UNIVERZITET U BEOGRADU FAKULTET VETERINARSKE MEDICINE Katedra za higijenu i tehnologiju namirnica animalnog porekla Marko P. Dmitrić DETEKCIJA SALMONE

UNIVERZITET U BEOGRADU FAKULTET VETERINARSKE MEDICINE Katedra za higijenu i tehnologiju namirnica animalnog porekla Marko P. Dmitrić DETEKCIJA SALMONELA VRSTA I KARAKTERIZACIJA Salmonella Enteritidis i Salmonella Typhimurium POREKLOM IZ LANCA HRANE Doktorska disertacija Beograd, 2018. godine

UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF VETERINARY MEDICINE Department of Hygiene and Technology of Food of Animal Origin Marko P. Dmitrić THE DETECTION OF SALMONELLA SPECIES AND CHARACTERISATION OF Salmonella Enteritidis and Salmonella Typhimurium FROM FOOD CHAIN Doctoral Dissertation Belgrade, 2018.

MENTORI Dr Neđeljko Karabasil, vanredni profesor Fakultet veterinarske medicine Univerziteta u Beogradu Dr Dejan Vidanović, viši naučni saradnik Veterinarski specijalistički institut Kralјevo ČLANOVI KOMISIJE Dr Vlado Teodorović, redovni profesor Fakultet veterinarske medicine Univerziteta u Beogradu Dr Ljubiša Šarić, naučni saradnik, Institut za prehrambene tehnologije Novi Sad Dr Lazar Ranin, redovni profesor Medicinski Fakultet Univerziteta u Beogradu Datum odbrane:

ZAHVALNICA Kompletno istraživanje tokom izrade ove doktorske disertacije sprovedeno je u laboratoriji Veterinarskog specijalističkog instituta Kraljevo. Velika je čast biti deo takvog kolektiva, ustanove koja mladom čoveku daje punu podršku za profesionalno usavršavanje. Ovom prilikom želeo bih da se zahvalim svim kolegama iz Instituta koji su mi pomogli, podržavali me i usmeravali tokom izrade doktorske disertacije. Za ukazano poverenje, korisne savete, razumevanje i neizmernu podršku u trenucima kada mi je bila najpotrebnija, iskreno se zahvaljujem svom mentoru, prof. dr Neđeljku Karabasilu. Nadam se da je ova doktorska disertacija samo početak našeg zajedničkog rada i da ćemo u godinama koje dolaze biti u prilici da zajedno uradimo i mnogo više. Posebnu zahvalnost na pomoći i znanju koje mi je nesebično preneo, dugujem drugom mentoru, dr Dejanu Vidanoviću. Članovima komisije zahvaljujem se na korisnim komentarima i dragocenim savetima tokom izrade ove doktorske disertacije. Kolegama, prijateljima i svima koji su na bilo koji način pomogli, najiskrenije se zahvaljujem. Ovu doktorsku disertaciju posvećujem svojoj porodici - roditelijma, Mileni, Pavlu i Isidori.

DETEKCIJA SALMONELA VRSTA I KARAKTERIZACIJA Salmonella Enteritidis i Salmonella Typhimurium POREKLOM IZ LANCA HRANE Kratak sadržaj Izolacija i identifikacija Salmonella spp. ostaje nezamenjiva kao potvrdna metoda u mikrobiologiji hrane i hrane za životinje. Međutim, savremena industrija hrane, ali i javno zdravstvo zahtevaju razvoj novih, brzih metoda za detekciju Salmonella spp., jednog od najvažnijih patogenih mikroorganizama prenosivih hranom. Pored toga, tokom epidemioloških studija, uglavnom nije dovoljno da se izolati Salmonella tipiziraju do nivoa vrste i serotipa, već je neophodna i primena metoda tipizacije koje mogu napraviti razliku između epidemiološki različitih, ali genetski srodnih izolata. Veliki broj alternativnih metoda, uključujući i real-time PCR protokole, razvijen je i validovan u cilju detekcije Salmonella spp. Pored toga, napredak u razvoju molekularnih metoda pružio je alate visoke diskriminatorne moći koji su posebno mesto primene zauzeli pri određivanju izvora kontaminacije hrane, omogućavajući brzu i izuzetno pouzdanu tipizaciju Salmonella spp. Ova doktorska disertacija obuhvata četiri osnovne celine: (1) In house validacija real-time PCR protokola za detekciju inva i ttr gena Salmonella spp. u hrani i hrani za životinje; (2) In house validacija real-time PCR protokola za detekciju Salmonella Enteritidis i S. Typhimurium u hrani; (3) Razvoj i in house validacija novog real-time PCR protokola za detekciju inva gena Salmonella spp. u hrani; (4) Molekularna karakterizacija i ispitivanje antimikrobne osetljivosti Salmonella Enteritidis and S. Typhimurium izolovanih iz hrane, hrane za životinje i fecesa. Tokom izrade ove doktorske disertacije formirana je kolekcija od 60 izolata Salmonella Enteritidis i 60 izolata S. Typhimurium (po 12 poreklom ljudi, 24 poreklom iz hrane i 24 poreklom iz fecesa živine), a zatim je izvršena njihova molekularna karakterizacija i ispitivanje antimikrobne osetljivosti. Ispitivanje antimikrobne osetljivosti Salmonella izvršeno je disk difuzionom metodom prema EUCAST protokolu, dok je za određivanje minimalne inhibitorne koncentracije primenjen E test. Molekularna karakterizacija izvršena je primenom PFGE metode (Pulsed Field Gel Electrophoresis) prema CDC

PulseNet protokolu. Dodatno, izvršena je i molekularna tipizacija primenom real-time PCR metode detekcijom safa gena S. Enteritidis i flia-is200 gena S. Typhimurium. Opsežna validaciona studija prilikom koje su testirani real-time PCR protokoli za detekciju inva i ttr gena Salmonella spp. u hrani i hrani za životinje, dala je odlične rezultate i pokazala da mogu biti upotrebljene kao adekvatna zamena standardnoj metodi. Poređenjem različitih procedura ekstrakcije DNK, niže Cq vrednosti ostvarene su primenom Chelex ekstrakcije, nego ekstrakcijom zasnovanoj na termalnoj lizi ćelije. Nakon optimizacije real-time PCR protokola za detekciju Salmonella Enteritidis i S. Typhimurium, uspešno je izvršena detekcija pomenutih serotipova ispitivanjem 30 uzoraka pilećeg mesa i isto toliko uzoraka pilećih kožica sa vrata. Pored toga metoda je uspešno primenjena i prilikom tipizacije 60 izolata Salmonella Enteritidis i 60 izolata S. Typhimurium. Izvršeno je i dizajniranje prajmera i probe i optimizacija potpuno novog real-time PCR protokola za detekciju inva gena Salmonella spp. u hrani. Ispitivanje inclusivity izvršeno je upotrebom 76 različitih sojeva salmonela, pri čemu nije bilo lažno negativnih rezultata. Provera exclusivity ispitana je upotrebom 45 mikroorganizama koji nisu pripadnici roda Salmonella, pri čemu nije bilo lažno pozitivnih rezultata. Metoda je uspešno primenjena prilikom ispitivanja pet različitih veštački kontaminiranih kategorija hrane (ukupno 150 uzoraka). Ispitivanjem genetske sličnosti 60 izolata S. Enteritidis, upotrebom enzima XbaI, utvrđeno je 20 različitih PFGE profila - genotipova. Ispitivanjem genetske sličnosti 60 izolata S. Typhimurium, upotrebom enzima XbaI, utvrđen je 21 različit PFGE profil - genotip. Unutar izolata koji pripadaju istom profilu genetska sličnost je iznosila 100% dok je sličnost između različitih genotipova iznosila od 78 do 97% za S. Enteritidis i od 77 do 98% za S. Typhimurium. Rezultati ispitivanja 60 izolata S. Typhimurium disk difuzionom metodom pokazali su da je 50% izolata rezistentno na ampicilin; 46,67% na tetraciklin; 31,67% na hloramfenikol; 11,67% na trimetoprim i 3,33% na pefloksacin. Utvrđena je osetljivost svih izolata na - azitromicin, cefotaksim, ceftazidim, gentamicin, meropenem, pefloksacin i tigeciklin. Rezultati ispitivanja 60 izolata S. Enteritidis disk difuzionom metodom pokazali su da je 10% izolata rezistentno na pefloksacin; 5% na ampicilin i 1,67% na tetraciklin. Utvrđena

je osetljivost svih izolata na - azitromicin, cefotaksim, ceftazidim, hloramfenikol, gentamicin, meropenem, tigeciklin, trimetoprim. Svi rezistentni izolati, nakon disk difuzione metode ispitani su i primenom E test traka. Ključne reči: Salmonella, real-time PCR, PFGE, antimikrobna rezistencija Naučna oblast: Veterinarska medicina Uža naučna oblast: Higijena i tehnologija mesa UDK broj: 619:637.5:579

THE DETECTION OF SALMONELLA SPECIES AND CHARACTERISATION OF Salmonella Enteritidis and S. Typhimurium FROM FOOD CHAIN SUMMARY The isolation and identification of Salmonella spp. remains irreplaceable as a confirmatory method in the microbiology of food and feed. However, the modern food industry and public health require the development of new, rapid methods for the detection of Salmonella spp., one of the most important foodborne pathogens. In addition, during epidemiological studies, it is generally not sufficient to determine Salmonella isolates up to the species or the serotype level, but it is also necessary to apply subtyping methods that can distinguish between epidemiologically distinct, but genetically related isolates. A number of alternative methods, including real-time PCR protocols, have been developed and validated for the detection of Salmonella spp. In addition, the advances in the development of molecular methods have provided tools of high discriminatory power that have been particularly useful in determining food contamination sources, enabling fast and highly reliable typing of Salmonella spp. This dissertation has four major sections: (1) In-house validation of the real-time PCR protocol for the detection of inva and ttr genes of Salmonella spp. in food and feed; (2) In-house validation of the real-time PCR protocol for the detection of Salmonella Enteritidis and S. Typhimurium in food; (3) Development and in-house validation of new real-time PCR protocol for the detection of the inva gene of Salmonella spp. in food; (4) Molecular characterization and antimicrobial susceptibility testing of Salmonella Enteritidis and S. Typhimurium isolated from food, feed and feces. An extensive validation study, where real-time PCR protocols for the detection of inva and ttr of Salmonella spp. in food and feed were tested, gave excellent results and showed that they can be used as an adequate replacement for the standard method. By comparing different DNA extraction procedures, lower Ct values were achieved by using "Chelex extraction" rather than by extraction based on the thermal lysis of the cell.

A total of 60 isolates of Salmonella Enteritidis and 60 isolates of S. Typhimurium (12 originating from humans, 24 originating from food and 24 originating from livestock feces) were collected, followed by their molecular characterization and antimicrobial sensitivity testing. The antimicrobial sensitivity testing of Salmonella was performed using the disk diffusion method according to the EUCAST protocol, while the E test was used to determine the minimum inhibitory concentration. The molecular characterization was performed using the PFGE method (Pulsed Field Gel Electrophoresis) according to the "CDC PulseNet" protocol. In addition, molecular typing was performed using the real-time PCR method by detecting safa gene of S. Enteritidis and flia- IS200 gene S. Typhimurium. After optimizing the real-time PCR protocol for the detection of Salmonella Enteritidis and S. Typhimurium, the detection of these serotypes was successfully performed by examining 30 samples of chicken meat and the same number of samples of chicken skin from the neck. In addition, the method was successfully applied to 60 types of isolates Salmonella Enteritidis and 60 S. Typhimurium isolates. Additionally, the primers and the probe were designed and a completely new real-time PCR protocol for the detection of the inva gene of Salmonella spp. in food was optimized. The inclusivity test was performed using 76 different Salmonella strains, with no false-negative results. The exclusivity check was tested using 45 non-salmonella strains, with no false positive results. The method was successfully applied when examining five different artificially contaminated food categories (a total of 150 samples). By examining the genetic similarity of 60 isolates of S. Enteritidis, using Xbal enzyme, 20 different PFGE profiles were identified - genotypes. By examining the genetic similarity of 60 S. Typhimurium isolates using Xbal enzyme, 21 different PFGE profiles were identified - genotype. Within isolates belonging to the same profile, the genetic similarity was 100% while the similarity between the different genotypes ranged from 78 to 97% for S. Enteritidis and from 77 to 98% for S. Typhimurium. The results of the study of 60 isolates of S. Typhimurium disc diffusion method showed that 50% of the isolates were resistant to ampicillin; 46.67% to tetracycline; 31.67% to

chloramphenicol; 11.67% to trimethoprim and 3.33% to pefloxacin. The sensitivity of all isolates to - azithromycin, cefotaxime, ceftazidime, gentamicin, meropenem, pefloxacin, tigecycline was determined. The results of the study of 60 isolates of the S. Enteritidis disc diffusion method showed that 10% of the isolates were resistant to pefloxacin; 5% to ampicillin and 1.67% to tetracycline. The sensitivity of all isolates to - azithromycin, cefotaxime, ceftazidime, chloramphenicol, gentamicin, meropenem, tigecycline, trimethoprim was determined. All resistant isolates, after disc diffusion methods, were also tested using the E test strip. Key words: Salmonella, real-time PCR, PFGE, antimicrobial resistance Scientific field: Veterinary Medicine Field of academic expertise: Meat Hygiene and Technology UDK number: 619:637.5:579

SPISAK SKRAĆENICA AMP - ampicilin AMR - rezistencija prema antimikrobnim lekovima ATCC - American Type Culture Collection AZM - azitromicin C - hloramfenikol CAZ - ceftazidim CDC - Centers for Disease Control and Prevention CFU - Colony-forming unit CN - gentamicin Cq - quantification cycle CTX - cefotaksim DNK - Dezoksiribonukleinska kiselina EC - European Commission ECDC - European Centre for Disease Prevention and Control EFSA - European Food Safety Authority EUCAST - European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing BVL - Federal Office of Consumer Protection and Food Safety (Germany) IAC - Internal Amplification Control ISO - International Organization for Standardization IZJZS - Institut za javno zdravlje Srbije LOD - Limit of Detection MEM - meropenem MIC - minimalna inhibitorna koncentracija NCTC - National Collection of Type Cultures OJEU - Official Journal of the European Union PCR - Polymerase Chain Reaction PEF - pefloksacin PFGE - Pulsed-Field Gel Electrophoresis

PT - Proficiency Testing qpcr - Real-Time PCR (quantitative Polymerase Chain Reaction) RL - sulfametoksazol SG - Službeni glasnik Republike Srbije TE - tetraciklin TFS - Thermo Fisher Scientific TGC - tigeciklin W- trimetoprim WHO - World Health Organization WGS - Whole Genome Sequence analysis XLD - Xylose Lysine Deoxycholate agar

SADRŽAJ 1. UVOD... 1 2. PREGLED LITERATURE... 3 2.1. Istorijat, taksonomija i nomenklatura Salmonella spp... 3 2.2. Morfološke, biohemijske i kulturelne osobine... 4 2.3. Rast i preživljavanje... 5 2.4. Infektivna doza... 6 2.5. Adaptiranost na domaćina... 6 2.6. Epidemiologija Salmonella... 7 2.7. Incidencija salmoneloze ljudi... 9 2.8. Patogeneza... 11 2.9. Klinička slika... 11 2.10. Rezistencija Salmonella prema antimikrobnim lekovima... 12 2.11. Metode za detekciju i određivanje broja Salmonella spp... 13 2.11.1. Detekcija i izolacija Salmonella spp. u hrani, hrani za životinje i uzorcima iz okruženja u zoni proizvodnje hrane... 13 2.11.2. Metode za određivanje broja Salmonella... 14 2.12. Detekcija Salmonella spp. primenom polimeraza lančane reakcije (Polymerase Chain Reaction - PCR)... 14 2.12.1. Klasičan PCR (Endpoint PCR)... 15 2.12.2. Real-time PCR... 15 2.13. Metode za tipizaciju Salmonella spp... 17 2.13.1. Fenotipske metode tipizacije... 18 2.13.1.1. Serotipizacija... 18 2.13.1.2. Fagotipizacija... 18 2.13.1.3. Rezistotipizacija (određivanje osetljivosti na antimikrobne lekove)... 19 2.13.2. Genotipske metode tipizacije... 19 2.14. Validacija alternativnih metoda... 20 3. CILJ I ZADACI... 21

4. MATERIJAL I METODE... 22 4.1. Laboratorija za ispitivanje... 22 4.2. Real-time PCR aparati korišćeni prilikom validacionih studija... 22 4.3. Upotrebljeni referentni sojevi... 23 4.4. Materijal iz proficiency testing... 27 4.5. Veštačka kontaminacija uzoraka... 28 4.5.1. Veštačka kontaminacija uzoraka hrane... 28 4.5.2. Veštačka kontaminacija uzoraka hrane za životinje... 29 4.6. Tip uzoraka i broj uzoraka... 29 4.6.1. Hrana i uzorci iz okruženja - detekcija Salmonella spp... 29 4.6.2. Hrana za životinje - detekcija Salmonella spp... 30 4.6.3. Hrana i uzorci iz okruženja - detekcija Salmonella Enteritidis i S. Typhimurium... 31 4.7. Formiranje kolekcije izolata Salmonella Enteritidis i S. Typhimurium... 31 4.8. Izolacija Salmonella spp... 34 4.9. Detekcija Salmonella spp. u fecesu živine... 35 4.10. Serotipizacija... 36 4.11. Ekstrakcija DNK Salmonella spp... 36 4.12. Real-time PCR detekcija Salmonella spp... 37 4.12.1. Protokol za detekciju inva gena (Protokol A)... 37 4.12.2. Protokol za detekciju ttr gena (Protokol M)... 38 4.12.3. Komercijalni real-time PCR kit... 39 4.13. Real-time PCR detekcija Salmonella Enteritidis i S. Typhimurium... 41 4.14. Dizajniranje prajmera i proba za detekciju InvA gena Salmonella spp. (Protokol MD)... 42 4.15. Određivanje granice detekcije (LOD) i efikasnosti amplifikacije PCR protokola.. 44 4.16. Kontrola reakcije... 44 4.17. Termini i statistička analiza... 45 4.18. Ispitivanje antimikrobne osetljivosti... 46 4.18.1. Disk difuziona metoda... 46 4.18.2. E test... 47 4.19. Gel elektroforeza pulsirajućem polju (Pulsed Field Gel Electrophoresis - PFGE)... 48

5. REZULTATI... 51 5.1. Real-time PCR detekcija inva (Protokol A) i ttr gena Salmonella spp. (Protokol M) u hrani i uzorcima iz okruženja... 51 5.1.1. Ispitivanje veštački kontaminiranih uzoraka... 53 5.1.2. Ispitivanje potencijalno prirodno kontaminiranih uzoraka... 55 5.1.3. Real-time PCR protokol za detekciju inva gena (protokol A) - pojedinačni rezultati prema grupi uzoraka nakon Chelex ekstrakcije DNK... 57 5.1.4. Real-time PCR protokol za detekciju ttr gena (protokol M) - pojedinačni rezultati prema grupi uzoraka nakon Chelex ekstrakcije DNK... 59 5.1.5. Real-time PCR protokol za detekciju inva gena (protokol A) - pojedinačni rezultati prema grupi uzoraka nakon PBS ekstrakcije DNK... 61 5.1.6. Real-time PCR protokol za detekciju ttr gena (protokol M) - pojedinačni rezultati prema grupi uzoraka nakon PBS ekstrakcije DNK... 63 5.2. Real-time PCR detekcija inva (Protokol A) i ttr gena Salmonella spp. (Protokol M) u hrani za životinje... 65 5.2.1. Ispitivanje veštački kontaminiranih uzoraka hrane za životinje... 65 5.2.2. Ispitivanje prirodno kontaminiranih uzoraka i uzoraka nastalih mešanjem prirodno kontaminiranih sa nekonatminiranim uzorcima hrane za životinje.. 66 5.3. Razvoj, optimizacija i in house validacija nove real-time PCR metode (protokol MD) za detekciju inva gena Salmonella spp... 68 5.3.1. Određivanje granice detekcije (LOD) i efikasnosti amplifikacije PCR protokola... 68 5.3.2. Ispitivanje robustnosti (Robustness) real-time PCR metode (protokol MD)... 68 5.3.3. Teoretsko ispitivanje specifičnosti ( in-silico testiranje) real-time PCR metode (protokol MD)... 69 5.3.4. Analitička specifičnosti real-time PCR metode (protokol MD)... 69 5.3.5. Ispitivanje veštački kontaminiranih uzoraka... 72 5.3.6. Ispitivanja veštački kontaminiranih uzoraka pilećeg mesa - poređenje protokola A, M i MD... 73 5.3.7. Učešće u ispitivanjima osposobljenosti ( Proficiency Testing Scheme ).. 75 5.4. Real-time PCR protokol za detekciju S. Enteritidis i S. Typhimurium... 76 5.5. Karakterizacija Salmonella Enteritidis i S. Typhimurium izolovanih iz lanca hrane... 82 5.5.1. Tipizacija primenom real-time PCR protokola za detekciju safa gena S. Enteritidis i flia-is200 gena S. Typhimurium... 82

5.5.2. Genotipizacija Salmonella Enteritidis i S. Typhimurium izolovanih iz lanca hrane (Gel elektroforeza pulsirajućem polju - Pulsed Field Gel Electrophoresis - PFGE)... 83 5.5.2.1. Genotipizacija Salmonella Enteritidis izolovanih iz lanca hrane (Pulsed Field Gel Electrophoresis - PFGE)... 84 5.5.2.2. Genotipizacija Salmonella Typhimurium izolovanih iz lanca hrane (Pulsed Field Gel Electrophoresis - PFGE)... 89 5.5.3. Rezultati ispitivanja osetljivosti S. Enteritidis i S. Typhimurium na antimikrobne lekove disk-difuzionom metodom... 94 5.5.3.1. Rezultati ispitivanja osetljivosti S. Enteritidis na antimikrobne lekove disk-difuzionom metodom... 94 5.5.3.2. Rezultati ispitivanja osetljivosti S. Typhimurium na antimikrobne lekove disk-difuzionom metodom... 96 5.5.3.3. Zbirni prikaz rezultata ispitivanja osetljivosti S. Typhimurium disk difuzionom metodom... 100 5.5.3.4. Zbirni prikaz rezultata ispitivanja osetljivosti S. Enteritidis disk difuzionom metodom... 101 5.5.4. Rezultati ispitivanja osetljivosti S. Enteritidis i S. Typhimurium na antimikrobne lekove E testom... 103 5.5.4.1. Rezultati ispitivanja osetljivosti S. Enteritidis na antimikrobne lekove E testom... 103 5.5.4.2. Rezultati ispitivanja osetljivosti S. Typhimurium na antimikrobne lekove E testom... 104 6. DISKUSIJA... 106 6.1. Real-time PCR detekcija Salmonella spp. u hrani i hrani za životinje... 107 6.2. Razvoj nove metode za detekciju Salmonella spp. u hrani... 117 6.3. Real-time PCR detekcija Salmonella Enteritidis i S. Typhimurium u hrani... 122 6.4. Karakterizacija Salmonella Enteritidis i S. Typhimurium izolovanih iz lanca hrane... 124 6.4.1. Tipizacija primenom real-time PCR protokola za detekciju safa gena S. Enteritidis i flia-is200 gena S. Typhimurium... 126 6.4.2. Genotipizacija Salmonella Enteritidis i S. Typhimurium primenom PFGE metode... 127 6.4.3. Ispitivanje osetljivosti S. Enteritidis i S. Typhimurium na antimikrobne lekove... 129 7. ZAKLJUČCI... 132 8. LITERATURA... 134

1. UVOD Salmonella spp. predstavljaju jedne od vodećih patogena prenosivih hranom. Procenjuje se da su Salmonella spp. odgovorne za oko 93,8 miliona slučajeva oboljenja ljudi godišnje, od čega se 80,3 miliona slučajeva dovode u vezu sa hranom (Majowicz i sar., 2010). Na osnovu izveštaja Evropske agencije za bezbednost hrane (European Food Safety Authority - EFSA), u zemljama Evropske unije tokom 2016. godine zabeleženo je ukupno 94.530 potvrđenih slučajeva salmoneloze sa incidencijom od 20,4 na 100.000 populacije (EFSA, 2017). Prema izveštaju o zaraznim bolestima koji je objavio Institut za javno zdravlje Dr Milan Jovanovic Batut, u Republici Srbiji tokom 2016. godine zabeleženo je 1589 slučajeva oboljevanja od salmoneloze, sa incidencijom od 22,4 na 100.000 populacije (IZJZS, 2017). Stvarni broj je verovatno značajno veći usled pogrešno postavljene dijagnoze, odnosno nepostavljanja etiološke dijagnoze svih slučajeva gastrointestinalnih poremećaja. Standardna metoda za detekciju Salmonella spp. u hrani uključuje neselektivno predobogaćenje, praćeno selektivnim obogaćenjem i selektivnom izolacijom na čvrstim podlogama, nakon čega sledi biohemijsko i serološko potvrđivanje suspektnih kolonija (ISO, 2017). Čitava procedura zahteva 4-5 dana za detekciju i potvrđivanje Salmonella spp., što u nekim slučajevima prevazilazi rok upotrebe ispitivanog proizvoda. Savremena industrija hrane, ali i javno zdravstvo zahtevaju razvoj novih, brzih metoda za detekciju patogenih mikroorganizama prenosivih hranom. Real-time PCR metod ispunjava taj uslov, a uz to obezbeđuje visok nivo osetljivosti i specifičnosti, odličnu efikasnost i smanjen rizik od unakrsne kontaminacije (Rodriguez-Lazaro i sar., 2014). Veliki broj alternativnih metoda, uključujući i real-time PCR protokole, razvijen je i validovan u cilju detekcije Salmonella spp. u hrani (Lee i sar., 2015). Validacijom i standardizacijom realtime PCR protokola za detekciju Salmonella spp. u hrani, ispunjavaju se zahtevi zakonske regulative neophodni da se alternativna metoda koristi kao ekvivalentna zamena standardnoj (SG, 2010). Pored detekcije Salmonella spp., real-time PCR metoda daje i mogućnost tipizacije izolovanih Salmonella spp., ali i njihovu detekciju direktno u uzorku (Maurischat i sar., 2015, Prendergast i sar., 2013, Bugarel i sar., 2017). Bez obzira da li se real-time PCR metoda primenjuje u cilju detekcije ili tipizacije patogenih mikroorganizama prenosivih hranom, neophodno je da bude validovana u skladu sa 1

nekim od međunarodno priznatih protokola (AFNOR, 2016, NordVal, 2017; ISO, 2016). Implementacija ove metode u rutinskim ispitivanjima, unaprediće sistem bezbednosti u celokupnom lancu proizvodnje hrane i hrane za životinje, obezbeđujući rezultate podudarne sa standardnom metodom, ali znatno brže. Optimizacija i in house validacija protokola za detekciju genoma Salmonella spp., sprovedena tokom izrade ove doktorske disertacije, pruža jasniji uvid u performanse ispitanih metoda i daje dovoljno podataka za njihovu eventualnu implementaciju u rutinskim ispitivanjima. Dodatno, ova teza daje i potpuno nov protokol za detekciju Salmonella spp. primenom real-time PCR metode. Na osnovu izveštaja Evropske agencije za bezbednost hrane u zemljama Evropske unije tokom 2015. godine zabeleženo je ukupno 94.625 potvrđenih slučajeva salmoneloze ljudi, pri čemu je u 31.829 (45,7%) slučajeva kao uzročnik potvrđena Salmonella Enteritidis, u 10.997 (15,8%) slučajeva S. Typhimurium i u 5.770 (8,3%) slučajeva monofazna S. Typhimurium (EFSA, 2016). Tri najčešća Salmonella serotipa u 2016., sa procentualnim učešćem 70.3 % od ukupno potvrđenih slučajeva salmoneloze ljidi, bila su takođe S. Enteritidis, S. Typhimurium i monofazna S. Typhimurium (1,4, [5],12:i:-). Shodno prikazanim podacima, rezultati ove doktorske disertacije o prisutnim genotipovima, rezistenciji na antimikrobne lekove, kao i detekciji Salmonella Enteritidis i S. Typhimurium primenom real-time PCR metode, biće dragoceni, posebno zbog toga što se radi o epidemiolški važnim serotipovima koji su najčešći uzročnici oboljevanja ljudi. Karakterizacija pomenutih sojeva doprineće proceni značaja njihovog nalaza u hrani za javno zdravlje. Validacija real-time PCR protokola za detekciju Salmonella Enteritidis i S.Typhimurium u pilećem mesu naći će svoju primenu nakon njihovog uvođenja u propise Republike Srbije, a koji su u primeni u zemljama Evropske Unije od 2011. godine (OJEU, 2011). 2

2. PREGLED LITERATURE 2.1. Istorijat, taksonomija i nomenklatura Salmonella spp. Salmonella spp. pripadaju familiji Enterobacteriaceae i prema današnjoj nomenklaturi obuhvataju preko 2600 različitih serovarijeteta (Issenhuth-Jeanjean i sar., 2014). Salmonella spp. su važan uzročnik oboljenja, kako u humanoj, tako i u veterinarskoj medicini. Salmoneloze su zoonoze (Hendriksen i sar., 2004; Hoelzer i sar., 2011)., ali je infekcija ljudi najčešće povezana sa konzumiranjem kontaminirane hrane (Thorns, 2000; Majowicz i sar., 2010). Većina serovarijeteta Salmonella spp. smatraju se patogenima za čoveka, ali razlike u virulenciji postoje u odnosu na serovarijetet i soj, a posledično se javljaju i razlike u karakteristikama i ozbiljnosti oboljenja do kojeg dovode (Sonja Radojičić, 2011; Adams i Moss, 2008). Današnja nomenklatura obuhvata dve vrste u okviru roda Salmonella: Salmonella enterica i S. bongori. Salmonella enterica vrsta podeljena je u 6 podvrsta: S. enterica subsp. enterica (subspecies I), S. enterica subsp. salamae (subspecies II), S. enterica subsp. arizonae (subspecies IIIa), S. enterica subsp. diarizonae (subspecies IIIb), S. enterica subsp. houtenae (subspecies IV) and S. enterica subsp. indica (subspecies VI). Od prve publikacije Kauffmann-White šeme (Subcommittee, 1934), nomenklatura Salmonella pretrpela je veliki broj izmena (Su and Chiu, 2007, Evangelopoulou et al., 2010, Brenner et al., 2000, Tindall et al., 2005). Trenutno, White-Kauffmann-Le Minor šema (Grimont and Weill, 2007), uključujući dodatak 47 (Guibourdenche et al., 2010) i dodatak 48 (Issenhuth-Jeanjean et al., 2014) koji obuhvataju novootkrivene serotipove u periodu od 2003-2010. godine, definiše 2659 serotipova u okviru roda Salmonella (Tabela 2.1). 3

Tabela 2.1. Broj serovarijeteta u okviru vrsta i podvrsta Salmonella (Issenhuth-Jeanjean et al., 2014) Vrsta / podvrsta Broj serovarijeteta S. enterica 2637 subsp. enterica 1586 subsp. salamae 522 subsp. arizonae 102 subsp. diarizonae 338 subsp. houtenae 76 subsp. indica 13 S. bongori 22 Serotipizacija Salmonella spp. zasniva se na ispitivanju O antigena (somatski antigen), H antigena (flagelarni antigen) i Vi antigena (kapsularni). Ova ispitivanja izvode se testom brze aglutinacije na mikroskopskoj plocici. U prvoj fazi seroloske tipizacije se ispituje O antigen i utvrđuje serološka grupa Salmonella. Zatim se u dve faze ispituje prisustvo H antigena i određuje serotip (Grimont and Weill, 2007; ISO, 2014). 2.2. Morfološke, biohemijske i kulturelne osobine Bakterije roda Salmonella su asporogeni, fakultativno anaerobni, Gram negativni štapići, dužine 2-5 µm i širine 0,7-1,5 µm (Ozkalp B., 2012). Sa izuzetkom S. Gallinarum biovar gallinarum / pullorum, ostale salmonele su pokretne zahvaljujući peritrihno raspoređenim flagelama. Optimalna temperatura za rast je 37 C, iako je rast zabeležen u opsegu od 5-47 C (Adams i Moss, 2008). Razlažu glukozu i druge ugljene hidrate uz stvaranje kiseline i gasa. Salmonele su oksidaza negativne i katalaza pozitivne, koriste citrat kao jedini izvor ugljenika, stvaraju hidrogen sulfid, vrše dekarboksilaciju lizina i ornitina i ne hidrolizuju ureu. Tipične kulture Salmonella na kosom TSI agaru (trostruki šećer/ gvožđe agar) pokazuju alkalnu (crvenu) kosu površinu i kiselo (žuto) dno sa stvarenjem gasa (mehurića) i (u oko 90% slučajeva) stvaranjem vodonik-sulfida (pocrnjenje agara) (ISO, 2017). 4

Pripadnici roda Salmonella se dobro razmnožavaju na običnim hranljivim podlogama, ali se za njihovu izolaciju iz hrane koriste selektivne i diferencijalne podloge (Gulsen Altug, 2012; Martin Busse, 1995). Standardna metoda za detekciju salmonela u hrani, podrazumeva upotrebu dve selektivne čvrste podloge za izolaciju, XLD agar i njemu komplementarnu selektivnu podlogu. Tipične kolonije Salmonella na XLD agaru imaju crno središte i svetlu prozirnu zonu crvenkaste boje. Varijante Salmonella H2S negativne (na primer S. Paratyphi A) na XLD agaru imaju ružičastu boju sa tamnije ružičastim središtem, dok Salmonella pozitivne na laktozu na XLD agaru imaju žutu boju sa crnim središtem ili bez njega (ISO, 2017). 2.3. Rast i preživljavanje Salmonella spp. mogu da rastu u ph rasponu od 4-9, a optimalna ph vrednost za rast iznosi 6,5-7,5. Zahtevaju visoku aktivnost (aw) vode za svoj rast, između 0,94 i 0,99, ali mogu preživeti na aw<0,2. Za većinu serotipova može se reći da se inhibicija rasta dešava na t <7 C, ph <3.8 ili aw<0.94 (Pui, 2001). Skladištenje hrane na temperaturi ispod 7 C sprečava umnožavanje svih serotipova sa izuzetkom Salmonella Heidelberg, koja ima sposobnost rasta na temperaturi do 5.3 C (Giaccone i sar., 2012). Salmonele su termolabilne bakterije i lako se uništavaju na temperaturi pasterizacije. S. Senftenberg 775W (ATCC 43845) je serotip najotporniji na termalnu inaktivaciju (u mleku ima D72 = 0.09 min, u poređenju sa S. Typhimurium za koju je D72 = 0.003 min) (Adams i Moss, 2008; Silva i Gibbs, 2012). Otpornost prema povišenoj temperaturi zavisi od više faktora, kao što su: aktivnost vode, sastav hrane, ph vrednost i starost bakterijskih ćelija. U uslovima snižene aktivnosti vode salmonele su otpornije na termalnu inaktivaciju (prisustvo vode favorizuje termalno raskidanje peptidnih veza). Sastav hrane, posebno sadržaj masti, kao i glicerola i saharoze mogu povećati otpornost na termalnu inaktivaciju. Osetljivost na povišenu temperaturu povećava se i udaljavanjem od neutralne ph vrednosti (povećavanjem ili smanjivanjem ph) (Giaccone i sar., 2012). 5

2.4. Infektivna doza Infektivna doza pri kojoj salmonele dovode do razvoja infekcije zavisi od nekoliko faktora kao što su imunološki status i uzrast domaćina, hrane kao nosioca i osobina samog soja bakterija. Generalno, smatra se da je za izazivanje oboljenja ljudi neophodno da broj salmonela dostigne 10 4 cfu/g namirnice (Giaccone i sar., 2012). Međutim, podaci iz epidemija pokazuju da veoma mali broj bakterija posle ingestije zajedno sa hranom može dovesti do razvoja bolesti (Tabela 2.2). Infektivna doza je niža ukoliko se salmonele nalaze u namirnicama sa visokim sadržajem masti (čokolada, sir) i proteina, koji štite bakterijsku ćeliju od uticaja niskog ph želudačnog soka. Kod dece su niže doze, kao i kod starijih osoba i osoba koje su pod terapijom antacidima (Blaser i Newman, 1982). Tabela 2.2. Neki od primera hrane povezane sa niskom infektivnom dozom u epidemijama salmoneloze ( Barrow i Methner, 2013) Vrsta hrane Salmonella serotip Infektivna doza (br. bakterija / osobi) Čokolada S. Eastbourne, S. Napoli, S. Typhimurium 10-100 Čedar sir S. Heidelberg, S. Typhimurium 1-100 Kukuruzne grickalice S. Argona 2-45 Hamburger S. Newport 10-100 Čips S. Saintpaul, S. Rubislaw, S. Javiana 4-45 2.5. Adaptiranost na domaćina Stepen prilagođenosti domaćinu razlikuje se između serotipova Salmonella i određuje njihovu patogenost, odnosno kliničke manifestacije. Po tom osnovu serotipovi Salmonella spp. mogu se podeliti u tri grupe (Stevens i sar., 2009): 1. serotipovi koji nisu adaptirani na specifičnog domaćina - ovoj grupi pripadaju serotipovi kao što su S. Enteritidis i S. Typhimurium, koji generalno dovode do većine gastrointestinalnih infekcija ljudi. Oni predstavljaju patogene i za životinje, a ishod infekcije kreće se u 6

širokom opsegu, od teških sistemskih bolesti do asimptomatskih stanja (Hoelzer i sar., 2011); 2. serotipovi visoko prilagođeni domaćinu - izazivaju sistemske infekcije ograničenog broja srodnih vrsta. Tako na primer, serotipovi prilagođeni čoveku, kao što su Salmonella Typhi i S. Paratyphi A, B, C, izazivaju tifoidnu i paratifoidnu groznicu ljudi. Slično, S. Gallinarum je specifično adaptirana na živinu (Velge i sar., 2012); 3. serotipovi prilagođeni specifičnom domaćinu, ali ponekad mogu inficirati i druge vrste - na primer, S. Choleraesuis, za koju su svinje primarni domaćin, izaziva i tešku sistemsku infekciju ljudi. Isto tako, Salmonella Dublin je visoko patogena za ljude, iako je prilagođena govedima kod kojih izaziva sistemske infekcije i može dovesti i do abortusa (Luciana i sar., 2012; Hoelzer i sar., 2011). Međutim, podelu serotipova prema adaptiranosti na domaćina bi ipak trebalo shvatiti uslovno, jer u okviru istog serotipa mogu postojati subtipovi koji se razlikuju u pogledu prilagođenosti domaćinu. Na primer postoje sojevi S. Typhimurium koji se mogu smatrati prilagođenim domaćinu, kao što je slučaj sa S. Typhimurium DT 2 i DT 99 sojevima koji dovode do specifičnog oboljenja golubova (avian paratyphoid disease) (Rabsch i sar., 2002). 2.6. Epidemiologija Salmonella Širom sveta Salmonella spp. predstavljaju jedan od najvažnijih patogenih mikroorganizama sa aspekta javnog zdravlja, a uz to dovode i do velikih ekonomskih opterećenja, u zemljama u razvoju, ali i u razvijenim zemljama (Crump i sar., 2004; Majowicz i sar., 2010). Salmonele mogu biti prisutne u okruženju, ali uobičajeno stanište za njih je gastrointestinalni sistem divljih i domaćih životinja (Winfield i Groisman, 2003). Životinje se mogu inficirati kroz kontaminaciju iz okruženja, od strane drugih životinja ili kroz kontaminiranu hranu. Pored živine, svinja, goveda, ovaca i koza (Wong i sar., 2002; Antunes i sar., 2016; Wiedemann i sar., 2014) i druge životinje, uključujuci ostale ptice, školjke, gmizavce i vodozemce, mogu se inficirati i biti nosioci salmonela (Tizard, 2004; Damborg i sar., 2016; Back i sar., 2016; Heinitz i sar., 2000). Takođe, rezervoari salmonela mogu biti i ljudi. Salmoneloze su zoonoze i mogu se prenositi sa životinja na ljude, ali i obratno (Hendriksen i sar., 2004; Hoelzer i sar., 2011). Glavni put infekcije ljudi je kroz kontaminiranu hranu, a primarni izvor je hrana životinjskog porekla, posebno živina i proizvodi od nje (Thorns, 2000). Takođe, izvor 7

infekcije mogu biti ljudi, životinje, voda i okruženje kontaminirano salmonelama (Bertrand i sar., 2008). Izvor Salmonella spp. za ljude često mogu biti i kućni ljubimci, posebno gmizavci i vodozemci, sa kojih se infekcija prenosi direktnim ili indirektnim kontaktom (Bertrand i sar., 2008; Damborg i sar., 2016). Inficirane životinje izlučuju salmonele fecesom i tako kontaminiraju zemlju, vodu, druge životinje i ljude. Sled događaja koji dovodi do infekcije ljudi preko hrane, najčešće uključuje životinju koja je nosilac salmonela, ali ne ispoljava kliničke simptome (eng. healthy carrier), sa koje se prenošenje patogenog mikroorganizma na čoveka vrši tokom proizvodnje, rukovanja ili konzumiranja hrane. U lancu proizvodnje hrane, kontaminacija salmonelama može se desiti u bilo kojoj tački: na njivi, na farmi, tokom proizvodnje, prerade i rukovanja hranom i hranom za životinje (Wong i sar., 2002). Salmonella spp. se često dovode u vezu sa živinom. Proizvodi od živine predstavljaju najznačajniji izvor salmoneloze, pri čemu su nedovoljno termički tretirani proizvodi i unakrsna kontaminacija označeni kao glavni rizik (Cox i sar, 2011; Rasschaert i sar., 2008). Prevalencija salmoneloze kod živine zavisi pre svega od sistema proizvodnje i primenjenih kontrolnih mera (Rašeta i sar., 2014; Pajić i sar., 2015). Jata živine inficirana na farmi, asimptomatski nose Salmonella spp. u gastrointestinalnom sistemu, koje predstavljaju izvor kontaminacije trupova prilikom klanja. Tokom proizvodnje mesa živine kontaminacija salmonelama moguća je u različitim fazama, posebno prilikom čerupanja i evisceracije (Cox i sar, 2011; Rasschaert i sar., 2008). Svinje takođe predstavljaju značajan izvor Salmonella spp. (Botteldoorn i sar., 2003; Karabasil i sar., 2008; Kureljusic i sar., 2017). Kolonizacija svinja salmonelama odigrava se na farmi, a izvor mogu biti kontaminirana voda i hrana, vektori i drugi izvori iz okruženja (Wong i sar., 2002). Svinje se mogu inficirati tokom transporta, takođe i u stočnom depou, koji se smatra glavnim izvorom kontaminacije Salmonella spp. pre klanja (Karabasil i sar., 2012 b). Nakon kolonizacije gastrointestinalnog sistema svinja, trupovi mogu biti kontaminirani prilikom klanja i obrade, a posledično kontaminirano meso može imati ulogu izvora salmoneloze (Karabasil i sar., 2012 b). Goveda mogu biti asimptomatski inficirana Salmonella spp., i posledično može doći do kontaminacije goveđeg mesa prilikom klanja ili obrade (Bacon i sar., 2002). 8

Voće i povrće takođe sve češče povezuju sa infekcijama Salmonella spp., jer je kontaminacija moguća na u različitim fazama proizvodnje, počevši od njive, prilikom transporta, pranja i pakovanja (Lynch i sar., 2009). 2.7. Incidencija salmoneloze ljudi Prema izveštaju o zaraznim bolestima u Republici Srbiji koji je objavio Institut za Javno zdravlje Dr Milan Jovanovic Batut u 2012. godini zabeleženo je 1550 slučajeva oboljevanja od salmoneloze, sa incidencijom 21,56/100.000 stanovnika. Registrovane su 63 epidemije salmoneloza u kojima je put prenosa bila hrana, sa ukupno 483 obolele osobe (IZJZS, 2013). U 2013. godini zabeležen je 1571 slučaj obolevanja od salmoneloza, sa incidencijom 21,82/100.000 populacije. Prijavljene su 74 epidemije salmoneloza u kojima je put prenosa bila hrana, sa ukupno 474 obolele osobe (IZJZS, 2014). Godine 2014. zabeleženo je 1512 slučajeva obolevanja od salmoneloza, sa incidencijom 21,1/100.000 populacije. Prijavljeno je 46 epidemija salmoneloza u kojima je put prenosa bila hrana, sa ukupno 409 obolelih osoba (IZJZS, 2015). U 2015. godini na teritoriji Republike Srbije zabeležen je najveći broj slučajeva salmoneloze u posmatranom periodu od 2012 do 2016. godine, ukupno 1712 slučajeva. Iincidencija je iznosila 24,01/100.000 populacije. Prijavljeno je 45 epidemija salmoneloza u kojima je put prenosa bila hrana, sa ukupno 374 obolele osobe i 9 smrtnih ishoda (IZJZS, 2016). U 2016. godini na teritoriji Republike Srbije zabeleženo je 1589 slučajeva obolevanja od salmoneloze, sa incidencijom 22,4/100.000 populacije. Najviša specifična stopa incidencije registrovana je u uzrasnoj grupi 0 4 godine (165,97/100.000), a najniža u uzrasnoj grupi 30-39 i 50-59 godina (7,77/100.000, odnosno 8,45/100.000). Prijavljene su 73 epidemije sa alimentarnim putem širenja infektivnog agensa, sa 636 obolelih osoba. Učešće alimentarnih epidemija u ukupnom broju prijavljenih epidemija iznosilo je 27,86% i niže je u poređenju sa 2015. godinom (36,8%). U okviru alimentarnih epidemija, najčešće su registrovane epidemije salmoneloze, ukupno 35 epidemija (47,95%) sa 194 obolele osobe (Tabela 2.3.). Tokom alimentarnih epidemija, najčešći uzročnik salmoneloze ljudi u Republici Srbiji, u periodu od 2014 do 2016., bila je Salmonella Enteritidis sa procentualnim učešćem - 76% (2014. god.), 80% (2015. god.) i 100% (2016. god.) (IZJZS, 2015; IZJZS, 2016; IZJZS, 2017). 9

Tabela 2.3. Alimentarne epidemije - salmoneloza ljudi u Republici Srbiji od 2012. do 2016. godine 2016. 2015. 2014. 2013. 2012. Broj potvrđenih slučajeva 194 374 409 474 483 Broj epidemija povezanih sa hranom 35 45 46 74 63 Na osnovu izveštaja Evropske agencije za bezbednost hrane (European Food Safety Authority - EFSA), u 2016. godini dve najfrekventnije zoonoze kod ljudi u Evropskoj uniji (EU) su bile kampilobakterioza i salmoneloza. EFSA je, u izveštaju objavljenom 2017. godine o stanju i trendovima zoonoza, zoonotskih agenasa i agenasa prenosivih hranom u zemljama članicama EU, navela da je tokom 2016. godine zabeleženo 94530 potvrđenih slučajeva salmoneloze kod ljudi. Broj obolelih ljudi, incidencija i broj epidemija povezanih sa hranom u zemljama Evropske Unije, u periodu od 2012. do 2016. godine prikazan je u tabeli 2.4. (EFSA, 2017). Tabela 2.4. Salmoneloza ljudi u zemljama Evropske Unije u periodu od 2012. do 2016. godine Salmoneloza ljudi 2016. 2015. 2014. 2013. 2012. Broj potvrđenih slučajeva 94530 94597 92012 87753 94278 Broj potvrđenih slučajeva na 100,000 stanovnika Broj epidemija povezanih sa hranom 20,4 20,9 20,7 20,3 21,9 1067 953 1049 1168 1533 Na osnovu izveštaja Evropske agencije za bezbednost hrane u zemljama Evropske unije tokom 2016. godine od ukupno 94530 potvrđenih slučajeva salmoneloze ljudi, u 32685 (48,5%) slučajeva kao uzročnik potvrđena Salmonella Enteritidis, u 9012 (13,4%) 10

slučajeva S. Typhimurium i u 5666 (8,4%) slučajeva monofazna S. Typhimurium. Tri najčešća Salmonella serotipa u 2015., sa procentualnim učešćem 69,7% od ukupno potvrđenih slučajeva salmoneloze ljidi, bila su takođe S. Enteritidis, S. Typhimurium i monofazna S. Typhimurium (1,4, [5],12:i:-), a u 2014 procentualno učešće iznosilo je 69,6% (EFSA, 2017). 2.8. Patogeneza Salmonella spp. mogu inficirati i hladnokrvne i toplokrvne domaćine i ova široka paleta potencijalnih domaćina odražava sposobnost ovog patogenog mikroorganizma da se prilagodi različitim okruženjima (Sanchez -Vargas i sar., 2011). Salmonela pokazuje izuzetnu karakteristiku prilikom invazije nefagocitnih ćelija domaćina, prilikom čega indukuju sopstvenu fagocitozu u cilju ulaska u ćeliju domaćina (Hansen-Vester i sar., 2002; Sanchez -Vargas i sar., 2011;). Posle ulaska Salmonella u ćeliju domaćina, one se nalaze u odeljku koji se naziva vakuola, a ona se sastoji od membrane ćelija domaćina. U normalnim okolnostima, prisustvo bakterijskog stranog tela aktiviralo bi imuni odgovor ćelija domaćina, što bi dovelo do spajanja vakuole sa lizozimima i sekrecije digestivnih enzima koji bi razorili bakterije u ćelija (Shu-Kee i sar., 2015). Međutim, Salmonella koristi efektorne proteine koji dovode do promena u vakuoli što rezultira blokiranjem spajanja sa lizozomima i omogućava intracelularno preživljavanje i umnožavanje Salmonella u ćelijama domaćina. Sposobnost bakterija da preživi unutar makrofaga omogućava im prenos u retikuloendotelijalnom sistemu (RES) (Monack i sar., 2004; Sanchez -Vargas i sar., 2011; Shu-Kee i sar., 2015). 2.9. Klinička slika Na osnovu kliničkih manifestacija salmoneloze ljudi, salmonele se mogu podeliti u dve grupe, tifoidne i netifoidne. Salmoneloza ljudi obuhvata četiri kliničke manifestacije: enteričnu groznicu, gastroenteritis, bakterijemiju i druge ekstraintestinalne komplikacije i hronično kliconoštvo (Shu-Kee i sar., 2015; Darby i sar., 2008). Uzročnik tifoidne groznice je Salmonella Typhi, dok paratifoidnu groznicu izaziva S. Paratyphi A, B and C. (Connor i Schwartz 2005; Shu-Kee i sar., 2015). Ostale Salmonella izuzimajući S. 11

Typhi i S. Paratyphi, za koje su rezervoari najčešće životinje, obično dovode do razvoja gastroenteritisa, praćenog simptomima kao što su dijareja bez krvi, mučnina, povraćanje, glavobolja, abdominalni grčevi i mijalgija (Sanchez -Vargas i sar., 2011). 2.10. Rezistencija Salmonella prema antimikrobnim lekovima Infekcija ljudi salmonelama najčešće rezultira blagim gastrointesinalnim poremećajem i obično ne zahteva antimikrobnu terapiju, već se primenjuje simptomatska terapija koja podrazumeva pre svega nadoknadu tečnosti i elektrolita (Darby i sar., 2008). Međutim, kod nekih pacijenata, kao što su deca ili stare osobe, imunokompromitovane osobe ili osobe sa sistemskim infekcijama, mogući su ozbiljniji slučajevi bolesti koji zahtevaju adekvatnu antimikrobnu terapiju (Angulo i sar., 2000; Hohmann, 2001). Godinama, ampicillin, trimetoprim-sulfametoksazol i hloramfenikol bili su lekovi izbora za teške infekcije salmonelama. Porast rezistencije prema ovim antimikrobnim lekovima značajno je redukovao njihovu efikasnost. Posledično, fluorohinoloni i cefalosporini proširenog spektra su postali antimikrobni lekovi izbora u terapiji invazivnih infekcija salmonelama (Winokur, 2000). Uopšteno, mehanizmi rezistencije koje koriste druge bakterije prema antimikrobnim agensima takođe se primenjuju i na salmonele, uključujući proizvodnju enzima koji inaktiviraju antimikrobne lekove, smanjenje propustljivosti bakterijske ćelijske membrane, aktiviranje efluks pumpe i modifikacije ciljnog regiona za antimikrobni lek (Sefton, 2002). Geni odgovorni za rezistenciju salmonela prema antimikrobnim lekovima prenose se na različite načine, uključujući konjugaciju, transformaciju i transdukciju (Foley i Lynne, 2008). Prenošenje gena rezistencije prelazi barijeru vrste, tako da se može ostvartiti između Salmonella (Ferguson i sar., 2002), ali je transfer gena moguć i između Salmonella spp. i drugih bakterijskih vrsta (Walsh i sar., 2008). Jasno je da problem antimikrobne rezistencije neće biti lako rešen, stoga su mnoge zemlje širom sveta ujedinjene u njegovom rešavanju kroz nacionalne, regionalne i globalne programe nadzora smanjene osetljivosti prema antimikrobnim lekovima (WHO, 2015). 12

2.11. Metode za detekciju i određivanje broja Salmonella spp. 2.11.1. Detekcija i izolacija Salmonella spp. u hrani, hrani za životinje i uzorcima iz okruženja u zoni proizvodnje hrane Tradicionalne metode izolacije Salmonella spp. uključuju neselektivno predobogaćenje definisane mase ili zapremine uzorka, praćeno fazom selektivnog obogaćenja, zatim izolacijom na čvrstim selektivnim podlogama i biohemijskim i serološkim potvrđivanjem suspektnih kolonija. Različiti pristupi izolacije Salmonella spp. standardizovani su od strane nekoliko ustanova kao što su International Organization for Standardization (ISO), Association of Official Analytical Chemists (AOAC), Food and Drug Administration (FDA) i Food Safety and Inspection Service (FSIS) (Lee i sar., 2014). Standardna metoda za detekciju Salmonella u hrani, prihvaćena i od Instituta za standardizaciju Republike Srbije je Horizontalna metoda za otkrivanje, određivanje broja i serotipizaciju Salmonella - Deo 1: Otkrivanje Salmonella spp. (SRPS EN ISO 6579-1:2017). Metoda SRPS EN ISO 6579-1: 2017 obuhvata i aneks D koji se odnosi na detekciju Salmonella enterica subspecies enterica serovars Typhi i Paratyphi. Detekcija Salmonella spp. hrani i hrani za životinje (izuzimajući aneks D) obuhvata četiri uzastopne faze: 1. Predhodno obogaćenje u neselektivnoj tečnoj podlozi (puferisana peptonska voda - BPW). 2. Selektivno obogaćenje - upotrebom selektivne tečne Rappaport - Vassiliadis podloge sa sojom (RVS bujon) ili modifikovanog polučvrstog Rappaport - Vassiliadis agara (MSRV agar) i Kauffmann tetrtionat - novoniocin bujona (MKTTn). 3. Izolacija na selektivnim čvrstim podlogama - vrši se upotrebom ksiloza lizin dezoksiholat agara (XLD agar) i druge selektivno diferencijalne podloge po izboru (komplementarna XLD agaru). 4. Potvrđivanje primenom biohemijskih i seroloških testova - biohemijsko potvrđivanje vrši se zasejavanjem čiste kulture na odgovarajuće podloge biohemijskog niza (TSI agar, urea agar, podloga za dekarboksilaciju lizina) ili upotrebom komercijalnih testova prema uputstvu proizvođača. Serološka potvrda 13

vrši se aglutinacijom na mikroskopskoj pločici upotrebom odgovarajućih antiseruma (ISO, 2017; Kirsten, 2018). Kompletna procedura zahteva 4 do 6 radnih dana. 2.11.2. Metode za određivanje broja Salmonella Godine 2012. Međunarodna organizacija za standardizaciju (ISO) publikovala je standard za određivanje broja salmonela (ISO, 2012), a 2014. godine i standard za detekciju, određivanje broja i serotipizaciju salmonela (ISO, 2014). Oba standarda prihvaćena su od Instituta za standardizaciju Srbije 2014. godine (SRPS CEN ISO/TS 6579-2:2014 i SRPS CEN ISO/TR 6579-3:2014). Metoda SRPS CEN ISO/TS 6579-2:2014 namenjena za određivanje broja salmonela zasnovana je na tehnici najverovatnijeg broja (the most probable number - MPN) (ISO, 2012). Broj salmonela u uzorku može biti određen i klasičnom metodom za brojanje bakterija, direktnim zasejavanjem na čvrste podloge, na primer XLD (Brichta-Harhay i sar., 2008). 2.12. Detekcija Salmonella spp. primenom polimeraza lančane reakcije (Polymerase Chain Reaction - PCR) Jedna od najčešće korišćenih molekularnih metoda za detekciju patogenih mikroorganizama prenosivih hranom je polimeraza lančana reakcija (PCR). Za implementaciju ove tehnike Cary B. Mullis dobio Nobelovu nagradu 1993. godine (www.nobelprize.org) i od tada je postala kamen temljac molekularne biologije (Mullis i sar., 1986). Metoda je našla široku primenu kako u kliničkoj mikrobiologiji, tako i u mikrobiologiji namirnica. 14

2.12.1. Klasičan PCR (Endpoint PCR) Polimeraza lančana reakcija (PCR) predstavlja brzu, osetljivu i specifičnu metodu za otkrivanje patogenih mikroorganizama u hrani. Zapravo, PCR predstavlja in vitro amplifikaciju definisane DNK sekvence (imitacija procesa DNK replikacije). Reakcija koristi dva oligonukleotida (prajmera) koji su komplementarni krajevima sekvence koja se umnožava i koji su međusobno suprotno orjentisani. Specifične sekvence nukleinske kiseline amplifikuju se tokom cikličanog procesa koji se sastoji iz tri faze (ISO, 2008; Mandal i sar 2011): a) denaturacija dvostrukog lanca nukleinske kiseline (DNK); b) aniling (eng. annealing) prajmera na komplementarnu ciljanu sekvencu; c) produžavanje prajmera pomoću termostabilne DNK polimeraze. Posle denaturacije dvostrukog lanca DNK, dva oligonukleotidna prajmera aneliraju se (hibridizuju se) na ciljani DNK segment koji se amplifikuje. Prajmeri su usmereni u obrnutom pravcu jedan od drugog u odnosu na svoju orijentaciju ka ciljanoj sekvenci. Zatim sledi proces polimerizacije, pri čemu se vrši ekstenzija prajmera komplementarnim vezivanjem baza za ciljanu sekvencu, pomoću DNK polimeraze otporne na toplotu. Ponovljeni procesi denaturacije toplotom, aneliranja prajmera i sinteze DNK rezultiraju skoro eksponencijalnom amplifikacijom DNK segmenta ograničenog prajmerima. Proizvodi PCR se otkrivaju gel-elektroforezom nakon bojenja etidijum-bromidom (Zhao i sar., 2014; ISO, 2008). 2.12.2. Real-time PCR Real-time PCR se razlikuje od klasičnog PCR-a po tome što ne zahteva gel ektroforezu za detekciju PCR proizvoda (Higuchi i sar.,1993). Ova metoda pruža mogućnost kontinuiranog praćenja stvaranja PCR produkata tokom čitave reakcije merenjem fluorescentnog signala koji stvara specifično dvojno-obeležena proba ili interkalirajuća boja. Intezitet fluorescencije proporcionalan je količini PCR amplikona (Law i sar., 2015). Uopšteno real-time PCR metoda obuhvata sledeće faze (ISO 2015 b): 15