaju nastanak ili razlaţu već nastale prooksidativne vrste, popravljaju i menjaju oštećene molekule. Pod normalnim uslovima produkcija prooksidativnih vrsta je u ravnoteţi sa antioksidativnom zaštitom organizma. Međutim, pod uticajem različitih endogenih i/ili egzogenih faktora koji deluju stresno, ova ravnoteţa moţe da se naruši, odnosno moţe da dođe do povećane produkcije prooksidanata i/ili smanjenja antioksidativne zaštite organizma. Ovakvo stanje naziva se oksidativni stres (Slika 10), i uzrok je mnogih oboljenja (arteroskleroza, kancer, kardiovaskularna oboljenja, astma, artitis, gastritis, dermatitis, dijabetes, bolesti jetre, bolesti bubrega, zapaljenski procesi, Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest itd). Slika 10. Oksidativni stress 12
4.2. Slobodni radikali Slobodni radikali su hemijske vrste koje poseduju jedan (ili više) nesparenih elektrona. Zbog toga što imaju nesparene elektrone vrlo su reaktivni i neselektivni. Mogu biti elektroneutralni ali i pozitivno ili negativno naelektrisani (radikal katjoni i radikal anjoni). Slobodni radikali nastaju homolitičkim raskidanjem postojeće hemijske veze (termolizom, fotolizom, zračenjem visoke energije) ili oksidoredukcionim procesima. Reaktivne vrste se dele na reaktivne slobodnoradikalske i neradikalske (oksidaciona sredstva koja lako prelaze u slobodne radikale) vrste. Najvaţnije reaktivne vrste kiseonika (ROS -od engl. reactive oxygen species), hlora (RCS - od engl. reactive chlorine species) i azota (RNS - od engl. reactive nitrogen species) date su u Tabeli 1. (Halliwel i Whiteman, 2004). Tabela 1. Najvaţnije reaktivne vrste Slobodni radikali Reaktivne kiseonične vrste (ROS) superoksid anjon, O 2 - hidroksi radikal, OH hidroperoksidni radikal, HO 2 peroksi radikal, RO 2 alkoksi radikal, RO karbonatni radikal, CO 3 ugljendioksidni radikal, CO 2 Neradikalski oblici vodonik peroksid, H 2 O 2 hipobromna kiselina, HOBr hipohlorna kiselina, HOCl ozon, O 3 singletni kiseonik, 1 O 2 organski peroksid, ROOH peroksinitrit, ONOO peroksinitritna kiselina, ONOOH Reaktive hloridne vrste (RCS) atomski hlor, Cl hipohlorna kiselina, HOCl nitril (nitronijum) hlorid, NO 2 Cl hloramini Reaktivne azotne vrste (RNS) azotmonoksidni radikal, NO azotdioksidni radikal, NO 2 azotasta kiselina, HNO 2 nitrozo katjon, NO + nitroksidni anjon, NOdinitrogen tetroksid, N 2 O 4 dinitrogen trioksid, N 2 O 3 peroksinitrit, ONOO peroksinitritna kiselina, ONOOH nitronijum (nitril) katjon, NO 2 + alkilperoksinitriti, ROONO nitril (nitrinijum) hlorid, NO 2 Cl 13
Nastanak slobodnih radikala u ţivim ćelijama je vezan kako za različite procese u spoljašnjoj sredini (jonizujuće, ultraljubičasto i toplotno zračenje, biohemija azotovih oksida i dr.) tako i za procese koji se odigravaju u samoj ćeliji. Ti procesi obuhvataju: - oksidativnu fosforilaciju (u mitohondrijama), - oksidativnu hidroksilaciju (u mikrozomima), - fagocitozu, - katalitiĉke reakcije nekih enzima (oksidaza), - procese lipidne peroksidacije, - reakcije oksidoredukcije u prisustvu metala sa promenljivom valencom i dr. (Koraćević i sar., 2003) Slobodni radikali kao izuzetno reaktivne hemijske vrste dovode do oksidativnog oštećenja ćelijskih struktura velikim brojem mehanizama: - peroksidacija polinezasidenih masnih kiselina praćena je poremećajem propustljivosti i fluidnosti membrana, - oksidacija tiolnih grupa enzima dovodi do inaktivacije enzima, - obrazovanje unakrsnih veza između MDA i fosfolipida odnosno proteina u ćelijskoj membrani menja adaptivnu sposobnost biomembrana, - oksidativno cepanje molekula nukleinskih kiselina dovodi do mutacija i kancerogeneze. Svaki tip molekula moţe biti oštećen ovim procesom, što moţe imati mnoge negativne posledice. Lipidna peroksidacija je najizrazitiji negativni fenomen u delovanju slobodnih radikala i predstavlja autokatalitički, najčešće ireverzibilan proces. Peroksidacija polinezasićenih masnih kiselina prolazi kroz stadijum inicijacije, stadijum propagacije (stadijum dalje peroksidacije i grananja reakcija oksidacije) i stadijum terminacije (Slika 11). Ovaj autokatalitički ciklus se moţe propagirati sve dok se lanac reakcija ne prekine sjedinjavanjem dva radikala u neradikalski proizvod. Međutim, najčešće dolazi do stacionarnog, ali ne i do trajnog zaustavljanja procesa jer akumulirani proizvodi lipidne peroksidacije mogu biti sami po sebi reaktivni. Inicijaciju lipidne peroksidacije moţe pokrenuti bilo koji oksidans sposoban da oduzme atom vodonika koji se nalazi u α-poloţaju od mesta dvostruke veze u molekulu masne kiseline iz lipidne membrane. Od svih kiseoničnih radikala najveći oksidacioni potencijal ima hidroksilradikal pa je on najčešće odgovoran za inicijaciju ovog procesa. U fazi inicijacije pored alkil radikala nastaju i drugi primarni produkti lipidne peroksidacije (konjugovani dieni, peroksidni radikali i lipidni hidroperoksidi). Druga faza ovog procesa predstavlja degradaciju nestabilnih primarnih produkata pri čemu se dobijaju brojni sekundarni produkti: kratkolančani ugljovodonici, aldehidi i ketoni, kao i krajnji proizvod lipidne peroksidacije malon dialdehid (MDA). Pored brojnih sekundarnih proizvoda stvaraju se i novi radikali koji omogućavaju nastavak slobodnoradikalske reakcije i uslovljavaju da se lipidna peroksidacija lančano ponavlja. Vrlo reaktivni sekundarni proizvodi, posebno MDA, reaguju sa slobodnim SH i NH 2 grupama aminokiselina, peptida, proteina, 14
nukleotida i fosfolipida dovodeći do kovalentne modifikacije ovih makromolekula što za posledicu ima gubitak njihove funkcije. Slika 11. Lipidna peroksidacija Lipidna peroksidacija se moţe kontrolisati ili ukloniti korišćenjem sintetičkih antioksidanasa kao što je BHT (butilovani hidroksi toluen) i BHA (butilovani hidroksi anizol) koji se hrani dodaju kao aditivi. Slobodni radikali nastaju: - termolizom, - elektromagnetnom radijacijom, - redoks reakcijama, - enzimskim reakcijama, - hemijskim procesima. Slobodni radikali nastaju (Slika 12) pucanjem veza unutar molekula u ćelijama organizma, a pod uticajem različitih faktora, kao što su: pušenje, izloţenost jonizirajućem zračenju, UV zracima, zagađenom vazduhu, kao posledica metaboličkih procesa i upale. 15
Slika 12. Nastajanje slobodnih radikala Kako bi se što efikasnije odbranili od negativnih efekata slobodnih radikala, potrebno je izbegavanje izlaganja delovanju slobodnih radikala, kao i unošenju što većih količina antioksidansa u organizam. Slobodni radikali oštećuju sve ćelijske strukture: ćelijsku membranu, ćelijske organele, a najveća šteta nastaje kada dođe do oštećenja genetskog materijala, DNK (Slika 13). Promene u genima vode ka mutacijama, a mutacije ćelija mogu dovesti i do nastanka malignh oboljenja. Oštećenjem zidova krvnih sudova omogućava se razvoj i napredovanje ateroskleroze. Ako kancerogene ćelije počnu da se razvijaju neograničeno nastaju tumori. U poslednje vreme došlo je do epidemije malignih oboljenja, a pretpostavlja se da je to velikim delom zbog mnogo veće izloţenosti stanovništva zagađenjima vode, vazduha, hrane i ţivotom pod stalnim stresom. Slika 13. Delovanje slobodnih radikala na zdravu ćeliju Slobodni radikali se neprekidno stvaraju i neutrališu u organizmu. Problem nastaje kada se oni stvaraju većom brzinom nego što organizam moţe da ih neutrališe, a do toga dolazi u uslovima stresa, kod povećanih fizičkih i umnih naprezanja, pod dejstvom otrova, pesticida, herbicida, duvanskog dima, zračenja, izduvnih gasova, prekomernog sunčanja, nekih lekova. Kada se slobodni radikali stvaraju većom brzinom nego što organizam moţe da ih neutrališe, 16
nastaju uslovi za propadanje čelija i razvoj bolesti. Mnoga oboljenja nerava, krvnih sudova, srca, tumori povezuju se upravo sa povećnom izloţenošću nekim štetnim agensima, koji su preko stvaranja slobodnih radikala doveli do razvoja bolesti. Slobodni radikali takođe ubrzavaju starenje organizma, jer dovode do ubrzanog propadanja ćelija (Todorović M. i sar., 1997). 4.3. Antioksidansi Najšire prihvaćena definicija bioloških antioksidanasa jeste ona koju je dao Halliwell (1990), a prema kojoj su antioksidansi "supstance koje prisutne u malim koncentracijama u odnosu na supstrat (biomolekul) koji se oksiduje, značajno usporavaju ili sprečavaju oksidaciju tog supstrata". Antioksidansi neutrališu slobodne radikale donirajući im jedan svoj elektron, ali otpuštanjem elektrona oni ne postaju slobodni radikali (Slika 14). Slika 14. Mehanizam stabilizacije slobodnog radikala antioksidansom Delovanje antioksidanasa (Aruoma, 1996) zasniva se na njihovoj sposobnosti da: - deluju kao "skevindţeri" slobodnih radikala, odnosno donori elektrona ili H-atoma, - kompleksiraju jone metala, sprečavajuci njihovu katalitičku funkciju u procesima, - razgrađuju hidro-perokside lipida, transformišuci ih u neradikalske vrste, - sprečavaju dejstvo singletnih oblika kiseonika, - inhibiraju neke enzime, - pokazuju sinergističke efekte, - redukuju neka jedinjenja. Shi i sar. (2001) klasifikovali su antioksidanse prema nivou i načinu delovanja u ljudskom organizmu na: preventivne antioksidante, "skevndţer" antioksidanse i "reparacione" antioksidanse. Preventivni antioksidansi sprečavaju nastanak slobodnih radikala. "Skevendţer" antioksidansi poseduju sposobnost da "hvataju" slobodne radikale. "Reparacioni" antioksidansi 17
deluju posebnim mehanizmima, obnavljujući ili uklanjajući oštećene vitalne biomolekule koji nastaju u uslovima oksidativnog stresa. U "reparacione" antioksidanse ubrajaju se fosfolipaze, proteaze, enzimi koji obnavljaju DNK, transferaze, itd. Prema rastvorljivosti ovi antioksidansi se dele na hidrosolubilne (vitamin C, mokraćna kiselina, bilirubin, albumin, glutation, neki polifenoli) i liposolubilne (vitamini E i A, karotenoidi, neki polfenoli) (Vaya i sar., 2001). Prema mestu nastajanja antioksidansi značajni za ljudski organizam dele se na: endogene i egzogene. Endogeni antioksidansi predstavljaju antioksidanse koji nastaju u ljudskom organizmu, dok se egzogeni unose putem hrane ili lekova. Fenolna jedinjenja su jedna od najvaţnijih grupa prirodnih egzogenih antioksidanasa, čija je aktivnost uslovljena strukturnim karakteristikama. Skorija istraţivanja pokazuju da što je ishrana bogatija prirodnim antioksidansima to je manja učestalost bolesti u ispitivanoj populaciji (Krishnaiah i sar. 2011). Takođe je pokazana veza između reaktivnih kiseoničnih vrsta i raznih degenerativnih bolesti uključujući: dijabetes, kancer, artritis, kardiovaskularne bolesti, Alchajmerove i Parkinsonove bolesti, Daunovog sindroma, starenja i dugih (Aruoma, 2003). Brojne studije su potvrdile korisno dejstvo prirodnih antioksidanasa (Denisov i Afanasev, 2005). Antioksidansi mogu biti prirodne ili sintetičke supstance koje imaju sposobnost da se suprotstave oksidaciji ili da inhibiraju reakcije koje iniciraju reaktivne vrste. Zbog toksikoloških razloga prekomerna upotreba sintetičkih antioksidanasa je dovedena u pitanje, a zahtevi potrošača su usmereni ka korišćenju prirodnih antioksidanasa (Slika 15) (Moure i sar., 2001). Vitamin C Vitamin E (α-tokoferol) Kvercentin Koenzim Q 10 (ubihinon) Slika 15. Neki prirodni antioksidansi 18
Najčešće korišceni sintetički antioksidansi u prehrambenim proizvodima su butilovani hidroksianizol (BHA), butilovani hidroksitoluen (BHT), propilgalat (PG) i tercbutilhidrohinon (TBHQ) (Slika 16). Slika 16. Neki sintetički antioksiodansi 4.3.1. Primarna antioksidativna zastita Ţivot u sredini bogatoj kiseonikom i odvijanje aerobnog metabolizma ne bi bili mogući bez prisustva antioksidativnih sistema zaštite od reaktivnih kiseoničnih metabolita. Tokom evolucije došlo je do razvoja enzima, koji zajedno sa određenim jedinjenjima manje molekulske mase sačinjavaju sistem zaštite od oksidacionih oštećenja. Superoksid dismutaza, glutation peroksidaza i katalaza čine enzimske siteme koji učestvuju u primarnoj antioksidativnoj zaštiti. Superoksid-dismutaze (SOD) predstavljaju grupu enzima prisutnih u svim aerobnim organizmima. Imaju ulogu u procesima katalize reakcije dismutacije superoksid anjon-radikala do vodonik peroksida i molekulskog kiseonika (Reakcija 1). Premda obavljaju istu funkciju, postoji više vrsta superoksid-dismutaza koje se razlikuju po vrsti metala koji se nalazi u aktivnom centru (Cu, Mn, Zn, Ec). 2O 2- + 2H + H 2 O 2 + O 2 Cu, Zn-SOD (Citosolna superoksid dismutaza) se nalazi u svim ćelijama, gde je uglavnom locirana u citosolu, dok aktivno dejstvo ispoljava i u lizozomima, peroksizomima, jedru i prostoru između unutrašnje i spoljašnje membrane mitohondrija. Cu predstavlja aktivno redoks mesto, a Zn je vaţan za strukturnu stabilizaciju aktivnog mesta. 19
Mn-SOD (Mitohondrijska superoksid dismutaza) ima formu tetramera i lokalizovana je u mitohondrijama. Funciju ispoljava u procesima diferencijacije ćelija, genezi tumora, kao i zaštiti od plućne intoksikacije izazvane hiperoksijom. Ec-SOD (Vanćelijska (ekstracelularna dismutaza)) je lokalizovana u vanćelijskom prostoru. Ova forma takođe sadrţi Cu i Zn u svom aktivnom centru. Novija istraţivanja ukazuju na činjenicu da je ovaj enzim prisutan u dva oblka, ali da je samo jedan od njih aktivan. Katalaza (CAT) je tetramer koji u svakoj subjedinici sadrţi hem grupu kao deo aktivnog centra enzima. Katalizuje razgradnju vodonik-peroksida do molekulskog kiseonika i vode. Reakcija je dvostepena i iziskuje vezivanje dva molekula vodonik-peroksida: CAT + H 2 O 2 Jedinjenje I Jedinjenje I + H 2 O 2 CAT + H 2 O + O 2 Peroksidaze su velika grupa enzima koje katalizuju reakciju razgradnje vodonikperoksida i drugih organskih peroksida: H 2 O 2 + 2GSH GPx 2H2 O + GSSG Glutation peroksidaza (GPx) je tetramerni enzim sa selenom u aktivnom centru koji uklanja vodonik-peroksid i pri niskim koncentracijama (kada je mala verovatnoća za odigravanje Reakcija 2). Da bi mogla kontinuirano da se odvija Reakcija 3 neophodna je stalna regeneracija oksidovanog oblika glutationa (GSSG) što se postiţe reakcijom koju katalizuje glutationreduktaza (GR) : GSSG + 2NADPH + H + GR 2GSH + NADP + Glutation S-transferaza je enzim koji katalizuje vezivanje glutationa preko sulfhidrilnih grupa za elektrofilne centre hidrofobnih molekula. Na ovaj način molekuli postaju rastvorljiviji u vodi i lakše se transportuju do vakuole ili apoplasta. Među supstratima ovih enzima se nalaze neki sekundarni biomolekuli biljaka kao i veliki broj ksenobiotika. Ovi enzimi su odgovorni za detoksifikaciju elektrofilnih i veoma citotoksičnih proizvoda lipidne peroksidacije izazvane oksidativnim stresom (Stojković M., 2014). U sistem primarne antioksidativne zaštite ubrajaju se i neenzimske supstance kao što su proteini transferin i ceruloplazmin koji imaju bitnu ulogu u transportu metalnih jona, zatim albumin, mokraćna kiselina i bilirubin. Svi navedeni primarni antioksidanti čine koordiniranu odbranu organizma od reaktivnih radikalskih oblika. 20
4.3.2. Sekundarna antioksidativna zaštita Sistem sekundarne antioksidativne zaštite čine brojna niskomolekularna jedinjenja različitog porekla i karaktera, kao što su ubihinon, L-askorbinska kiselina, tokoferoli, karotenoidi, fenoli i njihove kiseline, flavonoidi, derivati hidroksicinamata i dr. (Mimica-Dukić, 1997). Kako je struktura ovih jedinjenja veoma raznovrsna, tako su različiti i mehanizmi kojima ona ostvaruju svoju aktivnost u sistemu antioksidativne zaštite. Najčešće su to hvatači ("skevendţeri") slobodnih radikala, donori protona, inhibitori enzimskih sistema, helatori jona prelaznih metala, itd. U sistem sekundarne antioksidativne zaštite mogu se ubrojiti i enzimi koji aktivno učestvuju u otklanjanju oksidativnih oštećenja nukleinskih kiselina, lipida i proteina, kao što su: endo i egzonukleaze, DNK polimeraze i ligaze, fosfolipaza A2, GSHPx i fosfolipidzavisna GSHPx, glikozilaze, kao i brojni proteolitički enzimi. Ovi enzimi "popravljaju" oštećene molekule DNK, uklanjaju oksidovane masne kiseline membranskih lipida i kroz procese resinteze obnavljaju oksidovane aminokiseline i proteine. Askorbinska kiselina (vitamin C) uklanja superoksid anjon-radikal i vodonik-peroksid pri čemu nastaje semidehidro-askorbat koji je radikal ali nije reaktivan. Reakcijom dva molekula dobija se askorbinska i dehidro-askorbinska kiselina. Slika 17. Oksidacija askorbinske kiseline -tokoferol (vitamin E) kao liposolubilna komponenta zaštite od oksidacionih oštećenja reaguje sa slobodnim radikalima u ćelijskoj membrani i pri tome nastaje radikal vitamina E. Slaba reaktivnost ovog radikala je posledica delokalizacije nesparenog elektrona u aromatičnom jezgru. Vitamin C redukuje radikal vitamina E na prelazu iz lipidne u vodenu fazu (Stojković M., 2014). Slika 18. -tokoferol 21
4.3.2.1. Fenolna jedinjenja Fenolna jedinjenja predstavljaju široko rasprostranjenu grupu biljnih metabolita koja mogu biti vrlo jednostavne strukture, kao što su fenolne kiseline ili vrlo sloţene strukture, kao što su kondenzovani tanini. Zajednička karakteristika fenolnih jedinjenja je da sadrţe aromatičan prsten sa jednom ili više hidroksilnih grupa (koje mogu biti metilovane ili esterifikovane). Do danas je identifikovano više od hiljadu različitih prirodnih fenola, u slobodnom obliku ili češće u obliku glikozida (Leucuta i sar., 2005). Monosaharidi koji najčešće ulaze u sastav glikozida su: glukoza, galaktoza, arabinoza, ramnoza, ksiloza, manoza, glukuronska i galakturonska kiselina, pored toga šećeri mogu biti prisutni u obliku: mono-, di-, tri-, ili tetra-saharida. Fenolna jedinjenja su veoma značajna kako za organoleptičke osobine hrane tako i za njene pozitivne zdravstvene efekte. Najvaţnija dejstva fenolnih jedinjenja su: antioksidativno, antibakterijsko i antivirusno (Lampe, 1999). Neka polifenolna jedinjenja imaju ulogu biljnih pigmenata. Fenolna jedinjenja su integralni deo strukture ćelijskog zida, uglavnom kao polimeri (lignini). Ove strukture sluţe kao mehanička barijera u odbrani od mikroorganizama. Lignini su, posle celuloze, najzastupljenije organske strukture na Zemlji (Wallace i Fry, 1994; Strack, 1997). Fenolna jedinjenja se akumuliraju uglavnom u ćelijskim zidovima (Guern i sar., 1987; Monties, 1989) i to najvećim delom na površini ploda (epidermalni i subepidermalni slojevi), jer biosinteza ovih jedinjenja zavisi od svetlosti (Wollenweber, 1994; Macheix i sar., 1990). Akumulacija fenolnih jedinjenja varira i u zavisnosti od fiziološkog stanja biljke, kao rezultat ravnoteţe između biosinteze i daljeg metabolizma (Macheix i sar., 1990; Harborne, 1994). Brojna istraţivanja potvrđuju da je koncentracija polifenolnih jedinjenja manja u zrelom plodu, osim kod crvenih plodova kod kojih se flavonoidi i antocijani akumuliraju tokom sazrevanja (Britton, 1983; Macheix i sar., 1990). Iz stabljika, lišća, cvetova i plodova nekih biljaka, klica kukuruza, zobi, pirinčanog semena, kao i mnogih začinskih biljaka ekstrahovani su sirovi ekstrakti jakih antioksidativnih osobina. U ovim ekstraktima, prisutna su različita organska jedinjenja, od kojih dominantnu ulogu pri oksidativnom delovanju imaju fenolna jedinjenja. Smatra se da se deo antioksidativnog potencijala mnogih vrsta biljaka moţe pripisati prisustvu fenolnih jedinjenja. Biljni polifenoli se ne smatraju uvek pravim antioksidansima, ali je u mnogim in vitro istraţivanjima dokazan antioksidativni potencijal fenolnih materija u vodenoj fazi, "skevendţing" radikala, kao i pojačanje rezistentnosti prema oksidaciji lipoproteina male gustine, koji ukazuju na patogenezu u slučaju koronarnih bolesti. 22
Postoje različite klasifikacije fenolnih jedinjenja i većina je zasnovana na hemiskoj strukturi mada su za svaku klasu poznati i putevi njihove biosinteze. Ova jedinjenja se mogu podeliti u sledeće grupe (Hurtado-Fernández i sar. 2010): 1. Prosti fenoli - Fenolne kiseline (derivati benzoeve i cimetne kiseline) - Kumarini 2. Polifenoli - Flavonoidi (flavanoni, flavoni, flavonoli, katehini, antocijani ) - Tanini (hidrolizabilni i kondenzovani) Međutim, najčešća klasifikacija se zasniva na broju ugljenikovih atoma vezanih za osnovni skelet fenola (Robards i sar., 1999), što je prikazano u Tabeli 2. U literaturi se najčešće kao prirodni izvori polifenolnih jedinjnja spominju začinsko i lekovito bilje. Biosinteza i akumulacija polifenolnih jedinjenja se kontroliše, endogeno, tokom rasta (Macheix i sar., 1990; Strack, 1997) ili se reguliše egzogenim faktorima kao što su svetlost, temperatura, oštećenja i drugi stresni faktori (Dixon i Paiva, 1995). Fenilalanin, koji nastaje biosintetskim putem šikimske kiseline, je prekursor većine polifenolnih jedinjenja u biljkama. Hidroksicimetne kiseline, naročito njihovi estri sa koenzimom A, su najčešće strukturni elementi polifenolnih jedinjenja, kao što su estri i amidi cimetne kiseline, lignini, flavonoidi i kondenzovani tanini (Macheix i sar., 1990). 23
Tabela 2. Klasifikacija fenolnih jedninjena Osnovni skelet Klasa Primer jedinjenja C 6 prosti fenoli benzohinoni katehol, hidrohinon, rezorcinol C 6 -C 1 fenolne kiseline 4-hidroksibenzoeva, salicilna C 6 - C 2 fenilsirćetna kiselina 4-hidroksifenilsirćetna kiselina C 6 - C 3 cimetna kiselina fenilpropeni kumarini hromoni ferulna, kafena, kumarna eugenol, miristicin, umbeliferon, eskuletin eugenin C 6 - C 4 naftohinoni juglon C 6 - C 1 -C 6 C 6 - C 2 - C 6 C 6 - C 3 - C 6 flavonoidi ksantoni stilbeni antrahinoni flavanoni flavoni flavonoli katehini antocijani halkoni resveratrol naringenin, hesperetin apigenin, luteolin kvercetin, kaempferol katehin, epikatehin galokatehin, epigalokatehin pelargonodin, cijanidin (C 6 - C 3 ) 2 lignini pinoresinol (C 6 - C 3 - C 6 ) 2 biflavonoidi agatisflavon Polifenolna jedinjenja ispoljavaju antioksidativnu aktivnost u biološkim sistemima na više načine i to: - predajom H atoma, direktnim vezivanjem ("hvatanjem") slobodnih kiseoničnih i azotnih radikala, - heliranjem prooksidativnih metalnih jona (Fe 2+, Cu 2+, Zn 2+ i Mg 2+ ), - aktiviranjem antioksidacijskih enzima, - inhibicijom prooksidativnih enzima (lipoksigenaza, NAD(P)H oksidaza, ksantinoksidaza, oksidaza, enzimi citohroma P-450). 24
4.3.2.1.1. Fenolne kiseline Fenolne kiseline su sekundarni metaboliti rasprostranjeni iskljuĉivo u biljnom svetu. Ova jedinjenja su zasluţna za jedinstven ukus i aromu povrća i voća (Tomas-Barberan i Espin, 2001). Fenolne kiseline su jedinjenja koja obuhvataju veliku gupu široko rasprostranjenih hidroksi derivata cimetne (Slika 19) i benzoeve kiseline (Slika 20). Hidroksicimetne kiseline se u biljkama mogu naći u slobodnom obliku ili u obliku mnogobrojnih estara, kao na primer sa hinskom kiselinom (hlorogenska kiselina), vinskom kiselinom (kaftarna kiselina), glukozom (1 O cinamoilglukoza), holinom (sinapin) i drugim. Galna kiselina ulazi u sastav mnogih tanina (galotanini, kao što je pentagaloilglukoza), jedinjenja nađenih u biljkama, a korišćenih od davnina za štavljenje koţe (Dewick, 2002). Cimetna kiselina p-kumarinska kiselina Kafena kiselina Ferulna kiselina Sinapinska kiselina Hlorogenska kiselina Kaftarna kiselina 1-O-Cinamoilglukoza Sinapin Slika 19. Cimetna kiselina i njeni derivati 25
Benzoeva 4-hidroksibenzoeva Protokatehinska Galna kiselina kiselina kiselina kiselina kiselina Siringinska kiselina Salicilna kiselina Vanilinska kiselina Slika 20. Benzoeva kiselina i njeni derivati Fenolne kiseline su prisutne u ţitaricama - pšenici, raţu, ječmu, kukuruzu, pirinču (Zielinski i sar., 2001; Irakli i sar., 2012). Ima ih u lekovitom bilju: kamilici - Matricaria chamomilla (Nováková i sar, 2010), nani - Mentha piperita (Dorman i sar., 2003), majčinoj dušici Thymus serpyllum (Boros i sar., 2010), matičnjaku - Melissa officinalis (Marques i Farah, 2009; Barros I sar., 2013), ţalfiji - Salvia officinalis (Santos-Gomes i sar., 2002) i drugim. U velikoj količini su nađene u voću i povrću: jabuci (Dragovic-Uzelac i sar., 2005), krušci (Escarpa i González, 1999), groţđu (Gómez-Alonso i sar., 2007), malini, kupini, jagodi (Häkkinen i sar., 1999), višnji (Usenik i sar., 2008), paradajezu (Sánchez-Rodríguez isar., 2012), crnom luku (Prakash i Singh, 2007), peršunu (Kaiser i sar., 2013), zelenoj salati (Romani i sar., 2002). Brojne su studije poslednjih decenija istraţivale bioaktivni potencijal gljiva koje se pripisuje različitim molekulima, uključujući i fenolne kiseline (Ferreira i sar., 2009). U Tabeli 3. prikazane su izolovane fenolne kiseline u različitim vrstama gljiva u poslednjoj deceniji. 26
Tabela 3. Pregled fenolnih kiselina detektovanih u različitim vrstama gljiva Fenolna kiselina Vrsta gljive Referenca Galna kiselina Termitomyces heimii, Termitomyces mummiformis, Lactarius deliciosos, Pleurotus sajorcaju, Hydnum repandum, Lentinus squarrulosus, Sparassis crispa, Morchella conica, Russula brevipes, Geastrum arenarius, Cantharellus cibarius, Lactarius sanguifluus, Cantharellus clavatus, Auricularia polytricha... Puttaraju i sar., 2006; Kim i sar., 2008; Stojković i sar, 2013; Karaman, 2012 p Hidroksi benzoeva kiselina Protokatehinska kiselina Vanilinska kiselina Siriginska kiselina Cimetna kiselina Agaricus bisporus (beli), Agaricus bisporus (smeđi), Lentinus edodes, Lactarius deliciosus, Lepista nuda, Lycoperdon molle, Sarcodon imbricatus, Sparassis crispa, Phellinus linteus, Inonotus obliquus Lactarius bertillonii, Lactarius vellereus, Amanita crocea, Amanita mairei, Boletus poliporus, Boletus regius, Helvella lacunosa, Russula aurea, Laccaria amethystina... Agaricus bisporus (beli), Agaricus bisporus (smeđi), Lentinus edodes, Termitomyces mummiformis, Boletus edulis, Lactarius deliciosos, Pleurotus sajorcaju, Lentinus squarrulosus, Lactarius sanguifluus, Macrolepiota procera, Cantharellus clavatus, Termitomyces shimperi, Ganoderma lucidum, Lactarius bertillonii, Lactarius vellereus, Rhodotus palmatus, Xerocomus chrysenteron, Morchella esculenta, Clavulina cinerea, Clitocybe gibba, Craterellus cornucopiodes, Leccinum scabrum... Pleurotus sajor caju, Hydnum repandum, Lentinus squarrulosus, Morchella conica, Russula brevipis, Lactarius sanguifluus, Macrolepiota procera, Cantharellus clavatus, Auricularia polytricha, Pleurotus djamor, Helvella crispa, Termitomyces microcarpus, Termitomyces shimperi, Lentinus sajor caju, Termitomyces heimii, Lycoperdon molle, Tricholoma acerbum, Craterellus cornucopiodes, Agrocybe aegerita. Termitomyces mummiformis, Hydnum repandum, Morchella conica, Russula brevipes, Lactarius sanguifluus, Macrolepiota procera, Cantharellus clavatus, Pleurotus djamor, Lentinus sajor caju, Termitomyces tylerance, Morchella angusticeps, Termitomyces microcarpus, Agaricus blazei, Sparassis crispa Agaricus bisporus (beli), Agaricus bisporus (braon), Termitomyces heimii, Termitomyces mummiformis, Termitomyces shimperi, Pleurotus sajor caju, Hydnum repandum, Lentinus squarrulosus, Sparassis crispa, Lactarius sanguifluus, Cantharellus clavatus, Pleurotus djamor, Agaricus arvensis, Agaricus silvicola, Agaricus romagnesii, Cantharellus cibarius, Lycoperdon perlatum, Macrolepiota procera, Agaricus blazei, Ganoderma lucidum, Coprinopsis atramentaria, Lactarius bertillonii, Lactarius Mattila i sar., 2001; Ribeiro i sar., 2006, a2007; Heleno i sar., 2012a, 2012b, 2013a, 2013b; Leal i sar., 2013; Nowacka i sar., 2014 Mattila i sar.,2001; Puttaraju i sar., 2006; Kim i sar., 2008; Heleno i sar., 2012b, 2013a, 2013b; Karaman, 2012; Nowacka i sar., 2014 Puttaraju i sar., 2006.; Barros i sar., 2009; Karaman, 2012 Puttaraju i sar., 2006; Kim i sar., 2008. Puttaraju i sar., 2006; Kim i sar., 2008; Heleno i sar., 2012a,2012b; Leal i sar., 2013 27
p Kumarna kiselina Ferulna kiselina Kafena kiselina vellereus, Rhodotus palmatus, Xerocomus chrysenteron, Boletus regius, Russula aurea, Russula virescens. Cantharellus cibarius, Termitomyces heimii, Boletus edulis, Sparassis crispa, Geastrum arinarius, Lactarius sanguifluus, Macrolepiota procera, Pleurotus djamor, Lentinus sajor caju, Fistulina hepatica, Agaricus arvensis, Lepista nuda, Sparassis crispa, Ganoderma lucidum, Coprinopsis atramentaria, Lactarius bertillonii, Lactarius vellereus, Xerocomus chrysenteron, Morchella esculenta, Calvatia excipuliformis, Craterellus cornucopiodes, Leccinum scabrum, Pholiota mutabilis, Psilocybe capnoides, Ganoderma applanatum Termitomyces heimii, Termitomyces microcarpus, Termitomyces shimperi, Lactarius deliciosus, Pleurotus sajor caju, Lentinus squarrulosus, Sparassis crispa, Morchella conica, Cantharellus cibarius, Lactarius sanguifluus, Macrolepiota procera, Cantharellus clavatus, Pleurotus djamor, Flammulina velutipes, Inonotus obliquus. Termitomyces heimii, Termitomyces tylerance, Termitomyces microcarpus, Termitomyces shimperi, Boletus edulis, Lentinus squarrulosus, Morchella conica, Russula brevipes, Cantharellus cibarius, Lactarius sanguifluus, Macrolepiota procera, Cantharellus clavatus, Pleurotus djamor, Lentinus sajor caju, Morchella angusticeps, Fistulina hepatica, Flammulina velutipes, Sparassis crispa, Phellinus linteus, Pholiota mutabili. Valentao i sar., 2005; Puttaraju i sar., 2006; Ribeiro i sar., 2007; Kim i sar., 2008; Heleno i sar., 2012a, 2012b, 2013a, 2013b; Karaman, 2012; Nowacka i sar., 2014 Puttaraju i sar., 2006; Kim i sar., 2008. Puttaraju i sar., 2006; Ribeiro i sar., 2007; Kim i sar., 2008; Nowacka i sar., 2014. 28
4.3.2.1.2. Flavonoidi Flavonoidi su jedinjenja biljnog porekla. Preko 4000 razliĉitih flavonoidnih jedinjenja je do sada identifikovano u biljnim tkivima i njihov sadrţaj (kvalitativni i kvantitativni) varira u zavisnosti od starosti biljke i uslova sredine u kojoj je biljka rasla (Cook i Samman, 1996). Flavonoidi su najzastupljenija grupa fenolnih jedinjenja u biljkama sa 15 atoma ugljenika u osnovnoj C 6 -C 3 -C 6 strukturi, od kojih devet pripada benzopiranskom prstenu (benzenski prsten A kondenzovan sa piranskim prstenom C) a ostalih šest ugljenik ovih atoma čine benzenski prsten B povezan sa benzopiranskim prstenom na poziciji dva. Osnovni skelet flavonoida sa obeleţavanjem atoma dat je na Slici 21. Slika 21. Osnovni skelet flavonoida Iz biljaka je izolovano i proučeno preko 3000 flavonoida koji su, s obzirom na stepen oksidacije centralnog piranskog prstena, podeljeni u dvanaest klasa: flavoni, izoflavoni, flavanoni, flavonoli, flavanoli, flavani, katehini, antocijanidini, leukoantocijanidini, halkoni, dihidrohalkoni i auroni. Najzastupljeniji flavonoli su kvercetin, kampferol i miricetin, a od flavona najpoznatiji su luteolin i apigenin. Halkoni, auroni, flavanoni, dihidrohalkoni i izoflavoni se pojavljuju mestimično i u manjem broju biljnih vrsta. Flavanoni i izoflavoni su bezbojni, dok halkoni i auroni predstavljaju ţute pigmente. Flavonoidi su rasprostranjen i u svim zelenim biljkama, a nađeni 29ui u niţim organizmima. Najrasprostranjeniji su flavonoli i flavoni. Njihova glavna uloga u biljkama još uvek nije razjašnjena iako je utvrđeno da se ponašaju kao: antioksidansi, inhibitori enzima, fotosenzibilizatori i prenosioci energije, respiratori u biosintezama, a takođe imaju i estrogene i antikancerogene osobine (Laišić i Gruić-Injac, 1998). Svi flavonoidi mogu biti hidroksilovani, alkilovani i glikolizovani sa monosaharidima i oligosaharidima, a često imaju i acil grupe u različitim poloţajima na osnovnoj flavonoidnoj strukturi ili glikozidnom delu (Harborne i sar., 1999). Neki flavonoidai (tanini pre svega) ispoljavaju i veliku sklonost ka umreţavanju i polimerizaciji (Winkel Shirley, 2001). Promenom oksidacionog stanja alifatičnog niza, odnosno heterocikličnog prstena, nastaju različite klase flavonoida (Slika 22). 29
Slika 22. Različite klase flavanoidnih jedinjena Osim što predstavljaju biljne pigmente, flavonoidi takođe doprinose ukusu, najčešće gorčini, i oporosti biljaka u kojima se nalaze. Ova klasa jedinjenja nesumnjivo učestvuje i u odbranbenom ("defensive chemistry") sistemu biljaka, jer su oporost i gorčina koju daju biljkama neprijatni biljojedima, a takođe štite biljku i od štetnog dejstva UV zračenja. Dokazano je da se sintetišu kao odgovor na povećanu koncentraciju nekih metala u zemljištu (na primer aluminijuma) (Harborne i sar., 2000). Pozitivni efekti flavonoida na zdravlje doprineli su naglom porastu upotrebe biljnih flavonoida kao konstituenata funkcionalne hrane. Međutim, povećan i nekontrolisan unos flavonoida moţe da ima prooksidativnu aktivnost, prouzrokuje mutagene procese i inhibira ključne enzime u metabolizmu hormona (Skibola i Smith, 2000). Antioksidativni mehanizmi koji su karakteristični za flavonoide su otpuštanje vodonika, "hvatanje" radikala i helatizacija metala. Kao i kod ostalih polifenolnih antioksidanasa, broj i poloţaj hidroksilnih grupa utiče na antioksidativnu aktivnost. Kao snaţni antioksidansi, fenolna jedinjenja različitim mehanizmima neutrališući slobodne radikale u ćelijama, umanjuju lipidnu peroksidaciju ćelijske membrane, mogu da spreče oksidativna oštećenja DNK i širenje tumora (Havsteen, 2002). Osim toga, flavonoidi mogu uticati i na primarni proces starenja, mogu biti efikasni inhibitori oksidacije LDL, a epidemiološka proučavanja pokazuju inverzni odnos između unosa hrane bogate flavonoidima i kardiovaskularnih oboljenja. Svi ovi podaci ukazuju na to da povećana konzumacija voća i povrća bogatog nutritivnim sastojcima koji ispoljavaju antioksidativna svojstva moţe doprineti poboljšanju kvaliteta ţivota. Nutricionisti procenjuju da je dnevni unos flavonoida putem hrane oko 1-2 grama (Havsteen, 2002). 30
U Tabeli 4 prikazani su flavonoidi prisutni u različitim vrstama gljiva. Tabela 4. Pregled identifikovanih flavonoida u gljivama Flavonodi Vrsta gljive Referenca Kvercetin Suillus luteus, Suillus granulatus, Flammulina velutipes, Agaricus blazei, Sparassis crispa, Ganoderma lucidum, Ionotus obliquus, Lactarius sanguifluus, Lactarius semisanguifluus, Russula delica, Suillus bellinii. Ribeiro i sar., 2006; Kim i sar., 2008; Kalogeropoulos i sar., 2013 Rutin Kempferol Miricetin Krisin Cantharellus cibarius, Pleurotus ostreatus. Sparassis crispa, Ganoderma lucidum, Inonotus obliquus, Suillus bellinii, Lactarius deliciosus, Lactarius sanguifluus, Lactarius semisanguifluus. Pleurotus ostreatus, Agaricus bisporus, Agaricus blazei, Ganoderma lucidum Pleurotus ostreatus, Lactarius deliciosus, Lactarius sanguifluus, Lactarius semisanguifluus, Russula delica, Suillus bellinii Valentao i sar., 2005; Jayakumar i sar., 2011 Kim i sar., 2008; Kalogeropoulos i sar., 2013 Kim i sar., 2008 Jayakumar i sar., 2011; Kalogeropoulos i sar., 2013 Katehin Lentinus edodes, Agaricus blazei, Ganoderma lucidum Kim i sar., 2008 Hesperetin Ganoderma lucidum Kim i sar., 2008 Naringenin Sparassis crispa Kim i sar., 2008 Naringin Pleurotus ostreatus, Agaricus bisporus, Pleurotus eryngii, Ganoderma lucidum, Inonotus obliquus Kim i sar., 2008 Formometin Ganoderma lucidum Kim i sar., 2008 Biohanin Ganoderma lucidum Kim i sar., 2008 Pirogalol Agaricus bisporus, Flammulina velutipes, Agaricus blazei, Sparassis crispa, Ganoderma lucidum, Phellinus linteus Kim i sar., 2008 Resveratrol Sparassis crispa, Inonotus obliquus, Kim i sar., 2008 Genistein Lactarius sanguifluus Russula delica, Suillus bellinii Kalogeropoulos i sar., 2013 31
5. UV-VIS spektrofotometrija 5.1. Nastajanje UV-VIS spektara Spektrofotometrija je apsorpciona metoda koja se zasniva na proučavanju zavisnosti apsorpcije svetlosti od talasne duţine zračenja pri prolasku kroz supstancu. Apsorpcija se moţe pratiti kako u ultraljubičastoj (UV) i vidljivoj (VIS) oblasti tako i u infracrvenoj (IC), mikrotalasnoj i radiofrekventnoj oblasti. U analitičkoj praksi od interesa je oblast od 200 do 1000 nm. Slika 23. Elektronski prelazi i UV-VIS spektar molekula Prilikom interakcije elektromagnetnog zračenja sa materijom mogući su mnog i procesi (refleksija, rasipanje, apsorpcija, fluorescencija/fosforescencija, fotohemijske reakcije). Uopšteno, pri merenju UV-VIS spektara poţeljno je da svi procesi osim apsorpcije budu zanemarljivi. Pošto je svetlost jedan od oblika energije, apsorpcija svetlosti od strane materije dovodi do povećanja energetskog sadrţaja atoma ili molekula. Ukupna potencijalna energija molekula moţe se uopšteno predstaviti kao suma elektronske (E e ) vibracione (E v ) i rotacione (E r ) energije: E = E e + E v +E r pri čemu je E e > E v > E r Količina energije koju svaki molekul moţe da poseduje je serija diskretnih vrednosti. Energija kvanta apsorbovane svetlosti odgovara energiji potrebnoj za prelazak elektrona sa niţeg 32
na viši energetski nivo. U slučaju molekula, vibracioni i rotacioni energetski nivoi se superponiraju sa elektronskim i zbog toga što postoji mnogo mogućih elektronskih prelaza u apsorpcionom spektru se pojavljuju trake (Slika 23). Zbog interakcija sa rastvaračem apsorpcione trake su šire ako je supstanca rastvorena. Slika 24. Apsorpcija UV-VIS zračenja Kada svetlost prolazi kroz kivetu (Slika 24) u kojoj se nalazi uzorak za analizu, količina apsorbovane svetlosti predstavlja razliku između intenziteta upadne svetlosti (I o ) i propuštene svetlosti (I p ) i izraţava se transparencom ili apsorbancom. Transparenca predstavlja odnos inteziteta propuštene i upadne svetlosti: Apsorbanca se definiše kao: Odnosno T = I p / I o A = - log T A = - log T = - log ( I p / I o ) = ε l c gde je: A - apsorbanca I 0 - intenzitet upadnog zraka I - intezitet zraka po prolasku kroz uzorak e - molarna apsorptivnost l - debljina sloja [cm] c - koncentracija apsorbujuće supstance [mol/l]. Lambert-Beer-ov zakon je osnova kvantitativne spektrofotometrijske analize: apsorbanca rastvora direktno je proporcionalna koncentraciji apsorbujuće vrste i debljini sloja kroz koje 33
zračenje prolazi. Za kvantitativnu analizu je bitno da se merenja apsorbance vrše sa najvećom mogućom tačnošću i osetljivošću. U rastvoru koji sadrţi više komponenti koje apsorbuju elektromagnetno zračenje, a koje međusobno ne reaguju, apsorbanca ratsvora jednaka je zbiru pojedinačnih apsorbanci svih komponenti: A = Σ A i = A 1 + A 2 + A 3 + + A n Molarna apsorptivnost (naziva se još i ekstinkcioni koeficijent) je karakteristika analizirajuće supstance. Predstavlja konstantnu vrednost za konstantne uslove snimanja (talasna duţina, temperatura i rastvarač). U praksi, vrednost molarne apsorptivnosti takođe zavisi i od karakteristika upotrebljenog aparata. Zbog toga se u kvantitativnoj analizi najčešće ne koristi određena tablična vrednost, nego se svaki put snima kalibraciona prava koristeći standardni rastvor ispitivane supstance. Boja je vaţno svojstvo svake supstance i usko je povezana sa apsorpcijom i refleksijom svetlosti. Ljudsko oko vidi komplementarnu boju onoj koja je apsorbovana (Slike 25 i 26). U praksi, nastajanje i opaţanje boja su veoma kompleksni procesi koji zavise takođe i od spektra upadne svetlosti i od površinske strukture posmatranog predmeta. Slika 25. Apsorpcija i doţivljaj boje Slika 26. Apsorpcija i doţivljaj boje 34
5.2. Konstrukcija i funkcija UV-VIS spektrofotometra Spektrofotometar je instrument koji sluţi za merenje apsorbance (ili transparence) uzorka u funkciji od talasne duţine upotrebljenog elektromagnetnog zračenja (Slika 27). Ključne komponente spektrofotometra su: - izvor koji generiše širok spektar elektromagnetnog zračenja, - disperzioni element koji iz datog spektra izdvaja usku oblast talasnih duţina, - uzorak za analizu, - jedan ili više detektora koji mere intenzitet propuštenog zračenja, - optički delovi-prizme, sočiva i ogledala koji sluţe da usmere svetlosni snop. Slika 27. Osnovni delovi UV-VIS spektrofotometra Idealni izvor zračenja treba da daje svetlost konstantnog intenziteta u celom opsegu talasnih duţina, sa malim šumom i velikom stabilnosti. Na ţalost, takav izvor ne postoji. U UV- VIS spektrofotometriji od izvora zračenja najčešće se upotrebljavaju obična volframova lampa (300-2500 nm), i deuterijumska lampa koja pokriva i ultraljubičastu oblast (190-400 nm). Savremene deuterijumske lampe daju mali šum, ali tokom vremena intezitet zračenja koji daje ova lampa lagano opada. Kao alternative ovim dvema lampama moguća je primena ksenonske lampe (160-2000 nm) koja daje dobar kontinuum talasnih duţina u celoj oblasti UV-VIS spektra, ali ima ograničenja u pogledu znatno većeg šuma u odnosu na dve najkorišćenije lampe, pa nije pogodna za kvantitativna određivanja. 35
Disperzioni element ima funkciju da snop polihromatskog zračenja razloţi na pojedinačne talasne duţine, odnosno uske oblasti talasnih duţina. U te svhe se najčešće koriste prizma i difrakciona rešetka. Pošto su prizme proste i jeftine, a disperzija svetlosti je ugaono i temperaturno zavisna, u modernim spektrofotometrima uglavnom se koriste difrakcione rešetke. Detektori pretvaraju svetlosni signal u električni signal. Idealni detektor poseduje linearnu osetljivost u širokom opsegu talasnih duţina i intenziteta svetlosti, sa malim šumom i velikom osetljivošću. Moderni spektrofotometri sadrţe fotomultiplikator ili fotodiodni niz. Fotomultiplikator ima dobru osetljivost u celom UV-VIS područiju pri malom intenzitetu svetlosti. To omogućava da se sa većom sigurnošću mogu detektovati male razlike između slepe probe i uzorka za analizu, što znači da se mogu određivati male količine supstance. Fotodiodni niz kao detektor ima široki opseg detekcije talasnih duţina, što ga čini idealnim za snimanje celog UV-VIS spektra u kratkom vremenskom intervalu. Pošto se UV-VIS sprektrofotometrom najčešće snimaju tečni uzorci potrebno je da kiveta u kojoj se oni nalaze bude transparentna za UV-VIS zračenje. Kivete su obično pravougaonog oblika, najčešće unutrašnje širine 1cm. U nekim instrumentima umesto kiveta mogu se koristiti epruvete. Najčešćese primenjuju kivete izrađene od visoko kvalitetnih jedinjenja silicijuma ili kvarca, materijala koji su dobro transparentni za UV-VIS i blisku infracrvenu oblast. 36
6. Metode za određivanje antioksidativne aktivnosti Postoji veliki broj metoda za ispitivanje antioksidativnog kapaciteta pojedinih molekula. Metode za određivanje antioksidativne aktivnosti se mogu podeliti na više načina: prema sistemu ispitivanja (in vivo i in vitro), prema metodi detekcije (hemiluminiscentne, spektrofotometrijske, fluorometrijske, spektroskopske-esr), prema direktnosti određivanja (direktne i indirektne). Podela metoda za određivanje antioksidativne aktivnosti moţe se bazirati i na prisustvu lipida u sistemu i prema mehanizmu reakcije koja se odigrava između antioksidativnih jedinjenja i slobodnih radikala na koje se antioksidasciona aktivnost određuje (Sanchez-Moreno, 2002., Aruoma, 2003). Najčešće korišćena podela metoda koje se koriste za određivanje antioksidativnog kapaciteta predstavljena je u Tabeli 5. In vitro analitičke metode za određivanje antioksidantnog kapaciteta oslanjaju se na dva različita pristupa: konkurentna i nekonkurentna reakcija (Slika 28). Slika 28. Konkurentna i nekonkurentna reakcija U konkurentnoj reakciji ciljna vrsta - meta (biomolekuli koji mogu biti napadnuti in vivo) i antioksidansi se takmiče za reaktivno jedinjenje (radikal ili neradikal). Procena antioksidativne sposobnosti (kapaciteta) se zasniva kvantifikaciji, tj. određivanju količine jedinjenja koje olakšava analitičko merenje i definiše se kao proba. Kod konkurentnih testova proba je ciljna vrsta ili oksidovani oblik. Proba moţe biti i neka vrsta koja se dodaje nakon navedenih reakcija koje prate kvantifikaciju preostalih reaktivnih vrsta ili ciljnih molekula. 37
Tabela 5. Metode za određivanje antioksidativnog kapaciteta. Metode in vitro određivanja antioksidatinog kapaciteta Metode koje uključuju H-transfer reakcije (HAT) ROO + AH ROOH + A ROO +LH ROOH + L 1.ORAC metoda (Oxygen radical absorbance capacity) 2.LPIC metoda (Lipid peroxidation inhibition capacity) 3.TRAP metoda (Total radical trapping antioxidant parameter) 4. IOC metoda (Inhibited oxygen uptake) 5.SASA metoda (Scavenging of super oxide radical formation by alkaline) 1. TEAC metoda (Trolox equivalent antioxidant capacity) 2. FRAP metoda (Ferric Ion Reducing Antioxidant Power Assay) Elektron transfer metode (ET) M(n) + e - (iz AH) AH + M(n-1) 3. DPPH metoda (Scavengig of 2,2- difenil-1-pikrilhidrazil Radical Assay) 4. CUPRAC metoda (Copper (II) reduction capacity) 5. FCR metoda (Folin-Ciocalteu Reducing Capacity Assay) Ostale metode 1.TOSC metoda (Total oxidant scavenging capacity) 3.ECL metoda (Enhanced chemiluminescence) 4TLC bioautography 5.CAA metoda (Cellular antioxidant activity assay) U ovim testovima, antioksidativni kapacitet testiranih jedinjenja zavisi od: - brzine reakcije između njih i reaktivnih vrsta, - brzine reakcije ciljnih molekula i reaktivnih vrsta i 38
- koncentracionog odnosa između antioksidanasa i ciljnog molekula. Za izvođenje ovih testova neophodno je ispuniti uslove: - test proba mora biti reaktivna sa antioksidansom pri niskim koncentracijama, - maksimalna osetljivost u spektroskopskom ispitivanju između polaznog i oksidovanog oblika - ne smeju postojati sporedne reakcije, - antioksidans ne bi trebalo da reaguje sa ciljnim molekulom. U nekonkurentnim testovima, postoji reakcija između antioksidansa i reaktivne vrste u odsustvu ciljnih molekula, što u početnoj smeši, uključuje dve kompenente, koje takođe mogu biti probe za praćenje reakcije. Preostale reaktivne vrste se mogu meriti dodatkom pogodnog reagensa (Vertuani, 2004). 6.1. Metode koje ukjlučuju H-transfer reakcije Ove metode baziraju se na činjenici da antioksidans predaje atom vodonika i na taj način stabilizuje radikal: Slika 29. Princip H-transfera reakcije 6.1.1. ORAC metoda (Oxygen radical absorbance capacity) ORAC metoda je spektrofotometrijska metoda merenja antioksidativnog kapaciteta uzorka. Metoda se bazira na sposobnosti test-supstance da spreči oksidaciju β-fikoeritrina (fluorescein) od strane kiseoničnih slobodnih radikala (ROS). Rezultati merenja inhibicije oksidativne degradacije molekula fluoresceina delovanjem antioksidansa se očitavaju iz standardne krive zasnovane na antioksidantnoj aktivnosti različitih koncentracija Trolox-a. Merenja se vrše pomoću fluorimetra. Metodu su razvili naučnici Tufts Univerziteta iz Bostona u saradnji sa Ministarstvom poljoprivrede SAD, radi procene vrednosti pojedinih namirnica u 39
zaštiti organizma od oksidativnog stresa. Što je ORAC vrednost veća, veća je i antioksidaciona sposobnost nekog jedinjenja (Cvetković J., 2012). 6.1.2. TRAP metoda (Total radical trapping antioxidant parameter) TRAP je metoda koja se zasniva na merenju smanjenja fluorescencije R-fikokretina prilikom kontrolisane reakcije peroksidacije. TRAP vrednosti izračunavaju se pomoću kalibracione prave, koja se konstruiše na osnovu dobijenih vrednosti za standard Trolox, (Huang, 2005). Prednost ove metode je što se moţe koristiti i kao in vivo metoda. 6.2. Elektron transfer metode (ET) ET- metode su veoma korišćene metode za određivanje antioksidativnog kapaciteta in vitro. Ove metode podrazumevaju prisustvo dve komponente u reakcionoj smeši: oksidans (proba) i antioksidans, kao i odvijanje elektron - transfer reakcije (Slika 30): Oksidans (proba) + e- (iz antioksidansa) Redukovana oksidans + Oksidovani Slika 30. Princip elektron-transfer reakcija Proba, odnosno oksidans, uzima elektron iz antioksidansa i dovodi do promene boje rastvora. Promena intenziteta obojenosti rastvora je proporcionalna koncentraciji antioksidansa. Reakcija između antioksidansa i oksidansa je završena onda kada boja rastvora prestane da se menja. U svim metodama spektrofotometrijski se meri apsorbancija ispitivanog rastvora i prati njena zavisnost od molarne koncentracije. Zavisnost između promene asorbancije i koncentracije antioksidansa je linearna. Nagib krive daje kapacitet antioksidansa koji se predstavlja kao Trolox ekvivalent (TE) ili kao ekvivalent galne kiseline (GAE). 40
6.2.1. ABTS metoda (Scavengig of 2,2 -azobis-(3-etillbenzotiazolin-6-sulfat) Radical Assay) ABTS metoda uključuje stvaranje dugo-ţivećih radikala, 2,2 -azobis-(3- etillbenzotiazolin-6-sulfat) radikal-katjon (ABTS + ) koji ima apsorpcione maksimume na talasnim duţinama od 414, 645, 734 i 815 nm (Slika 31). Slika 31. Mehanizam delovanja ABTS + Svako jedinjenje koje ima niţi redoks potencijal od ABTS moţe reagovati sa radikalom (Re i sar.,1999). Rezulati se izraţavaju kao Trolox ekvivalenti. Askorbinska kiselina (vitamin C) se takođe koristi kao referentno jedinjenje umesto Troloxa a rezulati se izraţavaju kao masa askorbinske kiseline na 100 g ili 100 ml testiranog uzorka (VCEAC- vitamin C equivalent antioxidant capacity). 6.2.2. FRAP- metoda (Ferric Ion Reducing Antioxidant Power Assay) FRAP metoda se zasniva na sposobnosti antioksidanasa da redukuju gvoţđe - 2,4,6- tripiridil-s-triazin kompleks [Fe(III)-(TPTZ) 2 ] 3+ do intenzivno plavo obojenog kompleksa [Fe(II)-(TPTZ) 2 ] 2+ u kiseloj sredini (Slika 32). FRAP vrednosti se izračunavaju merenjem rasta apsorpcije na 593 nm i upoređivanjem istih sa standardnim rastvorom obojenih jona, ili standardnim rastvorom antioksidansa (npr. askorbinska kiselina). Svako jedinjenje sa redoks potencijalom niţim od redoks potencijala para Fe(III)/Fe(II), teorijski moţe redukovati Fe(III) do Fe (II) i usloviti znatno visoke rezultate FRAP- vrednosti. Sa druge strane, mnogi antioksidansi 41
ne mogu dovoljno brzo redukovati Fe(III) kako bi se brzina reakcije mogla meriti u posmatranom vremenskom interval (obično 4 minuta). U zavisnosti od vremena analize red njihove reaktivnosti se menja. Polifenoli sa takvim ponašanjem su: kvercetin, feruminska kiselina, kofeinska kiselina, taninska kiselina. Slika 32. Redukcija kompleksa [Fe(III)-(TPTZ) 2 ] 3+ do kompleksa [Fe(II)-(TPTZ) 2 ] 2+ Jedinjenja koja apsorbuju na talasnoj duţini određivanja mogu interferirati i izazvati precenjivanje FRAP vrednosti. Niska vrednost ph, koja je neophodna za metodu, moţe da dovede do precipitacije nekih proteina, kao što je kazein iz mleka (Kranl i sar., 2005). Antioksidansi koji deluju kao "gasioci" radikala (transferi H-atoma) ne mogu se određivati ovom metodom. 6.2.3. DPPH metoda (Scavengig of 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil Radical Assay) DPPH test je najrasprostranjenija metoda za ispitivanje antioksidativne aktivnosti mnogih prirodnih antioksidanasa. Prvi put je opisana 1958. godine (Blois, 1958), a kasnije je modifikovana od strane brojnih istraţivača. PubMed baza podataka pokazuje da je DPPH test od 1969. do 2010. godine bio uključen u više od 850 istraţivanja (Tirzitis & Bartosz, 2010). DPPH je stabilan slobodni radikal zbog delokalizacije nesparenog elektrona u celom molekulu, tako da molekuli ne dimerizuju, kao što bi to bio slučaj sa ostalim vrstama slobodnih radikala. Ovaj molekul ima tamnoljubičastu boju, koja se karakteriše apsorbancijom u etanolnom rastvoru na 515-517 nm (Slika 33). Kada antioksidans reaguje sa DPPH, u prisustvu vodonika kao donora elektrona, ovaj radikal se redukuje u DPPH i posledica toga je apsorpcija na manjim talasnim duţinama nego DPPH. Pritom dolazi do obezbojavanja (mada se moţe očekivati 42
prisustvo blede ţute boje koja potiče od pikril grupe), što je proporcionalno prisutnim elektronima: veći stepen obezbojavanja označava veću redukcionu sposobnost (Slika 34). Slika 34. Redukcija DPPH Slika 33. Promena apsorbancije u toku redukcije DPP Jedan od parametara koji je uveden za tumačenje DPPH metode je "efikasna koncentracija" ili EC 50 vrednost (ili IC 50 ), a ona se definiše kao koncentracija supstrata koja izaziva gubitak 50% DPPH aktivnosti, odnosno boje. Niţe IC 50 vrednosti odgovaraju jačoj antioksidantnoj aktivnosti i obrnuto. 43
6.2.4. CUPRAC metoda (Copper (II) reduction capacity) CUPRAC metoda se zasniva na praćenju redukcije bakar(ii) jona koji sa neokuproinom (2,9-dimetil-1,10-fenantrolin), pri ph=7 gradi bezbojan bis(neokuproin)bakar(ii) helatni komleks, Cu(II)-Nc. Cu(II)-Nc predstavlja redoks reagens u CUPRAC metodi. U prisustvu redukcionog sredstva nastaje Cu(I)-Nc, komleksno jedinjenje narandţasto-crvene boje koje pokazuje maksimum apsorbancije na 450 nm (Slika 35) (Ak & Gulcin, 2008). U poređenju sa drugim metodama za određivanje antioksidativne aktivnosti na redoks reakciju u CUPRAC metodi ne utiču parametri kao što su prisustvo vazduha, sunčeva svetlost i vlaţnost jer je Cu(II)-Nc reagens stabilniji od DPPH-a i ABTS-a. Redoks reakcija u CUPRAC metodi se odvija pri ph 7 (pribliţno fiziološki uslovi) za razliku od kisele sredine koja se mora obezbediti u FRAP metodi (ph 3,6) gde redukciona moć moţe biti suprimirana zbog reakcije hidroksilne grupe ispitivanog jedinjenja sa H+ jonom (Apak et al., 2008). Slika 35. Redukcija Cu(II) do Cu(I) 6.2.5. Metoda za određivanje ukupnog sadržaja fenolnih jedinjenja (Total Phenolic Content-TPC) ili FCR metoda (Folin Ciocalteu Reducing Capacity Assay) Sadrţaj ukupnih fenola u uzorcima je određivan Folin-Ciocalteau-ovom metodom (Singleton i Rossi, 1965). Metoda je bazirana na oksidaciji prisutnih fenola Folin-Ciocalteau-vim reagensom. Sam reagens predstavlja smešu fosfomolibdenske i fosfovolframove kiseline I moţe se predstaviti formulama: 44
3H 2 O P 2 O 5 13WO 3 5MoO 3 10H 2 O i 3H 2 O P 2 O 5 14WO 3 4MoO 3 10H 2 O (Peterson, 1979) Pri tome se sam reagens redukuje a intenzitet dobijene plave boje srazmeran je koliĉini fenola u rastvoru: Mo(VI) (ţuto obojen) + e Mo(V) (plavo obojen) Prilikom izvođenja ove metode, dolazi do prenosa elektrona u alkalnoj sredini sa fenolne komponente i drugih redukcionih vrsta na molibden (Mo) pri čemu se formira plavi kompleks koji se moţe detktovati spektrofotometrijski na 750-765nm. Galna kiselina se koristi kao standard i rezultati se prikazuju kao ekvivalenti galne kiseline (mg/l). Plavi kompleksi, koji se formiraju su nezavisni od strukture fenolnih jedinjenja što isključuje mogućnost postojanja koordinacionih kompleksa koji se formiraju između metala i fenolnih jedinjenja. Korišćeni reagens je nespecifičan za fenolna jedinjenja, jer moţe biti redukovan od strane mnogih nefenolnih jedinjenja kao što su aromatični amini, sumpor dioksid, vitamin C, Cu(I), Fe(II). U tom slučaju treba ukloniti ometajuće supstance i podestiti ph rastvora (ph 10). 45
7. Ekstrakcija rastvaračima različite polarnosti Najpopularnija, najčešća jednostavna i efikasna metoda koja je se koristi se za pripremanje biljnih ekstarakata je ekstrakcija rastvaračima različite polarnosti. Upotreba rastvarača različite polarnosti omogućava razdvajanje nepolarnih od polarnih sastojaka i smanjenje kompleksnosti ekstrakta. Prinos biljnog ekstarkta pri ekstrakciji zavisi od vrste rastvarača, tj. njegove polarnosti, od vremena i temperature ekstrakcije, kao i od hemijskih i fizičkih karakteristika uzorka. Osnovni parametri koji utiču na kvalitet ekstrakta: - deo biljke koji se koristi kao startni materijal, - rastvarač koji se koristi za ekstrakciju, - postupak ekstrakcije. Osobine komponenata koje se ekstrahuju iz biljnog materijala zavise od: - prirode biljnog materijala, - njegovog porekla, - stepena obrade, - sadrţaja vlage, - usitnjenost biljnog materijala. Dobar rastvarač treba da poseduje određene osobine kao što su: - mala toksičnost, - ispraljivost na niskim temperaturama, - pospešivanje brze fiziološke apsorpcije ekstrakta, - zaštitna funkcija, - sprečavanje ekstrahovanih jedinjenja da grade komplekse ili da disosuju. Faktori od kojih zavisi odabir rastvarača za ekstrakciju su: - količina fitokomponenata koje se ekstrahuju, - brzina ekstrakcije, - raznovrsnost komponenata prisutnih u ekstraktu kao i raznovrsnost komponenata koje su potencijalni inhibitori aktivnih jedinjenja, - jednostavnost u daljem manipulisanju ekstraktima, - toksičnost procesa ekstrakcije i moguće pozitivne osobine ekstrakta, - kao i od ciljnih vrsta koje se ekstrahuje. 46
Najčešće korišćeni rastvarači koji za ekstrakciju su: Voda: Voda je univerzalni rastvarač, koristi se za ekstrakciju fitokomponenata koje pokazuju antimikrobnu aktivnost. Ona rastvara i flavonoide (uglavnom antocijane) kao i fenole koji su odgovorni za antioksidativnu aktivnost. Aceton: Aceton rastvara mnoge liposolubilne i hidrosolubilne komponente. aceton se meša sa vodom, isparljiv je i nisko toksičan. Veoma je koristan ekstraktant, naročito za ispitivanje antimikrobne aktivnosti kada se očekuje ekstrakcija fenolnih jedinjenja. U nekim studijama je opisano da je ekstrakcija tanina i drugih fenola efikasnija u vodenom rastvoru acetona nego li u vodenom rastvoru metanola. I aceton i metanol ekstrahuju saponine koji pokazuju antimikrobnu aktivnost. Alkohol: Veća aktivnost etanolnih ekstrakata u poređenju sa aktivnošću vodenih ekstrakata objašnjava se prisutnošću veće količine polifenola, ekstahovanu iz vodenih rastvora. Alkoholi su efikasniji za oslobađanje polifenola iz ćelija. Visoka koncentracija mnogih flavonoida je detektovana u etanolnim ekstraktima. Otkriveno je da je etanol rastvarač koji lakše prolazi kroz ćelijsku membranu da bi ekstrahovao intracelularne komponente iz biljnog materijala. Metanol je polarniji rastvarač od etanola ali je zbog svoje citotoksičnosti nepogodan za neke vrste ekstrakcija jer moţe da dovede do netačnih rezltata. Etil-acetat: rastvarač koji se najčešće koristi u hromatografiji i prilikom ekstrakcije aktivnih komponenti. Iako je nestabilam i njegovi ekstrakti ne sadrţe velike količine flavonoida, često se koristi zbog niske cene i male toksičnosti. Etar: Etar se često koristi za ekstrakciju kumarina i masnih kiselina. Dihlorometan se koristi za selektivnu ekstrakciju terpenoida Rastvarači, kao što su metanol, etanol, etil-acetat, aceton i njihova kombinacija koriste se za ekstrakciju fenola iz biljnog materijala. Odabir odgovarajućeg rastvarača bitno utiče na prinos ekstrahovanih fenola. Otkriveno je da je metanol najefikasniji rastvarač za ekstrakciju polifenola male molekulske mase, dok se za ekstrakciju flavonola velike molekulske mase koristi vodeni rastvor acetona. Etanol je drugi dobar rastvarač za ekstrakciju polifenola i siguran je za ispitivanje hrane. Za pripramanje ekstrakata koji sadrţe antocijane najčešće se koriste metanol i etanol. Ovi rastvarači denaturišu ćelisku membranu, istovremeno rastvaraju antocijane i stabilizuju ih. Najbolji prinos pri ekstarakciji antocijana dobija se korišćenjem slabih organskih kiselina, kao što je mravlja, sirćetna, limunska, vinska i fosforna kiselina ili jake kiseline vrlo male koncentracije: trifluorsirćetna i hlorovodonična (Dimitrijević M., 2012). 47
Eksperimentalni deo 48
8. Priprema ekstrakta pečuraka Pečurke su brane tokom septembra i oktobra, 2016. godine u retkoj, mladoj borovoj šumi i u bukovoj šumi na teritoriji Zaplanja, u okolini Gadţinog Hana. Uzorci su prikupljani na pet lokaliteta. Nakon ćišenja od ostataka lišća i zemlje, pečurke su sušene do konstantne mase na vazduhu, usitnjene, a zatim je odmerena masa (10g) ekstrahovana na ultrazvučnom kupatilu. Uzorak je ekstrahovan dva puta po 30 minuta, sa sveţim porcijama rastvarača. Odnos pečurakai rastvarača je 1 : 10. Rastvarači koji su korišćeni za ekstrakciju su metanol, aceton i etil-acetat. Dobijeni ekstrakti su profiltrirani i koncentrovani na rotacionom vakuum uparivaču do suva. Masa suvog ostatka je merena na analitičkoj vagi i rastvorena u dimetil sulfoksidu (DMSO), a krajnja koncentracija ekstrakta je bila 20 mg/ml izraţena u odnosu na masu suvog ekstrakta (SE). 8.1. Aparatura i pribor - UV/Vis spektrofotometar, Perkin Elmer Lambda 15 - vaga, Shimadzu AX20 - ultrazvučno kupatilo, Maget Bela Palanka - vodeno kupatilo, Baths HH-S114 - vakuum uparivač, IKA RV 05 basic Werke - aparat za dejonizovanu vodu, TKA MICROMED 8.2. Korišćeni reagensi - 1%-tni rastvor K 3 [Fe(CN) 6 ] (Merck, Nemačka) - 10%-tna trihlorsirćetna kiselina (Merck, Nemačka) - 0,1% FeCl 3 (Merck, Nemačka) - Askorbinska kiselina (vitamin C) (Seharlau, Nemačka) - Pufer NaH 2 PO 4 -Na 2 HPO 4 (0,2 mol/l, ph=6,6) (NaH 2 PO 4 -Na 2 HPO 4 Zorka, Srbija) - Rastvor CuCl 2 ; 0,01M - Pufer NH 4 OAc (ph=7) - Butil hidroksi toluen (BHT) (Zorka, Srbija) - 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) (La Chema, Nemačka) - kalijum persulfat (K 2 S 2 O 8 ) (Merck, Nemačka) - Trolox (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karboksilna kiselina) (Sigma Aldrich, Nemačka) - metanol (100%, VWR International S.A.S, Francuska) - 2,2-azinobis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kiselina) (ABTS) - 2,9-dimetill-1,10-fenantrolin (neokuproin) (Merck, Nemačka) - dimetil sulfoksid (DMSO) (Sigma Aldrich, Nemačka) 49
9. Metode određivanja antioksidativne aktivnosti 9.1. Određivanje ukupnog sadržaja fenolnih jedinjenja (Total Phenolic Content-TPC) Određivanje ukupnog sadrţaja fenolnih jedinjenja u analiziranim gljivama rađeno je po metodi Singleton (Singleton i sar., 1999) korišćenjem Folin Ciocalteu reagensa. 0,05 ml ekstrakta pomešano je sa 0,5 ml Folin Ciocalteu reagensom, 2 ml Na 2 CO 3 i dopunjeno vodom do zapremine od 7,55 ml. Dobijena smeša je promešana i ostavljena da stoji 30 minuta u mraku, na sobnoj temperature nakon čega je merena apsorbanca na talasnoj duţini od 750 nm. 9.2. CUPRAC metoda (Copper (II) reduction capacity) U smešu koja sadrţi 0.05 ml uzorka i 1.05 ml vode, 1 ml amonijum-acetatnog pufera (ph=7) i 1 ml rastvora neokuproina dodato je 1 ml rastvora Cu(II)-hlorida. Dobijena smeša je dobro promešana i ostavljena da stoji 30 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, merena je apsorbanca na talasnoj duţini od 450 nm, pri čemu je slepu probu prestavljala smeša reagensa bez dodatog uzorka. 9.3. Određivanje "scavenging" antioksidansnog slobodno radikalskog kapaciteta prema 2,2 -azobis-(3-etillbenzotiazolin-6-sulfat) (ABTS) radikalu ABTS test je izveden metodom (TEAC) koju su opisali Re (Re i sar., 1999) i Arts (Arts i sar., 2004) uz male izmene. ABTS je rastvoren u metanolu do koncentracije 7٠10-3 mol/l. ABTS + radikal katjon nastaje kao proizvod reakcije između ABTS rastvora i 2,4٠10-3 mol/l K 2 S 2 O 8 Radni rastvor se priprema mešanjem ova dva u odnosu 1:1 (10+10). Stavlja se da stoji u mraku na sobnoj temperaturi 12 sati pre upotrebe. 14,8 ml ovog rastvora (ABTS + ) je razblaţen sa 240 ml metanola do aposrobance od 0,7 ± 0,02 na talasnoj duţini od 734 nm. 0,1 ml ekstrakta je pomešano sa 1,8 ml rastvora ABTS + i sa 2,1 ml metanola. Nakon 6 minuta reakcije na sobnoj temperaturi meri se smanjenje apsorbance na talasnoj duţini od 734 nm (ΔA=Ablank-A). 9.4. Određivanje "scavenging" antioksidansnog slobodno-radikalskog kapaciteta prema 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) radikalu 50
"Scavening" radikalski kapacitet uzoraka određen je pomoću DPPH radikala. Pripremane su reakcione smeše istih koncentracija ekstrakta (20 mg/ml). Za izvođenje ovog testa rastvor DPPH reagensa (1 10-4 mol/l) je pripremljen u metanolu. 1,4 ml DPPH i 0,1 ml ekstrakta je pomešano sa 2,4 ml metanola. Reakciona smeša je ostavljena da stoji u mraku 1h. Apsorbanca rastvora je merena nakon stajanja na talasnoj duţini od 515 nm. moći 9.5. Odredjivanje antioksidacione aktivnosti merenjem ukupne redukcione Reakcione smeše su pripremane mešanjem odgovarajuće količine ekstrakta, 1 ml 1%- tnog rastvora K 3 [Fe(CN) 6 ] i fosfatnog pufera (NaH 2 PO 4 -Na 2 HPO 4, ph=6,6), tako da je ukupna zapremina 3.7 ml. Smeše su inkubirane na 50 C 30 minuta i nakon toga je dodato 1 ml 10%-tne trihlorsirćetne kiseline i 0.6 ml 0,1% FeCl 3. Apsorbancija dobijenih smeša merena je na talasnoj duţini od 700 nm. Redukciona moć gljiva je izaţena preko redukcione moći askrobinske kiseline. 51
10. Hemometrijska analiza Hemometrijski pristup hemiji omogućava da na osnovu matematičkih i statističkih metoda pojasnimo dobijene rezultate. Takođe omogućava vizuelnu ilustraciju eksperimentalnih rezultata; prikupljanja informacija iz različitih područja; vezu između varijabli; određivanje sličnosti i različitosti između uzoraka. (Abollimo i sar., 2011). Klaster analiza je hemomemtrijska metoda koja za cilj ima grupisanje uzoraka na osnovu karakteristika koje oni imaju. Klasterska analiza se moţe podeliti u dve grupe: a) hijerarhijsku, gde su klasteri dobijeni povezivanjem jednog objekta koji je sukcesivno povezivan u veće grupacije ili počevši od jednog klastera koji obuhvata sve objekte i deljenjem u manje i homogenije klastere i b) nehijerarhijsku, kod koje objekti nisu sukcesivno povezani već se klasteri određuju direktno. Najćešće korišćena jeste hijerarhijska klaster analiza (HKA), kod koje se uzorci klasifikuju na osnovu sličnosti sa drugima u klasteru na osnovu nekog utvrđenog kriterijuma. Jedan on načina merenja sličnosti između dva objekta u HKA jeste Euklidova (Euclidean) udaljenost: n d ij = x iv x 2 jv v=1 gde je n broj varijabli. Što je manja Euklidova udaljenost to je veća sličnost između objekata. 52
Rezultati i diskusija 53
11. Rezultati i diskusija 11.1. Određivanje ukupnog sadržaja fenolnih jedinjenja (Total Phenolic Content-TPC) Određivanje ukupnog sadrţaja fenolnih jedinjenja (TPC) u različitim vrstama gljiva vršeno je pomoću Folin-Ciocalteu reagensa, pri čemu je kao rastvarač za ekstrakciju korišćen metanol. Standardna serija galne kiseline kao i metanolni ekstrakti svih analiziranih vrsta gljiva snimljeni su na spektrofotometru na talasnoj duţini od 750 nm. Kalibraciona prava za galnu kiselinu prikazana je na Slici 36. 0.14 0.12 0.1 A 0.08 0.06 0.04 0.02 y = 0.016x + 0.012 R² = 0.975 0 0 1 2 3 4 5 6 7 C Slika 36. Kalibraciona prava za određivanje sadrţaja fenolnij jedinjenja Ukupan sadrţaj fenolnih jedinjenja u metanolnim ekstraktima ispitivanih gljiva prikazan je na Slici 37. Rezultati su prikazani kao mikrogram ekvivalenta galne kiseline po mg suvog ekstrakta (µg GAE/mg SE). Određivanje ukupnih polifenolnih jedinjenja nije bilo moguće uraditi iz acetonskih i etil-acetatnih ekstrakata jer je prilikom mešanja sa Folin-Ciocalteu-ovim reagenssom došlo po zamućenja i stvaranja taloga. 54
Slika 37. Ukupan sadrţaj fenolnih jedinjenja u metanolnim ekstraktima analiziranih gljiva Ono što se sa Slike 37. moţe uočiti jeste da metanolni ekstrakti gljiva L.volemus i L. piperatus pokazuju slične vrednosti (41,8956 µg GAE/mg SE i 43,1693 µg GAE/mg SE, respektivno), koje su skoro duplo manje od vrednosti metanolnih ekstrakata gljiva L. semisanguifluus i L. sanguifluus (70,4976 µg GAE/mg i 75,2453µg GAE/mg, respektivno). Imajući u vidu postojanje direktno proporcionalne veze između sadrţaja polifenolnih jedinjenja i antioksidativne sposobnosti, očekuje se da će naredne metode za ispitivanje antioksidativne aktivnosti pokazati da ekstrakti gljiva L. semisanguifluus i L. sanguifluus ispoljavaju najbolju antioksidativnu aktivnost 11.2. CUPRAC metoda (Copper (II) reduction capacity) CUPRAC metoda je vrlo jednostavna metoda za određivanje hidrofilnih i lipofilnih antioksidanasa u hrani. Promena boje iz plave u ţuto-narandţastu posledica je redukcije Cu 2+ jona antioksidansima do Cu + pri čemu se gradi stabilan kompleks čiji je maksimum apsorpcije na 450 nm (Slika 38). 55
Slika 38. UV-VIS spektar Neo 2 Cu + (λ max =450 nm) Za određivanje antioksidativne aktivnosti korišćen je troloks kao standard. Tačnim odmeravanjem zapremine standardnog rastvora i dodavanja ostalih reagenasa koji se koriste u ovoj metodi dobijeni su rastvori tačno poznate koncentracije. Merenjem apsorbance u zavisnosti od koncentracije dobijena je kalibraciona prava koja sluţi za određivanje nepoznate koncentracije antioksidanasa u analiziranim gljivama (Slika 39): A 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 1 2 3 4 5 6 7 C y = 0,345x - 0,192 R² = 0,992 Slika 39. Kalibraciona prava za određivanje sposobnosti redukcije jona Cu 2+ u Cu + CUPRAC metoda korišćena je za ispitivanje antioksidativne aktivnosti metanolnog, acetonskog i etil-acetatnog ekstrakta gljive L. volemus, L. piperatus, L. semisanguifluu i L. sanguifluus, sa ciljem pronalaţenja najboljeg rastvarača za ekstrakciju antioksidanasa iz pomenutih gljiva. Dobijeni rezultati prikazani su na Slici 40. 56
Slika 40. Antioksidativna aktivnost analiziranih gljiva određena CUPRAC metodom u ekstraktima rastvarača različite polarnosti Prilikom ispitivanja antioksidativne aktivnosti svih vrsta gljiva, korišćena je ista početna koncentracija svih ekstrakata od 20 mg/ml. Na osnovu dobijenih rezultata moţe se uočiti da sva tri ekstrakta (metanolni, acetonski i etila-cetatni) gljive L. semisanguifluus i L. sanguifluus pokazuju znatno veću aktivnost u poređenju sa vrstama L. piperatus i L. volemus. Takođe, moţe se uočiti da acetonski ekstrakti svih vrsta gljiva sa izuzetkom L. volemusa pokazuju najveću aktivnost i to 19,2584 µg TE/mg SE za L. sanguifluus, 12,7669 µg TE/mg SE za L. semisanguifluus i 8,2854 µg TE/mg SE za L. piperatus. Pored ovog zapaţanja moţe se uočiti da ukoliko se poredi antioksidstivna aktivnost ekstrakata u funkciji izbora rastvarača moţe se zaključiti da prilikom izbora rastvarača za ovu metodu treba izbegavati etil-acetat jer ti ekstrakti pokazuju najmanju aktivnost. 57
11.3. Određivanje "scavenging" antioksidansnog slobodno radikalskog kapaciteta prema 2,2 -azobis-(3-etillbenzotiazolin-6-sulfat) (ABTS) radikalu ABTS metoda se koristi za određivanje antioksidativne aktivnosti i kao tehnika je veoma brza i jednostavna. Antioksidansi u ekstraktu redukuju ABTS + radikal katjon po metodi koju su opisali Ozgen i saradnici (2006). Kako je metanolni rastvor ABTS + radikal plave boje sa maksimumom apsorpcije na 734 nm (Slika 41), usled redukcije dolazi do smanjenja intenziteta boje, što za posedicu ima manju apsorbancu. Slika 41. UV-VIS spektar ABTS + radikala (λ max =734 nm) "Hvatanje" ABTS + radikala određivano je na osnovu kalibracione prave koja je dobijena korišćenjem troloksa kao standardnog reagensa i rezultati su prikazani kao mikrogram troloks ekvivalenta po miligramu suvog ekstrakta (µg TE/mg SE) (Slika 42). 58
0.14 0.12 0.1 A 0.08 0.06 y = 0,032x - 0,014 R² = 0,999 0.04 0.02 0 0 1 2 3 4 5 C Slika 42. Kalibraciona prava za određivanje antioksidativne aktivnosti ABTS + radikalom Slika 43. ABTS hvatačka sposobnost ekstrakata različite polarnosti analiziranih vrsta gljiva Na osnovu Slike 43, moţe se uočiti određena pravilnost kod analiziranih ekstrakata gljiva. Metanolni ekstrakti svih analiziranih vrsta gljiva pokazuju veću "hvatačku" sposobnost ABTS + radikala u odnosu na acetonske i etil-acetatne ekstrakte. Poređenjem antioksidavne 59
aktivnosti metanolnih ektrakata najveću sposobnost hvatanja ABTS radikala pokazuje metanolni ekstrakt L. sanguifluus i to 8,9890 µg TE/mg SE a najmanju L. piperatus 6,0507 µg TE/mg SE. Takođe, kod svih analiziranih vrsta gljiva antioksidativna sposobnost ekstrakta opada u nizu metanolni > acetonski > etil-acetatni ekstrakt. Ovakav redosled se objašnjava i najvećom polarnošću metanola u odnosu na ostale primenjene rastvarače, i njegovom sposobošću da u većoj meri rastvori polifenolna jedinjenja. Etil-acetatni ekstrakti imaju najmanje vrednosti sadrţaja polifenolnih jedinjenja. Aceton je po svojoj polarnosti između metanola i etil-acetata, tako da je i sadrţaj polifenola u acetonskom ekrtaktu manji od sadrţaja tih jedinjenja u metanolnim, ali veći od sadrţaja polifenola u etil-acetatnim ekstraktima. 11.4. Određivanje "scavenging" antioksidansnog slobodno radikalskog kapaciteta prema 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) radikalu Kapacitet hvatanja slobodnih radikala ispitivanih uzoraka određivan je merenjem njihove sposobnosti da redukuju DPPH radikale (DPPH test) (Brand-Williams i sar., 1995). 1,1- difenil-2-pikrilhidrazil radikal (DPPH ) je stabilan radikal čiji je maksimum apsorpcije na 515 nm (Slika 44). Slika 44. UV-VIS spektar metanolnog rastvora DPPH radikala Antioksidansi reaguju sa stabilnim DPPH radikalom i transformišu ga pri čemu dolazi do smanjenja ljubičaste boje rastvora radikala. Što je veće obezbojavanje rastvora DPPH, to je koncentracija antioksidanasa u uzorku veća. Nivo obezbojavanja rastvora DPPH radikala 60
ukazuje na "skevindţer" potencijal antioksidanasa. Upravo je ova metoda primenjena za određivanje antioksidativne aktivnosti ekstrakata različite polarnosti ispitivanih gljiva. Kalibracione prava je dobijena korišćenjem standardnog rastvora troloksa pri čemu je antioksidativna aktivnost izraţena kao mikrogram troloks ekvivalenta na miligram suvog ekstrakta (µg TE/mg SE) (Slika 45). 0.35 0.3 0.25 A 0.2 0.15 0.1 y = 0.040x - 0.049 R² = 0.996 0.05 0-0.05 0 2 4 6 8 10 C Slika 45. Kalibraciona prava za određivanje antioksidativne aktivnosti DPPH metodom Izvršeno je ispitivanje antioksidativne aktivnosti metanolnog, acetonskog i etil-acetatnog ekstrakta gljiva L. volemus, L. piperatus, L. sanguifluus i L. semisanguifluus. Dobijeni rezultati prikazani su na Slici 46. 61
Slika 46. DPPH "hvatačka" sposobnost ekstrakata različite polarnosti analiziranih vrsta gljiva Na osnovu dobijenog grafika moţe se zaključiti da je acetonski ekstrakt gljive L. sanguifluus pokazao najveću antioksidativnu aktivnost i to 2,4968 μg TE/mg SE. Za razliku od gljiva L. sanguifluus, L. semisanguifluus i L.piperatus, acetonski i etil-acetatni ekstrakt gljive L. volemus pokazuje znatno manju aktivnost dok metanolni ekstrakt pokazuje vrednost od 1,8355 μg/mg SE. Prema DPPH testu najmanju aktivnost pokazuje etil-acetatni ekstrakt gljive L. piperatus i to 0,0679 μg TE/mg SE. 11.5. Odredjivanje antioksidacione aktivnosti merenjem ukupne redukcione moći (TRP metoda) Moć redukcije Fe 3+ jona u Fe 2+ jon je još jedno merilo antioksidativne sposobnosti neke ispitivane vrste. Redukciona moć metanolnog, acetonskog i etil-acetatnog ekstrakta je određena korišćenjem askorbinske kiseline kao standarda i rezultati su prikazani kao mikrogram ekvivalenta askorbinske kiseline po miligramu suvog ekstrakta (µg AAE/mg SE). Uzorci su 62