Istraživački rad za natjecanje iz biologije ožujka, 2014. 2. G Učinkovitost prirodnih i sintetskih antimikrobnih tvari na mikroorganizme u svakodnevici
SADRŽAJ 1. UVOD... 1 2. OBRAZLOŽENJE TEME... 3 3. MATERIJAL I METODE RADA... 5 3.1. MATERIJAL...... 5 3.2. METODE RADA... 5 3.2.1. Priprema hranjive podloge... 5 3.2.2. Prikupljanje i nacjepljivanje uzorka. 5 3.2.3. Sterilizacija pribora.. 6 3.2.4. Pregledavanje razvijenih mikroorganizama..... 6 3.2.5. Izolacija čiste kulture mikroorganizama.. 6 3.2.6. Mjerenje ph vrijednosti... 6 3.2.7. Ispitivanje djelovanja antibiotika i dezinficijenasa.. 7 3.2.8. Valorizacija rezultata... 7 4. REZULTATI.. 8 5. RASPRAVA... 15 6. ZAKLJUČCI... 18 7. SAŽETAK... 19 8. POPIS LITERATURE... 20
1. UVOD Mikroorganizmi su najraznovrsnija i najmnogobrojnija skupina živih bića. Najjednostavniji su, najsitniji i iznimno prilagodljivi. Tu ubrajamo viruse, prokariotske i eukariotske organizme. Najstariji su stanovnici Zemlje i prethodnici svih živih organizama, kozmopoliti su, postoje u svim životnim sredinama, klimatskim zonama, vodi, zraku i zemlji. Brojni su mikroorganizmi ključni za pojedine životno važne procese kao što je nitrifikacija tla i dr 1. Na površini tijela i predmeta koji nas okružuju postoje mikroorganizmi koji su redovni stanovnici. Prema djelovanju na čovjeka razlikujemo: patogene uzrokuju bolesti, nepatogene bezopasne ili korisne i uvjetno patogene normalno prisutne u nekom dijelu tijela, dok na drugom izazivaju bolest. Ovisno o prilagodbama na rast i razmnožavanje bakterija u različitim stupnjevima utječu hrana, voda, kisik, temperatura, ph vrijednost, osmotski tlak, koncentracija CO 2 i prisutnost različitih antimikrobnih tvari. Suzbijanje rasta mikroorganizama uvjetovano je njihovim prilagodbama, a antimikrobne tvari su mikrobicidni agensi, (nepovratni učinak ubijanja mikroorganizama), mikrobiostatički agensi, (koče rast i razmnožavanje) i germicidni agensi, (uništavaju mikrooganizme općenito) 2. Postoje mnoge antimikrobne tvari koje se međusobno razlikuju s obzirom na uspješnost i primjenu. Prema primjeni razlikujemo antiseptike, (za živa tkiva) i dezinficijense,(za nežive objekte). Na njihovu djelotvornost utječu temperatura, sadržaj vode i ph supstrata. Cilj njihovog djelovanja je sprječavanje prenošenja patogenih mikroorganizama po čovjekovoj sredini i unošenja u organizam, a problem je kada i kakav dezinficijens upotrijebiti. U organizam se mogu unijeti na različite načine, pa treba uzeti u obzir sredstvo koje je najdjelotvornije za najviše skupina mikroorganizama na različitim podlogama. Kriterij po kojemu se odabiru je najdjelotvornije uništavanje mikroorganizama uz najmanje neželjenih posljedica. Za suzbijanje rasta mikroorganizama koriste se i antibiotici 2. To su kemoterapijska sredstva koja ubijaju mikroorganizme i sprječavaju njihovo razmnožavanje. Njihova uporaba datira od 1904. kada je liječnik P. Ehrlich pronašao kemijski spoj koji smanjuje simptome bolesti 1 Dostupno na URL: http://www.medioteka.hr/portal/ss_biologija2.php, 12.02.2014 2 Volner, Z. 2000. Opća medicinska mikrobiologija s epidemiologijom i imunologijom, Školska knjiga, Zagreb 1
spavanja. Nakon brojnih istraživanja otkriće prvog antibiotika penicilina pripisuje se A. Flemingu, koji je 1928. utvrdio djelovanje penicilina na stafilokoke. Budući da je smatrao da penicilin ne može preživjeti u ljudskom tijelu, odbacio ga je kao lijek. Tek 1939. H. Flarey potvrdio je njegovo djelovanje u čovjeku 3. Usprkos koristi koju je čovječanstvo imalo od uporabe antibiotika, analize korištenja lijekova pokazuju njihovu zlouporabu. Koriste se neselektivno, kod nejasnih stanja, a za borbu protiv virusa potpuno su neučinkoviti. Zbog prevelike uporabe antibiotika ugrožena je njihova djelotvornost, jer bakterije, s obzirom na često susretanje s njima, razvijaju otpornost. Kao i svi lijekovi i antibiotici imaju nuspojave. To mogu biti alergijske reakcije ili toksična djelovanja na pojedine organe. Mogu stupati u međusobne interakcije ili interakcije s drugim lijekovima. Osim toga njihovom se primjenom osim štetnih uništava i velik broj korisnih bakterija pa se kao alternativa nude prirodni antibiotici. Mnoge su biljke prave kemijske tvornice. Eterična ulja kojima se utvrđuje djelotvornost koriste se od davnina, a svoju su primjenu našla tek u novije vrijeme. Istraživanja se rade modifikacijama antibiograma aromatogramima gdje se pomoću papirića natopljenih eteričnim uljima ustanovljava inhibicija rasta mikroorganizama na hranjivoj podlozi. Te tvari posjeduju i imunostimulirajuće djelovanje pa su zbog toga dobar izvor u borbi protiv čestih infekcija. Među eteričnim uljima koja se koriste od davnina su i neka iz mediteranskih biljaka široko rasprostranjenih na našem otoku, ružmarin, lovor, origano, luk, kojima je dokazano djelovanje na neke od bakterija i gljivice. U odnosu na antibiotike imaju prednost što je na njih gotovo nemoguće razviti rezistentnost jer sadrže toliki broj spojeva da se mikroorganizmi ne mogu na sve njih naviknuti 4. Uz eterična ulja tu spominjemo koloidno srebro koje je navodno korišteno i prije otkrića antibiotika, a djelovanje mu je antivirusno, antibakterijsko i antifungalno, propolis smolasta tvar s antitumorskim, antibakterijskim, antiupalnim i anestetskim svojstvima. Osim propolisa tu ubrajmo i med koji radi niskog ph, osmotske aktivnosti i djelovanjem enzima nastalog H 2 O 2 ima antimikrobno djelovanje 5. S obzirom na sve veću otpornost bakterija prema sintetskim antibioticima, dezinficijensima i antisepticima čini se da revolucionarno vrijeme antibiotika prolazi. 3 Kučišec-Tepeš, N.1994. Specijalna bakteriologija i odabrana poglavlja iz opće i specijalne mikologije, Školska knjiga, Zagreb 4 Novak, Prirodni sastojci učinkoviti su, http://www.nezavisni.hr/index.php/zdravlje/istrazivanja/item/111 ; Varićak, T., Eterična ulja kao prirodni antiobiotici, http://www.zdrav-zivot.com.hr/index.php?cat=etericna_ulja_kao_prirodni_antibiotici, 19. 01. 2014. 5 Hegić, G. Ljekovitost meda, pomaže od nesanice do metastaza, URL: http://dobarzivot.net/zdravlje/ljekovitost-meda-pomaze-odnesanice-do-metastaza-tumora/, 20.01.2014. 2
2. OBRAZLOŽENJE TEME "Mikrobi su svugdje, mikrobi su svemoćni, mikrobi će imati posljednju riječ." L. Pasteur Jesmo li oprali ruke? Krećemo li se gdje je veći broj ljudi? Dodirujemo li površine koje nisu svakodnevno sterilizirane, a u doticaju su s više ljudi? Čistimo li svakodnevno predmete koje često koristimo? Koliko je čovjek dobra podloga za razvoj mikroorganizama? Trebamo li više vjerovati kemijskim pripravcima ili starim metodama borbe protiv mikroorganizama? Moderno doba je postalo doba straha od bolesti, infekcija, zaraza i općenito mikroorganizama. Svakodnevno smo bombardirani reklamama za antiseptike, antibiotska sredstva, dezinficijense i druga sredstva za ubijanje ili inhibiranje rasta i razmnožavanja mikroorganizama. S druge strane, farmaceutska i kemijska industrija nude niz visokorazvijenih specifičnih i nespecifičnih sintetskih sredstava za borbu protiv mikroorganizama. Njihovo djelovanje je dokazano učinkovito, a temeljni su ciljevi: 1. Sprječavanje prenošenja patogenih mikroba po čovjekovoj sredini i njihovo unošenje u organizam 2. Sprječavanje kvarenja hrane djelovanjem mikroorganizama 3. Sprječavanje prisustva mikroorganizama na nužno sterilnim predmetima. Djelovanje tih tvari dijeli se na mikrobiostatičko, pri čemu se inhibira rast i razmnožavanje mikroorganizama i mikrobicidno - ubijanje mikroorganizama, a rezultat njihovog djelovanja je sterilizacija ili dezinfekcija. Antibiotici su kemijski spojevi dizajnirani za borbu protiv mikroba, osobito bakterija. Korištenje im je uvjetovano prisutnošću bakterija. No, danas se sintetski antibiotici često koriste i kada nisu potrebni, primjerice za blage infekcije, virusne infekcije ili preventivno. Njihova prečesta upotreba dovodi do negativnih posljedica kao što su slabljenje imuniteta i razvoj otpornih vrsta bakterija, a kod nekih osoba izazivaju alergijske reakcije. Jedan od često korištenih dezinficijensa su gelovi za čišćenje ruku. Naime, proizvođači tvrde da ta sredstva ubijaju 99.9% bakterija. No, je li to zapravo istina? Zbog negativnih posljedica liječenja sintetskim antibioticima ljudi se sve više okreću starim metodama 3
poput upotrebe pripravaka od limuna, meda i šećera kod grlobolje ili pak propolisa, smolaste tvari koju pčele sakupljaju sa različitih biljaka. Osim toga, koristi se koloidna srebrna voda koja je, navodno, efikasna u uništavanju više od 650 mikroorganizama, uključujući viruse, bakterije i gljivice, zatim češnjak, vitamin C, kadulja i mnogi drugi. Prirodni antibiotici, osim što uništavaju mikroorganizme, jačaju imunitet što pomaže organizmu da ih sam uništi te su tako infekcije rjeđe. Ovim radom želim provjeriti opravdanost straha od prisutnosti mikroorganizama na svim površinama i ustanoviti koliko je čovjek dobra podloga za bakterije. U tu svrhu sam uzorke prikupila s površine prsta, kose i predmeta s kojima sam u svakodnevnom doticaju, (kvaka na ulaznim vratima škole, daljinski upravljač, ekran mobitela, školska klupa), te ispitivanje učinkovitosti djelovanja sintetskih antibiotika, ( antibiotik širokog spektra acyclovirum u "Sumamedu", tetracyclinum u Geokortonu ) i proizvoda za dezinfekciju, ("Domestos", gel za dezinfekciju ruku trgovačkog imena "Asepsol" i "48"), i raznih prirodnih tvari, (ekstrakt češnjaka, propolis, med, koloidno srebro, lavandino, ružmarinovo i kantarion), te mjerenjem ph vrijednosti tvari i medija i metodom modificiranog antibiograma, saznati tko je uspješniji u uništavanju mikroorganizama i mogu li prirodne tvari djelovati sinergistički sa sintetskim. Upravo je prečesta upotreba sintetskih antibiotika problem u današnjem liječenju i ovim istraživanjem želim odrediti postoji li i kolika je razlika u djelotvornosti sintetskih i prirodnih antimikrobnih tvari na bakterije u našem neposrednom okolišu. Također želim dokazati jesu li točne tvrdnje da pojedine prirodne tvari uništavaju uzročnike bolesti jednako učinkovito kao i sintetski antibiotici te možemo li ih upotrebljavati kao njihovu "zamjenu" ili iskoristiti njihovo zajedničko djelovanje ili sinergističko djelovanje sa sintetskim tvarima Moja pretpostavka je da su prirodni antibiotici barem jednako djelotvorni kao sintetski u samostalnom djelovanju, a u kombinaciji sa sintetskim pretpostavljam da im pojačavaju djelovanje uz izazivanje manje popratnih pojava, lakše prerađivanje u organizmu i bez opterećivanja okoliša niti proizvodnjom niti odlaganjem. 4
3. MATERIJAL I METODE RADA 3.1. MATERIJAL Materijal ovog istraživanja su bakterije sa raznih područja iz naše svakodnevne okoline. Uzorci su prikupljeni sa predmeta s kojima smo u svakodnevnom dodiru - daljinskog upravljača, kvake na školskim vratima, školske klupe i mobitela, te s površine prsta, (jedan uzorak prije korištenja dezinfekcijskog gela i jedan nakon korištenja) i s vlasi kose. Ta područja odabrana su jer ih se najčešće dodiruje od strane više osoba. 3.2. METODE RADA 3.2.1. Priprema hranjive podloge Za pripremu hranjive podloge korištena je Baird Parkerova podloga, a pripremljena je otapanjem i zagrijavanjem 10 grama praškaste podloge u 1 dl destilirane vode. Nakon zagrijavanja u vodenoj kupelji otopina postaje homogena, izljeva se u sterilizirane Petrijeve zdjelice. Zdjelice se poklope i ostave na hlađenje. Nakon što su ohlađene na poleđinu su markerom napisani nazivi uzoraka: daljinski upravljač, školska kvaka, školska klupa, ekran mobitela, otisak prsta prije dezinfekcije gelom - prst 1, otisak prsta nakon dezinfekcije gelom "Asepsol" - prst 2, otisak prsta nakon dezinfekcije gelom "48 - prst 3 i kosa. 3.2.2. Prikupljanje i nacjepljivanje uzorka Za uzorak s površine prsta pritisnut je otisak kažiprsta direktno na pripremljenu hranjivu podlogu, ruka je zatim očišćena gelom za dezinfekciju te je na drugu hranjivu podlogu stavljen novi otisak. Vlas kose također je stavljena direktno na hranjivu podlogu. Petrijeve zdjelice su zatvorene i ostavljene na inkubaciju 24 sata na temperaturi od približno 37 stupnjeva Celzijusa. Za ostale uzorke sterilnim štapićem povučeno je po već navedenim površinama i nakon toga se istim štapićem s uzorkom, razmaže uzorak po hranjivoj površini u odgovarajućoj zdjelici. Uzorak se razmazuje u obliku zmije, lagano dodirujući 5
podlogu pri tome pazeći da ju se ne zagrebe. Zdjelice se zatvore i ostavljaju na inkubaciju 48 sati na temperaturi od približno 37 stupnjeva Celzijusa. 3.2.3. Sterilizacija pribora Sterilizacija pribora napravljena je Bunsenovim plamenikom pri čemu se vrh mikrobiološke ušice drži u plamenu dok se ne užari, zatim se kroz plamen nakratko provuče i metalni dio držala ušice. Ušica je izvađena iz plamena i ohlađena na dijelu hranjive podloge prije uzimanja uzorka mikroorganizama. 3.2.4. Pregledavanje razvijenih mikroorganizama Hranjive podloge s uzorcima pregledane su nakon 48 sati, a razvijeni mikroorganizmi makroskopski su opisani i popisani u tablice. Brojnost prisutnih mikroorganizama, označena je u tablicama relativnim vrijednostima, tako da su najrasprostranjenije označene +++; srednje rasprostranjene ++, malo rasprostranjene +, a mikroorganizmi koji nisu prisutni 0. Rezultati dobiveni s različitih hranjivih podloga su uspoređeni radi ustanovljavanja prisutnosti istog mikroorganizma na svim hranjivim podlogama. 3.2.5. Izolacija čiste kulture mikroorganizama Nakon utvđivanja prisutnosti jednog mikroorganizma na više hranjivih podloga, uzorak se precjepljuje na novu hranjivu podlogu. Postupak se odvija tako da se Petrijeva zdjelica s uzorcima položi na hranjivu podlogu okrenuta prema dolje, podigne se poklopac tako da bude okrenut prema gore. Poklopac se podigne tako da se pojavi mali otvor kroz koji se može provući sterilizirana milrobiološka ušica. Ušicom se lagano zahvati malo uzorka s jedne kolonije i prenese na novu hranjivu podlogu metodom rijetkog nasađivanja. Petrijeva zdjelica se zatvori i ostavi na temperaturi od približno 37 stupnjeva Celzijusa 48 sati. Taj postupak izolacije primjenjuje se za izolaciju najrasprostranjenijih bakterija. 3.2.6. Mjerenje ph vrijednosti Pripremljene su otopine koje se planiraju koristiti u modificiranom antibiogramu. Univerzalnim indikatorskim papirom izmjerene su vrijednosti svake tvari; sintetski 6
antibiotik. Domestos, gelovi za dezinfekciju ruku, ekstrakt češnjaka, propolis, med, koloidno srebro, ružmarionovo, lavandino i kantrarionovo ulje i ph hranjive podloge. ph kože izmjeren tako da je koža navlažena destiliranom vodom i ph je izmjeren univerzalnim indikatorskim papirom. 3.2.7. Ispitivanje djelovanja antibiotika i dezinficijenasa Ispitivanje djelovanja antibiotika i dezinficijenasa provedeno je modificiranom antibiogram metodom. U tu svrhu se pripremljena antimikrobna sredstva nanose na krugove filter papira. Pripremljeni krugovi stavljeni su na hranjive podloge na koje se nacjepljuju bakterije. Prvo ispitivanje provedeno je tako da je svaka od prisutnih bakterija tretirana sintetskim antibioticima. Tako pripremljene Petrijeve zdjelice stave se na temperaturu od približno 37 stupnjeva Celzijusa na 48 sati. Nakon tog vremena pomičnom mjerkom mjeri se promjer zone bez mikroorganizama oko svakog kruga filter papira. Zatim se na bakteriju na kojoj su sintetski antibiotici pokazali najbolje i najlošije djelovanje ispituje djelovanje prirodnih antibiotika i to tako da se prvo ispituje njihovo zajedničko, a zatim pojedinačno djelovanje. U svakom od postupaka pripremljene Petrijeve zdjelice stave se na temperaturu od približno 37 stupnjeva Celzijusa na 48 sati. Nakon tog vremena pomičnom mjerkom mjeri se promjer zone bez mikroorganizama oko svakog kruga filter papira. 3.2.8. Valorizacija rezultata Nakon mjerenja računaju se koeficijenti uspoređivanjem zone djelovanja i veličine kruga filter papira. Dobiveni su rezultati unešeni u tablice. Rezultati djelovanja pojedinih prirodnih antimikrobnih tvari uspoređeni su s vrijednostima za sintetske antimikrobne tvari, a statistička značajnost odstupanja u rezultatima provjerena je hi kvadrat testom. 7
BROJ PRISUTNIH VRSTA KOL. OBLK KOLONIJE RUB KOLONIJE IZGLED POVRŠINE PROZIR- NOST BOJA KONZINST ENCIJA VELIČINA 4. REZULTATI Proučavani su uzorci prikupljeni sa 7 različitih podloga. (tablica 1). Tablica 1. Makroskopski opisane bakterijske kolonije po uzorcima UZORCI ŠKOLSKA KVAKA (uzorak 1.) ŠKOLSKA KLUPA (uzorak 2.) DALJINSK I UPRAV- LJAČ (uzorak 3.) EKRAN MOBITEL A (uzorak 4.) PRST OČIŠĆEN GELOM (uzorak 5.) PRST (uzorak 6.) VLAS KOSE (uzorak 7.) 4 okrugao gladak glatka ne žuta maziva mala nepravilan valovit hrapav polu bijela maziva velika okrugao gladak glatka ne bijela homogena mala nepravilan gladak hrapav ne narančasta homogena mala 5 nepravilan valovit hrapava polu bijela maziva velika okrugao gladak glatka ne žuta maziva mala okrugao gladak glatka ne narančasta homogena mala okrugao gladak glatka ne bijela homogena mala nepravilan valovit hrapava polu smeđa maziva srednja 3 nepravilan valovit hrapav polu bijela maziva velika okrugao gladak glatka ne bijela homogena mala okrugao gladak glatka ne narančasta homogena mala 3 nepravilan valovit hrapav polu bijela maziva velika okrugao gladak glatka ne žuta maziva mala okrugao gladak glatka ne bijela homogena mala 3 nepravilan valovit hrapav polu bijela maziva velika okrugao gladak glatka ne bijela homogena mala nepravilan režnjast glatka polu žuta maziva mala 4 okrugao gladak glatka ne žuta maziva mala okrugao gladak glatka ne bijela homogena mala okrugao gladak glatka ne narančasta homogena mala nepravilan valovit hrapav polu bijela maziva velika 4 okrugao gladak glatka ne bijela maziva velika okrugao gladak glatka ne narančasta homogena mala okrugao gladak glatka ne žuta maziva mala nepravilan gladak glatka ne bijela homogena mala Na uzorcima je makroskopski opisano između 3 i 5 vrsta bakterijskih kolonija. Uočeno je da su na svim podlogama prisutne iste vrste kolonija. Tablica koja je korištena za makroskopsko opisivanje je u prilogu, a u tablici 1 dat je pregled makroskopski opisanih bakterijskih kolonija na svim uzorcima s njihovim osnovnim obilježjima. Popisivanjem relativne zastupljenosti makroskopski opisanih kolonija po uzorcima, ustanovljeno je da je od 3 kolonije koje se pojavljuju na svim uzorcima, kolonija koja je 8
opisana kao bijela nepravilna dominantna, tj. najzastupljenija na svim podlogama. Također je ustanovljeno da je njen razvoj brži od ostalih jer promatranjem nacijepljenih podloga nakon 24 sata (Slika 1.), uglavnom je isključivo ona prisutna. Slika 1. Bakterijske kolonije s uzorka školska kvaka nakon 24 sata Slika 2. Bakterijske kolonije na uzorku ekran mobitela nakon 48 sati Slika 3. Bakterijske kolonije s uzorka prst neočišćen, nakon 48 sati Slika 4. Bakterijske kolonije na uzorku prst očišćen gelom, nakon 48 9
Slika 5. Bakterijske kolonije na uzorku školska klupa nakon 48 sati Druga kolonija prisutna na svim podlogama je bijela okrugla, dok ostale kolonije variraju prisutnošću i relativnom zastupljenošću od uzorka do uzorka. Najrjeđe prisutne kolonije su smeđa nepravilna i narančasta okrugla, koje su prisutne samo na nekoliko uzoraka i tada im je relativna zastupljenost mala (Slike 2., 3., 4. i 5.). Realtivna zastupljenost prisutnih kolonija prikazana je u tablici 2. Tablica 2. Relativna zastupljenost prisutnih makroskopski opisanih kolonija na uzorcima Uzorak Prisutna kolonija Žuta okrugla Bijela okrugla Narančasta okrugla Smeđa nepravilna Bijela nepravilna UZORAK 1. ++ ++ + 0 +++ UZORAK 2. + ++ + + +++ UZORAK 3. 0 + + 0 +++ UZORAK 4. + + 0 0 +++ UZORAK 5. + + 0 0 +++ UZORAK 6. + ++ 0 ++ +++ UZORAK 7. + ++ ++ 0 +++ 10
Na tri najzastupljenije bakterijske kolonije ispitali smo djelovanje sintetskih antibiotika i antiseptika od kojih su korišteni otopina sumameda,(azitromicin), geokorton mast (oksitetraciklin-hidrokortizon), octanisept (oktenidinklorid fenoksietanol) i dermatol (natrijev benzoat, natrijev silikat, kalijev sorbat, soli kalija, magnezija i natrija) i domestos (natrijev hipoklorit). Rezultati su prikazani u tablici 3, a izraženi su koeficijentima koji su izračunati kao omjer promjera kruga bez bakterija na podlozi i promjera filter papira s nanešenim sredstvom (Slika 6.). Slika 6. Mjerenje promjera kruga bez bakterija Relativno najveći koeficijent pokazuje otopina sumameda, dok najmanji pokazuje octanisept. Najmanji utjecaj sintetski su antibiotici pokazali na koloniju koja je opisana kao žuta okrugla (Slika 7.) dok je najbolji utjecaj uočen na bijelu nepravilnu koloniju (Slika 8.). Slika 7. Djelovanje sintetskih antibiotika na okruglu žutu koloniju Slika 8. Djelovanje sintetskih antibiotika na bijelu nepravilnu 11
Tablica 3. Djelovanje sintetskih antibiotika na prisutne kolonije izraženo koeficijentima ANTIBIOTIK ŽUTA OKRUGLA BIJELA OKRUGLA BIJELA NEPRAVILNA SUMAMED 1 1,27 1,24 GEOKORTON 1,32 1 1,13 OCTANISEPT 1 1,17 1 DOMESTOS 1,34 1,30 1,31 DERMATOL 1 1 1,09 Na bakterijske kolonije na koje su sintetski antibiotici pokazali relativno najbolje i najlošije djelovanje ispitano je djelovanje prirodnih antibiotskih tvari od kojih su korišteni ekstrakt češnjaka, med, lavanda, kantarionovo ulje, koloidno srebro, ružmarin i propolis. Rezultati njihovog samostalnog djelovanja prikazani su u tablici 4, također su izraženi koeficijentima koji se kao i kod djelovanja sintetskih antibiotika računaju kao omjer promjera kruga bez bakterija i promjera filter papira sa djelatnom tvari (Slika 9.). Slika 9. Mjerenje kruga bez bakterija kod prirodnih antibiotika lavanda Tablica 4. Djelovanje prirodnih antibiotika na odabrane bakterijske kolonije izraženo koeficijentima NAZIV PRIRODNOG ANTIBOTIOKA UZORAK 1. (bijela nepravilna) UZORAK 2. (žuta okrugla) LUK 1 1 MED 1 1 LAVANDA 1,35 1,59 KANTARION 1 1 KOLOIDNO 1 1 SREBRO RUŽMARIN 1,125 1,25 PROPOLIS 1 1 12
Eterična ulja lavande i ružmarina pokazuju djelovanje na obje istraživane kolonije, dok ostali prirodni antibiotici u samostalnom djelovanju ne pokazuju nikakav rezultat (Slika 10.). Slika 10. Djelovanje ekstrakta češnjaka i koloidnog srebra na bijelu nepravilnu bakterijsku koloniju nakon 48 sati Nanošenjem više prirodnih antibiotika na bakterijsku podlogu dobiveni su bolji rezultati, ali djelovanje meda i kantarionovog ulja i dalje se pokazuje kao najlošije (Slike 11. i 12.) Slika 11. Zajedničko djelovanje prirodnih antibiotika na bijelu okruglu bakterijsku koloniju nakon 48 sati Slika 12. Zajedničko djelovanje prirodnih i sintetskih bakterija na žutu okruglu bakterijsku koloniju Rezultati hi kvadrat testiranja prikazani su u tablici 5. (Ostale tablice se nalaze u prilogu). 13
Tablica 5. Hi kvadrat testiranje koeficijenata djelovanja sumameda (f t ) i lavande (f 0 ) na žutu okruglu i bijelu nepravilnu bakterijsku koloniju f 0 f t f 0 - f t (f 0 - f t) 2 1,59 1,0 0,59 0,3481 0,3481 1,35 1,24 0,11 0,0121 0,009758 = 0,357858 Dobiveni hi kvadrat uz jedan stupanj slobode i 1% - tno odstupanje znatno je manji od granične vrijednosti za 6,637 pa odstupanje nije statističko značajno. Mjerenja ph provedena su univerzalnim indikatorskim papirom (Slika 12.), a utvrđeno je da sva antimikrobna sredstva sintetska i prirodna kao i hranjiva podloga imaju neutralana ph, između 6 i 7, jedino odstupanje prisutno je kod domestosa koji pokazuje lužnatost, ph 12. Slika 13. Mjerenje ph univerzalnim indikatorskim papirom 14
5. RASPRAVA Istraživanjem smo pokušali utvrditi prisutnost bakterija na nama i predmetima u našem neposrednom okolišu i u tu svrhu smo prikupili 7 uzoraka i učinkovitost uobičajenih sintetskih i prirodnih antimikrobnih sredstava. Kolonije koje su se razvile opisane su makroskopski i utvrđeno je da se na svih sedam uzoraka nalaze 3 iste kolonije i 2 koje se pojavljuju na pojedinim uzorcima. S obzirom na to da se čovjek ne smatra iznimno dobrom podlogom za bakterije radi relativno kiselog ph, 5,5 nije nas iznenadilo da su na koži prstiju i kosi prisutne iste bakterijske kolonije koje su prisutne i na predmetima u neposrednom okolišu. Opravdanost straha od bakterija - U našem neposrednom okolišu smo, dakle, zaista okruženi bakterijama koje se doticanjem tih površina prenose na naše tijelo (Slike 1., 2., 3., 4. i 5.). Promatranjem razvoja bakterijskih kultura na hranjivim podlogama uočila sam da je jedna od kolonija dominantna, razvija se i širi brže od ostalih. Ta je bakterijska kolonija makroskopski opisana kao bijela nepravilna kolonija. Učinkovitost uobičajenih dezinfekcijskih i antiseptičkih sredstava - Ruke su nakon uzimanja prvog uzorka očišćene antiseptičkim gelovima za ruke i nakon toga je uzet drugi uzorak. (slika 4.) Na oba uzeta uzorka su prisutne iste bakterijske kolonije, iako je na uzorku uzetom nakon čišćenja ruku gelovima relativna brojnost bakterija nešto manja. Ti proizvodi u najvećem dijelu sadržavaju alkohol kao djelotvornu tvar, premda je samo od onih koji sadrže 60 90%tni alkohol opravdano očekivati baktericidno djelovanje. Uobičajeni gelovi za suho pranje ruku sadrže 45% - tni etanol koji u tu svrhu nije učinkovit 6. Deklariranje tih gelova kao antiseptičkih ili dezinfekcijskih zapravo je neprimjereno jer od opisanih 4 vrste bakterijskih kolonija prisutnih na neočišćenom prstu, nakon čišćenja gelom ostaju prisutne 3 vrste, što je 75% bakterija, dok je njegova učinkovitost 25%. Drugo uobičajeno sredstvo za dezinfekciju je Domestos, kemijski aktivna tvar u njemu je natrijev hipoklorit koji ima jaka oksidacijska svojstva. Pokazao se djelotvoran na svim bakterijskim kolonijama. Učinkovitost na prisutne bakterijske kolonije mu je bila najveća od sintetskih tvari, ali statistički nije odstupala od ostalih uobičajenih 6 Vidić Štras, I., Antibakterijski gelovi gelovi za suho pranje ruku. URL: http://www.inpharma.hr/index.php/news/159/18/antibakterijski-gelovi-gelovi-za-suho-pranje-ruku, 13.01.2014. 15
dezinfekcijskih sredstava, a upotreba mu svakako nije preporučljiva na živom tkivu. Opravdava svoju titulu apsolutnog dezinficijensa na prisutnim bakterijskim kolonijama. Sredstvo koje često upotrebljavamo za dezinfekciju rana je Octanisept po kemijskom sastavu sadrži oktenidinklorid i fenoksietanol, pokazalo se slabo djelotvorno i to samo na jednu vrstu bakterijskih kolonija. Budući da je bočica s raspršivačem bila u upotrebi neko vrijeme prije istraživanja, premda propisno pohranjena i zatvorena, mogu uzeti u obzir da mu se djelotvornost smanjila radi isparavanja aktivnih tvari, tako da u preporuci za korištenje, a nakon provjeravanja djelotvornosti sredstva odmah nakon otvaranja, svakako treba navesti da mu se djelotvornost smanjuje nakon određenog vremena, ako to istraživanje potvrdi. Često korištena antibiotska mast za rane Geokorton po kemijskom sastavu tetraciklin, pokazala se djelotvornom na prisutne vrste bakterija u okolišu te njena djelotvornost ne odstupa statistički značajno od jakog Domestosa, (tablice u prilogu), tako da je i primjena te masti u svrhu suzbijanja bakterija opravdana (Slike 7. i 8.). Djelotvornost prirodnih antimikrobnih tvari - Na mnogim internetskim stranicama navode se podaci o djelotvornosti prirodnih antibiotika 7, većina od upotrebljenih prirodnih sredstava nisu pokazala nikakvu djelotvornost u samostalnom djelovanju. Kao najdjelotvorniji su se pokazali eterično ulje lavande i ružmarina (Slika 9.). Budući da njihova djelotvornost statistički ne odstupa od djelovanja pouzdanih dezinficijenasa, (tablice u prilogu), a po koeficijentu djelotvornosti čak pokazuje i veću djelotvornost, (tablica 4), svakako im je opravdana upotreba u svrhu antiseptičkog i dezinfekcijskog djelovanja. S obzirom na ugodan miris, upotreba im nije ograničena na vanjsku primjenu, kao što je slučaj kod octanisepta i domestosa, nego se mogu koristiti i kao ulja u aromatskim lampama, nakapati na mrežice klima uređaja, vrećice usisavača i sl, kako bi antiseptički djelovali na bakterije u zraku posebno u prostorima u kojima boravi više ljudi. Koloidno srebro za koje se navodi da je djelotvorno protiv čak 700 bakterija 8, nije pokazalo nikakvu djelotvornost na prisutne bakterijske kolonije. S obzirom na prisutnost većeg broja proizvođača svakako uzimam u obzir da sam na raspolaganju 7 dostupno na: URL: http://www.kemig.hr/kozmetika/brandovi/pranarom/etericno ulje mravinca prirodni antibiotik. 13.01.2014; Novak, Ivan Prirodni sastojci učinkoviti su poput sintetiziranih lijekova, URL:http://www.nezavisni.hr/index.php/zdravlje/istrazivanja/item/111, 19.01.2014. Varićak, Tajana, Eterična ulja kao prirodni antiobiotici, URL: http://www.zdravzivot.com.hr/index.php?cat=etericna_ulja_kao_prirodni_antibiotici, 19. 01. 2014. 8 Becker, R., Koloidno srebro, URL: http://www.conchiglia.us/hrvatska/hr_monos/hr_monos_2010set29_argento_colloidale_tecnosalute_ferioli.pdf, 19.01.2014. 16
imala manje kvalitetan proizvod i da djelotvornost koloidnog srebra treba ispitati uspoređujući proizvode više različitih proizvođača. Med i propolis također nisu pokazali očekivanu djelotvornost na suzbijanje bakterija 9, tako da ne mogu potvrditi njihovu antiseptičku učinkovitost, međutim kao i češnjak, od davnine upotrebljavan kao prirodni antibiotik, unose se u organizam oralno pa moram uzeti u obzir moguću djelotvornost na bakterije unutar organizma. Svakako s obzirom na njihovo djelovanje na imunitet, a imajući u vidu ostale aktivne komponente koje sadrže, ne mogu isključiti njihovu važnost u obrani organizma od bakterija. Kantarionovo ulje nije se pokazalo učinkovito protiv prisutnih bakterijskih kolonija, a budući se njegova upotreba preporuča za njegovanje rana i opekotina radi protuupalnog djelovanja 10, zaključujem da mu djelovanje nije antiseptičko nego ima utjecaj na pojačanu epitelizaciju tkiva. Djelovanje sumameda - Sintetski, opće primjenjivan antibiotik širokog spektra - sumamed, (azitromicin), nije pokazao statistički značajno bolje djelovanje na bakterijske kolonije, (tablica u prilogu), a na jednu od kolonija čak nije uopće pokazao djelovanje. (Slika 6.) Kao i kod meda, propolisa i češnjaka treba uzeti u obzir da se uzima oralno pa možda pokazuje jače djelovanje na bakterije unutar organizma (Slika 10.). Ipak, s obzirom na pokazanu učinkovitost, a i djelovanje na ljudski organizam, preporuka bi svakako trebala biti korištenje specifičnih antibiotika, ovisno o antibiogramima provedenim na brisevima infekcijom zahvaćenog organskog sustava. Sinergističko djelovanje antimikrobnih tvari - Prirodne antimikrobne tvari pokazale su značajno jaču antibakterijsku aktivnost kada su stavljene da zajednički djeluju na jednoj podlozi. (Slike 10. i 11.) Bakterijske kolonije nisu se uglavnom uopće razvijale, pri čemu se primjećuju samo uz kantarion i med 11. Brojna istraživanja koja dokazuju djelotvornost prirodnih antibiotika posebno u njihovom sinergističkom djelovanju uglavnom uzimaju u obzir da je te tvari potrebno uzimati u većim količinama i kroz duži vremenski period da bi pokazale svoju stvarnu djelotvornost, koja je prema tim istraživanjima bolja nego kod sintetskih lijekova. 9 Pasarić, S., 9 prirodnih antibiotika koji će vam pomoći u borbi protiv infekcija, URL: http://alternativa-zavas.com/index.php/clanak/article/9-prirodnih-antibiotika, 19.01.2014. 10 Dragica, I., Kantarionovo ulje, URL: http://alternativa-za-.vas.com/index.php/clanak/article/kantarionovo-ulje, 19.01.2014. 11 Novak, I., Prirodni sastojci učinkoviti su poput sintetiziranih lijekova, URL: http://www.nezavisni.hr/index.php/zdravlje/istrazivanja/item/111, 19.01.2014 17
6. ZAKLJUČCI Na sedam odabranih uzoraka ustanovljena je prisutnost ukupno 5 makroskopski različitih bakterijskih kolonija od kojih su 3 prisutne na svim uzorcima, a 2 se pojavljuju povremeno. Kolonija opisana kao bijela nepravilna dominantna je jer je na svim podlogama relativno najviše rasprostranjena, a razvija se i brže od ostalih. Na uzorcima uzetim s čovjeka prisutne su iste bakterijske kolonije kao i na površinama u neposrednoj okolini što znači da se bakterije iz okoliša prenose na čovjeka. Djelotvornost sintetskih antiseptika pokazala se upitna, tako da gelovi za suho pranje ruku ne mogu zamijeniti provjerenu metodu pranja ruku sapunom i toplom vodom, a antiseptičkim se sredstvima koja sadrže alkohole mora uzeti u obzir da im djelotvornost može slabiti duljim stajanjem radi hlapljenja aktivnih tvari. Djelotvornost antibiotske masti ostaje očuvana. Domestos kao dezinficijens dokazano je učinkovit protiv bakterija u našem okolišu. Učinkovitost Sumameda kao sintetskog antibiotika nije apsolutna te bi svakako preporučljivije od njegove nekritične upotrebe bilo prepisivanje specifičnih antibiotika ovisno o antibiogramima provedenim na brisevima infekcijom zahvaćenog organskog sustava. Unatoč očekivanjima svi prirodni antibiotici nisu dokazali učinkovitost protiv bakterija u samostalnom djelovanju. Jedini učinkoviti pokazali su se eterično ulje lavande i ružmarina. U zajedničkom djelovanju prirodni antibiotici pokazali su se kao apsolutni čistači bakterija uzgojenih u našim uvjetima, i u tom slučaju uočljiva je slabija djelotvornost kantarionovog ulja i meda, kojima ipak pripisujemo djelovanje na epitelizaciju tkiva kod kantarionovog ulja i utjecaj na povećanje imuniteta zahvaljujući bogatstvu ostalih sastojaka u medu. Hipoteza da se antimikrobno djelovanje prirodnih antibiotika pojačava sinergijom pokazala se točna. Nismo dokazali statistički značajno odstupanje u samostalnom djelovanju sintetskih i prirodnih antibiotika, uzimajući u obzir samo one koji su se pokazali aktivnima u tom pogledu te je početna hipoteza da su barem jednako djelotvorni na ovaj način potvrđena. Svakako je za preporuku korištenje eteričnih ulja ugodnog mirisa za dezinfekciju prostorija u kojima boravi više ljudi. Njihova upotreba je raznovrsna, u aroma svjetiljkama, u obliku kapljica na mrežicama klima uređaja, uz grijaće elemente, a osim što djeluju antiseptički na prostor imaju i dokazana djelovanja na druge organske sustave kao što je dišni, živčani i dr. 18
Budući da je potrošnja sintetskih antibiotika u stalnom porastu, a često nije opravdana i vrlo je neselektivna, velik broj bakterija razvija rezistentnost na te lijekove. Farmaceuti preporučuju, a mi se ovim radom pridružujemo tim preporukama, velik oprez kod primjene antibiotika jer na području farmakološke sinteze novih antibiotika nema pomaka, tako da ako bakterije postanu rezistentne na postojeće, nema alternative za liječenje mnogih bolesti. 7. SAŽETAK Mikroorganizmi su najraznovrsnija i sveprisutna skupina živih bića. S obzirom na njihovu rasprostranjenost i različite utjecaje koje imaju na čovjeka razvijena su različita sredstva kojima se suzbija njihov rast i razmnožavanje, a najčešće se deklariraju kao antiseptici, dezinficijensi i antibiotici. Istraživanje je provedeno da bi se provjerila opravdanost straha od bakterija i ukazalo na moguće antimikrobno djelovanje prirodnih tvari kao alternativu uporabi sintetskih na koje radi česte i nekritične uporabe bakterije razvijaju otpornost, javljaju se neželjene reakcije kod ljudi, a njihova proizvodnja i odlaganje predstavlja i ekološki problem. Ispitane su površine koje se svakodnevno dodiruju te koža i kosa pri čemu je ustanovljeno da su na svima prisutne uglavnom iste vrste bakterijskih kolonija. Uobičajeni antiseptici nisu pokazali očekivanu djelotvornost, dezinficijensi su se pokazali učinkoviti, a sintetskim antibioticima učinkovitost je ovisila o vrsti bakterijskih kolonija. Prirodne antimikrobne tvari nisu pokazale očekivanu učinkovitost, osim eteričnog ulja lavande i ružmarina, kojima je hi kvadrat testom ispitana djelotvornost u odnosu na sintetske tvari i pri tome je ustanovljeno da nema statistički značajne razlike u njihovoj djelotvornosti. U zajedničkom djelovanju prirodne su tvari učinkovitije te se pokazuje da je njihovo sinergističko djelovanje puno bolje od djelovanja svake pojedinačne antimikrobne tvari. Treba propitivati opravdanost upotrebe sintetskih antimikrobnih tvari i poznavati njihov kemijski sastav da bi se steklo povjerenje u njihovu djelotvornost. Djelovanje prirodnih antimikrobnih tvari svakako je potrebno dalje ispitati kao i njihov učinak na jačanje imuniteta i brži oporavak od bolesti, kao antiseptici uspješno se mogu koristiti eterična ulja nekih biljaka. 19
8. POPIS LITERATURE 1. Anonymus, ZVRK: tween & teen web magazin, http://www.medioteka.hr/portal/ss_biologija2.php, 12.02.2014 2. Anonymus, Eterično ulje mravinca - "Prirodni antibiotik", Kemig, http://www.kemig.hr/kozmetika/brandovi/pranarom/etericno_ulje_mravinca pri rodni_antibiotik_, 13.01.2014 3. Dragica, I., Kantarionovo ulje crveni eliksir, Alternativa za vas, http://alternativaza-.vas.com/index.php/clanak/article/kantarionovo-ulje, 19.01.2014. 4. Hegić, G. Ljekovitost meda, pomaže od nesanice do metastaza, Dobar život, http://dobarzivot.net/zdravlje/ljekovitost-meda-pomaze-od-nesanice-do-metastazatumora/, 20.01.2014. 5. Kučišec-Tepeš, N.1994. Specijalna bakteriologija i odabrana poglavlja iz opće i specijalne mikologije, Školska knjiga, Zagreb 6. Becker, R., Koloidno srebro: Prirodni neotrovni antibiotik, Movimento D'amore San Juan Diego http://www.conchiglia.us/hrvatska/hr_monos/hr_monos_2010set29_arge nto_colloidale_tecnosalute_ferioli.pdf, 19.01.2014. 7. Novak, I., Prirodni sastojci učinkoviti su poput sintetiziranih lijekova, Nezavisni, http://www.nezavisni.hr/index.php/zdravlje/istrazivanja/item/111, 19.01.2014. 8. Pasarić, S., 9 prirodnih antibiotika koji će vam pomoći u borbi protiv infekcija, Alternativa za vas, http://alternativa-za-vas.com/index.php/clanak/article/9- prirodnih-antibiotika, 19.01.2014. 9. Varićak, T., Eterična ulja kao prirodni antiobiotici, Zdrav život: obiteljski časopis o zdravlju, http://www.zdravzivot.com.hr/index.php?cat=etericna_ulja_kao_prirodni_antibiotici, 19. 01. 2014. 10. Vidić Štras, I., Antibakterijski gelovi gelovi za suho pranje ruku, inpharma: časopis za stručnu javnost, http://www.inpharma.hr/index.php/news/159/18/antibakterijski-gelovi-gelovi-zasuho-pranje-ruku, 13.01.2014. 11. Volner, Z. 2000. Opća medicinska mikrobiologija s epidemiologijom i imunologijom, Školska knjiga, Zagreb 20
PRILOG PRILOG 1. Tablica 1. Makroskopske karakteristike kolonije OBLIK KOLONIJE točkast okrugao nepravilan korijenast RUB KOLONIJE gladak valovit končast resičav rastrgan PRESJEK KOLONIJE IZGLED POVRŠINE plosnat uzdignut konveksan bradavičast hrapava glatka sluzava PROZIRNOST prozirna poluprozirna neprozirna BOJA žuta narančasta smeđa bijela KONZISTENCIJA suha vlažna sluzava maziva VELIČINA KOLONIJE sitne srednje velike RELATIVNA ZASTUPLJENOST KOLONIJE NA UZORKU dominantna +++ srednje zastupljena ++ zastupljena u tragovima + nije prisutna 0
PRILOG 2. Tablica 2. Hi kvadrat testiranje koeficijenata djelovanja sumameda (f t ) i ružmarina (f 0 ) na žutu okruglu i bijelu nepravilnu f 0 f t f 0 - f t (f 0 - f t) 2 1,25 1,0 0,25 0,0625 0,0625 1,125 1,24-0,115 0,013225 0,0106653 = 0,0731653 Dobiveni hi kvadrat uz jedan stupanj slobode i 1% - tno odstupanje znatno je manji od granične vrijednosti za 6,637 pa odstupanje nije statističko značajno. Tablica 3. Hi kvadrat testiranje koeficijenata djelovanja geokortona (f t ) i lavande (f 0 ) na žutu okruglu i bijelu nepravilnu f 0 f t f 0 - f t (f 0 - f t) 2 1,59 1,0 0,59 0,3481 0,3481 1,35 1,24 0,11 0,0121 0,0097581 = 0,3578581 Dobiveni hi kvadrat uz jedan stupanj slobode i 1% - tno odstupanje znatno je manji od granične vrijednosti za 6,637 pa odstupanje nije statističko značajno. Tablica 4. Hi kvadrat testiranje koeficijenata djelovanja sumameda (f t ) i ružmarina (f 0 ) na žutu okruglu i bijelu nepravilnu f 0 f t f 0 - f t (f 0 - f t) 2 1,25 1,32-0,07 0,0049 0,00371212 1,125 1,13-0,005 0,000025 0,000022124 = 0,003734244 Dobiveni hi kvadrat uz jedan stupanj slobode i 1% - tno odstupanje znatno je manji od granične vrijednosti za 6,637 pa odstupanje nije statističko značajno.
Tablica 5. Hi kvadrat testiranje koeficijenata djelovanja octanisepta (f t ) i lavande (f 0 ) na žutu okruglu i bijelu nepravilnu f 0 f t f 0 - f t (f 0 - f t) 2 1,59 1,0 0,59 0,3481 0,3481 1,35 1,0 0,35 0,1225 0,1225 = 0,4706 Dobiveni hi kvadrat uz jedan stupanj slobode i 1% - tno odstupanje znatno je manji od granične vrijednosti za 6,637 pa odstupanje nije statističko značajno. Tablica 6. Hi kvadrat testiranje koeficijenata djelovanja octanisepta (f t ) i ružmarina (f 0 ) na žutu okruglu i bijelu nepravilnu f 0 f t f 0 - f t (f 0 - f t) 2 1,25 1,0 0,25 0,0625 0,0625 1,125 1,0 0,125 0,015625 0,015625 = 0,078125 Dobiveni hi kvadrat uz jedan stupanj slobode i 1% - tno odstupanje znatno je manji od granične vrijednosti za 6,637 pa odstupanje nije statističko značajno. Tablica 7. Hi kvadrat testiranje koeficijenata djelovanja domestosa (f t ) i lavande (f 0 ) na žutu okruglu i bijelu nepravilnu f 0 f t f 0 - f t (f 0 - f t) 2 1,59 1,34 0,25 0,0625 0,0466418 1,35 1,31 0,04 0,0016 0,001221374 = 0,047863174 Dobiveni hi kvadrat uz jedan stupanj slobode i 1% - tno odstupanje znatno je manji od granične vrijednosti za 6,637 pa odstupanje nije statističko značajno. Tablica 8. Hi kvadrat testiranje koeficijenata djelovanja domestosa (f t ) i ružmarina (f 0 ) na žutu okruglu i bijelu nepravilnu f 0 f t f 0 - f t (f 0 - f t) 2 1,25 1,34-0,09 0,0081 0,006044776 1,125 1,31-0,185 0,034225 0,02612595 = 0,032170726 Dobiveni hi kvadrat uz jedan stupanj slobode i 1% - tno odstupanje znatno je manji od granične vrijednosti za 6,637 pa odstupanje nije statističko značajno.
Tablica 9. Hi kvadrat testiranje koeficijenata djelovanja sumameda (f t ) i octanisepta (f 0 ) na žutu okruglu i bijelu nepravilnu f 0 f t f 0 - f t (f 0 - f t) 2 1,0 1,34-0,34 0,1156 0,086269 1,0 1,31-0,31 0,0961 0,073359 = 0,159628 Dobiveni hi kvadrat uz jedan stupanj slobode i 1% - tno odstupanje znatno je manji od granične vrijednosti za 6,637 pa odstupanje nije statističko značajno.