Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Vanessa Krasnić Priprema adenovirusnih vektora za unos gena TLR5 u stanice pl

Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Vanessa Krasnić Priprema adenovirusnih vektora za unos gena TLR5 u stanice pluća Diplomski rad Zagreb, 2019. godina

Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Vanessa Krasnić Priprema adenovirusnih vektora za unos gena TLR5 u stanice pluća Diplomski rad Zagreb, 2019. godina

Ovaj rad izrađen je u Laboratoriju za naprednu genomiku, na Zavodu za molekularnu medicinu, Institut Ruđer Bošković u Zagrebu, pod vodstvom dr. sc. Jelene Knežević, više znanstvene suradnice na IRB-u. Rad je predan na ocjenu Biološkom odsjeku Prirodoslovno-matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu, radi stjecanja zvanja magistra molekularne biologije.

Zahvale Zahvaljujem mentorici dr. sc. Jeleni Knežević i suvoditeljici prof. dr. sc. Nadi Oršolić koje su mi omogućile izradu ovog diplomskog rada. Prvenstveno zahvaljujem dr. sc. Jeleni Knežević što mi je pružila mogućnost izrade ovog diplomskog rada na IRB-u. Zahvaljujem dr. sc. Dragomiri Majhen na savjetima i mogućnosti izrade djela eksperimenata u laboratoriju za staničnu biologiju i prijenos signala na IRB-u. Veliko hvala doktorandici Matei Kurtović na vodstvu kroz eksperimentalni kao i pismeni dio rada. Hvala i doktorandici Maji kao i doktorandu Davoru na pomoći tijekom izvođenja eksperimentalnog djela rada u laboratoriju. Zahvaljujem Marinu na svim porukama utjehe u kasnim ponoćnim satima i na ramenu za plakanje kada mi je to bilo najpotrebnije, kao i na informatičkim sposobnostima koje su mi dobro došle. Puno hvala mami i tati koji su uvijek tu i koji su svojom ljubavlju i nesebičnim davanjem učinili da sve ovo bude moguće. Također hvala Sabrini i Josipu što su tu uz mene kada god je potrebno. Ovaj rad posvećujem osobi koja više nije ovdje, a koja je prva pustila suzu kada sam ukoračila u svijet fakultetskog obrazovanja, najdraža osobo nadam se da ćeš gdje god da jesi pustiti suzu i kada ono završi.

Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA Priprema adenovirusnih vektora za unos gena TLR5 u stanice pluća Vanessa Krasnić Rooseveltov trg 6, 10 000 Zagreb, Hrvatska Diplomski rad Kronična opstruktivna plućna bolest (KOPB) i rak pluća značajni su uzročnici smrtnosti u svijetu. Izloženost duhanskom dimu predstavlja glavni čimbenik razvoja KOPB-a. Epidemiološka istraživanja pokazala su da je KOPB, neovisno o statusu pušenja, najveći čimbenik rizika za razvoj raka pluća. Genetička podloga povezanosti ovih patoloških entiteta je nepoznata. U održavanju homeostaze organizma važnu ulogu ima regulacija imunosnog odgovora. Bitnu ulogu u pokretanju imunosti imaju toll-like receptori (TLR) tako što prepoznaju patogenu pridružene slijedove i induciraju signalne puteve u domaćinu kao antimikrobni odgovor. Ranija istraživanja su pokazala da je genetička varijanta gena TLR5, N592S, povezana s nastankom KOPBa i raka pluća. Cilj ovog istraživanja je konstruirati replikacijski defektan adenovirusni vektor uvođenjem gena za TLR5 wt i TLR5 N592S u okosnicu adenovirusa tipa 5 (Ad5) koji bi omogućio unos tog gena u modelni organizam, u ovom slučaju humane stanice pluća (A549, WI38 i H1299), u svrhu daljnjih funkcionalnih istraživanja. Rekombinantni Ad5-TLR5 virus konstruiran je manipulacijom Ad5 genoma kao plazmida u E. coli korištenjem homologne rekombinacije u bakterijskom soju BJ5183. Ad5-TLR5 wt i Ad5-TLR5 N592S umnoženi su u humanim embrionalnim stanicama bubrega 293 (HEK293) i pročišćeni ultracentrifugiranjem u gradijentu cezijevog klorida. ( 70 stranica, 22 slike, 9 tablica, 82 literaturna navoda, jezik izvornika: hrvatski) Rad je pohranjen u Središnjoj biološkoj knjižnici Ključne riječi: Kronična opstruktivna plućna bolest, rak pluća, gen TLR5, kloniranje, adenovirusni vektori Voditelj: Dr. sc. Jelena Knežević, viša znanstvena suradnica, Institut Ruđer Bošković Suvoditelj: Prof. dr. sc. Nada Oršolić, redoviti profesor Ocjenitelji: Prof. dr. sc. Nada Oršolić, Izv. prof. dr. sc. Maja Matulić, Prof. dr. sc. Maria Špoljar

BASIC DOCUMENTATION CARD University of Zagreb Faculty of Science Department of Biology Graduation Thesis Preparation of adenoviral vectors for insertion of the TLR5 gene into lung cells Vanessa Krasnić Rooseveltov trg 6, 10 000 Zagreb, Hrvatska Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and lung cancer are major causes of death in the world. Exposure to tobacco smoke presents the main factor in the development of COPD. Epidemiological research has shown that COPD represents, regardless of smoking status, the biggest risk factor for developing lung cancer. The genetic basis of the association of these pathological entities is unknown. The regulation of the immune response plays an important role in maintaining homeostasis. Toll-like receptors (TLR) are important for initiating immunity by recognising the sequences associated with the pathogen and inducing signal pathways in the host as an antimicrobial response. Previous researches have shown that the genetic variant of TLR5, N592S gene, is associated with COPD and lung cancer. The aim of this research was to construct a replication-defective adenoviral vector by introducing a gene for TLR5 wt and TLR5 N592S into the adenovirus type 5 (Ad5) backbone that would allow the insertion of this gene into a model organism, in this case human lung cells (A549, WI38 and H1299), for the purpose of further functional research. Recombinant Ad5-TLR5 virus was constructed by manipulating the Ad5 genome as a plasmid in E. coli using homologous recombination in bacterial strain BJ5183. Ad5- TLR5 wt and Ad5-TLR5 N592S were amplified in human embryonic kidney cells 293 (HEK293) and purified by ultracentrifugation in the caesium chloride gradient. (70 pages, 22 figures, 9 tables, 82 references, original in: Croatian) Thesis deposited in the Central Biological Library Key words: Chronic obstructive pulmonary disease, lung cancer, TLR5 gene, cloning, adenoviral vectors Supervisor: Dr. sc. Jelena Knežević, Senior Research Associate, Ruđer Bošković Institute Co-supervisor: Prof. Nada Oršolić, PhD, Professor Reviewers: Prof. dr. sc. Nada Oršolić, Izv. prof. dr. sc. Maja Matulić, Prof. dr. sc. Maria Špoljar

SADRŽAJ 1. UVOD... 1 1.1. Kronična opstruktivna plućna bolest (KOPB) i rak pluća... 1 1.2. Imunosni sustav... 2 1.3. Toll-like receptori (TLR)... 3 1.3.1. Prijenos signala putem toll-like receptora... 4 1.3.2. Toll-like receptor 5 (TLR5)... 5 1.3.3. Polimorfizmi u genima TLR... 6 1.4. Tehnologija rekombinantne DNA... 7 1.5. Adenovirusi i njihova građa... 7 1.5.2. Životni ciklus adenovirusa Ad5... 9 1.5.1. Genom adenovirusa tipa 5 (Ad5)... 10 1.5.3. Replikacija adenovirusa... 10 1.5.4. Adenovirusni vektori prve generacije... 11 2. CILJ RADA... 12 3. MATERIJALI I METODE... 13 3.1. MATERIJALI... 13 3.1.1. Stanice... 13 3.1.1.1. Bakterijske stanice... 13 3.1.1.2. Humane stanice... 13 3.1.2. Hranjivi mediji... 13 3.1.3. Sastav i priprema otopina... 14 3.1.4. Komercijalni kompleti... 15 3.1.5. Enzimi i antitijela... 15 3.1.6. Osnovne kemikalije... 15 3.1.5. Plazmidi... 16 3.2. METODE... 17 3.2.1. Priprema vektora pshuttle-cmv za ligaciju... 18 3.2.1.1. Određivanje masene koncentracije vektora pshuttle-cmv... 18 3.2.1.2. Razgradnja vektora pshuttle-cmv restrikcijskom endonukleazom EcoRV... 18 3.2.1.3. Precipitacija, defosforilacija i pročišćavanje vektora pshuttle-cmv... 18 3.2.2. Izolacija inserata TLR5 wt i TLR5 N592S za ligaciju... 19 3.2.2.1. Izrezivanje inserata iz ekspresijskih klonova restrikcijskom endonukleazom PmeI... 19

3.2.2.2. Agarozna gel-elektroforeza... 19 3.2.2.3. Pročišćavanje TLR5 inserata... 20 3.2.3. Ligacija inserata TLR5 wt i TLR5 N592S u vektor pshuttle-cmv... 20 3.2.4. Transformacija kompetentnih bakterija Escherichia coli DH5-α temperaturnim šokom... 21 3.2.5. Izolacija plazmidne DNA... 22 3.2.6. Lančana reakcija polimerazom... 22 3.2.7. Razgradnja uzoraka restrikcijskim endonukleazama PmeI i BamHI... 24 3.2.8. Izolacija plazmidne DNA metodom mini-prep... 24 3.2.9. Izolacija plazmidne DNA metodom midi-prep... 24 3.2.10. Potvrda ispravne orijentacije inserta koji kodira gen za TLR5... 24 3.2.11. Razgradnja konstrukata pshuttle-cmv-tlr5 restrikcijskom endonukleazom PmeI... 26 3.2.12. Transformacija kompetentnih bakterija Escherichia coli BJ5183-AD-1 elektroporacijom... 26 3.2.13. Transformacija kompetentnih bakterija Escherichia coli DH5-α temperaturnim šokom... 27 3.2.14. Razgradnja konstrukata Ad5-TLR5 restrikcijskom endonukleazom EcoRV... 27 3.2.15. Razgradnja uzoraka restrikcijskom endonukleazom PacI... 28 3.2.16. Transfekcija HEK-293 stanica s adenovirusnim konstruktom... 28 3.2.17. Pročišćavanje adenovirusnih vektora... 30 3.2.18. Određivanje koncentracije adenovirusnih čestica u suspenziji pročišćenih adenovirusa... 31 3.2.19. Zaražavanje stanica A549, WI38 i H1299... 32 3.2.20. Elektroforeza u poliakrilamidnom gelu uz prisutnost SDS-a (SDS-PAGE)... 32 3.2.21. Analiza Western blot... 33 4. REZULTATI... 36 4.1. Priprema inserata TLR5 wt i TLR5 N592S za kloniranje u vektor pshuttle-cmv... 36 4.2. Metoda ligacije i amplifikacije ligiranih produkata... 36 4.3. Izolacija plazmidne DNA iz stanica bakterije Escherichia coli... 38 4.4. Razgradnja konstrukata pshuttle-cmv-tlr5 restrikcijskim enzimima PmeI i BamHI... 40 4.5. Provjera ligacije inserata TLR5 wt i TLR5 N592S s vektorom pshuttle-cmv... 42 4.6. Homologna rekombinacija u svrhu dobivanja rekombinantnih virusa... 43 4.7. Povrda uspješne homologne rekombinacije... 45 4.8. Dobivanje, umnažanje i pročišćavanje virusnih čestica Ad5-TLR5 wt i Ad5-TLR5 N592S... 46 4.9. Unos gena TLR5 wt i TLR5 N592S u humane stanice pluća... 48 4.10. Western blot analiza ekspresije proteina TLR5... 48 5. RASPRAVA... 51

6. ZAKLJUČAK... 54 7. LITERATURA... 55 8. Životopis... 63

1. UVOD 1.1. Kronična opstruktivna plućna bolest (KOPB) i rak pluća Kronična opstruktivna plućna bolest (KOPB) četvrti je glavni uzročnik kroničnog morbiditeta i smrtnosti u cijelom svijetu (Pauwels i sur. 2001). Glavne karakteristike vezane uz KOPB su ireverzibilna opstrukcija protoka zraka i trajna upala (Kim i Criner 2013). Prva istraživanja bila su usmjerena na pušenje kao najvažniji čimbenik rizika za KOPB. Međutim rezultati velikog broja objavljenih istraživanja sugeriraju da su čimbenici rizika neovisni o pušenju snažno povezani s KOPB-om. Ti čimbenici uključuju izlaganje onečišćenom zraku, dugotrajnu izloženost prašini i dimu, ponavljajuće infekcije donjeg respiratornog sustava tijekom djetinjstva, plućne tuberkuloze, kroničnu astmu, intrauterini zastoj rasta, lošu prehranu i loš socioekonomski status (Salvi i Barnes 2009). Istraživanja su pokazala kako antigene kemikalije cigaretnog dima mogu dovesti do razvoja kompleksa antigen-antitijelo koji potencijalno može inducirati plućne ozljede (Arcavi i Benowitz 2004). Takvi kompleksi mogu uzrokovati plućne i periferne promjene imunosnog sastava sline i bronhoalveolarne tekućine koje povećavaju osjetljivost na infekcije respiratornog sustava (Hersey i sur. 1983). Djelovanje nikotina kao najvažnije imunosupresivne komponente cigaretnog dima (Arcavi i Benowitz 2004) može potaknuti oslobađanje kateholamina i kortikosteroida koji mogu povećati broj CD8+ limfocita u staničnom sustavu i suzbiti obranu domaćina od infekcija (Miller i sur. 1982). Inducirana sustavna upala zbog pušenja cigareta karakterizira povećanje u cirkulirajućim upalnim molekulama kao što su proupalni citokini. Nekoliko istraživanja izvijestilo je da pušenje može uzrokovati povišene razine TNF-a (engl. tumor necrosis factor), TNF receptora, interleukina 1 (IL-1), IL-6, IL-8 i granulocit-makrofagnih čimbenika (Bermudez i sur. 2002, Glossop i sur. 2006, Churg i sur. 2009). Rak pluća je maligna bolest koja se tradicionalno klasificira u dva tipa, karcinom pluća ne-malih stanica (engl. non-small cell lung cancer, NSCLC) i karcinom pluća malih stanica (engl. small cell lung cancer, SCLC) (Durham i Adcock 2015). Rizik od raka pluća kod pušača je 17,2% za muškarce i 11,6% za žene u usporedbi s 1,3% i 1,4% za nepušače (Villeneuve i Mao 1994). Rak pluća je uzrokovan mutacijama koje dovode do proliferacije mutiranih stanica i stvaranja tumora (Durham i Adcock 2015). 1

Zajednički uzročni čimbenik KOPB-a i raka pluća je pušenje cigareta. Međutim iako cigaretni dim predstavlja najveću opasnost za oboljeljenje od raka, mnogi pušači nikada neće razviti ovu bolest (Turner i sur. 2007) dok postoje slučajevi kod kojih se rak pluća razvija kod nepušača (Thun i sur. 2006). Ovi podaci upućuju na važnost genetičke podloge za razvoj raka pluća. KOPB je čimbenik rizika za razvoj karcinoma pluća, a posebno karcinoma pločastih stanica (Papi i sur. 2004) što povećava vjerojatnost čak i do pet puta za razvijanje bolesti kod pušača s opstrukcijom protoka zraka u odnosu na ljude s normalnom funkcijom pluća (Houghton 2013). 1.2. Imunosni sustav Poznato je kako se obrana domaćina protiv patogena oslanja na urođene i stečene komponente (Hoffmann i sur. 1999). Imunosni odgovor može biti nespecifičan i kao takav pripada urođenoj imunosti, a ukoliko je specifičan pripada stečenoj imunosti. U urođenom imunosnom odgovoru kao prvoj liniji obrane posreduju imunosne stanice perifernih tkiva kao što su monociti, neutrofili, makrofagi, dendritičke stanice, T stanice, B stanice i NK stanice (engl. Natural killer cells). Primarni izazov urođenom imunosnom sustavu je diskriminacija velikog broja potencijalnih patogena od vlastitih stanica uz upotrebu ograničenog broja receptora (Aderem i Ulevitch 2000). Posljedično tomu dolazi do predstavljanja komponenti patogena T stanicama i aktivacije stečenog imunosnog odgovora te uspostave zaštitnog imuniteta (Aderem i Underhill 1999). Stečena imunost je uključena u uklanjanje patogena u kasnoj fazi infekcije kao i u stvaranju imunosne memorije (Akira i sur. 2006). Receptori urođene imunosti prepoznaju određene molekularne uzorke na površini patogeničnih bakterija (PAMP, prema engl. pathogen-associated molecular patterns) pa im otuda i naziv receptori za prepoznavanje uzorka (PRR, prema engl. pattern recognition receptors) (Malenica 2005). Bitnu ulogu u indukciji urođene imunosti, a time i pokretanju stečene imunosti igraju toll-like receptori (TLR) tako što prepoznaju i diskriminiraju gljivice i bakterije inducirajući odgovarajuće signalne puteve u domaćinu kao antimikrobni odgovor (Aderem i Ulevitch 2000, Akira i sur. 2001). Receptori TLR se uglavnom eksprimiraju u ljudskim imunosnim stanicama, kao što su monociti, neutrofili, makrofagi, dendritičke stanice, T stanice, B stanice i NK stanice. U tim stanicama angažman receptora TLR s prepoznatim ligandima izvedenim iz patogenih organizama izazivaju urođeni imunosni odgovor. Epitel je prva linija u obrani protiv invazije mikroorganizama 2

i mjesto ekspresije receptora TLR koji imaju ključnu ulogu u obrani protiv mikroorganizama prepoznavanjem konzerviranih bakterijskih molekula (Yu i Chen 2008). 1.3. Toll-like receptori (TLR) Otkriće receptora TLR revolucionarni je događaj u znanosti i medicinskim istraživanjima te pomaže u poboljšanju razumijevanja uloge urođene imunosti u fiziologiji i patologiji ljudskog zdravlja, a samim time i pokretanju stečenog imunosnog odgovora (Akira i sur. 2001). Prvi receptor TLR otkriven je u vinskoj mušici (Drosophila melanogaster) gdje mu je opisana ključna uloga u emrionalnom razvoju u dorzo-ventralnoj polarnosti kao i obrani organizma od gljivičnih infekcija (Anderson i sur. 1985). Na početku se smatralo kako su receptori TLR eksprimirani samo u imunosnim stanicama, ali danas postoji sve veći broj dokaza koji ukazuju na to da su neki receptori TLR osjetljivi na produkte oštećenog tkiva (Chen i sur. 2007, Cook i sur. 2004). Oštećeno tkivo kao takvo izaziva upalu, stoga je hipoteza da receptori TLR iniciraju upalni odgovor na bolesti kao što su npr. aterogeneza, dijabetes pa čak i rak (O Neill i sur. 2009, Dekleijn i Pasterkamp 2003, Kim 2006). Receptori TLR su transmembranski proteini koji se sastoje od izvanstanične regije N-terminalnog ponavljanja bogatog leucinom (engl. Leucine-rich repeat), transmembranske domene i C- terminalne citoplazmatske domene slične citoplazmatskoj domeni receptora IL-1 poznate kao TIR (Toll/IL1) domena. TIR domena je odgovorna za aktiviranje nizvodnih signalnih puteva (Kawai i Akira 2007). Do sada je identificirano 10 funkcionalnih receptora TLR kod ljudi i 12 kod miševa. Receptor TLR10 je funkcionalan jedino kod ljudi dok je receptor TLR11 funkcionalan jedino kod miševa. S obzirom na staničnu lokalizaciju i ligande koje prepoznaju receptori TLR su podijeljeni u dvije podskupine. Jedna se podskupina sastoji od receptora TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6 i TLR11 koji su izraženi na staničnim površinama i prepoznaju uglavnom mikrobne membranske komponente kao što su lipidi, lipoproteini i proteini, a druga se podskupina sastoji od receptora TLR3, TLR7, TLR8 i TLR9 koji se eksprimiraju isključivo u unutarstaničnim vezikulama kao što su endoplazmatski retikulum (ER), endosomi, lizosomi i endolizosomi gdje prepoznaju nukleinske kiseline mikrobnog podrijetla (Kawai i Akira 2010) (Slika 1). 3

Receptori TLR2 i TLR4 su uključeni u prepoznavanje različitih komponenti bakterijskih staničnih stijenki poput lipopolisaharida (Takeuchi i sur. 1999) dok je ssrna fiziološki ligand za TLR7 i TLR8 (Heil i sur. 2004). Receptor TLR3 sisavaca prepoznaje dsrna (Alexopoulou i sur. 2001). Receptor TLR5 sisavaca prepoznaje bakterijski flagelin iz Gram-pozitivnih i Gram-negativnih bakterija, a njegova aktivacija mobilizira nuklearni čimbenik NF-kB i stimulira proizvodnju čimbenika nekroze tumora-alfa (TNF-α) (Hayashi i sur. 2001). Slika 1: Toll-like receptori i njihovi ligandi (preuzeto i prilagođeno prema Pandey i sur. 2013). 1.3.1. Prijenos signala putem toll-like receptora Stimulacija stanica s ligandima koje prepoznaju receptori TLR regrutira adapter protein koji sadrži TIR domenu kao što je mijeloidni diferencijacijski čimbenik 88 (engl. Myeloid differentiation primary response gene 88, MyD88). Vezanjem molekule MyD88 omogućava se aktivacija (forsforilizacija) molekule IRAK-4 (engl. interleukin-1 receptor-associated kinase 4) čija je domena smrti u interakciji s domenom smrti MyD88. Aktivacijom, IRAK-4 zatim aktivira i fosforilira IRAK-1 koji kao takav aktivira Traf-6 (engl. TNF receptor associated family 6). Zatim dolazi do niza reakcija ubikvitinilacije Traf-6, protein kinaze TAK-1 (engl. Transforming growth facor-β-activated protein kinase 1) koja ima mogućnost fosforilacije komleksa IkB kinaze (IKK) 4

što dovodi do oslobađanja NF-kB i njegove translokacije u jezgru (O Neill 2006). Aktivacija NFkB omogućuje transkripciju imunomodulacijskog sustava gena, uključujući gene za različite citokine i kemokine (Slika 2) (Akira i sur. 2006). Proizvodnja citokina i kemokina zauzvrat aktivira upalu kroz regrutiranje imunosnih stanica domaćina i aktivaciju antimikrobnih obrana (McInturff i sur. 2005). 1.3.2. Toll-like receptor 5 (TLR5) Receptor TLR5 je član obitelji TLR koji se eksprimira na staničnoj površini, a sadrži izvanstaničnu domenu bogatu leucinom, transmembransku domenu i citoplazmatsku domenu (Hayashi i sur. 2001, Pandey i sur. 2013). Gen koji kodira za receptor TLR5 lokaliziran je na kromosomu 1, na mjestu 1q33.3. i sadrži pet egzona (Trejo-de la O i sur. 2014). Flagelin, glavna komponenta bakterijske flagele predstavlja ligand za receptor TLR5 (Song i sur. 2017). Flagelinske molekule iz različitih bakterija imaju hipervarijabilnu središnju domenu i konzervirane N- i C- krajeve važne za stvaranje protofilamenata i pokretljivost (Bardoel i sur. 2011). Vezanje flagelina na receptor TLR5 aktivira put koji ovisi o MyD88 (Gupta i sur. 2014), a čime se pokreće prijenos signala putem receptora TLR5 koji je shematski prikazan na Slici 2. Slika 2: Prijenos signala putem receptora TLR5 (preuzeto i prilagođeno iz Gupta i sur. 2014). 5

1.3.3. Polimorfizmi u genima TLR Opsežne analize receptora TLR otkrile su njihovu specifičnost u prepoznavanju liganada, ekspresiji u različitim stanicama i tkivima i što je najvažnije njihovu ulogu u patogenezi višestrukih bolesti povezanih s urođenim i stečenim imunosnim sustavom (O Neill i sur. 2009). Mnoga su izvješća ukazala na to da se genetske varijacije u TLR genima odnose na osjetljivost na bolesti. Sposobnost pravilnog reagiranja na TLR ligande može biti narušena pojedinačnim nukleotidnim polimorfizmima (engl. single nucleotide polymorphism, SNP) unutar TLR gena. Poznato je nekoliko SNP-ova u ljudskim genima za TLR (TLR1-10), a izvještaji su također predložili da ti SNP-ovi imaju funkcionalni utjecaj i medicinsku važnost za širok raspon ljudskih bolesti (Trejo-de la O i sur. 2014). Istraživanja su pokazala kako specifični polimorfizmi gena koji kodiraju receptore TLR ili njihove signalne molekule mogu razjasniti odnose između TLR signalizacije i ljudske bolesti (Cook i sur. 2004). Do sada, najbolje istraženi TLR polimorfizam je supstitucija asparaginske kiseline s glicinom na položaju 299 (D299G) kod receptora TLR4 (Arbour i sur. 2000). Ovaj polimorfizam identificiran je zbog povezanosti sa smanjenim odgovorom dišnih putova na inhalirani bakterijski lipopolisaharid (LPS) kod ljudi i odgovarajućim smanjenim signalnim odgovorom na lipopolisaharid in vitro (Shuang i sur. 2017). Polimorfizam D299G povećava rizik od zaraze Gram-negativnim bakterijama i razvoj sepse, a osim toga povezan je s povećanim rizikom od malarije, aspergiloze, respiratornog sincicijskog virusa i razvoja bronhiolitisa. Poznato je da polimorfizam Arg753Gln na receptoru TLR2 narušava nizvodnu signalizaciju i povezan je s osjetljivosti na tuberkulozu dok polimorfizam Thr1486Cys na receptoru TLR9 povećava rizik od malarije (Kawai i Akira 2011). U kodirajućem slijedu receptora TLR5 otkriveno je pet istovjetnih odnosno tihih mutacija i 13 pogrešnih (engl. missence) mutacija (Merx i sur. 2006). Polimorfizam na receptoru TLR5, Arg393STOP, koji uzrokuje preuranjeni STOP kodon povezan je s osjetljivosti na legionarsku bolest (Kawai i Akira 2011). Drugi uobičajeni SNP u genu koji kodira za TLR5 je rs2072493/n592s i nalazi se u izvanstaničnoj domeni receptora TLR5 (Shuang i sur. 2017). Ovaj je SNP povezan s ukupnim preživljenjem ispitanika koji boluju od kolorektalnog karcinoma u velikoj skupini ljudi koji pripadaju bijeloj rasi (Klimosch i sur. 2013). 6

1.4. Tehnologija rekombinantne DNA Tehnologija rekombinantne DNA je kloniranje djelova DNA, tj. stvaranje mnogobrojnih kopija DNA putem replikacije u prokariotskoj ili eukariotskoj stanici. U genetičkom inžinjerstvu najčešće korišteni organizam u kloniranju je bakterija Escherichia coli. Prokariotske stanice ne sadrže enzime za posttranslacijsku i posttranskripcijsku modifikaciju pa se za ekspresiju nekih eukariotskih gena moraju koristiti eukariotski vektori. Ova tehnika omogućuje konstrukciju novih, rekombinantnih molekula DNA kombinacijom dvaju ili više različitih fragmenata DNA. Kloniranje DNA fragmenata započinje izoliranjem molekule DNA koja se potom fragmentira na određenu duljinu pomoću restrikcijskih enzima. Restrikcijske endonukleaze tipa II prepoznaju specifičan slijed nukleotida tzv. palindromske slijedove na čijim mjestima potom hidroliziraju fosfodiesterske veze i ostavljaju tupe ili stršeće krajeve. Sljedeći korak predstavlja konstrukciju rekombinantne molekule DNA ugradnjom željenog inserta u vektor. Važno je da su krajevi inserta i vektora isti, primjerice ukoliko insert sadrži ravne krajeve i vektor mora imati ravne krajeve kako bi DNA-ligaza mogla stvoriti fosfodiestersku vezu. Vektori sadrže dvolančanu molekulu DNA, a najčešće su to plazmidi bakterija ili kvasaca, bakterijski i animalni virusi. Nakon konstrukcije, rekombinantnom DNA molekulom vrši se transformacija kompetentnih bakterijskih stanica ili transfekcija eukariotskih stanica. Uspješan prijenos DNA od interesa u stanicu domaćina rezultira amplifikacijom rekombinantnih molekula DNA (http://www.genetika.biol.pmf.unizg.hr/pogl20.html). Ovaj rad će se baviti kloniranjem DNA slijedova koji kodiraju za gene TLR5 wt i TLR5 N592S u vektor pshuttle-cmv u svrhu konstrukcije rekombinantne DNA molekule. Za ekspresiju gena koji kodiraju receptor TLR5 wt kao i TLR5 N592S koristit će se replikacijski defektni adenovirusni vektori. 1.5. Adenovirusi i njihova građa Rowe i sur. prvi su otkrili adenovirus (Ad) 1953. godine pokušavajući kultivirati ljudsko adenoidno tkivo u laboratoriju (Rowe i sur. 1953). Otkriće nove skupine virusa koji prvenstveno utječu na bolesti respiratornog sustava dovelo je do imenovanja porodice Adenoviridae s obzirom na tkivo iz kojega je virus prvi put izoliran (Enders i sur. 1956). Različiti ljudski adenovirusni serotipi, njih čak 51, grupirani su u skupine od A do F na temelju veličine i organizacije genoma, homologije DNA, nukleotidnog sastava i onkogenosti (Zhang 1999, Chaurasiya i Hitt 2016). Najčešće proučavana skupina u virologiji i molekularnoj 7

biologiji je skupina C koja se sastoji od adenovirusa tipa 1, 2, 5 i 6. U laboratoriju su najčešći adenovirus 2 (Ad2) i Ad5 koji se koriste kao vektori za isporuku gena (Zhang 1999). Adenovirusna čestica je ikozaedarskog oblika veličine 70-90 nm koja sadrži linearni dvolančani genom DNA od približno 36 kilobaznih parova (kbp) (Chaurasiya i Hitt 2016). Struktura adenovirusne čestice prikazana je na Slici 3. Adenoviruse čini vanjska kapsida i unutarnja jezgra (Ip i Qasim 2013). Razlikujemo tri glavna kapsidna proteina adenovirusa: vlakna, pentonske baze i heksone. Vrhovi ikozaedra sastoje se od pentonskih baza koje usidruju proteine vlakana koja su odgovorna za primarno vezanje virusa na staničnu površinu domaćina dok se heksoni nalaze na površini jednakostraničnih trokuta ikozaedra (Campos i Barry 2007, Chaurasiya i Hitt 2016). Adenovirusna vlakna se sastoje od tri domene: kratki rep, domena drška i globularna domena glave (Campos i Barry 2007). Tri monomera vlakna trimeriziraju kako bi nastala struktura slična anteni smještena na svakom vrhu ikozaedarske kapside. Repna domena trimera pričvršćuje vlakno u penton i određena je višestrukim N-terminalnim aminokiselinskim ponavljanjima, domena drška omogućuje interakciju sa stanicom domaćina, a domena glave omogućuje vezanje za CAR (engl. coxsackie-adenovirus receptor) na stanici domaćina (Khare i sur. 2011). Slika 3: Struktura adenovirusa (preuzeto i prilagođeno prema https://nptel.ac.in/courses/102103041/module2/lec13/1.html). 8

1.5.2. Životni ciklus adenovirusa Ad5 Životni ciklus Ad5 započinje njegovim ulaskom u stanicu domaćina koji uključuje interakciju virusne čestice sa staničnim receptorom (Zhang 1999). Istraživanja in vitro pokazala su da je početno vezanje Ad5 visokog afiniteta posredovano interakcijom distalne domene glave adenovirusnog vlakna za staničnu površinu domaćina, točnije s receptorom CAR koji pripada tipu 1 transmembranskog proteina superobitelji imunoglobulina (Howitt i sur. 2003). Receptor CAR je protein veličine 46 kda koji predstavlja funkcionalni adenovirusni receptor. CAR sadrži transmembransku, citoplazmatsku i izvanstaničnu domenu. S obzirom da se vlakno Ad5 veže na molekulu koja predstavlja receptor za virus coxsackie tipa B, naziva se coxsackie/adenovirusnim receptorom (CAR) (Bergelson i sur., 1998). Nakon vezanja na primarni receptor CAR, virus ulazi endocitozom u stanice internalizacijom u endosomalne vezikule (Slika 4). Aminokiselinski slijed Arg-Gly-Asp (RGD) (Bai i sur. 1993) na bazi pentonskog proteina omogućuje interakciju sa staničnim receptorima integrina αvβ5 i αvβ3 (Wickham i sur. 1993). Interakcija pentonskih baza s integrinima je također potrebna za aktivaciju cisteinskih proteaza koje sudjeluju u razgradnji virusne kapside (Nemerow 2000). Nakon internalizacije, kiselo okruženje endosoma dovodi do izlaska virusa u citoplazmu lizom endosomske membrane (Pastan i sur. 1986, Chaurasiya i Hitt 2016). Virusne čestice zatim se specifično vežu na mikrotubule i njima pomiču prema kompleksu nuklearnih pora. U različitim fazama pri prijenosu do nuklearne pore od virusa se odvajaju pojedini proteini, od kojih su neki i degradirani (Greber i sur. 1993). Virusni genom se u konačnici uvodi u jezgru kroz kompleks nuklearne pore i dolazi do ekspresije viralnih gena (Wagner i sur. 1992, Chaurasiya i Hitt 2016). 9

Slika 4: Endocitoza adenovirusne čestice (preuzeto i prilagođeno prema https://www.creativediagnostics.com/tag-adenovirus-antigens-1.htm). 1.5.1. Genom adenovirusa tipa 5 (Ad5) Genom Ad5 je dvolančana linearna molekula DNA dugačka 36 kb. Svaki kraj viralnog genoma ima ponavljajući DNA slijed od 100 do 150 bp poznat kao inverzna terminalna ponavljanja (ITR). Lijevi ITR kraj (194-385 bp) sadrži signal pakiranja ψ (engl. encapsidation signal, ES). ITR regije kao i signal za pakiranje sadrže cis-aktivirajuće elemente potrebne za replikaciju i pakiranje viralne DNA u kapsidu (Zhang 1999, Ostapchuk i Hearing 2003). Terminalni protein (TP) je kovalentno vezan na 5' kraj svakog virusnog DNA lanca (Rekosh i sur. 1977) i sintetiziran je kao prekursor (ptp) koji ima važnu ulogu u inicijaciji replikacije virusa (Kelly 1984). Razlikujemo rane (E) i kasne (L) regije genoma koji sadrže različite transkripcijske jedinice podijeljene prema početku virusne DNA replikacije (Zhang 1999). 1.5.3. Replikacija adenovirusa Replikativni ciklus adenovirusa počinje od njihova ulaska u stanice i završava pri otpuštanju iz liziranih, zaraženih stanica. Svaki replikativni ciklus traje 32-36 sati i dijeli se na ranu fazu u kojoj dolazi do ekspresije ranih gena i kasnu fazu koju karakterizira virusna replikacija DNA, ekspresija kasnih gena i sastavljanja virusa traje ostatak vremena (Shaw i Ziff 1980, Zhang 1999). Transkripcijske jedinice adenovirusne čestice prikazane su na Slici 5. Proizvodi ranih gena, kao i replikacija virusne DNA su preduvjeti za ekspresiju kasnih gena (Thomas i Mathews 1980). Ekspresija ranih gena započinje ulaskom virusne DNA u stanice i to redoslijedom E1A, E1B, E2, E3 i E4, a nakon koje slijedi ekspresija intermedijarnih gena te na kraju kasnih gena. Ekspresiju kasnih gena (L1-L5) koji kodiraju za većinu virusnih kapsidnih proteina omogućuje zajednički 10

glavni kasni promotor (engl. Major late promoter, MLP) (Shaw i Ziff 1980, Chaurasiya i Hitt 2016). Slika 5: Prikaz transkripcijskih jedinica adenovirusa (preuzeto i prilagođeno prema Afkhamy i sur. 2016). 1.5.4. Adenovirusni vektori prve generacije Adenovirusi mogu poslužiti kao dobri vektori zbog svojih svojstava, npr. oni prenose gene u širokom spektru tipova stanica, a da pritom prijenos gena ne ovisi o aktivnoj podjeli stanica. Dodatno, mogu se dobiti visoki titri virusa i visoka razina ekspresije transgena (He i sur. 1998). Adenovirus ima mogućnost pakiranja do 105% genoma duljine divljeg tipa (wt) (Ghosh- Choudhury i sur. 1987) koje omogućava umetanje približno 1,8-2,0 kb strane DNA (Afkhami i sur. 2016). Uvođenjem delecija u ranu regiju E1 i/ili E3, mogu se konstruirati vektori s većim kapacitetom unosa strane DNA (Bett i sur. 1993). Adenovirusni vektori s deletiranom E1 regijom, bilo sa ili bez E3 delecije, nazivaju se vektori prve generacije (Danthinne i Imperiale 2000). Brisanje E1 regije omogućuje umetanje transgena veličine do 5,1 kb (Chaurasiya i Hitt 2016). E1 delecija čini viruse nesposobnima za replikaciju i proizvodnju infektivnih virusnih čestica u ciljnim stanicama (He i sur. 1998). Nadalje, brisanje E3 zajedno s E1 regijom može dodatno povećati sposobnost umetanja stranih gena do veličine 8,2 kb (Douglas 2007). 11

2. CILJ RADA Istraživanja su pokazala da su određene mutacije povezane s karcinomom pluća i KOPB-om i da je za funkcionalne analize potrebno napraviti ekspresijske konstrukte koji će se koristiti u različitim modelima in vitro. Međutim, velik broj staničnih linija je izuzetno rezistentan na unos strane DNA. Stoga je jedan od načina zaobilaženja ovog problema korištenje adenoviralnih konstrukata. Cilj ovog diplomskog rada bio je konstruirati replikacijski defektne adenovirusne vektore uvođenjem gena za TLR5 wt i TLR5 N592S u okosnicu adenovirusa tipa 5 (Ad5) koji bi zatim omogućio ciljani unos tog gena u modelni organizam, u ovom slučaju humane stanice pluća, A549, WI38, H1299. 12

3. MATERIJALI I METODE 3.1. MATERIJALI 3.1.1. Stanice 3.1.1.1. Bakterijske stanice U svrhu amplifikacije sljedova DNA pshuttle-cmv-tlr5 N592S i pshuttle-cmv-tlr5 wt korištene su kompetentne stanice Escherichia coli, soj DH5-α. U svrhu dobivanja dovoljne količine Ad5-TLR5 wt i Ad5-TLR5 N592S korištene su kompetentne stanice Escherichia coli, soj DH5-α. U svrhu konstrukcije rekombinantnog Ad5-TLR5 virusa manipulacijom Ad5 genoma kao plazmida u bakteriji Esherichia coli homolognom rekombinacijom korišten je bakterijski soj BJ5183. 3.1.1.2. Humane stanice Stanična linija HEK-293 (engl. human embryonic kidney) korištena je za umnažanje konstruiranih adenovirusnih vektora Ad5-TLR5 wt i Ad5-TLR5 N592S. Kao modeli za istraživanja in vitro korištene su humane stanične linije koje endogeno eksprimiraju gen koji kodira za receptor TLR5. Humane stanične linije koje su korištene su WI38 humana stanična linija zdravih fibroblasta epitelnog podrijetla iz tkiva pluća, A549 humana stanična linija epitelnog porijekla iz karcinoma pluća, H1299 humana stanična linija raka pluća nemalih stanica, metastatskog porijekla. 3.1.2. Hranjivi mediji LB (Luria-Bertani) medij sastava: 5 g/l kvaščevog ekstrakta, 10 g/l triptona i 10 g/l NaCl koji se nakon pripreme sterilizira autoklaviranjem. Ohlađenom sterilnom mediju doda se antibiotik kanamicin tako da konačna koncentracija bude 25 µg/ml. U svrhu pripreme krute hranjive podloge u tekući medij dodaje se agar konačne koncentracije 12,5 g/l. Medij je korišten za uzgoj bakterije Escherichia coli. 13

DMEM medij (engl. Dulbecco s Modified Eagle s Medium - high glucose, Sigma) koristi se za uzgoj HEK-293 stanica. Sadrži glukozu koncentracije 4500 mg/l, L-glutamin, natrijev hidrogenkarbonat. Prije upotrebe, originalnom pakiranju medija doda se fetalni goveđi serum (FBS, Sigma) do konačne koncentracije od 10%. 3.1.3. Sastav i priprema otopina Pufer TD pripremljen je miješanjem 8 g NaCl i 0,38 g KCl otopljenih u 150 ml H2O. Takvoj otopini potom se doda 0,1 g Na2HPO4, 3 g Tris baze i nadopuni vodom do 500 ml. Vrijednost ph mora biti između 7,4 i 7,5 što se postiže dodatkom HCl 5M nakon čega se otopina nadopuni vodom do ukupnog volumena od 1 L. Nakon pripreme otopina se alikvotira i autoklavira u trajanju od 20 minuta. Otopina cezijevog klorida gustoće 1,25 pripremljena je otapanjem 36,16 g cezijevog klorida u 100 ml pufera TD. Otopina cezijevog klorida gustoće 1,34 pripremljena je otapanjem 51,20 g cezijevog klorida u 100 ml pufera TD. Otopina cezijevog klorida gustoće 1,40 pripremljena je otapanjem 62,00 g cezijevog klorida u 100 ml pufera TD. Otopina P1 za resuspenziju bakterija sadrži 50 mm Tris-HCl, 10 mm EDTA, nadopunjenih vodom do 500 ml, a vrijednost ph mora biti 8,0. Nakon pripreme otopina se autoklavira, a prije upotrebe u otopinu se dodaje RNAza A konačne koncentracije 100 µg/ml. Otopina P2 za lizu sadrži 200 mm NaOH, 1% SDS koji su nadopunjeni vodom do 500 ml. Otopina P3 za neutralizaciju sadrži 3 M KAc, vrijednost ph namješta se octenom kiselinom do konačnog iznosa 5.5 nakon čega se otopina nadopuni vodom do 500 ml. Otopina 70%-tnog etanola priprema se dodavanjem 30 ml mqh2o u 70 ml 100%-tnog etanola. Gel za razdvajanje 10%-tni pripremljen je miješanjem 1,5 ml mqh2o, 1,85 ml TRIS 1M čija vrijednost ph iznosi 8,8, 50 µl 10%-tnog SDS-a, 1,65 ml 30% akrilamida, 25 µl APS i 2,5 µl TEMED-a. 14

Gel za sabijanje 5%-tni pripremljen je miješanjem 1,4 ml mqh2o, 0,25 ml TRIS 1M čija vrijednost ph iznosi 6,8, 20 µl 10%-tnog SDS-a, 0,35 ml 30% akrilamida, 10 µl APS i 2 µl TEMED-a. Pufer Hot lysis Laemmli 6x pripremljen je otapanjem 1,2 g SDS-a u 2 ml bih2o nakon čega se u tu otopinu dodaje 2,5 ml Tris-HCl-a čija vrijednost ph iznosi 6,8, 20 mg bromfenol plavog. Nakon što se tako pripremljena smjesa otopi, u nju se dodaje 3 ml glicerola i 1,2 ml merkaptoetanola. 3.1.4. Komercijalni kompleti QIAquick Gel extraction Kit (Qiagen) korišten je u svrhu pročišćavanja inserta TLR5 iz 0,6%- tnog agaroznog gela. Izolacija plazmidne DNA metodom midi-prep provedena je pomoću kita Pure Yield TM Plasmid Midiprep System (Promega). Izolacija plazmidne DNA metodom ručni mini-prep provedena je pomoću QIAprep SpinMiniprep (Qiagen) kompleta za izolaciju. Izolacija plazmidne DNA metodom mini-prep provedena je pomoću kompleta za izolaciju PureYield PlasmidMiniprep System (Promega). Detekcija proteinskih vrpci metodom Western provedena je pomoću kompleta za detekciju Clarity Western ECL Substrate (Bio-Rad). 3.1.5. Enzimi i antitijela EcoRV (NEB), rsap, T4 DNA-ligaza (NEB), Taq DNA polimeraza (NEB), PmeI (NEB), BamHI (NEB), PacI (NEB), monoklonskog anti-ha antitijela (Santa Cruz Biotechnology, Inc), Anti-miš imunoglobulin G antitijelo s konjugiranom peroksidazom (Santa Cruz Biotechnology, Inc). 3.1.6. Osnovne kemikalije NEBuffer 3.1 (NEB), CutSmart pufer (NEB), agaroza (Roth), pufer TAE, EtBr (Sigma), Gel Loading Dye Purple 6x (NEB), izopropanol, 5M NaCl, etanol, fenol : kloroform : izoamil alkohol u omjeru 25 : 24 : 1, Pufer za T4 DNA-ligazu, 70%-tni etanol, pufer-mg 2+ (NEB), smjesa dntpova (NEB), Lipofectamine 2000, OptiMEM, DMEM HG (Sigma), DPBS (Lonza), tripsin, PageRuler Prestained Protein Ladder (Thermo Scientific), 100 bp DNA Ladder, Quick-Load 2- Log DNA Ladder (NEB). 15

3.1.5. Plazmidi Plazmid Shuttle-CMV sadrži 7469 parova baza i korišten je za konstrukciju rekombinantnog plazmida s ugrađenim divljim i mutiranim, N592S tipom gena koji kodira za receptor TLR5. Ovaj plazmid sadrži gen za rezistenciju na antibiotik kanamicin (Kan), izvorište replikacije (ORI), lijevu i desnu obrnutu ponavljajuću sekvencu ITR, lijevu i desnu ruku homologije koje sadrže sekvence homologne padeasy (Slika 6). Između promotora citomegalovirusa čovjeka (CMV) i poliadenilacijskog signala virusa SV40 nalazi se MCS ( engl. multiple cloning site ). Slika 6: Mapa plazmida pshuttle-cmv. Mapa je konstruirana korištenjem programskog alata SnapGene TM 1.1.3. Na mapi su prikazani izvorište replikacije (ori), promotor citomegalovirusa čovjeka (CMV), gen za rezistenciju na antibiotik kanamicin i neomicin (NeoR/KanR), poliadenilacijski signal virusa SV40, lijeva i desna obrnuto ponavljajuća sekvenca ITR, lijeva i desna ruka homologije, višestruko mjesto za kloniranje (MCS). Plazmid AdEasy-1 sadrži 33 477 parova baza i korišten je u svrhu konstrukcije rekombinantnog Ad5-TLR5 virusa manipulacijom Ad5 genoma kao plazmida u bakteriji Escherichia coli pri čemu je korištena homologna rekombinacija između uzoraka pshuttle-cmv-tlr5 i vektora padeasy. Plazmid sadrži gen za rezistenciju na antibiotik ampicilin (Amp) koji se gubi nakon homologne rekombinacije sa slijedom DNA pshuttle-cmv-tlr5. Izvorište replikacije pbr322, Ad5 lijevu i desnu ruku homologije koje sadrže sekvence homologne vektoru pshuttle-cmv. 16

Plazmid nosi i deleciju za gene E1 i E3 što omogućava umetanje inserta, odnosno onemogućava replikaciju virusa. Mapa plazmida AdEasy-1 prikazana je na Slici 7. Slika 7: Mapa plazmida AdEasy-1. Mapa je konstruirana korištenjem programskog alata SnapGene TM 1.1.3. Na mapi su prikazani izvorište replikacije (ori), gen za rezistenciju na antibiotik ampicilin (AmpR), kozak sekvenca, obrnuto ponavljajuća sekvenca ITR. 3.2. METODE 17

3.2.1. Priprema vektora pshuttle-cmv za ligaciju 3.2.1.1. Određivanje masene koncentracije vektora pshuttle-cmv U svrhu određivanja masene koncentracije vektora pshuttle-cmv, korišten je spektrofotometar s kojega je očitana masena koncentracija vektora pshuttle-cmv. Masena koncentracija vektora pshuttle-cmv očitana je mjerenjem apsorbancije pri 260 nm, kao i omjer apsorbancije (engl. optical density, OD) 260/280 nm i 230/280 nm. Potom je u svrhu razgradnje vektora pshuttle- CMV restrikcijskom endonukleazom EcoRV izračunata srednja masena koncentracija vektora pshuttle-cmv. Srednja masena koncentracija izračunata je preko formule: γ = γ 1 + γ 2 + + γ n n Gdje je: γ srednja masena koncentracija (ng/µl), γ masena koncentracija pri 260 nm, n ukupni broj očitanja masene koncentracije uzorka pri 260 nm. 3.2.1.2. Razgradnja vektora pshuttle-cmv restrikcijskom endonukleazom EcoRV U svrhu hidrolize fosfodiesterske veze vektor pshuttle-cmv podvrgnut je restrikcijskoj razgradnji pomoću restrikcijske endonukleaze EcoRV. Cijepanje vektora pshuttle-cmv s restrikcijskim enzimom EcoRV provedeno je prema uputama proizvođača restrikcijskog enzima. 3.2.1.3. Precipitacija, defosforilacija i pročišćavanje vektora pshuttle-cmv U svrhu talođenja vektoru pshuttle-cmv dodala se otopina 5 M NaCl u ukupnom volumenu od 7,5 µl, 67,5 µl mqh2o i 250 µl EtOH ohlađenog na -20 C. Smjesa se potom centrifugirala u vremenskom trajanja od 15 minuta na 4 C i 25 000 x g. Potom je supernatant uklonjen, a talog je ostavljen na zraku u trajanju od 20 minuta u svrhu njegova sušenja. U svrhu sprječavanja cirkularizacije vektora pshuttle-cmv tijekom postupka ligacije korištena je metoda defosforilacije vektora pshuttle-cmv. Postupak defosforilacije proveden je prema uputama proizvođača alkalne fosfataze rsap (engl. Shrimp Alkaline Phosphatase). U svrhu pročišćavanja vektora pshuttle-cmv nakon defosforilacije, u smjesu defosforiliranog vektora pshuttle-cmv ukupnog volumena 50 µl dodalo se 50 µl mqh2o i 100 µl otopine fenol : kloroform : izoamil alkohol u omjeru 25 : 24 : 1. Pripremljena smjesa se potom centrifugirala na 15 000 x g u trajanju od 3 minute nakon čega se pokupio supernatant. U 70 µl supernatanta dodao 18

se 5 M NaCl u volumenu od 6 µl, 24 µl mqh2o i 200 µl EtOH sa -20 C. Pripremljena smjesa s ukupnim volumenom od 100 µl se centrifugirala na 25 000 x g na temperaturi od 4 C u trajanju od 15 minuta. Talog pročišćenog vektora pshuttle-cmv potom se otopio u 20 µl mqh2o i kao takav spremio na -20 C. 3.2.2. Izolacija inserata TLR5 wt i TLR5 N592S za ligaciju 3.2.2.1. Izrezivanje inserata iz ekspresijskih klonova restrikcijskom endonukleazom PmeI U svrhu pripreme restrikcijske smjese za izrezivanje inserata koji kodiraju gene za TLR5 wt i TLR5 N592S iz ekspresijskih klonova pcdna3.1 htlr5 wt i pcdna3.1 htlr5 N592S na spektrofotometru su pri 260 nm očitane masene koncentracije i OD 260/280 nm i 230/280 nm ekspresijskih klonova pcdna3.1 htlr5 wt i pcdna3.1 htlr5 N592S. Potom je izračunata srednja masena koncentracija ekspresijskih klonova pcdna3.1 htlr5 wt i pcdna3.1 htlr5 N592S. Izrezivanje inserata iz ekspresijskih klonova s restrikcijskim enzimom PmeI provedeno je prema uputama proizvođača PmeI restrikcijskog enzima. Pripravljena je restrikcijska smjesa u ukupnom volumenu od 50 µl dodatkom 1 µg ekspresijskog klona pcdna3.1 htlr5 wt odnosno ekspresijskog klona pcdna3.1 htlr5 N592S. 3.2.2.2. Agarozna gel-elektroforeza U svrhu razdvajanja, pročišćavanja i same identifikacije nukleinskih kiselina na temelju njihove molekulske mase i veličine koristi se metoda agarozne gel-elektroforeze. Pod utjecajem električnog polja dolazi do gibanja nukleinskih kiselina kroz agarozni gel prema njegovom pozitivnom polu. Molekule se kroz gel gibaju ovisno o veličini što znači da će manje čestice putovati brže od onih većih. Za detekciju nukleinskih kiselina koristi se etidij bromid koji se ugrađuje između baza DNA te na taj način nakon postavljanja uzorka DNA pod UV svjetlo transiluminatora omogučuje detekciju fluorescencije. U svrhu potvrde prisutnosti inserata koji kodiraju gen za TLR5 wt i TLR5 N592S pripremljene restrikcijske smjese iz prethodnog koraka nanose se na 1%-tni agarozni gel. Ovakav gel pripremljen je otapanjem 1,0 g agaroze u 100 ml pufera TAE ( sastava: 40 mm Tris, 20 mm octena kiselina, 1 mm EDTA) u tikvici. Otapanje se vrši zagrijavanjem otopine do vrenja u mikrovalnoj pećnici, nakon čega se otopina hladi na sobnoj temperaturi te joj se potom dodaje 0,5 µl EtBr. Ohlađena otopina agaroze ulije se u kadicu za elektroforezu u koju su prethodno dodani češljići za tvorbu jažica. Nakon skrutnjavanja, gel se postavi u uređaj za elektroforezu koji je 19

ispunjen puferom TAE. Kako bi se omogućilo vizualno praćenje elektroforeze uzorci kao i marker molekulskih masa (Quick-Load 2-Log DNA Ladder(NEB)) pomiješaju se s migracijskim bojilom (Gel Loading Dye, Purple 6x (NEB)) u omjeru 6:1. Nakon potvrđene prisutnosti inserata koji kodiraju gen za TLR5 wt i TLR5 N592S provedena je gelelektroforeza. 3.2.2.3. Pročišćavanje TLR5 inserata U svrhu izolacije inserata koji kodiraju gen za TLR5 wt i TLR5 N592S nakon provedene gelelektroforeze skalpelom se iz 0,6%-tnog agaroznog gela izrezala najniža vrpca koja je odgovarala insertima koji kodiraju gen za TLR5 wt i TLR5 N592S. Koristio se QIAquick Gel extraction Kit po uputama proizvođača. Iz razlike mase prazne epruvete i epruvete s insertom izračunala se masa samog inserta. Potom su se u svaku epruvetu s insertom dodala 3 volumena pufera QG. Takve suspenzije zatim su se inkubirale na 50 C 10 minuta uz povremeno miješanje na vorteksu u svrhu potpunog otapanja agaroznog gela. U sljedećem koraku dodao se jedan volumen izopropanola u epruvete s insertima koji kodiraju gen za TLR5 wt i TLR5 N592S. Uzorci su se potom prebacili u kolone QIAquick i centrifugirali 60 sekundi, na 17 900 x g. Potom se u svaku kolonu u svrhu ispiranja dodalo po 750 µl pufera PE te su kolonice inkubirane 3 minute na sobnoj temperaturi. Kolone su se zatim centrifugirale u trajanju od 1 minute pri 17 900 x g. Potom su kolone premještene u čiste epruvete i na sredinu membrane svake kolonice dodalo 40 µl eluacijskog pufera EB te su kolonice potom inkubirane 4 minute. U svrhu uklanjanja supernatanta epruvete su centrifugirane 60 sekundi, pri 17 900 x g. Kolonice su potom uklonjene, a talozi s pročišćenim insertima koji kodiraju gene za TLR5 wt i TLR5 N592S ostali su u epruvetama. 3.2.3. Ligacija inserata TLR5 wt i TLR5 N592S u vektor pshuttle-cmv U svrhu podešavanja omjera inserata TLR5 wt, TLR5 N592S i vektora pshuttle-cmv u odnos 5:1 na spektrofotometru su određene masene koncentracije gena koji kodiraju za TLR5 wt i TLR5 N592S. Masa potrebnog inserta se računa preko formule: m (insert, ng) = m(vektor,ng) M (insert,bp) M(vektor,bp) U svrhu pripreme ligacijske smjese korišten je enzim T4 DNA-ligaza prema uputama proizvođača enzima. Ukupni volumen ligacijskih smjesa bio je 50 µl, a njihov sastav prikazan je u Tablici 1. X, 20

Tablica 1: Sastav ligacijskih smjesa za ligaciju inserata koji kodiraju gen za TLR5 wt i TLR5 N592S u vektor pshuttle-cmv (prva i druga ligacijska smjesa). Treća ligacijska smjesa predstavlja negativnu kontrolu i ne sadrži insert. Otopina TLR5 wt Volumen (µl) TLR5 N592S Negativna kontrola Volumen (µl) Volumen (µl) Pufer za T4 DNA-ligazu 10 x 5 5 5 T4 DNA ligaza 1 1 1 insert 32,5 27,8 / pshuttle-cmv 5 5 5 mqh 2O 6,5 11,2 39 Pripremljene ligacijske smjese inkubirale su se preko noći na 16 C. 3.2.4. Transformacija kompetentnih bakterija Escherichia coli DH5-α temperaturnim šokom Kemijska transformacija, kao i elektroporacija, metode su kojima se vrši transformacija rekombinantne molekule DNA u domaćina. Kemijska transformacija uključuje pripremu kompetentnih bakterijskih stanica tretmanom s ledeno hladnim CaCl2 prilikom kojega se stanična membrana bakterija opusti i stvaraju se pore na njoj. Stvaranje pora omogućuje slobodan ulaz rekombinantne DNA molekule u stanicu domaćina nakon toplinskog šoka pri 42 C. Koraci koji uključuju transformaciju bakterijskih stanica DH5-α provodili su se na ledu, pored upaljenog plamenika kako bi se smanjila mogućnost kontaminacije. U svrhu amplifikacije plazmidnih konstrukata korištene su kompetentne bakterijske stanice Escherichia coli, soj DH5-α. Tri epruvete s po 50 µl kompetentnih bakterijskih stanica DH5-α s -80 C, odmrzavale su se na ledu. U prvu epruvetu dodalo se 3 µl pripremljene ligacijske smjese s insertom koji kodira gen za TLR5 wt, u sljedeću epruvetu dodalo se 3 µl ligacijske smjese s insertom koji kodira gen za TLR5 N592S i u treću epruvetu dodalo se 3 µl ligacijske smjese bez inserta. Transformirane stanice zatim su se inkubirale na ledu 30 minuta nakon čega je slijedio toplinski šok inkubacijom na 42 C u trajanju od 45 sekundi. Nakon toga stanice su se vratile na led u trajanju od 2 minute. Takvoj suspenziji stanica zatim se dodalo 950 µl LB-medija sa sobne temperature. Sljedeći korak uključio je oporavak stanica u trajanju od 60 minuta na 37 C, u rotacijskoj tresilici na 250 rpm-a. Razmaz bakterijskih suspenzija koji je slijedio nakon oporavka 21

stanica vršio se na krutim LB-podlogama s kanamicinom nakon čega su takve podloge inkubirane preko noći na 37 C. Nakon 20 sati, s krutih hranjivih podloga odabrano je po 20 različitih kolonija iz dviju ploča tretiranih s ligacijskom smjesom sa željenim insertom i iste su prenesene u 5 ml tekuće LB hranjive podloge koja sadrži 5 µl kanamicina. Prenošenje se postiglo doticanjem odgovarajuće bakterijske kolonije sterilnimnastavkom koji se potom inkubira preko noći u tresilici uz stalnu vrtnju od 250 rpm-a i pri 5%-tnim CO2. 3.2.5. Izolacija plazmidne DNA U svrhu izolacije plazmidne DNA iz bakterijskih stanica Escherichia coli soj DH5-α provedena je metoda mini-prep komercijalno dostupnim kompletom za izolaciju QIAprep SpinMiniprep (Qiagen). Volumen od 1 ml svih 40 prekonoćnih kultura pripremljenih u koraku 3.2.4. prebacio se u 1,5 ml epruvete i centrifugiran na 8 000 rpm-a u trajanju od 3 minute. Sljedeći korak uključio je resuspendiranje taloga u 200 µl P1 otopine ohlađene na temperaturi od 4 C. Potom se takvim suspenzijama dodaje 200 µl otopine P2, a epruvete se preokrenu 6 puta. Suspenzije su potom inkubirane u trajanju od 5 minuta na sobnoj temperaturi te je u njih dodano 200 µl otopine P3 ohlađene na 4 C. Zatim se u svrhu miješanja sadržaja epruveta one okreću pet puta. Epruvete su potom centrifugirane u trajanju od 10 minuta na 18 000 rpm-a i 4 C. Supernatanti su prebačeni u nove 1,5 ml epruvete u koje je potom dodano 450 µl izopropanola te su zatim centrifugirane na 4 C 20 minuta i 18 000 rpm-a. Talozima na dnu epruveta potom je dodano 500 µl 70%-tnog etanola nakon čega su smjese centrifugirane 10 minuta na 4 C i 18 000 rpm-a. Nakon centrifugiranja uklonjen je etanol iz epruveta. U svrhu sušenja, talozi DNA s dna epruveta ostavljeni su na zraku u trajanju od 30 minuta nakon čega su otopljeni u 40 µl mqh2o. Masene koncentracije izolirane DNA očitale su se na spektrofotometru pri 260 nm. 3.2.6. Lančana reakcija polimerazom Lančana reakcija polimerazom (engl. Polymerase Chain Reaction, PCR) je metoda koja omogućuje umnažanje specifičnih fragmentata DNA. Svaka PCR reakcija zahtijeva prisutnost DNA koju se želi umnožiti, početnica, nukleotida i DNA polimeraze. DNA polimeraza je ključni enzim koji povezuje pojedinačne nukleotide kako bi se formirao PCR produkt. Nakon pripreme, reakcijska otopina stavlja se u uređaj koji podizanjem i spuštanjem temperature omogućuje ponavljanje reakcija umnažanja DNA koje se odvijaju u tri glavna koraka. Reakcijska otopina se 22

prvo zagrijava iznad točke taljenja dvaju komplementarnih lanaca DNA što omogućava njihovo razdvajanje, a proces je nazvan denaturacijom. Temperatura se zatim spušta kako bi se specifičnim početnicima omogučilo komplementarno vezanje na ciljne DNA segmente, proces poznat kao hibridizacija. Ponovno se podiže temperatura kako bi DNA polimeraza mogla dodavati nukleotide na rastući DNA lanac. Svakim ponavljanjem ova tri koraka, broj kopiranih molekula DNA udvostručuje se (Garibyan i Avashia 2013). U svrhu potvrde uspješne ligacija inserta koji kodira gen za TLR5 wt, odnosno TLR5 N592S u vektor pshuttle-cmv korištena je metoda PCR. Prvo su pripremljene matične otopine za svaki od 40 uzoraka DNA prethodno izoliranih iz stanica DH5-α, u ukupnom volumenu od 50 µl i s odgovarajućom masenom koncentracijom od 10 ng/µl. Potom su pripremljene reakcijske smjese PCR u epruvetama PCR za svaki od 40 uzoraka potencijalnih pozitivnih liganada, ukupnog volumena od 25 µl. Kao pozitivna kontrola korišten je ekspresijski klon pcdna3.1 htlr5 wt. Korištena je i negativna kontrola koja je umjesto uzorka DNA sadržavala mqh2o dok je sastav ostatka PCR smjese bio isti kao i za ostale uzorke DNA. Uvjeti pri kojima se PCR provodio navedeni su u Tablici 2. Očekivani produkt PCR reakcije iznosio bi 143 parova baza, a amplificirana regija je od 1249 bp do 1391 bp za konstrukte pshuttle-cmv-tlr5 N592S, tj. amplificirana regija konstrukta pshuttle- CMV-TLR5 wt bila bi od 1231 bp do 1373 bp. Nukleotidni sljedovi korištenih početnica: Uzvodna početnica: 5 GCTCCTGCTGAGCTTCAACT - 3 Nizvodna početnica: 5 TAAGGTTGGGCAGGTTTCTG - 3 Tablica 2: Temperaturni program korišten za PCR reakciju KORAK TEMPERATURA/ C TRAJANJE Početna denaturacija 94 2 minute Denaturacija 94 15 sekundi Komplementarno sparivanje početnica 53 30 sekundi 23

Sinteza DNA 72 45 sekundi Završna sinteza 72 7 minuta Nakon provedene PCR reakcije u svrhu potvrde uspješnosti umnažanja fragmenata DNA lančanom reakcijom polimeraze provedena je elektroforeza na 1,5%-tnom agaroznom gelu u vremenu trajanja od 1 sat pri 80 V. 3.2.7. Razgradnja uzoraka restrikcijskim endonukleazama PmeI i BamHI U svrhu dodatne potvrde uspješne ligacije konstrukata pshuttle-cmv-tlr5 N592S-1, pshuttle- CMV-TLR5 N592S-4, pshuttle-cmv-tlr5 N592S-10, pshuttle-cmv-tlr5 N592S-11, pshuttle-cmv- TLR5 wt-4, pshuttle-cmv-tlr5 wt-6 pripremljene su restrikcijske smjese prema uputama proizvođača restrikcijskih enzima PmeI i BamHI. Nakon reakcije razgradnje enzimima PmeI i BamHI provedena je elektroforeza pri 90 V u trajanju od 1 sat na 1,5%-tnom agaroznom gelu. 3.2.8. Izolacija plazmidne DNA metodom mini-prep U svrhu izolacije plazmidne DNA iz uzoraka pshuttle-cmv-tlr5 wt-6 i pshuttle-cmv- TLR5 N592S-4 metodom mini-prep korišten je komercijalno dostupan komplet za izolaciju PureYield PlasmidMiniprep System (Promega) prema uputama proizvođača. 3.2.9. Izolacija plazmidne DNA metodom midi-prep U svrhu izolacije plazmidne DNA uzoraka pshuttle-cmv-tlr5 wt-6 i pshuttle-cmv TLR5 N592S-4 iz prekonoćnih kultura metodom midi-prep korišten je komercijalno dostupan komplet za izolaciju Pure Yield TM Plasmid Midiprep System (Promega) prema uputama proizvođača. 3.2.10. Potvrda ispravne orijentacije inserta koji kodira gen za TLR5 U svrhu potvrde prisutnosti i pravilne orijentacije inserta koji kodira gen za TLR5 provedena je metoda lančane reakcije polimerazom kojom su umnoženi sljedovi DNA pshuttle-cmv-tlr5 wt- 6, pshuttle-cmv-tlr5 wt-3, pshuttle-cmv-tlr5 wt-10 i pshuttle-cmv-tlr5 N592S-4. Pripravljena je smjesa za PCR reakciju uzoraka prethodno pripravljenih otopina midi-prep iz koraka 3.2.11. za sljedove DNA pshuttle-cmv-tlr5 wt-6, pshuttle-cmv-tlr5 wt-3, pshuttle- CMV-TLR5 wt-10 i pshuttle-cmv-tlr5 N592S-4 kao i mini-prep otopina uzoraka pshuttle-cmv- TLR5 wt-6 i pshuttle-cmv-tlr5 N592S-4 pripremljenih u koraku 3.2.10, pozitivnu i negativnu kontrolu. Ukupni volumen pripremljenih smjesa iznosio je 25 µl. Kao pozitivna kontrola koristio 24

se uzorak pcdna3.1 htlr5 wt. Sastav smjese negativne kontrole isti je kao sastav ostalih uzoraka, ali je umjesto DNA uzorka dodan 1 µl mqh2o. Sastav i uvjeti reakcije nalaze se u Tablicama 3 i 4. Očekivani produkt PCR reakcije iznosio bi 316 bp, a amplificirana regija je od 1003 bp do 1318 bp za konstrukte DNA pshuttle-cmv-tlr5 N592S. Dok bi očekivani produkt za konstrukte pshuttle-cmv-tlr5 wt iznosio 298 bp, a amplificirana regija je od 1003 bp do 1300 bp. Tablica 3: Sastav smjese reakcije PCR za uzorke korištene u svrhu potvrde ispravne orijentacije inserta koji kodira gen za TLR5. reagensi Volumen (µl) mqh 2O 18 Pufer 10x Standard Taq Reaction 2,5 dntp (10 mm) 0,5 Početnica fw (10 µm) 1 Početnica rev (10 µm) 1 DNA (10 ng/µl) 1 Taq DNA polimeraza 1 *Taq DNA polimeraza dodaje se posljednja, a priprema reakcijske smjese vrši se na ledu Tablica 4: Temperaturni program korišten za PCR reakciju Uvjeti reakcije PCR Temperatura ( C) Vrijeme Početna denaturacija 94 2 minute Denaturacija 94 15 sekundi Komplementarno sparivanje 60 30 sekundi početnica Sinteza DNA 72 45 sekundi Završna sinteza 72 7 minuta Nukleotidni sljedovi korištenih početnica: Uzvodna početnica: 5 - GAGCTCGGATCCACTAGTCC - 3 Nizvodna početnica: 5 - CTGCAGCTGTTCCAGAAAGG - 3 25

Nakon provedene reakcije PCR u svrhu potvrde uspješnosti umnažanja fragmenata DNA lančanom reakcijom polimeraze provedena je elektroforeza na 1%-tnom agaroznom gelu u vremenu trajanja od 1 sat pri 80 V. 3.2.11. Razgradnja konstrukata pshuttle-cmv-tlr5 restrikcijskom endonukleazom PmeI U svrhu transformacije bakterijskih stanica Escherichia coli soj BJ5183 provedena je linearizacija konstrukta pshuttle-cmv-tlr5 wt-6 i pshuttle-cmv-tlr5 N592S-4 restrikcijskom razgradnjom pomoću restrikcijske endonukleaze PmeI. Ukupni volumen restrikcijske smjese iznosio je 50 µl, a iste su pripemljene prema uputama proizvođača restrikcijske endonukleaze PmeI. 3.2.12. Transformacija kompetentnih bakterija Escherichia coli BJ5183-AD-1 elektroporacijom Elektroporacija kao i kemijska transformacija, metoda je kojom se unosi rekombinantna DNA u stanicu domaćina. Propuštanje električnog polja omogućuje permeabilnost stanične membrane i stvaranje kanala u membrani kroz koje rekombinantna DNA molekula ulazi u stanicu. U svrhu konstrukcije rekombinantnog Ad5-TLR5 virusa manipulacijom Ad-5 genoma kao plazmida u bakterijama Escherichia coli homolognom rekombinacijom, koristio se bakterijski soj BJ5183. Bakterijske stanice Escherichia coli soj BJ5183, recbc sbcbc s ugrađenom adenovirusnom okosnicom padeasy-1 sadrži sljedove komplementarne slijedu DNA pshuttle- CMV-TLR5 wt-6 odnosno pshuttle-cmv-tlr5 N592S-4 biti će transformirane postupkom elektroporacije. Kao rezultat homologne rekombinacije u bakteriji Escherichia coli između mjesta homologije dvaju plazmida nastaje plazmid s ugrađenim insertom koji kodira gen za TLR5 wt, odnosno TLR5 N592S. Epruveta s BJ5183-AD-1 elektrokompetentnim stanicama sa -80 C, odmrznuta je na ledu nakon čega se 40 µl elektrokompetentnih stanica stavilo u kivetu za elektroporaciju prethodno ohlađenu na ledu. U dvije različite kivete potom je dodan 1 µl prethodno s restrikcijskim enzimom PmeI lineariziranog konstrukta pshuttle-cmv-tlr5 wt-6, odnosno pshuttle-cmv-tlr5 N592S-4. Kiveta se potom umetnula u elektroporator (Gene Pulser Xcell, Bio-Rad) i kroz nju se proveo visokovoltažni puls od 2,5 kv, otpor od 200 Ω i kapacitativnost od 25 µf u trajanju od 5 ms. Nakon provedenog pulsa u suspenziju stanica dodan je 1 ml tekućeg LB medija i bakterije resuspendirane. koji je potom resuspendiran. Nakon resuspenzije stanice su prebačene u sterilne epruvete od 15 ml i inkubirane u vremenu trajanja od 60 minuta u tresilici koja rotira brzinom od 250 rpm-a pri 37 C. 26

U svrhu selekcije pozitivnih transformanata, bakterije su nasađene na krutu LB podlogu s kanamicinom te su potom inkubirane preko noći na 37 C. Nakon 20 sati po deset transformiranih kolonija iz svake krute LB podloge preneseno je u 5 ml tekuće hranjive podloge LB koja sadrži 5 µl kanamicina. Prenošenje se postiglo doticanjem kolonije sterilnim tipsem koje su kao takve inkubirane preko noći na 37 C, u rotacijskoj tresilici pri 250 rpm-a. Potom je korištena metoda mini-prep u svrhu izolacije plazmidne DNA iz 1 ml prekonoćnih kultura za 20 različitih kolonija. Prvih 10 prekonoćnih kultura iz kojih se vršila izolacija odgovaralo je transformantima Ad5-TLR5 wt-6, a drugih 10 kolonija odgovaralo je transformantima Ad5-TLR5 N592S-4. 3.2.13. Transformacija kompetentnih bakterija Escherichia coli DH5-α temperaturnim šokom U svrhu amplifikacije dovoljne količine plazmida iz bakterije Escherichia coli dobivene homolognom rekombinacijom provedena je metoda kemijske transformacije bakterijskih stanica Escherichia coli soj DH5-α s prethodno izoliranim konstruktima Ad5-TLR5. Razmaz bakterijskih suspenzija izvršen je na krutim LB podlogama s kanamicinom za selekciju transformiranih kolonija. Podloge su potom inkubirane na 37 C i pri 5%-tnim CO2 preko noći. Nakon 20 sati po dvije transformirane kolonije konstrukta Ad5-TLR5 wt3, Ad5-TLR5 wt8, Ad5- TLR5 N592S-3 i Ad5-TLR5 N592S-4 prenesene su u 5 ml tekuće hranjive podloge LB s 5 µl kanamicina, doticanjem sterilnim tipsem. Takve suspenzije potom su inkubirane preko noći na 37 C uz stalnu trešnju pri 250 rpm-a. Nakon inkubacije, u svrhu izolacije plazmidne DNA korištena je metoda mini-prep. Na spektrofotometru su zatim pri 260 nm očitane masene koncentracije prethodno izolirane DNA za svih osam uzoraka u svrhu pripreme reakcije restrikcije s restrikcijskim enzimom EcoRV. 3.2.14. Razgradnja konstrukata Ad5-TLR5 restrikcijskom endonukleazom EcoRV U svrhu potvrde homologne rekombinacije provedena je linearizacija konstrukta Ad5-TLR5 wt-3 i Ad5-TLR5 N592S-3 restrikcijskom razgradnjom pomoću restrikcijske endonukleaze EcoRV. Ukupni volumen restrikcijskih smjesa iznosio je 15 µl, a iste su pripemljene prema uputama proizvođača restrikcijske endonukleaze EcoRV. 27

Nakon inaktivacije restrikcijske endonukleaze EcoRV provedena je elektroforeza na agaroznom gelu u svrhu potvde uspješnosti hidrolize fosfodiesterske veze okosnice DNA, za restrikcijske smjese. 3.2.15. Razgradnja uzoraka restrikcijskom endonukleazom PacI U svrhu konačne potvrde uspješne homologne rekombinacije između bakterijskih stanica BJ5183- AD-1 i konstrukta pshuttle-cmv-tlr5 wt-3 odnosno pshuttle-cmv-tlr5 N592S-3 pripremljene su restrikcijske reakcije s restrikcijskom endonukleazom PacI. Ukupni volumen restrikcijskih smjesa iznosio je 50 µl, a iste su pripemljene prema uputama proizvođača restrikcijske endonukleaze PacI. Nakon razgradnje restrikcijskim enzimom PacI provedena je elektroforeza pri 90 V u trajanju od 1 sat na 1%-tnom agaroznom gelu. 3.2.16. Transfekcija HEK-293 stanica s adenovirusnim konstruktom U svrhu umnažanja adenovirusnog konstrukta korištena je stanična linija HEK-293 (engl. human embryonic kidney). HEK-293 stanična linija je imortalizirana ugradnjom adenovirusnih ranih gena E1A u stanični genom. Komplementacijom u HEK-293 staničnoj liniji stvaraju se virusne čestice iz razloga što su rekombinantni vektori deficijentni u regiji E1A odgovornoj za replikaciju virusnog genoma. HEK-293 stanična linija uzgajana je u plastične pločice sa 6 bunarića do postizanja 80% konfluentnosti površine na kojoj rastu. Plazmid s adenovirusnim genomom ugrađenim u plazmidnu osnovu prije transfekcije lineariziran je restrikcijskim enzimom PacI. Transfekcija HEK-293 stanica provedena je pomoću reagensa Lipofectamine2000. Pripremljena je otopina koja je sadržavala 230 μl medija OptiMEM u koju je dodano 4 µg plazmidne DNA. Druga otopina pripremljena je miješanjem 240 μl medija OptiMEM i 10 μl reagensa Lipofectamine2000. Nakon pripreme, sadržaj dvije otopine je pomiješan i inkubiran 20 minuta. Stanice HEK-293 isprane su hranjivom podlogom DMEM HG (engl. Dulbecco's modified Eagle's medium, high glucose). Smjesi otopina dodan je DMEM te je dobivena smjesa prebačena na stanice u plastične pločice sa 6 bunarića. Nakon inkubacije u trajanju od 4 sata pri 37 C, zamijenjena je hranjiva podloga nad stanicama dodatkom po 2 ml svježeg DMEM u svaki bunarić. Ovako transfecirane stanice inkubirane su 10 dana pri 37 C i 5% CO2. Nakon deset dana inkubacije transfeciranih stanica, sadržaj plastičnih posuda sa 6 bunarića skupljen je, zamrznut pri temperaturi od -20 C i odmrznut pri 37 C kroz 3 ciklusa, kako bi se 28

oslobodile virusne čestice iz stanica. Dobiveni lizat stanica centrifugiran je 5 minuta pri 3000 x g i odvojen je suprenatant od ostataka stanica u talogu te spremljen na -20 C. Stanice HEK-293 u 49 pasažu presađene su kada su dosegle 90% konfluentnosti tako što im je uklonjena tekuća podloga te su isprane s 4 ml fosfatnog pufera (engl. phosphate buffer saline, PBS). Pufer je potom uklonjen, a stanice tretirane s 1 ml sterilnog tripsina. Tripsin predstavlja proteolitički enzim izoliran iz gušterače goveda koji iza karboksilne skupine arginina ili lizina omogućuje specifično cijepanje proteina. Stanice se ispiru tripsinom u svrhu omogućavanja njihovog međusobnog odvajanja kao i njihovog odvajanja od same podloge. Nakon ispiranja tripsinom stanice su inkubirane 5 minuta kako bi se odlijepile od podloge te im je zatim dodano 9 ml svježe tekuće podloge DMEM HG. Nakon toga je po 1 ml takve otopine prenesen u nove plastične posudice sa stanicama HEK-293 kojima je prethodno uklonjen medij. Stanice su zatim resuspendirane s PBS-om nakon čega je isti uklonjen. U svaku od plastičnih posuda potom je dodano po 9 ml svježeg hranjivog medija DMEM te su potom inkubirane 48 sati pri 37 C i 5% CO2. Nakon 48 sati u svrhu infekcije virusnim lizatom, korištene su HEK-293 stanice koje su dostigle konfluentnost od 80%. Prvo je adenovirus zamrznut pri temperaturi od -20 C i odmrznut pri 37 C kroz 3 ciklusa, kako bi se oslobodile virusne čestice iz stanica. U plastične posude sa stanicama HEK-293 dodan je adenovirus u čijoj se okosnici nalazi divlji tip gena koji kodira za receptor TLR5 ukupnog volumena od 10 µl u prvu, 20 µl u drugu, 50 µl u treću i 100 µl u četvrtu plastičnu posudu. Paralelno je u plastične posude dodan adenovirus u čijoj se okosnici nalazi mutirani, N592S tip gena koji kodira za receptor TLR5 ukupnog volumena od 10 µl u prvu, 20 µl u drugu, 50 µl u treću i 100 µl u četvrtu plastičnu posudu. Ovako transficirane stanice inkubirane su 48 sati u inkubatoru pri 37 C i 5%-tnim CO2. Nakon 48 sati inkubacije stanični sadržaji plastičnih posuda za uzgoj stanica s zajedno s hranjivim medijem pomiješani su u jednu epruvetu od 50 ml za divlji tip gena koji kodira za receptor TLR5, odnosno drugu epruvetu od 50 ml za mutirani tip gena koji kodira za receptor TLR5 koje su potom spremljene na -20 C. HEK-293 stanice koje se nalaze u 40 plastičnih posuda, a koje su dostigle 70-80% konfluentnosti inficirane su s po 20 µl adenovirusa u čijoj se okosnici nalazi divlji tip gena koji kodira za receptor 29

TLR5. Postupak je ponovljenu novih 40 plastičnih posuda s HEK-293 stanicama, ali sada s po 20 µl adenovirusa u čijoj se okosnici nalazi mutirani tip gena koji kodira za receptor TLR5. U svrhu replikacije virusa inkubirane su inficirane stanice u trajanju od 72 sata na 37 C. Nakon 72 sata 50% stanica je bilo zalijepljeno, a 50% odljepljeno s vidljivim citopatološkim učinkom (engl. cytopathiceffect, CPE). Laganim lupkanjem o plastičnu posudu, stanice su odvojene od podloge i sadržaj plastičnih posuda je skupljen u epruvete od 50 ml Epruvete su centrifugirane 10 minuta pri 750 x g u svrhu odvajanja hranjivog medija od taloga. Talozi s adenovirusnim vektorom u čijoj se okosnici nalazi gen TLR5 wt su potom resuspendirani i prebačeni u ukupnom volumenu od 8 ml u epruvetu od 10 ml te spremljeni na -20 C do izolacije i pročišćavanja. Isti postupak ponavljen je i s HEK-293 stanicama transfeciranim s adenovirusnim vektorom u čijoj se okosnici nalazi gen koji kodira TLR5 N592S. 3.2.17. Pročišćavanje adenovirusnih vektora U svrhu pročišćavanja adenovirusnog vektora iz dobivenog lizata radi uklanjanja ostataka stanica kao i praznih virusnih kapsida provedeno je ultracentrifugiranje na jastučiću celzijevog klorida i kasnije u gradijentu cezijevog klorida. U svrhu pročišćavanja virusa, tri otopine cezijevog klorida pripremljene su u TD puferu, gustoće 1,25 g/ml, 1,34 g/ml i 1,40 g/ml. Pročišćavanje virusa izvedeno je u dva koraka u laminaru. U prvom koraku u dvije epruvete za centrifugu T880 od 11 ml je stavljeno po 2,4 ml cezijevog klorida gustoće 1,40 g/ml te nadslojeno ispuštanjem tekućine pipetom niz stijenku epruvete za centrifugu kap po kap s po 2,4 ml ml cezijevog klorida gustoće 1,25 g/ml. Na smjese je dodano po 4 ml adenovirusnog vektora u čijoj se okosnici nalazi gen koji kodira za divlji tip receptora TLR5 te su potom epruvete za centrifugu do vrha nadopunjena s DPBS-om. Postupak je ponovljen u dvije nove epruvete za centrifugu, ali s adenovirusnim vektorom u čijoj se okosnici nalazi gen TLR5 N592S. Uzorci su centrifugirani u rotoru SW41 Ti, ultracentrifugirke Beckman u trajanju od 90 minuta pri 35 000 x g. Nakon centrifugiranja uzorci su izvađeni iz nosača i stalaka i preneseni u laminar te postavljeni na plastični stalak ispred tamne pozadine. Čestice virusa bile su vidljive kao prstenasti sloj između dviju otopina cezijevog klorida različitih gustoća. Virus je iz otopine cezijevog klorida izdvojen ubadanjem sterilne igle do malo iznad linije virusa te prebačen u čistu epruvetu time da je iz svake tube za centrifugu preneseno po 1 ml virusa. 30

U drugom koraku centrifugiralo se u gradijentu cezijevog klorida tako što je u epruvetama koje sadrže po 2 ml virusa pročišćenog na jastučiću cezijevog klorida stavljeno 9 ml cezijevog klorida gustoće 1,34 g/ml. Epruvete za centrifugu su ekvilibrirane na vagi dodavanjem otopine cezijevog klorida gustoće 1,34 g/ml. Uzorci su pričvršćeni u stalak i nosač te stavljeni na ultracentrifugiranje 20 sati pri 35 000 x g, 20 C. Centrifugiranjem nastaje gradijent cezijevog klorida, a virus se zaustavlja na mjestu u kojem je gustoća cezijevog klorida jednaka gustoći virusnih čestica i vidi se oko polovice epruvete za centrifugu kao bijeli trag. Virus iz cezijevog klorida u ukupnom volumenu od 1 ml izvađen je iglom prema gore opisanom postupku i prebačen u čistu 1,5 ml epruvetu. U svrhu uklanjanja otopine cezijevog klorida iz pročišćenih adenovirusa korištena je kolona Column PD-10 Sphadex G-25M, Amersham Pharmacia Biotech Cat.No. 17-0851-01. Kolona se pričvrstila na metalni stalak nakon čega joj je vrh odrezan škarama kako bi tekućina iz nje iscurila te se potom kolona isprala 6 puta s po 5 ml DPBS-a. Sljedeći korak bio je dodavanje virusa u ukupnom volumenu od 1 ml na kolonu i skupljanje eluata. Potom je slijedilo skupljanje sljedećih eluata dodavanjem DPBS-a na kolonu u volumenima od 500 µl za eluat 1, 2, 3, 4, 250 µl DPBS-a za eluate 5 i 6, 500 µl DPBS-a za eluat 7 i 250 µl DPBS-a za eluate 8, 9, 10. Frakcije 5, 6, 7, 8 odgovarale su frakcijama u kojima se nalaze adenovirusi zbog toga što su mutne i konkavne u odnosu na frakcije u kojima nema virusa. Potom je virusima dodan glicerol tako da bude prisutan u konačnoj otopini 10%. Pročišćeni virusi su alikvotirani i uskladišteni na -80 C do upotrebe. 3.2.18. Određivanje koncentracije adenovirusnih čestica u suspenziji pročišćenih adenovirusa Određivanje ukupnog broja virusnih čestica vrši se mjerenjem apsorbancije pri 260nm. Ova spektrofotometrijska metoda se koristi samo za pročišćeni virus. U svrhu određivanja koncentracije adenovirusnih čestica pripremljena su razrjeđenja pročišćenih adenovirusa (Ad5-TLR5 wt i Ad5-TLR5 N592S ) 10x i 20x u otopini PBS-a (sastava: 137 mm NaCl, 2,7 mm KCl, 4,3 mm Na2HPO4 i 1,4 mm KH2PO4, pri ph 7,4) i 0,1%-tnog SDS-a (natrijev dodecilsulfat). Otopine su potom inkubirane 10 minuta u termobloku pri 56 C u svrhu oslobađanja virusne DNA iz kapsida. Potom su virusni pripravci centrifugirani pri 10 000 x g u vremenu trajanja od 30 sekundi i supernatant prebačen u nove 1,5 ml epruvete. Potom su izmjerene apsorbancije pri 260 nm prema otopini PBS-a i 0,1%-tnog SDS-a. Broj virusnih čestica izračunat je prema formuli: 31

N =A260 x R x 1,1 x 10 12, gdje je: N broj virusnih čestica u ml, A260 izmjerena apsorbancija pri 260 nm, R razrjeđenje. 3.2.19. Zaražavanje stanica A549, WI38 i H1299 U svrhu infekcije virusnim česticama humane stanične linije epitelnog podrijetla iz karcinoma pluća A549, zdravih fibroblasta epitelnog podrijetla iz tkiva pluća WI38, raka pluća ne-malih stanica H1299, nasađene su u plastične pločice s 12 bunarića tako što je u svakom bunariću nasađeno 200 000 stanica. Stanice su inkubirane preko noći pri 37 C i 5%-tnim CO2 nakon čega je po bunariću dodan 1 ml svježeg DMEM medija. Stanice su potom inficirane virusnim česticama tako što je u bunariće sa svakom staničnom linijom dodano 5 000, 10 000 odnosno 30 000 virusnih čestica i inkubirano 90 minuta. Volumen virusnih čestica koji je potrebno dodati stanicama izračunat je prema formuli: V (virusne čestice, µl) = N(stanice) N (bunarić). MOI c(matična otopina) Gdje je: MOI- ukupni broj virusnih čestica po stanici, c (matična otopina) koncentracija matične otopine tako da 1 µl otopine sadrži 1 x 10 9 virusnih čestica. Infekcija stanica u jednom slučaju provedena je s Ad5-TLR5 wt, a u drugom s Ad5-TLR5 N592S. Poslije inkubacije stanicama je promijenjen medij te su vraćene u inkubator u trajanju od 48 sati. Nakon 48 sati inkubacije stanicama je uklonjen medij i po bunariću dodan prethodno zagrijani na 96 C, pufer Hot lysis Laemmli 1x u volumenu od 200 µl. Uzorci su potom sonificirani, vorteksirani i kuhani na 95 C 10 minuta. 3.2.20. Elektroforeza u poliakrilamidnom gelu uz prisutnost SDS-a (SDS-PAGE) SDS-PAGE elektroforeza je denaturirajuća elektroforeza jer se narušava nativna struktura analiziranih proteina djelovanjem određenih reagensa. Prije samog nanošenja uzorci proteina miješaju se s puferom za nanošenje na gel koji sadrži natrij dodecil sulfat (SDS) kao i β- merkaptoetanol, reducirajući reagens. SDS omogućuje disocijaciju proteinskih podjedinica i narušava tercijarnu strukturu proteina. β-merkaptoetanol omogućuje redukciju disulfidnih veza između polipeptidnih lanaca čime narušava sekundarnu strukturu proteina. Natrij dodecil sulfat daje negativan naboj svim proteinima i njegovim stupanjem u komleks s polipeptidnim lancima, 32

oni zauzimaju oblik nasumičnog klupka. Proteini se na gelu odjeljuju isključivo na temelju njihove molekulske mase zbog maskiranja naboja bočnih aminokiselinskih ogranaka vezanjem SDS-a na proteine u stalnom omjeru po jedinici mase. 3.2.21. Analiza Western blot Analiza Western blot je tehnika za razdvajanje, identifikaciju i određivanje prisutnosti proteina na temelju njihove molekulske mase. Određena masa proteina nanosi se na poliakrilamidni gel na kojem putuju pod djelovanjem napona tako što oni proteini manje molekulske mase putuju brže dok oni veće molekulske mase putuju sporije. Nakon provedene elektroforeze na poliakrilamidnom gelu razdvojeni proteini s gela se prebacuju na membranu pod utjecajem istosmjerne električne struje. Nakon prijenosa, membrana se blokira zasićenjem proteinima kao što su albumin goveđeg seruma ili obranim mlijekom u prahu u svrhu sprječavanja nespecifičnog vezanja antitijela. Proteini se potom inkubiraju u otopini sa specifičnim primarnim antitijelom za određeni protein. Konačno slijedi detektiranje proteina kao i određivanje njihovog položaja na membrani vezanjem sekundarnih antitijela koja sadrže kovalentnu vezanu molekulu enzima čiji se signali registriraju kolorimetrijom ili kemiluminiscencijom. U svrhu pripreme gelova za SDS-PAGE elektroforezu pripremljene su otopine za 10%-tne gelove za razdvajanje (donji gelovi) i 5%-tne gelove za sabijanje (gornji gelovi). Nakon pripremljenih otopina, smjesa gela za razdvajanje izlivena je između dva stakalca pričvršćenih na postolje. U svrhu sprječavanja pristupa atmosferskom kisiku koji bi onemogućio polimerizaciju gela na otopinu gela se dodala otopina izopropanola u trajanju od 40 minuta. Nakon polimerizacije, izopropanol je izliven i rub gela je ispran redestiliranom vodom te je potom na njega nanesena smjesa gela za sabijanje. Odmah nakon nanošenja gela za sabijanje umetnut je češljić za formiranje jažica i gel je polimerizirao u vremenu trajanja 60 minuta. Nakon polimerizacije gela u svrhu nanošenja uzoraka na gel radi dokazivanja uspješnosti infekcije staničnih linija A549, WI38, H1299 virusnim česticama, 20 µl uzoraka proteinskog ekstrakta inkubirano je u termobloku u trajanju od 5 minuta na 96 C. Nakon inkubacije uzorci su naneseni na poliakrilamidni gel u svrhu provođenja elektroforeze za svaku staničnu liniju za sedam uzoraka: neinficirani uzorak, uzorak inficiran s 5 000, 10 000 i 30 000 virusnih čestica Ad5-TLR5 wt, uzorak inficiran s 5 000, 10 000 i 30 000 virusnih čestica Ad5-TLR5 N592S. Kao marker molekulskih masa 33

korišten je PageRuler Prestained Protein Ladder (Thermo Scientific), a elektroforeza se provela u uređaju za vertikalnu elektroforezu (Bio-Rad) pri 160 V po gelu, u trajanju od 45 minuta. U svrhu prijenosa proteina s gela na PVDF membranu korišten je uređaj TranBlot Turbo BlottingSystem (Bio-Rad). Prije samog prijenosa membrana je aktivirana metanolom u trajanju od 60 sekundi i zatim isprana u trajanju od 60 sekundi u mqh2o. Membrana je postavljena na filter papire ekvilibrirane u puferu za transfer, a na njih se postavio gel na kojemu se također nalaze filter papiri. Potom se tako složena kaseta u svrhu transfera postavila u uređaj u kojemu transfer traje 7 minuta, a vrši se pri 2 500 ma. Prije samog postupka blokiranja pripremila se 5%-tna otopina mlijeka u prahu otapanjem uu puferu PBS-T na magnetnoj miješalici. Membrana se postavila u plastičnu posudicu u koju se dodao volumen pripremljene 5%-tne otopine mlijeka u prahu koji je dovoljan da prekrije membranu. Potom se membrana inkubirala pri sobnoj temperaturi u trajanju od 60 minuta uz miješanje. Nakon blokiranja, membrana se inkubirala na 4 C preko noći u pripremljenoj otopini primarnog mišjeg monoklonskog anti-ha antitijela uz miješanje na tresilici. Otopina primarnog antitijela pripremila se razrjeđenjem 20 µl izvorne otopine antitijela u 10 ml 5%-tne otopine mlijeka u prahu. Sljedeći dan membrana je tri puta isprana u puferu PBS-T u trajanju od 15 minuta uz miješanje pri sobnoj temperaturi. Membrana se potom inkubirala u otopini sekundarnog antimišjeg imunoglobulin G antitijela s konjugiranom peroksidazom, u vremenu trajanja od 60 minuta. Otopina sekundarnog antitijela pripremila se razrjeđenjem 5 µl izvorne otopine antitijela u 5 ml 5%-tne otopine mlijeka u prahu. Nakon provedene inkubacije membrana se ponovno ispirala tri puta u trajanju od 15 minuta u otopini PBS-T. U svrhu dokazivanja uspješnosti infekcije staničnih linija A549, WI38, H1299 virusnim česticama i detekcije proteinske vrpce HA proteina na PVDF membrani korišten je kemiluminescentni reagens Luminol. U ovom radu korišten je komercijalno dostupan komplet za detekciju Clarity Western ECL Substrate (Bio-Rad). Prije same detekcije pomiješala se otopina reagensa A s otopinom reagensa B u omjeru 1 : 1 i takvom smjesom potom se prekrila membrana. Reagens A predstavlja otopinu luminola, a reagens B predstavlja otopinu peroksida. Membrana se potom inkubirala u trajanju od 5 minuta pri sobnoj temperaturi nakon čega se višak otopine uklonio s membrane koja se potom uslikala uređajem C-Digit Blot Scanner s ekspozicijom u trajanju od 12 minuta. 34

35

4. REZULTATI 4.1. Priprema inserata TLR5 wt i TLR5 N592S za kloniranje u vektor pshuttle-cmv Prvi dio ovoga eksperimenta bio je uklonirati gen koji kodira za divlji tip receptora TLR5 i njegov mutirani oblik, N592S tip u vektor pshuttle-cmv. U tu svrhu vektor pshuttle-cmv pocijepan je s restrikcijskom endonukleazom EcoRV. Slijedeći korak obuhvaćao je izrezivanje inserata koji kodiraju za divlji tip receptora TLR5 i njegov mutirani oblik, N592S tip iz ekspresijskih klonova pcdna3.1 htlr5 wt kao i pcdna3.1 htlr5 N592S restrikcijskom endonukleazom PmeI. U svrhu provjere uspješnosti hidrolize fosfodiesterske veze okosnice DNA potom je provedena metoda elektroforeze postavljanjem pripremljenih restrikcijskih smjesa na agarozni gel (Slika 9). Slika 8: Elektroforeza na agaroznom gelu nakon razgradnje s restrikcijskom endonukleazom PmeI. Na gel je nanesen marker molekulskih masa (M), uzorci pcdna3.1 htlr5 wt i pcdna3.1 htlr5 N592S tretirani s enzimom PmeI (1, 2). U jažicama 2 i 3 vidljive su vrpce veličine oko 2.9 kb koje bi odgovarale insertima koji kodiraju gen TLR5 wt odnosno TLR5 N592S, a vrpce od oko 5 kb odgovarale bi uzorcima pcdna3.1 htlr5 wt i pcdna3.1 htlr5 N592S bez inserta koji kodiraju gen TLR5 wt odnosno TLR5 N592S. 4.2. Metoda ligacije i amplifikacije ligiranih produkata U svrhu ligacije inserata koji kodiraju gen TLR5 wt i TLR5 N592S u vektor pshuttle-cmv na spektrofotometru su očitane masene koncentracije uzoraka koje su potrebne za podešavanje omjera 36

inserta (TLR5 wt i TLR5 N592S ) i vektora pshuttle-cmv u odnos 5 : 1. Očitane masene koncentracije su iznosile 5,74 ng/µl za insert koji kodira gen TLR5 wt, 6,71 ng/µl za insert koji kodira gen TLR5 N592S i 20 ng/µl za vektor pshuttle-cmv. Produkt ligacije inserta koji kodira za TLR5 wt u vektor pshuttle-cmv vidljiv je na Slici 10. Slika 9: Produkt ligacije inserta koji kodira gen TLR5 wt prethodno tretiran s restrikcijskom endonukleazom PmeI u vektor pshuttle-cmv prethodno tretiranog enzimom EcoRV. Slika je rekonstruirana programskim alatom SnapGene TM 1.1.3. U svrhu amplifikacije konstrukta pshuttle-cmv-tlr5 wt i pshuttle-cmv-tlr5 N592S provoden je postupak transformacije kompetentnih bakterijskih stanica DH5-α s prethodno pripremljenim ligacijskim smjesama (Slike 11 i 12). 37

Slika 10: Prekonoćne bakterijske kulture transformiranih kolonija DH5-α koje sadrže željeni fragment koji kodira gen za divlji tip receptora TLR5. Slika 11: Prekonoćne bakterijske kulture transformiranih kolonija DH5-α koje sadrže željeni fragment koji kodira gen za mutirani oblik receptora TLR5, N592S tip. 4.3. Izolacija plazmidne DNA iz stanica bakterije Escherichia coli U svrhu izolacije konstrukata pshuttle-cmv-tlr5 kojim su bakterije DH5-α prethodno transformirane, prekonoćne bakterijske kulture 40 odabranih klonova uzgojene su u tekućoj LB hranjivoj podlozi. Nakon izolacije plazmidnih DNA metodom mini-prep, na spektrofotometru su očitane njihove masene koncentracije te izračunate srednje masene koncentracije (Tablica 5). 38

Tablica 5: Srednje vrijednosti masenih koncentracija izolirane DNA (pshuttle-cmv-tlr5 wt, pshuttle- CMV-TLR5 N592S ) Uzorak γ (ng/µl) Uzorak γ (ng/µl) TLR5 TLR5 Wt-1 259,7 N592S-1 678,74 Wt-2 347,8 N592S-2 462,35 Wt-3 289,17 N592S-3 571,20 Wt-4 518,44 N592S-4 849,38 Wt-5 481,80 N592S-5 636,9 Wt-6 651,5 N592S-6 724,59 Wt-7 944,81 N592S-7 555,90 Wt-8 887,55 N592S-8 649,26 Wt-9 521,60 N592S-9 686,92 Wt-10 427,59 N592S-10 592,24 Wt-11 685,25 N592S-11 536,33 Wt-12 60,24 N592S-12 630,73 Wt-13 536,93 N592S-13 864,09 Wt-14 350,09 N592S-14 415,48 Wt-15 295,09 N592S-15 60,00 Wt-16 430,17 N592S-16 625,74 Wt-17 647,99 N592S-17 804,04 Wt-18 133,34 N592S-18 750,71 Wt-19 365,35 N592S-19 687,54 Wt-20 782,64 N592S-20 595,99 Nakon izolacije plazmidne DNA u svrhu potvrde ligacije inserta koji kodira gen TLR5 wt, odnosno inserta koji kodira gen TLR5 N592S u vektor pshuttle-cmv korištena je metoda PCR. Poslije provedene PCR reakcije produkti iste nanose se na 1,5%-tni agarozni gel (Slika 13). Rezultati umnažanja PCR produkata radi potvrde uspješne ligacije prikazani su na Slikama 13 i 14. Na slikama su bile vidljive vrpce koje su odgovarale produktima reakcije PCR od 143 parova baza za uzorke pshuttle-cmv-tlr5 N592S-1, pshuttle-cmv-tlr5 N592S-4, pshuttle-cmv- TLR5 N592S-10, pshuttle-cmv-tlr5 N592S-11, pshuttle-cmv-tlr5 wt-4, pshuttle-cmv- TLR5 wt-6. 39

Slika 12: Produkti PCR reakcije. Elektroforeza na agaroznom gelu plazmida izoliranih iz 17 različitih bakterijskih kolonija. Marker molekulskih masa (M), plazmidi iz različitih bakterijskih kolonija (pshuttle- CMV-TLR5 N592S-1 - pshuttle-cmv-tlr5 N592S-17 (1-17), pcdna3.1 htlr5 wt (18), negativna kontrola (19)). Slika 13: Produkti PCR reakcije. Elektroforeza na agaroznom gelu plazmida izoliranih iz 10 različitih bakterijskih kolonija. Marker molekulskih masa (M), plazmidi iz različitih bakterijskih kolonija (pshuttle- CMV-TLR5 N592S-18 (1), pshuttle-cmv-tlr5 N592S-19 (2), pshuttle-cmv-tlr5 N592S-20 (3), pshuttle-cmv- TLR5 wt-2 (4), pshuttle-cmv-tlr5 wt-4 (5), pshuttle-cmv-tlr5 wt-6 (6), pshuttle-cmv-tlr5 wt-8 (7), pshuttle-cmv-tlr5 wt-9 (8), pshuttle-cmv-tlr5 wt - 18 (9), pshuttle-cmv-tlr5 wt-20 (10), pcdna3.1 htlr5 wt (11), negativna kontrola (12)). 4.4. Razgradnja konstrukata pshuttle-cmv-tlr5 restrikcijskim enzimima PmeI i BamHI U svrhu potvrde uspješne ligacije inserata koji kodiraju gen za TLR5 wt i TLR5 N592S u vektor pshuttle-cmv provedena je razgradnja potencijalnih konstrukta pshuttle-cmv-tlr5 pomoću restrikcijskih endonukleaza PmeI i BamHI. Prije pripreme restrikcijskih reakcija na spektrofotometru su očitane masene koncentracije konstrukata pshuttle-cmv-tlr5 te izračunate njihove srednje masene koncentracije (Tablica 6). 40

Tablica 6: Srednje vrijednosti masenih koncentracija uzoraka pshuttle-cmv-tlr5 N592S-1, pshuttle-cmv- TLR5 N592S-4, pshuttle-cmv-tlr5 N592S-10, pshuttle-cmv-tlr5 N592S-11 i pshuttle-cmv-tlr5 wt-4, pshuttle-cmv-tlr5 wt-6. Uzorak γ (ng/µl) TLR5 N592S-1 622,38 TLR5 N592S-4 786,73 TLR5 N592S-10 748,45 TLR5 N592S-11 720,635 TLR5 wt-4 720,635 TLR5 wt-6 695,94 U svrhu provjere uspješnosti hidrolize fosfodiesterske veze okosnice DNA provedena je metoda elektroforeze postavljanjem pripremljenih restrikcijskih smjesa potencijalnih konstrukata pshuttle-cmv-tlr5 na agarozni gel. Na agaroznom gelu bile su jasno vidljive vrpce za uzorke pshuttle-cmv-tlr5 wt-6 i pshuttle-cmv-tlr5 N592S-4 prethodno tretiranih restrikcijskim enzimima PmeI i BamHI, što je bila potvrda uspješne reakcije ligacije. Za uzorak TLR5 wt-6 vidljive su tri vrpce od 5413 bp, 3931 bp i 1037 bp, a za uzorak TLR5 N592S-4 vidljive su vrpce veličine 5431 bp, 3931 bp i 1037 bp (Slika 15). Slika 14: Elektroforeza na agaroznom gelu uzoraka pshuttle-cmv-tlr5 wt-3 (1), pshuttle-cmv-tlr5 wt-10 (2), pshuttle-cmv-tlr5 wt-4 (3), pshuttle-cmv-tlr5 wt-6 (4), pshuttle-cmv-tlr5 N592S-1 (5), pshuttle- CMV-TLR5 N592S-4 (6), pshuttle-cmv-tlr5 N592S-10 (7), pshuttle-cmv-tlr5 N592S-11 (8) prethodno tretiranih restrikcijskim endonukleazama PmeI i BamHI, marker molekulskih masa (M). 41

Plazmidi pshuttle-cmv-tlr5 wt-6 i pshuttle-cmv-tlr5 N592S-4 su uzgojeni i izolirani metodama mini-prep i midi-prep nakon potvrđene uspješne ligacije. Potom je očitana masena koncentracija izoliranih DNA pri 260 nm na spektrofotometru i izračunata njihova srednja masena koncentracija (Tablica 7). Tablica 7: Srednje vrijednosti masenih koncentracija plazmida pshuttle-cmv-tlr5 WT-6 i pshuttle- CMV-TLR5 N592S-4 nakon izolacije. Uzorak TLR5 wt-6 mini-prep TLR5 N592S-4 mini-prep TLR5 wt-6 midi-prep TLR5 N592S-4 midi-prep γ (ng/µl) 83,90 80,39 334,04 278,38 4.5. Provjera ligacije inserata TLR5 wt i TLR5 N592S s vektorom pshuttle-cmv U svrhu potvrde ligacije i pravilne orijentacije inserta koji kodiraju gen za TLR5 wt, odnosno TLR5 N592S s vektorom pshuttle-cmv korištena je metoda PCR. Rezultati umnažanja PCR produkata radi potvrde uspješne ligacije prikazani su na Slici 16. Iz slike se ističu vrpce uzoraka mini-prep kao i midi-prep za konstrukte pshuttle-cmv-tlr5 wt-6 i pshuttle-cmv-tlr5 N592S-4 koje odgovaraju produktima PCR reakcije od 316 parova baza što je bila potvrda uspješne ligacije kao i orijentacije inserta. 42

Slika 15: Produkti reakcije PCR: plazmidi uzoraka mini-prep pshuttle-cmv-tlr5 wt-6 (1), pshuttle-cmv- TLR5 N592S-4 (2), pshuttle-cmv-tlr5 wt-3 (5) i pshuttle-cmv-tlr5 wt-10 (6) uzoraka midi-prep pshuttle- CMV-TLR5 wt-6 (3) i pshuttle-cmv-tlr5 N592S-4 (4), marker molekulskih masa (M). Gel sadrži produkt PCR reakcije veličine 316 parova baza DNA na jažicama; 1,2,3,4 što je potvrda za uspješnu ligaciju inserta za pshuttle-cmv-tlr5 wt-6 i pshuttle-cmv-tlr5 N592S-4. 4.6. Homologna rekombinacija u svrhu dobivanja rekombinantnih virusa U svrhu dobivanja rekombinantnog virusa homolognom rekombinacijom između konstrukta pshuttle-cmv-tlr5 i genoma Ad5, stanična linija BJ5183-AD-1 transformirana je konstruktima pshuttle-cmv-tlr5 wt-6 i pshuttle-cmv-tlr5 N592S-4, prethodno lineariziranih restrikcijskom endonukleazom PmeI postupkom elektroporacije. Rekombinantni virus konstruiran je in vivo manipulacijom Ad5 genoma kao plazmida u bakteriji Escherichia coli pri čemu je došlo do homologne rekombinacije između vektora pshuttle-cmv-tlr5 i adenovirusnog vektora padeasy-1 u bakterijskom soju Escherichia coli, BJ5183-AD-1 kojoj posreduju lijeva ruka (engl. Left arm) i desna ruka (engl. Right arm) homologije. Prekonoćne bakterijske kulture 20 odabranih klonova uzgojene su u tekućoj hranjivoj podlozi LB u svrhu izolacije plazmida pshuttle-cmv-tlr5 wt-6 i pshuttle-cmv-tlr5 N592S-4 kojim su bakterije BJ5183-AD-1 prethodno transformirane. Nakon izolacije plazmidnih DNA metodom mini-prep na spektrofotometru su očitane masene koncentracije izolirane DNA te izračunate njihove srednje masene koncentracije (Tablica 8). 43

Tablica 8: Na spektrofotometru očitane masene koncentracije izolirane DNA 20 uzoraka Ad5-TLR5. Uzorak γ (ng/µl) uzorak γ (ng/µl) Ad5-TLR5 wt-1 349,6 Ad5-TLR5 N592S-1 314,7 Ad5-TLR5 wt-2 372,6 Ad5-TLR5 N592S-2 301,0 Ad5-TLR5 wt-3 282,1 Ad5-TLR5 N592S-3 239,7 Ad5-TLR5 wt-4 430,7 Ad5-TLR5 N592S-4 264,9 Ad5-TLR5 wt-5 322,6 Ad5-TLR5 N592S-5 189,9 Ad5-TLR5 wt-6 432,1 Ad5-TLR5 N592S-6 470,9 Ad5-TLR5 wt-7 401,0 Ad5-TLR5 N592S-7 354,7 Ad5-TLR5 wt-8 337,9 Ad5-TLR5 N592S-8 420,9 Ad5-TLR5 wt-9 334 Ad5-TLR5 N592S-9 336,36 Ad5-TLR5 wt-10 169,5 Ad5-TLR5 N592S-10 378,2 U svrhu amplifikacije konstrukata Ad5-TLR5 u bakteriji Escherichia coli, bakterije DH5-α su kemijski transformirane plazmidnom DNA. Prekonoćne bakterijske kulture 8 kolonija uzgojene su u tekućoj LB hranjivoj podlozi radi izolacije plazmida. Nakon izolacije plazmidnih DNA očitana masena koncentracija za konstrukt prve kolonije Ad5-TLR5 wt-3 je iznosila 1019,05 ng/µl, a druge kolonije konstrukta Ad5-TLR5 wt-3 1094,78 ng/µl, prve kolonije konstrukta Ad5-TLR5 wt- 8 1005,75 ng/µl, a druge kolonije konstrukta Ad5-TLR5 wt-8 1025,22 ng/µl, prve kolonije konstrukta Ad5-TLR5 N592S-4 1011,98 ng/µl, a druge kolonije konstrukta Ad5-TLR5 N592S-4 1110,55 ng/µl, 1036,57 ng/µl za uzorak prve kolonije konstrukta Ad5-TLR5 N592S-3 dok je druge kolonije konstrukta Ad5-TLR5 N592S-3 iznosila 1005,81 ng/µl. Svih 8 uzoraka potom je podvrgnuto restrikciji pomoću restrikcijske endonukleaze EcoRV, a produkti restrikcije provjereni su elektroforezom na 0,8%-tnom agaroznom gelu (Slika 17). Na gelu su uočene vrpce koje odgovaraju padeasy-1 (gornjih 6 vrpci) i plazmidu pshuttle-cmv (donje dvije vrpce). Vrpce koje odgovaraju padeasy-1 veličine su 11560 bp, 7637 bp, 4545 bp, 3828 bp, 2617 bp, 2052 bp i 1238 bp. Vrpce koje odgovaraju plazmidu Shuttle-CMV veličine su 7741 bp, 1383 bp, 1258bp. 44

Slika 16: Elektroforeza na agaroznom gelu uzoraka Ad5-TLR5 wt-3 (1, 2), Ad5-TLR5 wt-8 (3, 4), Ad5- TLR5 N592S-3 (5, 6), Ad5-TLR5 N592S-4 (7, 8) tretiranih s restrikcijskom endonukleazom EcoRV. Na agarozni gel nanesen je i marker molekulskih masa (M). 4.7. Povrda uspješne homologne rekombinacije U svrhu potvrde uspješne homologne rekombinacije između BJ5183-AD-1 stanica i konstrukta pshuttle-cmv-tlr5 wt odnosno pshuttle-cmv-tlr5 N592S provedena je restrikcijska reakcija s restrikcijskom endonukleazom PacI za uzorke prvih kolonija Ad5-TLR5 wt-3 i Ad5-TLR5 N592S-3. Produkti restrikcije naneseni su na 1%-tni agarozni gel, a dobivene vrpce odgovarale su veličinama od >30 kb i 4,5 kb (Slika 18). Slika 17: Elektroforeza na agaroznom gelu uzoraka Ad5-TLR5 wt-3 (1, 2) i Ad5-TLR5 N592S-3 (3, 4) tretiranih s restrikcijskom endonukleazom PacI. Na agarozni gel nanesen je i marker molekulskih masa (M). 45

4.8. Dobivanje, umnažanje i pročišćavanje virusnih čestica Ad5-TLR5 wt i Ad5-TLR5 N592S U svrhu dobivanja adenovirusnih čestica, prethodno linearizirani konstrukti Ad5-TLR5 wt i Ad5- TLR5 N592S restrikcijskom endonukleazom PacI transfekcijom su uneseni u kulturu bubrežnih stanica ljudskog embrija, HEK-293. Komplementacijom u staničnoj liniji HEK 293 stvaraju se virusne čestice zato što su rekombinantni vektori deficijentni u regiji E1A koji su odgovorni za replikaciju virusnog genoma. Nadalje, stanična linija HEK-293 omogućuje ekspresiju virusnih proteina kao i sklapanje virusnih čestica koje oslobađanjem iz inficiranih stanica imaju mogućnost inficiranja drugih stanica. Nakon učinjene transfekcije dolazi do umnažanja plazmidne DNA. Nakon toga slijedi postupak infekcije stanica HEK-293, virusnim lizatom dobivenim nakon 48 sati inkubacije stanica HEK-293 inficiranim s 10 µl, 20 µl, 50 µl i 100 µl adenovirusa. Transfekcija stanica HEK 293 s adenovirusom u čijoj se okosnici nalazi divlji tip gena koji kodira gen za TLR5 vrši se u 40 plastičnih posuda koje su dostigle 70-80% konfluentnosti. Postupak je ponovljen u drugih 40 plastičnih posuda sa stanicama HEK293, ali sada s adenovirusom u čijoj se okosnici nalazi gen koji kodira za TLR5 N592S. Nakon 72 sata inkubacije pri 37 C 50% stanica je zalijepljeno, a 50% odljepljeno s vidljivim citopatološkim učinkom. Laganim lupkanjem boce, stanice se odvoje od podloge i njihov sadržaj skupljen. Sadržaj epruveta potom je centrifugiran, a talog stanica s virusnim česticama koristio se u svrhu pročišćavanja adenovirusnog vektora. Ultracentrifugiranje na jastučiću celzijevog klorida (Slika 19) i kasnije u gradijentu cezijevog klorida (Slika 20) omogućilo je pročišćavanje adenovirusnog vektora iz dobivenog lizata u svrhu uklanjanja ostataka stanica kao i praznih virusnih kapsida. Slika 18: Adenovirusna vrpca nakon prvog centrifugiranja 46

Slika 19: Adenovirusna vrpca nakon drugog centrifugiranja U svrhu određivanja koncentracije adenovirusnih čestica u suspenziji pročišćenih adenovirusa mjerenjem apsorbancije pri 260 nm u razrjeđenju virusnog pripravka od 10x, odnosno 20x, dobiveni su rezultati prikazani u Tablici 9. Određivanje ukupnog broja virusnih čestica je važan podatak u kontroli kvalitete pročišćenih replikacijski nesposobnih adenovirusa. Ova spektrofotometrijska metoda se koristi samo za pročišćeni virus, a apsorbancija treba biti između 0,02 i 0,15. Tablica 9: Ukupan broj virusnih čestica u volumenu od 1 ml dobiven mjerenjem apsorbancije pri 260 nm pri virusnim razrjeđenjima 10 x i 20 x. Virus A 260 R N Ad5-TLR5 wt 0,091 10 1,00 x 10 12 Ad5-TLR5 wt 0,073 20 1,606 x 10 12 Ad5-TLR5 N592S 0,151 10 1,661 x 10 12 Ad5-TLR5 N592S 0,075 20 1,650 x 10 12 47

4.9. Unos gena TLR5 wt i TLR5 N592S u humane stanice pluća U svrhu infekcije stanične linije A549, WI38, H1299 inficirane su virusnim česticama tako što je u bunariće za svaku staničnu liniju dodano 5 000, 10 000 odnosno 30 000 virusnih čestica. Infekcija stanica u jednom slučaju provedena je konstruktom Ad5-TLR5 wt, a u drugom s konstruktom Ad5- TLR5 N592S. 4.10. Western blot analiza ekspresije proteina TLR5 U svrhu dokazivanja uspješnosti infekcije staničnih linija A549, WI38, H1299 virusnim česticama provedena je metoda western blot. Elektroforeza na poliakrilamidnom gelu provedena je za sedam uzoraka: neinficirani uzorak, uzorak inficiran s 5 000 virusnih čestica Ad5-TLR5 wt, uzorak inficiran s 10 000 virusnih čestica Ad5-TLR5 wt, uzorak inficiran s 30 000 virusnih čestica Ad5-TLR5 wt, uzorak inficiran s 5 000 virusnih čestica Ad5-TLR5 N592S, uzorak inficiran s 10 000 virusnih čestica Ad5-TLR5 N592S, uzorak inficiran s 30 000 virusnih čestica Ad5-TLR5 N592S. Potom se izvršila detekcija proteinskih vrpci (Slike 21, 22, 23). Slika 20: Analiza ekspresije proteina TLR5 u staničnoj liniji A549, metodom Western blot pomoću sekundarnog anti-mišjeg imunoglobulina G antitijela s konjugiranom peroksidazom. Marker proteinskih masa (M), neinficirani uzorak (NI), uzorak inficiran s 5 000 virusnih čestica Ad5-TLR5 wt (WT 5000), uzorak inficiran s 10 000 virusnih čestica Ad5-TLR5 wt (WT 10 000), uzorak inficiran s 30 000 virusnih čestica Ad5-TLR5 wt (WT 30 000), uzorak inficiran s 5 000 virusnih čestica Ad5-TLR5 N592S (N592S 5000), uzorak inficiran s 10 000 virusnih čestica Ad5-TLR5 N592S (N592S 10 000), uzorak inficiran s 30 000 virusnih čestica Ad5-TLR5 N592S (N592S 30 000). 48

Slika 21: Analiza ekspresije proteina TLR5 u staničnoj liniji H1299, metodom Western blot pomoću sekundarnog anti-mišjeg imunoglobulina G antitijela s konjugiranom peroksidazom. Marker proteinskih masa (M), neinficirani uzorak (NI), uzorak inficiran s 5 000 virusnih čestica Ad5-TLR5 wt (WT 5000), uzorak inficiran s 10 000 virusnih čestica Ad5-TLR5 wt (WT 10 000), uzorak inficiran s 30 000 virusnih čestica Ad5-TLR5 wt (WT 30 000), uzorak inficiran s 5 000 virusnih čestica Ad5-TLR5 N592S (N592S 5000), uzorak inficiran s 10 000 virusnih čestica Ad5-TLR5 N592S (N592S 10 000), uzorak inficiran s 30 000 virusnih čestica Ad5-TLR5 N592S (N592S 30 000). Slika 22: Analiza ekspresije proteina TLR5 u staničnoj liniji WI38, metodom Western blot pomoću sekundarnog anti-mišjeg imunoglobulina G antitijela s konjugiranom peroksidazom. Marker proteinskih masa (M), neinficirani uzorak (NI), uzorak inficiran s 5 000 virusnih čestica Ad5-TLR5 wt (WT 5000), uzorak inficiran s 10 000 virusnih čestica Ad5-TLR5 wt (WT 10 000), uzorak inficiran s 30 000 virusnih čestica Ad5-TLR5 wt (WT 30 000), uzorak inficiran s 5 000 virusnih čestica Ad5-TLR5 N592S (N592S 5000), uzorak inficiran s 10 000 virusnih čestica Ad5-TLR5 N592S (N592S 10 000), uzorak inficiran s 30 000 virusnih čestica Ad5-TLR5 N592S (N592S 30 000). 49