UNIVERZITET U BEOGRADU FARMACEUTSKI FAKULTET Vanja M. Todorović ISPITIVANJE ANTIOKSIDATIVNOG I ANTIMIKROBNOG POTENCIJALA KAKAO PRAHA I NJEGOVOG UTICAJ

Транскрипт

1 UNIVERZITET U BEOGRADU FARMACEUTSKI FAKULTET Vanja M. Todorović ISPITIVANJE ANTIOKSIDATIVNOG I ANTIMIKROBNOG POTENCIJALA KAKAO PRAHA I NJEGOVOG UTICAJA NA PONAŠANJE MIŠEVA NAKON KRATKOTRAJNE I DUGOTRAJNE SUPLEMENTACIJE doktorska disertacija Beograd, 2018

2 UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF PHARMACY Vanja M. Todorović INVESTIGATION OF COCOA POWDER S ANTIOXIDANT AND ANTIMICROBIAL POTENTIAL AND ITS IMPACT ON MICE BEHAVIOR AFTER SHORT-TERM AND LONG-TERM SUPPLEMENTATION Doctoral Dissertation Belgrade, 2018

3 MENTOR: dr Slađana Šobajić, redovni profesor Univerziteta u Beogradu - Farmaceutski fakultet ČLANOVI KOMISIJE: dr Miroslav Savić, redovni profesor Univerziteta u Beogradu - Farmaceutski fakultet dr Boris Šakić, Associate Professor, Department of Psychiatry and Behavioral Neurosciences, McMaster University, Hamilton, Ontario, Canada (Visiting Professor, Faculty of Biology, University of Belgrade, Serbia) dr Bato Korać, vanredni profesor Univerziteta u Beogradu - Biološki fakultet U Beogradu,

4 Eksperimentalni deo ove doktorske disertacije urađen je u laboratorijama Katedre za bromatologiju i vivarijumu Univerziteta u Beogradu - Farmaceutskog fakulteta, laboratorijama Zavoda za biohemijsko inženjerstvo, Prehrambeno-biotehnološkog fakulteta Univerziteta u Zagrebu, Hrvatska, laboratorijama Departmana za hemiju hrane, tehnologiju i biotehnologiju Hemijskog fakulteta Tehnološkog Univerziteta u Gdanjsku, Poljska (u okviru projekta CA16112 Personalized Nutrition in aging society: redox control of major age-related diseases ), laboratorijama Departmana za hranu i biotehnologiju, Tehnološkog fakulteta Univerziteta u Nišu, kao i u laboratorijama Departmana za fiziologiju Instituta za biološka istraživanja Siniša Stanković Univerziteta u Beogradu. Zahvaljujem se: mentoru prof. dr Slađani Šobajić na ukazanom poverenju i pruženim prilikama za stručna usavršavanja, na pomoći u osmišljavanju eksperimenata i diskusijama rezultata, kao i na aktivnom učešću prilikom pisanja radova i izrade ove doktorske disertacije prof. dr Miroslavu Saviću na korisnim predlozima prilikom planiranja eksperimenata kao i komentarima i sugestijama tokom izrade ove doktorske disertacije prof. dr Borisu Šakiću na stručnim savetima i pomoći u planiranju eksperimenata ponašanja, kao i analizi i diskusiji rezultata prof. dr Bati Koraću na sjajnim idejama i smernicama tokom eksperimenata, ali i na komentarima i predlozima tokom pisanja ove doktorske disertacije kolegama sa Katedre za bromatologiju na razumevanju i toleranciji prijateljima na neizmernoj podršci porodici na bezuslovnoj ljubavi i beskrajnoj veri u uspeh

5 ISPITIVANJE ANTIOKSIDATIVNOG I ANTIMIKROBNOG POTENCIJALA KAKAO PRAHA I NJEGOVOG UTICAJA NA PONAŠANJE MIŠEVA NAKON KRATKOTRAJNE I DUGOTRAJNE SUPLEMENTACIJE SAŽETAK Kakao prah je industrijski proizvod koji se dobija preradom kakao zrna (Theobroma cacao L.) i poseduje jedinstven ukus i aromu. Sve češće se svrstava u veoma popularnu grupu funkcionalnih namirnica. Visok sadržaj biološki aktivnih jedinjenja omogućava fiziološke efekte kakao praha koji prevazilaze uobičajenu nutritivnu ulogu namirnica. Specifičan polifenolni profil uz prisustvo purinskih alkaloida čine ovu namirnicu od posebnog interesa u brojnim studijama i dosadašnji nalazi afirmativni su u kontekstu antioksidativnog i antimikrobnog potencijala, hepatoprotektivnog delovanja, zatim delovanja biološki aktivnih jedinjena kakao praha na rad kardiovaskularnog i nervnog sistema. Prvi eksperimentalni cilj ove disertacije bio je hemijska karakterizacija kakao praha i ispitivanje njegove in vitro antioksidativne i antimikrobne aktivnosti kao i uticaja tehnološke obrade kakao praha na iste. Drugi deo disertacije imao je za cilj ispitivanje uloge biološki aktivnih jedinjenja kakao praha na bihejvioralni fenotip zdravih miševa soja C57BL/6 i procenu in vivo antioksidativne aktivnosti u pogledu enzima antioksidativne zaštite hepatocita suplementiranih miševa. HPLC-DAD-MS karakterizacijom kakao praha identifikovano je i kvantifikovano 17 biološki aktivnih jedinjenja od kojih su najzastupljeniji bili metilksantini (teobromin (14,10 mg/g) i kofein (5,84 mg/g)), zatim monomerni flavan- 3oli (epikatehin (1,00 mg/g), katehin (0,51 mg/g) i galokatehin (0,25 mg/g)), nakon čega su sledili oligomerni procijanidini i derivati hidroksibenzoeve kiseline. Prirodni kakao prahovi imali su značajno veći sadržaj ukupnih polifenola, flavonoida, proantocijanidina, i monomernih flavan-3ola u poređenju sa alkalizovanim kakao prahovima i analiziranim grupama čokolada (crne čokolade sa ili bez maline i mlečne čokolade). Konzistentno sa tim, prirodni kakao prahovi pokazali su najveću prosečnu vrednost antioksidativnog kompozitnog indeksa (ACI) od 89,4%. Među testiranim mikrobiološkim sojevima, gljivica Candida albicans izdvojila se kao najosetljiviji

6 mikroorganizam (MIK = 5,0 mg/ml). Antimikrobni potencijal ekstrakata alkalizovanih kakao prahova samo na Gram negativne bakterije bio je statistički viši u poređenju sa prirodnim kakao prahovima. Procesi prerade kakao praha značajno smanjuju sadržaj polifenola i antioksidativnu aktivnost, ovaj efekat je manje izražen kod metilksantina, dok je na antibakterijski efekat kakao praha proces alkalizacije delovao stimulativno. Za procenu ponašajnog fenotipa miševa korišćena je baterija testova nakon kratkotrajne i dugotrajne suplementacije dijetarno relevantnim količinama kakao praha i ekvivalentne količine sintetskih metilksantina (teobromin i kofein). Ova studija ukazuje da su sve kratkotrajno suplementirane životinje pokazale bolju prostornu orjentaciju, ali da efekta na učenje i pamćenje nije bilo ni posle kratkotrajne ni posle dugotrajne suplementacije. Bioaktivna kakao jedinjenja nisu uticala na emocionalne odgovore kod miševa. Samo kratkotrajna suplementacija metilksantinima prouzrokovala je smanjenje spontane noćne aktivnosti miševa, dok je ovaj efeakt izostao nakon dugotrajne suplementacije. Dugotrajna suplementacija metilksantinima dovela je do povećanja nivoa GSH-Px, γ-gcs proteina u jetri, ali se efekat u smislu povećane aktivnosti antioksidativnih enzima niti nivoa glutationa nije pokazao kod iste grupe miševa. Nivo CuZnSOD proteina jetre bio je povećan usled suplementacije i kakao prahom i metilksantinima, ali ne i aktivnost ovog enzima. Ova studija potvrdila je in vitro antioksidativno i antimikrobno delovanje kakao praha, a in vivo nalazi suplementacije dijetarno relevantnim količinama kakao praha nisu potvrdili njegov modulatorni efekat na ponašanje i aktivnost enzima antioksidativne zaštite, čime se otvorila nova tema za eksperimente koji se odnose na rasvetljavanje mehanizama i količina u kojima biološki aktivna jedinjenja kakao praha mogu imati ulogu u oblikovanju ponašanja i promeni redoks ravnoteže na nivou hepatocita miševa. Ključne reči: kakao prah, polifenoli, metilksantini, antioksidativni kompozitni indeks, antimikrobna aktivnost, ponašanje, enzimi antioksidativne zaštite Naučna oblast: Farmacija Uža naučna oblast: Bromatologija UDK broj: 615:663.91:57.084(043.3)

7 INVESTIGATION OF COCOA POWDER S ANTIOXIDANT AND ANTIMICROBIAL POTENTIAL AND ITS IMPACT ON MICE BEHAVIOR AFTER SHORT-TERM AND LONG-TERM SUPPLEMENTATION ABSTRACT Cocoa powder is an industrial product obtained by processing cocoa beans (Theobroma cacao L.) and has a unique flavor and aroma. High content of several biologically active compounds allows various physiological effects of cocoa powder that exceed the usual nutritional role of this food, so it is often classified into a very popular group of "functional foods". Specific polyphenol profile in the presence of purine alkaloids make this food stimulating research topic, and the findings so far are affirmative in the context of antioxidant and antimicrobial potential, hepatoprotective action, as well as the effects on cardiovascular and nervous system. The first experimental goal of this dissertation was the chemical characterization of non-nutritive compounds in cocoa powder, evaluation of its in vitro antioxidant and antimicrobial activities, with the emphasis on the difference between natural and processed cocoa powder properties. The second part of dissertation was focused on examination of the role of cocoa powder or methylxanthines supplementation in doses that were dietary relevant on behavioral phenotype of healthy C57BL/6 mice and on the assessment of in vivo antioxidant activity in regard to antioxidant enzymes in mice liver. HPLC-DAD-MS characterization of cocoa powder has identified and quantified 17 biological active compounds, the most abounded were methylxanthines (teobromine (14,1 mg / g) and caffeine (5.8 mg / g)), followed by monomer flavan-3ols (epicatechin (1.0 mg / g), catechin (0.5 mg / g) and galocatechin (0.26 mg / g)), oligomeric procyanidins and hydroxybenzoic acid derivatives. Natural cocoa powders had significantly higher content of total polyphenols, flavonoids, proanthocyanidins, and monomer flavan-3ol compared to alkalized cocoa powders and analyzed chocolate groups (black chocolates with or without raspberry and milk chocolates). Consistently, natural cocoa powders showed the highest average value of antioxidant composite index (ACI = 89.4%). Among the tested microbiological strains, Candida albicans was the most sensitive microorganism (MIC = 5.0 mg / ml). The antimicrobial potential of

8 alkalized cocoa powder extracts, exclusively on Gram negative bacteria, was statistically higher compared to natural cocoa powders. Cocoa powder processing significantly reduced the polyphenol content and antioxidant activity, this effect is less reflected in methylxanthines, while the antibacterial effect of cocoa powder has even been enhanced by the alkalization process. To asses mice behavioral phenotype a comprehensive battery of tests was used after a short-term and long-term supplementation with dietary relevant quantities of cocoa powder and an equivalent amount of synthetic methylxanthines (theobromine and caffeine). This study suggests that all short-term supplemented animals showed a better spatial orientation, but the effects on learning and memory were not noticed either after short-term nor long-term supplementation. Bioactive cocoa compounds did not affect emotional responses in mice. Only short-term supplementation with methylxanthines caused a decrease in spontaneous nocturnal activity of mice, while this effect was absent after long-term supplementation. Long-term supplementation with methylxanthines led to increased level of GSH-Px, γ-gcs proteins in liver homogenates, but the effect in terms of increased antioxidant enzymes activity and glutathione level were not showen in the same mice group. The CuZnSOD protein level was increased by both cocoa powder and methylxanthines supplementation, but enzyme activity was not affected. This study confirmed in vitro antioxidant and antimicrobial activity of cocoa powder. In vivo findings of supplementation with dietary relevant quantities of cocoa powder did not confirm its modulating effect on mice behavior nor on activity of liver antioxidant enzymes. Thus, it opened a new topic for experiments related to mechanisms and quantities of biologically active cocoa compounds that could play a role in shaping behavior and changing redox balance at the hepatocyte level in mice. Key words: cocoa powder, polyphenols, methylxanthines, antioxidant composite index, antimicrobial activity, behavior, antioxidant enzyme protection Scientific filed: Pharmacy Scientific subfield: Bromatology UDC number: 615:663.91:57.084(043.3)

9 SADRŽAJ 1. UVOD KAKAO ISTORIJAT KAKAO ZRNO Sorte kakao zrna KAKAO PRAH I KAKAO PROIZVODI Tehnološki postupak proizvodnje kakao praha i čokolade HEMIJSKI SASTAV KAKAO PRAHA Metilksantini kakao praha Polifenoli kakao praha EFEKTI KAKAO PRAHA NA ORGANIZAM Redoks ravnoteža Reaktivne kiseonične vrste Sistemi antioksidativne zaštite Enzimski sistem antioksidativne zaštite Neenzimski sistem antioksidativne zaštite Antioksidativna aktivnost kakao praha Antimikrobna aktivnost kakao praha Hepatoprotektivno delovanje kakao praha Kardiovaskularni sistem i kakao prah Antioksidativna aktivnost Anti-inflamatorna aktivnost Kancer i kakao prah Nervni sistem i kakao prah Neuroprotektivni efekat Neuromodulatorni efekat CILJEVI ISTRAŽIVANJA MATERIJAL I METODE IN VITRO ISPITIVANJA KAKAO PROIZVODA Materijali Hemikalije Priprema ekstrakata kakao praha... 42

10 3.1.4 Priprema ekstrakata čokolade Hemijska karakterizacija profila biološki aktivnih sastojaka kakao praha Određivanje sadržaja biološki aktivnih sastojaka HPLC-MS metodom Određivanje ukupnih fenolnih jedinjenja - mikro-metoda Određivanje ukupnih flavonoida - mikro-metoda Određivanje proantocijanidina Hemijska karakterizacija profila biološki aktivnih sastojaka čokolade Određivanje sadržaja biološki aktivnih sastojaka HPLC metodom Određivanje ukupnih fenolnih jedinjenja Određivanje ukupnih flavonoida Određivanje proantocijanidina Određivanje antioksidativnog potencijala kakao praha DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil) mikro-metoda FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) mikro-metoda TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) mikro-metoda Određivanje antioksidativnog potencijala čokolade DPPH metoda FRAP metoda TEAC metoda Određivanja antimikrobnog potencijala kakao praha Priprema sojeva mikroorganizama Minimalna inhibitorna koncentracija (MIK) IN VIVO ISPITIVANJA KAKAO PRAHA Priprema hrane za suplementacionu studiju Dizajn suplementacione studije Merenje ponašanja Neurološki testovi Test silaženja sa platforme (Step-Down Test) Test održavanja na žici (Hanging Basket Test) Rota-rod test Test hodanja po gredi (Beam Walking Test)... 60

11 Test spontanih alternacija (Spontaneous Alternation Behaviour Test) Spontana noćna aktivnost (Spontaneous Nocturnal Activity) Test novog objekta (Novel Object Test) Test otvorenog polja (Open Field Test) Morisov vodeni lavirint (Morris Water Maze Test) Određivanje aktivnosti antioksidativnih enzima u jetri miševa nakon dugotrajne suplementacije Priprema homogenata jetre za određivanje aktivnosti enzima antioksidativne zaštite Određivanje koncentracije proteina Određivanje aktivnosti katalaze (CAT) Određivanje aktivnosti ukupne superoksid-dismutaze (SOD) Određivanje aktivnosti MnSOD i CuZnSOD Određivanje aktivnosti glutation-peroksidaze (GSH-Px) Određivanje aktivnosti glutation-s-tranferaze (GST) Određivanje aktivnosti glutation-reduktaze (GR) Određivanje ukupnog glutationa Određivanje proteina u jetri miševa nakon dugotrajne suplementacije Western blot Priprema homogenata jetre za Western Blot Razdvajanje proteina na SDS-PAGE Prenos proteina sa poliakrilamidnog gela na membranu Imunološka detekcija proteina (Western blot) Kvantifikacija rezultata dobijenih Western blot analizom STATISTIČKA OBRADA PODATAKA REZULTATI I DISKUSIJA SADRŽAJ BIOLOŠKI AKTIVNIH SASTOJAKA KAKAO PRAHA SADRŽAJ BIOLOŠKI AKTIVNIH SASTOJAKA ČOKOLADE ANTIOKSIDATIVNI POTENCIJAL KAKAO PRAHA ANTIOKSIDATIVNI POTENCIJAL ČOKOLADE ANTIOKSIDATIVNI KOMPOZITNI INDEKS KAKAO PROIZVODA ANTIMIKROBNI POTENCIJAL KAKAO PRAHA... 93

12 4.7 UTICAJ KRATKOTRAJNE I DUGOTRAJNE DIJETARNE SUPLEMENTACIJE KAKAO PRAHOM NA PONAŠANJE MIŠEVA Telesna masa Unos hrane i vode Neurološki testovi Test silaženja sa platforme Test održavanja na žici Rota-rod test Test hodanja po gredi Test spontanih alternacija Spontana noćna aktivnost Test novog objekta Test otvorenog polja Morisov vodeni lavirint Učenje/pamćenje, emocionalna reaktivnost i lokomotorna aktivnost UTICAJ DUGOTRAJNE DIJETARNE SUPLEMENTACIJE KAKAO PRAHOM NA NIVO PROTEINA I AKTIVNOST ENZIMA ANTIOKSIDATIVNE ZAŠTITE U HOMOGENATU JETRE Nivo glutationa Glutation-peroksidaza (GSH-Px) Nivo GSH-Px proteina Aktivnost GSH-Px Nivo γ-gcs (γ -glutamilcistein-sintetaza) proteina Aktivnost glutation-reduktaze (GR) Aktivnost glutation-s-transferaze (GST) Superoksid-dismutaza (SOD) Aktivnost SOD Nivo CuZnSOD proteina Aktivnost CuZnSOD Nivo MnSOD proteina Aktivnost MnSOD Katalaza (CAT) Nivo proteina katalaze

13 Aktivnost CAT Efekat biološki aktivnih jedinjenja kakao praha na enzime antioksidativne zaštite ZAKLJUČCI LITERATURA

14 1. UVOD 1.1 KAKAO ISTORIJAT Veruje se da biljka kakaovac vodi poreklo iz Amazona ili basena reke Orinoko. Još od godine p. n. e. kakaovac, kao domaći usev, uzgajan je od strane Olemek Indijanaca. Sofisticirano društvo njihovih kulturoloških naslednika, Maja, konzumiralo je cenjeni napitak xocoatl (sho-kwa-til, odnosno kakao), koji je pripreman od mlevenog kakao semena pomešanog sa vodom, crnim biberom, vanilom i drugim začinima. Maje oko 600. godine migriraju ka Južnoj Americi osnivajući najstariju plantažu kakaoa na Jukatanu. Kakao zrna tog vremena bila su veoma vredna roba i korišćena su kao sredstva za plaćanje i jedinice računanja. Kristofer Kolumbo godine donosi kakao zrno iz Južne Amerike u Evropu, ali njegova vrednost nije odmah prepoznata. Dvadesetak godina kasnije španski osvajač Kortez, osvajajući Meksiko, proba čuveni napitak xocoatl i prepoznaje njegovu čar i vrednost. Ne mnogo kasnije osniva plantažu kakaoa sa ciljem da "uzgaja novac" i tako Španija započinje svoj kakao monopol. Upravo su Evropljani bili ti koji su od kakao zrna počeli da prave čokoladu i ostale kakao proizvode. Čokoladne proizvode koji su nam danas dostupni dugujemo holandskom hemičaru Conradu J. Van Houtenu, koji je godine patentirao hidrauličnu presu koja mrvi kakao zrna iz kojeg nastaje kakao prah. 1.2 KAKAO ZRNO Kakao zrno je plod biljke kakaovca (Theobroma cacao L., porodica Stericuliacae). Botanički naziv ove biljke potiče iz starogrčkog (θεός (theos) i βρῶμα (broma)) što se doslovno može prevesti hrana Bogova. Kakaovac (Slika 1) je listopadno drvo, visine 4 8 m. Listovi kakaovca su krupni, jajoliki, zašiljeni na vrhu, naizmenični. Cvetovi se razvijaju direktno na stablu i glavnim granama (kauliflorija). Plod je krupna, sočna bobica, na donjem delu proširena, zašiljena 1

15 na vrhu. U pulpi ploda, dužine oko 20 cm, nalazi se do 50 semena (Kovacevic, 2004). Drvo kakaovca počinje da cveta treće godine od zasada, a da daje plod nakon pet godina. Prosečan životni vek mu je dvadeset godina. Slika 1. Kakaovac (Theobroma cacao L.) Postoje dve interesantne teorije o poreklu kakaovca. Jedna grupa istraživača veruje da su originalne jedinke kakaovca rasle od jugoistočnog Meksika sve do reke Amazon, a kasnije bile kultivisane na ravnicama Južne Amerike. Novija proučavanja pokazuju da kakaovac potiče iz tropskih područja Amazona, a posle od strane čoveka biva rasprostranjen do Srednje, čak i Severne Amerike. Ova biljka danas uspeva u ravničarskim područjima ispod Anda na visinama od m, u oblastima Južne i Centralne Amerike i Afrike. Klimatski uslovi koji najbolje pogoduju kakaovcu uključuju raspon temperature C i prosečnu količinu godišnjih padavina od mm. Idealno zemljište za kakaovac bi trebalo biti dubine najmanje 1,5 m sa sadržajem gline od 30 40%. On se najuspešnije gaji na zemljištu sa širokim spektrom ph, od 6 do 7,5 kako bi mu bili dostupni svi neophodni nutrijenti. Plod kakaovca (Slika 2) tokom zrenja menja boju. Upravo po boji, zaključuje se koji se plod može ubrati. Plod se ubira tako da se ne ošteti mala peteljka koja ga drži, jer iz nje ponovo raste cvet. Zatim se plod pažljivo preseca kako se kakao zrno ne bi oštetilo. Kakao zrna se vade zajedno sa pulpom koja ih okružuje i kao takva započinju proces jednonedeljne fermentacije pod uticajem prirodnih mikroorganizama koji se razmnožavaju koristeći šećer iz pulpe kao izvor energije. Kakao zrna od purpurne 2

16 prelaze u karakterističnu braon boju i počinju da ispuštaju karakterističan miris. Nakon fermentacije kakao zrna se izlažu sušenju na suncu ili u specijalnim pećima na drva. Dalje se ona mogu pržiti i mleti, pakovati i isporučivati u svrhu dalje prerade. Slika 2. Kakao zrno Poznato je da se najveće količine kakaovog zrna upotrebljavaju u konditorskoj industriji. Međutim, ono nalazi svoju primenu i u kozmetičkoj industriji, kao i u izradi nekih farmaceutskih oblika gde se često kao podloga koristi kakao maslac (Butyrum Cacao) koji je jedan od produkata prerade kakao zrna Sorte kakao zrna Četiri vrste kakao zrna, pogodne za ljudsku upotrebu, (criollo, forastero, trinitario i nacional), međusobno se razlikuju po boji kotiledona. Antocijanini daju boju kotiledonima i imaju ključnu ulogu u stvaranju arome kakao proizvoda. Criollo je izvorni španski kakaovac koji je bio otkriven od strane Kolumba na otoku Gvajani godine. Predstavlja najređu vrstu kakaovca (5-10 % svetske proizvodnje) i uzgaja se samo u Južnoj Americi. Ima belu boju kotiledona jer su antocijanini prisutni u leuko formi te je svojstvene fine arome. Kakao proizvodi proizvedeni od ovog zrna imaju svetlo braon boju s blagom aromom lešnika. Forastero, afrički varijetet, nalazi najveću primenu u konditorskoj industriji. Ima ljubičastu boju kotiledona te zbog toga nema posebnu aromu. 3

17 Trinitario potiče iz Trinidada, a hibrid je prethodna dva varijeteta i objedinjuje njihova najbolja svojstva. Zauzima oko 10-15% svetske proizvodnje. Preradom daje kakao zrna izvrsne arome tako da se primjenjuje u proizvodnji finih čokolada (Beckett, 2009; Wollgast i Anklam, 2000a). Postoji i četvrti varijetet nacional, koji se proizvodi u Ekvadoru i spada u plemenite sorte kakaovca (Counet i sar., 2004). 1.3 KAKAO PRAH I KAKAO PROIZVODI Konditorski proizvodi, a posebno kakao prah i čokolada, spadaju u grupu proizvoda koje konzumira široka populacija, naročito deca, tako da je, pored zdravstvene bezbednosti, veoma važna i njihova senzorna prihvatljivost (Betoret i sar., 2011; Pajin i sar., 2013). Njihov kvalitet uključuje različite fizičke karakteristike (veličina čestica, čvrstoća, mazivost, reološka svojstva) a koje su uslovljene primenjenim procesom proizvodnje (Loncarevic i sar., 2016) Tehnološki postupak proizvodnje kakao praha i čokolade Tehnologija proizvodnje kakao praha i čokolade obuhvata postupke prerade kakao zrna (čišćenje, drobljenje, uklanjanje ljuske), proizvodnju kakao mase i kakao maslaca, proizvodnju i pakovanje kakao praha, proizvodnju čokoladne mase kao i proizvodnju i pakovanje čokolade (Slika 3) (Beckett, 2009). Veoma česta pojava je da se u zemljama u kojima se gaji kakao zrno, ono i prerađuje do kakao mase. Na ovaj način se rešava problem promene vlage zrna tokom transporta i njegove potencijalne mikrobiološke kontaminacije. Proces prerade kakao zrna do kakao mase obuhvata čišćenje kakao zrna, termički tretman (pečenje) i uklanjanje ljuske (Pajin i sar., 2013). 4

18 Slika 3. Tehnološki postupak dobijanja kakao praha i čokolade (Vasiljevic, 2016) Prva faza u proizvodnji kakao proizvoda jeste čišćenje kakao zrna (uklanjanje grubih i finih nečistoća, prašine). Potom sledi drobljenje koje ima za cilj dobijanje kakao loma odgovarajućih dimenzija bez izmene hemijskog sastava. Treća faza predstavlja odvajanje dobijenog kakao loma od kakao ljuske. Ovakva kakao zrna (kotiledoni) dalje se peku, melju i vrlo često alkalizuju u cilju dobijanja kakao mase. Naime, usitnjavanje kakao loma u cilju dobijanja kakao mase, u osnovi predstavlja razaranje ćelija kotiledona zbog oslobađanja kakao maslaca. Kakao maslac difunduje na površinu nemasnih kakao čestica čineći kakao masu stabilnom suspenzijom usitnjenog kakao jezgra (čestice manje od 40 μm) u kakao maslacu. Kakao masa ne sme sadržati više od 5% kakao ljuske i ne više od 10% ukupnog pepela. Alkalizacija je veoma čest proces pri kome se usitnjena kakao zrna tretiraju alkalnim rastvorima soli da bi se postigla tamnija boja i ublažio gorko-kiseli ukus, kao i da bi se poboljšala svojstva dispergovanja u kakao napicima. Kiseli ukus koji potiče od fermentisanog kakao zrna se ublažava jednostavnom neutralizacijom pomoću rastvora alkalne soli. Pri procesu alkalizacije ph vrednost se povećava sa 5,2-5,6 na približno 5

19 neutralnu vrednost 6,8-7,5. Nastala smeša naziva se kakao masom koja se dalje koristi za proizvodnju kakao praha, odnosno čokolade. U proizvodnji kakao praha, kakao masa podleže presovanju pri čemu se iz nje izdvaja kakao maslac, a sa ciljem formiranja kakao pogače koja se dalje melje do gotovog proizvoda. Ovakav kakao prah se može pakovati i smatrati finalnim proizvodom ili se skladištiti za dalju preradu u konditorskoj industriji. Prilikom proizvodnje čokolade, kakao masi dodaju se šećer i mleko u prahu kako bi se dobila čokoladna masa koja se adekvatno meša, alkalizuje, končira (dugotrajno mešanje čokoladne mase sa ciljem razvoja aromatičnih materija (hemijske promene) i optimizacije osobina proticanja odnosno reološkog ponašanja (fizičke promene)) i oblikuje u krajnji proizvod. Tabela 1. Sastav kakao praha, mlečne i crne čokolade (%) sastojak kakao prah crna čokolada mlečna čokolada kakao masa kakao maslac šećer mleko u prahu HEMIJSKI SASTAV KAKAO PRAHA Osnovni nutritivni sastojci kakao praha jesu svakako lipidi, ugljeni hidrati i proteini. U pogledu masno-kiselinskog sastava lipida najzastupljenije su oleinska (34 %) i stearinska kiselina (34 %), zatim palmitinska (27 %), a u manjoj meri su prisutne i linolna (3%) i linolenska kiselina (0,3 %) (Torres-Moreno i sar., 2015). Kakao prah se smatra brzim izvorom energije upravo iz razloga visokog udela prostih šećera (pre svega saharoze). S obzirom da kakao zrno može biti dobar izvor dijetnih vlakana, kakao prah se sve više ispituje na sadržaj lignana kojima se pripisuje pozitivan uticaj na smanjenje krvnog pritiska i holesterola u krvi (Sarria i sar., 2012). Od proteinskih struktura zastupljeni su: albumini, globulini, prolamini i glutenini. Oni često u kakao prahu mogu biti prisutni u obliku slabo rastvornih jedinjenja sa polifenolima (Bertazzo i sar., 2011). 6

20 Pored makronutrijenata, kakao prah doprinosi dijetarnom unosu gvožđa, bakra, kalcijuma i fosfora kao i askorbinske kiseline i vitamina B grupe. Kakao prah sadrži i čitav niz različitih biološki aktivnih supstanci koji ostvaruju brojna povoljna delovanja u ljudskom organizmu: metilksantini (teobromin i kofein), polifenolne strukture (flavonoidi i fenolne kiseline), biogeni amini, cijanidini, slobodne masne kiseline (Aprotosoaie i sar., 2015). Količina navedenih komponenti znatno zavisi od sorte i sastava kakao zrna, njegovog načina obrade, tehnološkog postupka proizvodnje, kao i vrste finalnog kakao proizvoda Metilksantini kakao praha Kakao prah predstavlja značajan dijetarni izvor purinskih alkaloida sa snažnim fiziološkim delovanjima to su metilksantini, od kojih su najviše zastupljeni teobromin i kofein (Slika 4). Teobromin je dominantna ksantinska komponenta kakao praha, koja je svoj naziv i dobila po kakaou kao najvažnijem izvoru u prirodi. Slika 4. Hemijska struktura metilksantina kakaoa Teobromin je manje rastvoran u poređenju sa kofeinom tako da se on duže metaboliše u organizmu, sporije deluje te mu je potrebno duže vreme da dostigne maksimalni farmakološki efekat (Tarka, Jr., 1982). Teobromin poseduje blag stimulativni efekat na centralni nervni sistem, dok je stimulativni efekat kofeina daleko izraženiji (Cappelletti i sar., 2015). Metilksantini svoje povoljne fiziološke efekte ostvaruju i na nivou kardiovaskularnog, gastrointestinalnog, respiratornog i urinarnog sistema (Nehlig i sar., 1992; Spiller, 1998). 7

21 Količine navedenih purinskih alkaloida variraju u zavisnosti od vrste kakao proizvoda. Određivanje njihovog sadržaja ima i veliki značaj sa aspekta procene bezmasnih kakao delova kakao proizvoda, koji se mogu dovesti u vezu i sa drugim bioaktivnim jedinjenjima kakaoa (Richards i Wailes, 2012). Sadržaj teobromina u prirodnom kakao prahu kreće se u opsegu 1,5 2%, dok je sadržaj kofeina oko tri puta niži. U čokoladi sa 60 % kakao-mase, sadržaj teobromina iznosi oko 0,9 %, dok mlečna čokolada sadrži između 0,15 i 0,20 % teobromina (Gavrilovic, 2003). Belščak i saradnici (Belscak i sar., 2009) su u svojim istraživanjima na različitim vrstama kakao proizvoda pokazali da su proizvodi sa višim sadržajem kakao-delova imali i veći udeo metilksantina Polifenoli kakao praha Fenolna jedinjenja ili polifenoli predstavljaju najbrojniju i najrasprostranjeniju grupu biološki aktivnih supstanci u biljnom svetu. Do sada je otkriveno više od 8000 različitih polifenola. Oni su produkti sekundarnog metabolizma biljaka, a njihovo prisustvo u animalnim tkivima je posledica konzumiranja biljne hrane (Shahidi i Naczk, 2003). Biosinteza polifenola se odvija jednim od dva metabolička puta: put šikiminske kiseline i put malonske kiseline (acetogeninski put) (Bravo, 2009). Obe navedene kiseline potiču iz metabolizma glukoze u biljkama (Formica i Regelson, 1995). Svi polifenoli se u osnovi mogu podeliti na flavonoide i neflavonoide (Slika 5). Sa dijetarnog aspekta, najznačajniji među njima iz klase flavonoida su flavan-3oli, flavonoli, izoflavoni i antocijanidini, a što se neflavonoida tiče to su derivati hidroksibenzoeve kiseline, derivati hidroksicimetne kiseline i stilbeni. 8

22 Slika 5. Klasifikacija polifenola (Jaganath i Crozier, 2009) Flavonoidi su najzastupljenija grupa fenolnih jedinjenja u biljkama sa 15 atoma ugljenikovih atoma u osnovnoj C6-C3-C6 strukturi (Slika 6), od kojih devet pripada benzopiranskom prstenu (benzenski prsten A kondenzovan sa piranskim prstenom C), a ostalih šest ugljenikovih atoma čine benzenski prsten B povezan sa benzopiranskim prstenom na poziciji dva. Slika 6. Osnovna hemijska struktura flavonoida Flavan-3oli su strukturno najkompleksnija podklasa flavonoida (Slika 7). Obuhvataju jedinjenja od jednostavnih monomera, katehina i njegovog epimera epikatehina, do oligomernih i polimernih proantocijanidina, koji se još nazivaju i kondenzovanim taninima. Za flavan-3ole se često u literaturi može naći naziv flavanoli ili katehini, a zavisno od položaja prstena B i hidroksilne grupe na poziciji tri u odnosu na prsten C, mogu se javiti u dva epimerna oblika: (+)-katehin i (-)-epikatehin sa 9

23 njihovim odgovarajućim derivatima. Flavan-3-oli podležu reakcijama hidroksilacije pri čemu nastaju (+)-galokatehin i (-)-epigalokatehin. Takođe, često učestvuju u esterifikaciji sa galnom kiselinom gradeći katehin galate, od kojih su najrasprostranjeniji (-)-epikatehin galat i (-)-epigalokatehin galat. Njihova veoma važna karakteristika je da grade polimere koji se nazivaju proantocijanidini ili kondenzovani tanini. Proantocijanidini obično sadrže od 2 do 60 monomernih jedinica, koje su uglavnom povezane C8-C4 vezom. Ukoliko se broj monomernih jedinica kreće od 2-7, nazivaju se oligoproantocijanidini (Tsao, 2010). Prisustvo flavan-3ola u hrani doprinosi formiranju određenih parametara kvaliteta kakvi su: gorčina, kiselost, slast, viskozitet, aroma i boja (Aron i Kennedy, 2008; Ribereau-Gayon i sar., 2006). Slika 7. Opšta struktura flavan-3ola Istraživanja kakao polifenola sprovode se još od ranih pedesetih godina. Smatra se da oni značajno doprinose karakterističnom kakao ukusu i među prvima su identifikovani: katehini, proantocijanidini, antocijanini, i neke fenolne kiseline (Foryth, 1955). Naime, najzastupljenije polifenolne strukture su: flavan-3oli (epikatehin i katehin) kao i njihovi oligomeri i polimeri (Slika 8). Kuplovanje (epi)katehinskih subjedinica se javlja prvenstveno između pozicija 4 i 8, ali mogu se uključiti i pozicije 4 i 6. Najvažniji kakao proantocijanidini su dimeri (B1, B2, B3, B4, B5), trimer (C1) i tetramer (A2) (Prior i Gu, 2005). 10

24 Slika 8. Osnovni flavan-3oli kakao praha Pored navedenih osnovnih katehina, kakao prah je izvor i galokatehina i epigalokatehina (Slika 9), koji inače predstavljaju osnovne fenolne komponente čaja (Zeeb i sar., 2000). Slika 9. Manje zastupljeni flavan-3oli u kakao prahu Flavonoidni profil kakao praha upotpunjava i prisustvo manjih količina flavonola kvercetina i njegovih glikozida (arabinozid, glukozid, galaktozid) (Slika 10) (Lamuela- Raventos i sar., 2001). Dodatno, Sanchez-Rabaneda i saradnici identifikovali su flavanon naringenin; flavone luteolin i apigenin i njihove glikozide (Sanchez i sar., 2003). 11

25 Slika 10. Osnovni flavonol kakao praha S obzirom da kotiledoni kakao semena obiluju fenolnim kiselinama, neke od njih opstaju tokom procesa prerade i sadržane su u finalnim kakao proizvodima (Jalal i Collin, 1977). Ovakvu osobinu pokazuju derivati hidroksicimetne kiseline, i to posebno hlorogenska kiselina (Slika 11). Slika 11. Neflavonoid kakao praha U dosadašnjim in vitro ispitivanjima biološke aktivnosti kakao praha pokazano je da amidi hidroksicimetne kiseline sa aromatičnim aminokiselinama (klovamid i dideoksiklovamid) u pogledu antioksidatinog potencijala mogu da se porede sa gore opisanim polifenolnim jedinjenjima (Slika 12). Ova dva jedinjenja pripadaju grupi fenolnih struktura, većinski zastupljenih u crvenoj detelini (Tebayashi i sar., 2000). Slika 12. Amidi ruzmarinske kiseline prisutni u kakao prahu 12

26 Brojne su studije čiji je predmet istraživanja profilisanje i kvantifikovanje polifenola u različitim vrstama kakao proizvoda. Sadržaj polifenolnih komponenti kakao proizvoda, kako ukupnih tako i pojedinačnih značajno varira, i to zbog razlike u varijetetu (u nekim zrnima sadržaj ide i do 20%), geografskom poreklu, kultivaciji, načinu gajenja biljke i rukovanju sa plodovima posle branja (Niemenak i sar., 2006; Wollgast i Anklam, 2000b). Takođe, znatno zavisi od brojnih faktora tokom proizvodnog procesa kakao proizvoda ali i samih primenjenih metoda tokom određivanja. U Tabeli 2 sumirani su dosadašnji najznačajniji literaturni nalazi. Tabela 2. Sadržaj polifenola kakao proizvoda u odnosu na primenjenu analitičku tehniku proizvod ekstrakcija metoda sadržaj referenca kakao prah 70 % metanol Folin- Ciocalteau (galna kiselina) mg/g ukupnih polifenola (Belscak i sar., 2009) kakao prah kakao prah kakao prah kakao prah kakao masa crna čokolada mlečna čokolada 70 % aceton Folin- Ciocalteau (galna kiselina) 70:29,5:0,5 aceton/ voda/sirćetna kiselina 70:29,5:0,5 aceton/ voda/sirćetna kiselina 70:29,5:0,5 aceton/ voda/sirćetna kiselina Folin- Ciocalteau (galna kiselina) NP-HPLC-MS (epikatehin, katehin) NP-HPLC- DAD (epikatehin) 50 % aceton RP-HPLC- ESI/MS (epikatehin) voda Folin- Ciocalteau (galna kiselina) voda Folin- Ciocalteau (galna kiselina) 41,82 mg/g ukupnih polifenola 35,69 mg/g ukupnih flavan- 3ola 1,964-3,723 mg/g epikatehina i katehina 1,05-2,53 mg/g epikatehina 5,02 mg/g proantocijanidina 1,822 mg/g ukupnih polifenola 1,343 mg/g ukupnih polifenola (Nsor-atindana i sar., 2012) (Miller i sar., 2009) (Miller i sar., 2009) (Langer i sar., 2011) (Pedan i sar., 2016) (Belscak- Cvitanovic i sar., 2012) (Belscak- Cvitanovic i sar., 2012) 13

27 1.5 EFEKTI KAKAO PRAHA NA ORGANIZAM Konzumiranje kakao proizvoda bilo je ranije često kritikovano zbog sadržaja masti i šećera, i njihova potrošnja (naročito čokolade) povezivana je sa pojavom akni, karijesa, gojaznosti, hipertenzije, bolesti koronarnih arterija i dijabetesa. Prema tome, mnogi lekari su upozoravali pacijente o potencijalnim zdravstvenim opasnostima od konzumiranja velikih količina kakao proizvoda. Međutim, nedavno otkrivanje biološki aktivnih fenolnih jedinjenja kakao praha promenilo je ovu percepciju i stimulisalo istraživanje njegovih efekata u starenju, poremećaju redoks ravnoteže, regulaciji krvnog pritiska, aterosklerozi. Kroz vreme kakao proizvodi bivaju isticani zbog svog izraženog antioksidativnog potencijala. Međutim, u mnogim studijama, kontradiktorni rezultati i zabrinutost oko metodoloških problema otežavaju zdravstvenim radnicima i javnosti da razumeju dostupne dokaze o uticaju kakao praha / čokolade na zdravlje. Poslednjih godina kakao prah sve se češće nalazi na listi popularnih funkcionalnih namirnica kojima se pripisuju povoljni biološki i zdravstveni efekti. Specifičan polifenolni profil uz prisustvo purinskih alkaloida omogućava fiziološke efekte kakao praha koji prevazilaze uobičajenu nutritivnu ulogu namirnica (Ackar i sar., 2013). Upravo ovakav sastav čini ovu namirnicu veoma interesantnom i od posebnog interesa kako sa prehrambenog tako i sa farmakološkog aspekta (Visioli i sar., 2009). Jedinstven hemijski sastav predstavlja polaznu tačku različitih istraživačkih pitanja u smislu biološkog delovanja pojedinačnih kakao jedinjenja ali i njihovih potencijalnih interakcija te posledičnih pojačanih ili oslabljenih efekata na zdravlje kakao praha kao punog matriksa. Rezultati dosadašnjh studija afirmativni su u kontekstu preventivnog delovanja kakao praha i njegovih aktivnih principa u smislu antioksidativnog i antimikrobnog potencijala, hepatoprotektivnog delovanja, zatim delovanja na rad kardiovaskularnog i nervnog sistema, dok su nalazi dobijeni u ispitivanjima antikancerogenih efekata kakao praha i dalje diskutabilni Redoks ravnoteža Koncept postojanja ravnoteže između prooksidativnih i antioksidativnih procesa u ćeliji je centralan za razumevanje oksidativnog stresa iz više razloga. Prvo, naglašeno je da harmonija može biti poremećena promenama na bilo kojoj strani te ravnoteže; 14

28 abnormalnim generisanjem slobodnih kiseoničnih vrsta (reactive oxygen species, ROS) ili nekim nedostatkom u antioksidativnom odbrambenom mehanizmu. Iako su ROS prvi put privukli pažnju biologa kao potencijalno štetni nusproizvodi aerobnog metabolizma, kroz brojna istraživanja prepoznato je da oni igraju važne uloge u mnogim unutarćelijskim signalnim putevima i metaboličkim procesima (Droge, 2002; Zhang i sar., 2016). Ovaj koncept o ravnoteži ukazuje i na činjenicu da će odgovor na oksidativni stres biti gradiran. Dakle, manji poremećaji u ravnoteži se brzo popravljaju usled homeostatske adaptacije, dok veliki poremećaji u ravnoteži mogu dovesti do progresivne štete i smrti ćelije. Postoji mnogo potencijalnih izvora ROS, a njihov relativni doprinos zavisi od okolnosti u određenom sistemu. Kako je delovanje ROS često ograničeno difuzijom, efekti na ćelijsku funkciju su pre svega posledica delovanja na biomolekule u neposrednoj blizini. Ako se uzme u obzir raznovrsnost reaktivnih vrsta kiseonika, kao i njihovih potencijalnih ciljeva, može se postaviti pitanje koje su sve potencijalne biohemijske i patofiziološke posledice njihovih interakcija Reaktivne kiseonične vrste Pod terminom "reaktivne kiseonične vrste" obuhvaćeni su i slobodni radikali i njihovi ne-radikalski intermedijeri. Slobodni radikali se definišu kao hemijske vrste koje sadrže jedan ili više nesparenih elektrona, i baš ta nestabilna elektronska konfiguracija daje visoku reaktivnost ovim vrstama. Slobodni radikali se mogu generisati od mnogih hemijskih elemenata, ali u biološkim sistemima fundamentalni su oni koji nastaju od kiseonika ili azota (Slika 13). 15

29 Slika 13. Osnovne reaktivne kiseonične vrste, njihovo poreklo i putevi neutralizacije (modifikacija, (Burton i Jauniaux, 2011)) U fiziološkim uslovima, najčešći slobodni radikal kiseonika je superoksidni anjon radikal (O - 2 ), pri čemu se mitohondrije smatraju njegovim glavnim izvorom (Cadenas i Davies, 2000). Prenos elektrona duž kompleksa respiratornog lanca nije potpuno efikasan, pa se dešava curenje elektrona na molekularni kiseonik, posebno iz kompleksa I i III, što rezultira formiranjem O - 2. Stopa formiranja O - 2 je veća ako postoji veći broj elektrona u lancu, na primer u uslovima povećane glukoze (> 6,1 mmol/l) i usled povećanog prisustva kiseonika (Burton i Jauniaux, 2011). Paradoksalno, stvaranje O - 2 je povećano i u uslovima hipoksije, a to se objašnjava činjenicom da smanjena raspoloživost kiseonika, koji predstavlja konačni akceptor elektrona sa kompleksa IV, uzrokuje akumuliranje elektrona (Li i Jackson, 2002). Pri normalnim fiziološkim uslovima, 2% kiseonika se pretvara u O - 2, umesto da se redukuje do vode (Boveris i Chance, 1973). Zbog svog naelektrisanja, O - 2 ne može da prođe kroz - membranu mitohondrija, i posledično ostaje u matriksu ove organele. Drugi izvori O 2 pri fiziološkim uslovima uključuju delovanje enzima nikotinamid adenin dinukleotid fosfat (NADPH) oksidaze (Raijmakers i sar., 2006). U patološkim uslovima, enzim ksantin-oksidaza ima dominantnu ulogu u formiranju O - 2. Uloga ksantin-oksidaze je da degradira purine, ksantin i hipoksantin u mokraćnu kiselinu u fiziološkim uslovima, koristeći NAD + kao elektronski akceptor. Međutim, pod hipoksičnim uslovima on se 16

30 proteolitički cepa do oksidovanog oblika koji pomaže prenosu elektrona na molekularni kiseonik (Raijmakers i sar., 2006). Superoksidni anjon radikal se neutrališe delovanjem enzima, superoksiddismutaze, koji ga konvertuje u vodonik-peroksid. Vodonik-peroksid nije slobodni radikal, pa je i manje reaktivan nego O - 2. Međutim, i on potpada pod termin ROS, jer je blisko uključen u stvaranje i neutralizaciju slobodnih radikala. Pošto je nepolarna supstanca, sposobna je da difunduje kroz plazma membranu i membrane organela, a samim tim i deluje široko kao sekundarni glasnik u putevima prenosa signala. Vodonikperoksid se, pak, detoksikuje odnosno pretvara u vodu delovanjem enzima katalaza i glutation-peroksidaza. Važno je da antioksidativni enzimi ne budu u koliziji, jer neuravnoteženost između superoksidnog anjon radikala i vodonik-peroksida može rezultovati formiranjem mnogo reaktivnijeg hidroksil radikala ( OH). Ova reakcija je katalizovana slobodnim fero jonima u Fentonovoj reakciji (Florence, 1984). Hidroksil radikal neselektivno oksiduje bilo koji biomolekul u njegovoj neposrednoj blizini i ima procenjeni poluživot od 10-9 s. Sa druge strane, prekomerna generacija superoksidnog anjon radikala može takođe dovesti do interakcije sa azotnim oksidom i do stvaranja peroksinitrita, koji je moćan prooksidans. Peroksinitrit ima sposobnost difuzije te može da deluje i na susedne ćelije (Pacher i sar., 2007) Sistemi antioksidativne zaštite Sa ciljem održavanja ravnoteže između produkcije i eliminacije slobodnih radikala razvijeni su različiti sistemi koji predstavljaju zaštitu od oksidativnih oštećenja. Osnovni zadatak antioksidativne zaštite je sprečavanje i odlaganje oštećenja, ali i reparacija oštećenja ćelija i ćelijskih struktura već nastalih delovanjem slobodnih radikala. Sistem antioksidativne odbrane se može podeliti na enzimski i neenzimski (Birben i sar., 2012). 17

31 Enzimski sistem antioksidativne zaštite Svi enzimi odbrane imaju prelazni metal u svom aktivnom centru, sposoban da zauzme različita oksidativna stanja dok prenosi elektrone tokom procesa neutralizacije. Antioksidativni enzimi se mogu podeliti na: a) Primarne antioksidativne enzime - reaguju direktno sa prooksidativnim vrstama sprečavajući formiranje slobodnih radikala ili uklanjaju već stvorene slobodne radikale. Ovoj grupi pripadaju: superoksid-dismutaza (SOD), glutationperoksidaza (GSH-Px), katalaza (CAT), i glutation-s-transferaza (GST). b) Sekundarne antioksidativne enzime - regenerišu molekule antioksidanasa malih molekulskih masa. Ovoj grupi pripadaju glutation-reduktaza (GR) i glukozo-6- fosfat-dehidrogenaza (G-6-PD). Dve izoforme superoksid-dismutaze pretvaraju superoksidni anjon radikal u vodonik-peroksid i molekularni kiseonik; oblik sa manganom koji je ograničen na mitohondrije, i oblik sa bakrom i cinkom koji se predominanatno nalazi u citoplazmi. To je jedini enzim koji reaguje direktno sa slobodnim radikalom i predstavlja prvu liniju odbrane protiv slobodnih radikala. Vodonik-peroksid se potom konvertuje do vode delovanjem katalaze ili glutation-peroksidaze. Katalaza je veoma reaktivan enzim koji razgrađuje H 2 O 2 nastao prilikom dismutacije O - 2 ili u reakcijama koje katalizuje ksantin-oksidaza, a kao proizvodi razgradnje nastaju voda i molekularni kiseonik ( katalazna reakcija ). Glutation-peroksidaza čini veću grupu enzima od kojih su najzastupljeniji: selenzavisna glutation-peroksidaza, selen-nezavisna glutation-peroksidaza i fosfolipid hidroperoksid glutation-peroksidaza (Kutlu i Susuz, 2004). Ovi enzimi katalizuju redukciju H 2 O 2 do H 2 O, kao i redukciju organskih hidroperoksida (ROOH) do odgovarajućih alkohola (ROH) uz prateću reakciju oksidacije glutationa. Dakle, aktivnost glutation-peroksidaze zavisi od prisustva redukovanog glutationa (GSH) jer se on ponaša kao donor vodonika. Glutation-S-transferaza predstavlja familiju proteina koja katalizuje nukleofilni napad atoma sumpora iz glutationa na elektrofilne supstrate, te je osnovna uloga GST detoksikacija velikog broja jedinjenja: ksenobiotika, hepatičkih toksina, kancerogena, 18

32 epoksida i drugih potencijalno toksičnih supstanci. Pored enzimske, GST ima još i transportnu i sintetičku funkciju. Tripeptid glutation je glavni ćelijski tiol redoks pufer, i sintetiše se u citoplazmi iz L-glutamata, L-cisteina i glicina. GSH učestvuje u velikom broju reakcija detoksikacije, pri čemu formira glutation-disulfid, koji se konvertuje nazad u GSH dejstvom glutation-reduktaze uz utrošak NADPH (Nicol i sar., 2000). Osnovna uloga glukozo-6-fosfat-dehidrogenaze je kataliza oksidacije glukozo-6- fosfata u 6-fosfoglukonolakton čime započinje pentozo fosfatni put, u kome nastaju pentoze koje su prekursori nukleinskih kiselina i svih nukleotidnih koenzima. Oksidacijom glukozo-6-fosfata regeneriše se i NADPH neophodan za različite reakcije biosinteze i detoksikacije u organizmu. Aktivnost antioksidativnih metalo-enzima zavisi od unosa odgovarajućih mikroelemenata, gvožđa, bakra, cinka, selena, mangana hranom i od njihovog statusa u organizmu Neenzimski sistem antioksidativne zaštite Neenzimski antioksidansi se prema poreklu mogu podeliti na endogene i egzogene (dijetarne antioksidanse). Endogeni antioksidansi imaju ključnu ulogu u održavanju normalnih ćelijskih funkcija i opšteg zdravlja organizma. Međutim, usled brojnih uticaja spoljašnje sredine, veoma često antioksidativni potencijal endogenih molekula opada, te je dijetarni unos antioksidanasa neophodan za normalno funkcionisanje organizma. Procenjuje se da bi više od dve trećine slučajeva kancera, nastalih kao posledica mutacije gena, moglo biti sprečeno promenom navika u ishrani, što podrazumeva povećani unos hrane bogate prirodnim antioksidansima (Ratnam i sar., 2006). Neenzimska zaštita od slobodnih radikala obuhvata: a) visokomolekularne antioksidanse metaloproteini koji imaju sposobnost da spreče stvaranje slobodnih radikala tako što vezuju slobodne jone metala u forme koje im onemogućavaju katalitičko delovanje. Najvažniji metaloproteini koji regulišu nivo gvožđa i bakra u ćeliji su transferin, feritin i ceruloplazmin. 19

33 b) niskomolekularne antioksidanse - heterogena grupa supstanci u koju se ubrajaju glutation, askorbat (vitamin C), α-tokoferol (vitamin E), vitamin A, koenzim Q10 i različiti produkti sekundarnog metabolizma biljaka. Glutation je tripeptid (γ-glutamil-cisteinil-glicin - GSH) koji se nalazi u citoplazmi, jedru i mitohondrijama i predstavlja glavni endogeni antioksidans u ćelijama. Osnovno mesto sinteze glutationa u organizmu je jetra. Uloge glutationa u ćeliji su sledeće: deluje kao koenzim i učestvuje u transportu aminokiselina; učestvuje u metabolizmu i održavanju tiolnih grupa proteina i niskomolekulskih jedinjenja kao što je koenzim A; regeneriše askorbinsku kiselinu i održava je u redukovanom obliku; učestvuje u formiranju dezoksiribonukleotida; vrši detoksikaciju enzimskim putem (GST) ili neenzimskim putem u reakciji sa toksičnim jedinjenjima pri čemu nastaju GSH-konjugati; štiti organizam od oksidativnih oštećenja, pri čemu neenzimski reaguje sa reaktivnim kiseoničnim vrstama ili učestvuje u razgradnji peroksida kao supstrat glutation-peroksidaze (Anderson, 1998) (Slika 14). Slika 14. Metabolizam i osnovne funkcije glutationa Legenda: GSH glutation; GSSG oksidovani glutation; Cis cistein; Glic glicin; Glut glutamat; GR - glutation-reduktaza; NADP + nikotinamid dinukleotid fosfat; NADPH - redukovani nikotinamid dinukleotid fosfat Odnos redukovanog i oksidovanog oblika glutationa (GSH/GSSG) je jedan od osnovnih indikatora oksidativnog stresa u ćeliji. 20

34 Vitamin C (L-askorbinska kiselina) je esencijalni mikronutrijent i pripada grupi hidrosolubilnih vitamina. Askorbat ima izražena antioksidativna svojstva koja se u slučaju lipidne peroksidacije iskazuju doniranjem jednog elektrona lipidnom radikalu, u cilju prekidanja lančane reakcije, pri čemu nastaje askorbat radikal. Vitamin E (αtokoferol) i vitamin A su efikasni liposulibilni antioksidansi koji funkcionišu tako što prekidaju lanac lipidne peroksidacije u plazma membrani i LDL česticama. Aktivnost sva tri antioksidativna vitamina zavisi od unosa hranom i statusa u organizmu. Koenzim Q10 je jedinjenje iz grupe ubihinona. Poseduje fenolnu strukturu koja mu omogućava antioksidativnu aktivnost. Neophodan je deo mitohondrijalnog elektrontransportnog lanca u kome služi kao nosač elektrona i protona. Koenzim Q10 se sintetiše u organizmu i unosi hranom, što postaje značajno sa godinama, obzirom da starenjem njegova produkcija u organizmu opada. Polifenoli su najbrojniji sekundarni metaboliti biljaka i utvrđeno je da imaju jak antioksidativni potencijal. Široko su rasprostranjeni u voću i povrću te im se pripisuje paleta bioloških efekata, računajući i hvatanje slobodnih radikala Antioksidativna aktivnost kakao praha S obzirom da kakao prah obiluje polifenolnim strukturama i to pre svega flavan- 3olima odnosno katehinima, na Slici 15 sistematizovana su delovanja ovih jedinjenja u pogledu antioksidativne aktivnosti. Naime, oni mogu ispoljiti svoju antioksidativnu aktivnost direktnim mehanizmima kao što su čišćenje ROS i heliranje metalnih jona ili putem indirektnih mehanizama koji uključuju: aktivaciju antioksidativnih enzima, inhibiciju prooksidativnih enzima i modulaciju interakcija receptora i liganada kojima otpočinju brojni signalni putevi inflamacije, a čiji je okidač oksidativni stres (Fan i sar., 2017; Fraga i sar., 2010; Youn i sar., 2006). 21