UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO-MATEMATČIKI FAKULTET NIŠ DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU Antimikrobna i antioksidativna aktivnost etarskog ulja biljne vrste Artemisia vulgaris L. MASTER RAD Student: Jelena Cvetković 47 Mentor: prof. dr. Tatjana Mihajilov-Krstev Niš, 2016.
UNIVERSITY OF NIŠ FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS DEPARTMANT OF BIOLOGY AND ECOLOGY Antimicrobial and antioxidant activity of essential oil of plant species Artemisia vulgaris L. MASTER THESIS Candidate: Jelena Cvetković 47 Menthor: prof. dr. Tatjana Mihajilov-Krstev Niš, 2016.
ZAHVALA Master rad pod nazivom Antimikrobna i antioksidativna aktivnost etarskog ulja biljne vrste Artemisia vulgaris rađen je pod mentorstvom prof. dr. Tatjane Mihajilov-Krstev, kojoj se zahvaljujem na stručnoj pomoći, ukazanom poverenju i posvećenom vremenu. Zahvaljujem se i članovima komisije na učešću u oceni i odbrani ovog master rada. Zahvaljujem se i prijateljima, kolegama i rodbini, a posebnu zahvalnost dugujem svojoj porodici na neizmernoj podršci, strpljenu i razumevanju tokom studiranja.
SAŽETAK Cilj ovog rada je bio ispitivanje antimikrobne i antioksidativne aktivnosti etarskog ulja biljne vrste Artemisia vulgaris L. Nadzemni deo ove biljne vrste je prikupljen na početku cvetanja, tokom jula i avgusta 2013. godine, jer se tada očekuje najveći sadržaj ulja. Iz osušenih i samlevenih nadzemnih delova biljne vrste A. vulgaris destilovano je etarsko ulje u aparatu po Clavenger-u. Etarsko ulje je bilo bledo žute boje, a sadržaj ulja je bio 0,48% (v/w) (d=0,7364 µg/µl). Antimikrobna aktivnost etarskog ulja je ispitivana mikrodilucionom metodom. Kao test organizmi uzeti su patogeni bakterijski sojevi iz grupe Gram (+) i Gram (-) bakterija. Inhibitorne i baktericidne koncentracije etarskog ulja su bile u opsegu od <0,074 do 2,36 µg/ml (MIC) i <0,074 do 4,72 µg/ml (MBC) protiv Gram (-) bakterija i od <0,074 do 2,36 µg/ml (MIC) i <0,074 do 36,82 µg/ml (MBC) protiv Gram (+) bakterija. Antioksidativna aktivnost etarskog ulja je ispitivana uz pomoć DPPH i ABTS testa. Etarsko ulje A. vulgaris je pokazalo relativno dobru antioksidativnu aktivnost. IC 50 vrednost etarskog ulja u DPPH testu je bila 19,48 mg/ml, dok je za BHA i vitamin C bila 0,093 mg/ml i 0,054 mg/ml. Efektivne koncentracije u ABTS testu su bile od 1,43 mg VitC/g, i od 26,43 mg/ml etarskog ulja biljne vrste A. vulgaris. Ključne reči: Artemisia vulgaris, etarsko ulje, antimikrobna aktivnost, antioksidativna aktivnost
SUMMARY The aim of this paper is the examination of the antimicrobial and antioxidant activity of the essential oil of a plant spacies Artemisia vulgaris L. The plant mentioned is collected during July and August 2013, at the very beginning of the process of blooming because the the expected level of the essential oil is at that moment the greatest. The essential oil is distilled of dried and milled overhed parts od A. vulgaris species. The mentioned process is done in the device of the Clavenger type. The essential oil was pale yellow in color, oil content was 0,48% (v/w) (d=0,7364 µg/µl). The antimicrobial activity of the essential oil was examined with the use the microdilution method. Some pathogenic bacterial strains from the group Gram (+) and Gram (-) bacteria were taken as test organisms. The inhibitory and bactericidal concentrations of essential oil were in the range from <0,074 to 2,36 µg/ml (MIC) and <0,074 to 4,72 µg/ml (MBC) against Gram (-) bakteria and from <0,074 to 2,36 µg/ml (MIC) and <0,074 to 36,82 µg/ml (MBC) against Gram (+) bakteria. Antioxidant activity of essential oil was evaluated using DPPH and ABTS tests. The essential oil of A. vulgaris showed a relatively good antioxidant activity. The IC 50 value of the essential oil in the DPPH test was 19.48 mg/ml, while for the BHA and vitamin C was 0.093 mg/ml and 0.054 mg/ml. Results in the ABTS test show effective concentrations of 1.43 mg VitC/g and a concentration of 26.43 mg/ml of A. vulgaris oil. Key words: Artemisia vulgaris, essential oil, antimicrobial activity, antioxidant activity
SADRŽAJ 1.UVOD... 1 2. OPŠTI DEO... 2 2.1. Karakteristike familije Asteraceae... 2 2.2. Karakteristike roda Artemisia... 2 2.3. Biljna vrsta Artemisia vulgaris... 3 2.4. Etarsko ulje... 4 2.5. Mikroorganizmi... 4 2.5.1. Bakterije... 5 2.5.2. Patogenost bakterija... 5 2.5.3. Glavne osobine nekih patogenih bakterija... 5 2.6. Antioksidansi... 8 3. CILJ RADA... 10 4. MATERIJAL I METODE... 11 4.1. Biljni materijal... 11 4.1.1. Dobijanje etarskog ulja... 11 4.2. Metode za određivanje antioksidativne aktivnosti etarskog ulja biljne vrste A. vulgaris... 12 4.2.1. DPPH metoda... 12 4.2.2. ABTS metoda... 12 4.3. Testiranje antimikrobne aktivnosti etarskog ulja biljne vrste A. vulgaris... 13 4.3.1. Bakterijske kulture... 13 4.3.2. Mikrodiluciona metoda... 13 4.3.3. Statistička obrada podataka... 14 5. REZULTATI I DISKUSIJA... 15 5.1. Hemijski sastav etarskog ulja biljne vrste A. vulgaris... 15 5.2. Antioksidativna aktivnost etarskog ulja biljne vrste A. vulgaris... 16 5.3. Antimikrobna aktivnost etarskog ulja biljne vrste A. vulgaris... 16 6. ZAKLJUČAK... 20 7. LITERATURA... 21 8. BIOGRAFIJA... 24 9. KLJUČNA DOKUMENTACIJA...25
1. UVOD Po mišljenju naučnika, istorija lekovitih suptanci, dobijenih iz biljaka stara je koliko i ljudski rod, pa i više, jer je poznato da su se obolele životinje često instiktivno hranile određenim biljkama koje nisu njihova prirodna svakodnevna hrana i tako se lečile (Matović, 2000). Najstarija pisana svedočenja o lekovitim biljkama potiču iz vremena od oko 6000 godina p.n.e. (Matović, 2000). U novije vreme istraživačke metode se sve više usavršavaju, otkrivaju se nove materije, od kojih neke predstavljaju prekretnicu u medicine i farmaciji (Tucakov, 1990). Danas je poznato oko 60 000 lekovitih i 18 000 aromatičnih biljaka (Kitić, 2010). Izuzetno prirodno bogatstvo Srbije se između ostalog ogleda i u oko 876 lekovitih biljnih vrsta (Matović, 2000). Poslednjih godina su od strane naučne javnosti postavljana mnoga pitanja o bezbednosti upotrebe sintetičkih jedinjenja što je povećalo interesovanje za upotrebu prirodnih priozvoda i detaljnije proučavanje biljaka (Jovanović, 2011). U ovom radu je ispitivano etarsko ulje biljne vrste Artemisia vulgaris L. kao potencijalnog prirodnog izvora antimikrobnih i antioksidativnih jedinjenja, u cilju dobijanja neškodljivih farmakoloških proizvoda. 1
2. OPŠTI DEO 2.1. Karakteristike familije Asteraceae Najbrojnija familija u okviru klase Magnoliopsida, je porodica Asteraceae kojoj pripada oko 1/3 vrsta. U okviru klase dikotiledonih skrivenosemenica najobimnija je familija glavočika (Asteraceae, Compositae), a ujedno i jedina familija reda Asterales. Asteraceae su ogromna kosmopolitska familija od 920 rodova i 19 000 vrsta. Asteraceae su većinom zeljaste jednogodišnje ili višegodišnje biljke, ređe šiblje i drveće, jastučaste forme itd. Najstariji foslilni ostaci datiraju iz doba oligocena. Familija Asteraceae čini posebnu prirodnu celinu i nemoguće ih je podeliti u posebne familije, pa čak ni u podfamilije. Danas najveći broj botaničara glavočike deli u dve podfamilije, na osnovu gradje glavičaste cvasti, kao i nekih drugih osobina: Asteroideae (Tubuliflorae) i Cichorioideae (Liguflorae). Podfamilija Asteroideae (Tubuliflorae) cvasti su sastavljene samo iz cevastih cvetova, ili su po obodu jezičasti a samo u sredini cevasti. Kod ove podfamilije nisu zastupljene mlečne cevi. Podfamilija Cichorioideae (Liguflorae) glavica je sastavljena samo iz jezičastih cvetova i sastoje se iz pet listića. Člankovite mlečne cevi se nalaze u vegetativnim delovima (Tatić, 2002). 2.2. Karakteristike roda Artemisia Familiji Asteraceae pripada rod Artemisia koji obuhvata preko 200 vrsta. Najveći broj vrsta se javlja u stepama Evrope, Azije, kao i u stepskim oblastima Severne i Srednje Amerike. U Srbiji je pronađeno 9 vrsta. Predstavnici ovog roda su zeljaste ili polužbunaste biljke. Listovi su naizmenično raspoređeni, retko celi, najčešće su jednostavno ili više puta perasto deljeni (Gajić, 1975). Glavice su često viseće, cilindrične ili loptaste, grupisane u metličaste ili grozdaste cvasti. Plod je ahenija po obliku cilindrična ili spljoštena (Gajić, 1975). 2
Najznačajnije vrste roda Artemisia su: A. petrosa, A. vulgaris, A. apsinthium, A. maritima, A. pontica, A. lobelii, A. annua, A. campestris, A. scoparia. 2.3. Biljna vrsta Artemisia vulgaris Narodni naziv vrste je komonika, trnomet, crni pelin, divlji pelin (Životić, 1982). Artemisia vulgaris je višegodišnja biljka koja dostiže visinu od 50 150 (200) cm sa granatim rizomom. Stabljika je uspravna u gornjem delu vunasto maljava. Listovi su sa gornje strane tamnozeleni, najčešće goli dok su sa donje strane pokriveni dlakama. Listovi su dugački 5-10 cm, u gornjem i srednjem delu stabljike su jednostavno perasto deljeni, a u donjem delu dvostruko perasto deljeni. Mnogobrojne glavice sa kratkim drškama, uspravne ili malo viseće sakupljene su u jako granatim metličastim cvastima. Listići involukruma su slabo vunasto dlakavi, spoljašnji listići su lancetasti, šiljati dok su unutrašnji listići involukruma duguljasti i tupi sa širokum kožastim obodom. Cvetna loža je gola. Cvetovi su žuti ili ružičastosmeđe boje, skoro goli. Središnji cvetovi su dvopolni, a obodni cvetovi su ženski. Ahenija je cilindrična (Gajić 1975). Slika 2. 1. Artemisia vulgaris L. Artemisia vulgaris nastanjuje staništa kao sto su oranice, krompirišta, kukuruzišta, požarišta, javlja se i pored puteva, pruga, oko kuća. Može se naći u Evropi, Aziji, Severnoj Americi (Gajić, 1975). 3
Komonika sadrži etarsko ulje, gorke materije, apsintin, anapsintin i bere se od maja do avgusta (Životić, 1982). 2.4. Etarsko ulje Aromatične biljke su biljke koje sadrže etarska ulja. Esencijalna (etarska) ulja lokalizovana su u različitim delovima biljaka i daju im karakterističnu aromu i miris. To su uljaste bezbojne ili slabo obojene, bistre tečnosti, koje lako isparavaju (polučvrsti i čvrsti preparati), rastvaraju se u nepolarnim organskim rastvaračima (Kovačević, 2004). Iz biljnih organa se može vršiti izolacija etarskih ulja na više načina (Kitić, 2010). Sastav etarskog ulja u različitim delovima iste biljke može biti sličan ali i potpuno različit. Primećeno je da je količina ulja različita kod različitih vrsta biljaka ali i da varira i između jedinki iste vrste. Faktori koji utiču na sastav i količinu etarskog ulja su: genotip, ekološki faktori, vreme prikupljanja materijala, način obrade biljne sirovine i način izolacije etarskog ulja (Kovačević, 2004). Etarska ulja su uglavnom produkti viših biljaka, koje su raspoređene u preko pedeset familija. Najpoznatije su aromatične biljke familija Asteraceae, Lamiaceae, Apiaceae, Rutaceae, Myrtaceae i Lauraceae (Jovanović, 2011). 2.5. Mikroorganizmi Mikroorganizmni su kosmopolitski organizmi. Mogu biti sitniji od 0.1 mm, mikroskopskih veličina, ne mogu da se vide golim okom, ali obuhvataju i organizme koji dostižu makroskopske razmere koji se mogu videti golim okom. Mikroorganizmi obuhvataju: viruse, bakterije, alge, gljive, lišaje i protozoe. Značajna osobina svih mikroorganizama, pored činjenice da su rašireni na svakom mestu planete Zemlje, zasnovana je na njihovim mikroskopskim razmerama, brzom metabolizmu, brzom razmožavanju, raznolikosti enzima i biohemiskih procesa (Petrović, 2007). 2.5.1. Bakterije Bakterije su prokariotski mikroorganizmi, spadaju u najsitnije organizme celularne građe. Iako su jednostavne građe sposobni su da obavljaju sve funkcije neophodne za život: disanje, ishranu, rast, razmnožavanje i dr. Pored četiri osnovna oblika bakterijske ćelije: loptast, štapićast, 4
spiralan i končast, javljaju se i različiti izvedeni oblici. Izvedeni oblici su rezultat specifičanog rasporeda bakterijskih ćelija nakon deobe. Najveći broj bakterija obrazuje jedna ćelija, međutim ima i bakterija koje predstavljaju končaste ili grozdaste skupine velikog broja ćelija - kolonije. Bakterije naseljavaju sva raspoloživa staništa, zahvaljujući pre svega ogromnoj metaboličkoj aktivnosti (Petrović, 2007). 2.5.2. Patogenost bakterija Bakterije se prema sposobnosti da izazovu oboljenje dale na patogene, uslovno patogene i apatogene bakterije. Patogen mikroorganizam je svaki mikroorganizam koji može biti uzrok nekog oboljenja, a sama sposobnost izazivanja oboljenja patogenost. Uslovno patogene bakterije ili oportunisti u normalnim okolnostima ne izazivaju bolesti, već samo kada se za to stvore posebni uslovi. Većina bakterijskih vrsta je apatogena, tj. ne izaziva patološke procese (Švabić-Vlahović, 2005). Stepen patogenosti mikroorganizma naziva se virulencija. Virulencija je rezultat mogućnosti mikroorganizma da adherira za domaćina, izvrši invaziju i/ili luči toksine. Sve karakteristike koje omogućavaju uzorkovanje oboljenja su faktori virulencije. Mikroorganizmi prodiru u organizam na različite načine ali prvi korak u ovom procesu je adhezija (pričvršćivanje), zatim invazija i kolonizacija (prodiranje u tkivo domaćina i umnožavanje u velikom broju, širenje dalje u organizam). Da li će mikroorganizam izazvati oboljenje ili ne zavisi od osobina samog mikroorganizma, tj od njegove patogenosti, odnosno virulencije (Petrović, 2007). 2.5.3. Glavne osobine nekih patogenih bakterija Metoda bojenja bakterija po Gram-u je dobila naziv po Cristian Gram 1884. godine koji je prvi uveo ovu metodu. Bojenje ovom metodom je složeno jer se koriste više od jedne boje. Prema sastavu ćelijskog zida i bojenja po Gram-u bakterije se dele na: Gram-pozitivne i Gram-negativne bakterije. Gram-pozitivne i Gram-negativne bakterije razlikuju, osim po sastavu ćelijskog zida i prema: osetljivosti na antibiotike, lizozim, količini lipida u ćelijskom zidu, zahtevima za hranljivim materijama i dr. (Mihajilov-Krstev, 2008). 5
U ovom radu su testirane sledeće Gram-negativne bakterije: Escherichia coli Escherichia coli je Gram-negativna bakterija, štapićastog oblika, pokretni fakultetivno anaerobni bacil, sa peritrihijalnim flagelama. Raspoređeni su pojednidanačno ili u nepravilnim skupinama. Escherichia coli je normalni deo flore digestivnog trakta čoveka i životinja (Švabić- Vlahović, 2005). Neophodna je za procese varenja i sintezu nekih supstanci (vitamini B12 i K) (Jovanović, 1997). To je uslovno patogena bakterija (oportunista). Escherichia coli se ubraja u prilično otpornu bakteriju. Na temperaturei ispod nula je otporna, dok je temperatura od 60 C ubija za 15-20 min (Jovanović, 1997). Najčešće izaziva infekcije urinarnog trakta, sepsu i meningitis (Švabić-Vlahović, 2005). Proteus mirabilis Vrste roda Proteus su Gram-negativni izrazito pokretni bacili. Široko su rasprostranjeni u prirodi. Značajno mesto zauzimaju među bakterijama koje učestvuju u razgradni organskih materija. Rod obuhvata sledeće vrste bakterija: P. mirabilis, P. vulgaris, P. myeofociens, P. penneri. Dobro se razmnožavaju na hranljivim podlogama. Proteus mirabilis zbog izrazite pokretljivosti na čvrstim podlogama ispoljava efekat rojenja, karakterističan rast u naizmeničnim ciklusima migracije i konsolidacije, stvarajući seriju koncentričnih krugova oko mesta inokulacije. P. mirabilis izaziva najčešće infekcije urinarnog trakta (Švabić-Vlahović, 2005). Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa - Gram-negativni štapići, poseduju fimbrije, nemaju kapsulu i ne stvaraju spore. Živi u prirodi, najčešće u površinskim vodama i zemlji. Veoma je otporna bakterija i uzročnik je brojnih infekcija. Može da kolonizuje digestivni trakt ili druge regione kao oportunista. Koristi različite izvore ugljenika i energije, raste u aerobnim uslovima i na promenljivim temperaturama. Potrebe ove bakterije za hranljivim sastojcima su minimalne pa se zato nalaze na mestima gde drugih mikoorganizama ima manje (Švabić-Vlahović, 2005). Klebsiella pneumoniae / Klebsiella oxytoca Rod Klebsiella obuhvata četiri vrste: K. pneumoniae, K. oxytoca, K. terrigena, K. planticola. To su Gram-negativni bacilli, nepokretni, sa izraženom kapsulom. Široko su rasprostranjeni u prirodi. Prisutne su u zemlji, vodi i intestinalnom traktu ljudi i životinja. 6
Predstavnici ovog roda se obično sreću kao uzročnici oboljenja kod hospitalizovanih bolesnika sa oslabljenim imunitetom (Švabić-Vlahović, 2005). Enterobacter aerogenes Enterobacter aerogenes Gram-negativni štapići, fakultativno anaerobni, široko rasprostranjen u prirodi. Nalaze se u zemlji, vodi, otpadnim vodama, na biljkama i u intestinalnom traktu ljudi i životinja. Izazivaju oportunističke infekcije, najčešće u bolničkim uslovima. Javlja se kao uzročnik infekcija respiratornog i urinarnog trakta, opekotina i rana, ponekad meningitisa i sepse (Švabić-Vlahović, 2005). Shigella sonnei Šigele su pravi bacilli prečnika 0,5-0, 8 µm, dugi 2-3 µm, Gram-negativni striktno patogeni mikroorganizmi. Nepokretni su, poseduju fimpbrije, ne stvaraju spore ni vidljivu kapsulu. Shigella sonnei kasno fermentuje laktozu (za 3-4 dana) i manitol pozitivna je. Šigele spadaju u bakterije koje su osetljive na uslove sredine van organizma, naročito na kiselu sredinu. Nakon zasejavanja na hranljivim podlogama i inkubacije (18-24h) na 37 C izrastu kolonije koje su glatke, sjajne, laktoza negativne. Sigella sonnei, pored ovih kolonija formira i R-kolonije koje posle 3-4 dana postaju laktoza pozitivne (Švabić-Vlahović, 2005). Gram-pozitivne bakterije koje su testirane u ovom radu su sledeće: Staphylococcus aureus Predstavnici ovog roda su loptastog oblika, najčešće raspoređenih u vidu grozdastih formacija. Staphylococcus aureus je dobio ime po karakterističnom pigmentu koji kolonijama ove bakterije daje zlatnožutu boju. Izuzetno je otporna, može dugo da opstane van tela domaćina i široko je rasprostranjena u prirodi. Može da izazove oboljenja gotovo svih organa i tkiva čovekovog organizma. Produkuje beta-laktamaze i druge mehanizme rezistencije na antibiotike. Neke od bolesti koje Staphylococcus aureus može da izazove su: kožne infekcije, respiratorne infekcije, endokarditis, osteomijelitis (Švabić-Vlahović, 2005). Sarcina lutea Sarcina lutea je Gram-pozitivna koka, nepokretna. Ćelije formiraju pravilne pakete kubastog oblika. Može se naći u zemlji, vodi, vazduhu i deo je normalne flore kože sisara. U 7
oligotrofnom okruženju može da preživi duži vremenski period. Kod osoba sa oslabljenim imunitetom može da izazove infekciju kože (Ristić, 2013). Clostridium perfringens Clostridium perfringens je nepokretan, Gram-pozitivan bacil. U nepovoljnim uslovima formira sporu. U živom organizmu ima kapsulu koja se gubi presejavanjem na veštačkim hranilištima. Na čvrstim hranljivim podlogama formira glatke, svilenkasto-zute kolonije ravnih ivica. Sojevi C. perfingens produkuju najmanje 12 različitih toksina i antigena. Clostridium perfringens je otporniji na kisele i alkaline uslove od većine bakterija. Spore su otporne i u prirodi preživljavaju duže od deset godina (Švabić-Vlahović, 2005). Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes je Gram-pozitivni bacil, bez kapsule i ne stvara spore, poseduje flagele i pokretna je na sobnoj temperature ali ne i na 37 C. Dobro raste u aerobnim i mikroaerofilnim uslovima. U slobodnoj prirodi može da preživi više godina, kao i u zamrznutoj hrani. Postupci pasterizacije i dezinfekciona sredstva je efikasno ubijaju (Švabić-Vlahović, 2005). 2.6. Antioksidansi Slobodni radikali su molekuli ili delovi molekula koji imaju jedan ili više nesparenih elektrona u spoljašnjem elektronskom omotaču i oni su uzrok njihove visoke reaktivnosti. Usled uvećanja slobodnih radikala, kada njihova sinteza prevaziđe tzv. antioksidativne odbrane organizma dolazi do oksidativnog stresa. Oksidativni stres dovodi do promene u strukturi i funkciji ćelija, tkiva pa i kompletnog organizma. Savremena istraživanja pokazuju da je jedan od glavnih uzroka različitih bolesti oksidativni stres (dijabetes, maligna oboljenja, bolesti jetre, bubrega, kardiovaskularne bolesti, Alchajmerova bolest i druge teške bolesti). Na proizvodnju slobodnih radikala utiču požari, hemijska zagađenja, zračenje, pušenje, povećana koncentracija kiseonika, i dr. Antioksidansi su supstance koje imaju sposobnost da spreče nastanak ili da smanje efekte slobodnih radikala. Oni se dele na endogene (enzimski i neenzimski) i egzogene. Endogeni enzimski antioskidansi su: superoksid dismutaza (SOD), katalaza (CAT), glutation peroksidaze (GPx), a endogeni neenzimski su: vitamin E, vitamin C i dr. Egzogeni antioksidansi se unose 8
preko hrane i to mogu biti flavonoidi, omega-3 i omega-6 masne kiseline, metali i dr (Pešić, 2014). Značaj antioksidanasa dobijenih iz biljnog materijala je u poslednje vreme predmet istraživanja fitomedicine u cilju unapređenja zdravlja i zaštiti od raznih oboljenja. Iz nadzemnih i podzemnih delova nekih biljaka mogu se izolovati ekstrakti i etarska ulja koja imaju antioksidacione osobina. Na primer, kao snažan antioksidans se je pokazalo etarsko ulje Thymus serpyllum (Petrović et al., 2014). Za antioksidativnu aktivnost biljka su odgovorna uglavnom fenolna jedinjenja kao što su ruzmarinska kiselina, timol, karvakol i eugenol (Alma et al., 2003; Miguel et al., 2003; Nestorović- Živković, 2013; Stojković, 2014). 9
3. CILJ RADA Ciljevi ovog rada su definisani u sledećem: Prikupljanje biljne vrste Artemisia vulgaris sa lokaliteta opisanog u litearturi; Determinacija biljnog materijala; Izolovanje etarkog ulja postupkom hidrodestilacije metodom po Clevenger-u; Analiza objavljenih litaraturnih podataka o hemijskom sastavu etarskog ulja vrste Artemisia vulgaris; Ispitivanje antimikrobne aktivnosti izolovanog etarskog ulja uz pomoć mikrodilucione metode; Ispitivanje antioksidativne aktivnosti izolovanog etarskog ulja uz pomoć DPPH i ABTS metode; Statistička obrada dobijenih rezultata i njihovo poređenje sa podacima iz literature; Izvođenje zaključaka i tumačenje rezultata u skladu sa postojećom literaturom u svetlu opravdanosti upotrebe ove biljne vrste u tradicionalnoj medicini, kao i pronalaženja novih izvora antimikrobnih supstanci. 10
4. MATERIJAL I METODE 4.1. Biljni materijal Artemisia vulgaris L. je prikupljana tokom jula i avgusta 2013. godine, sa obale Gabrovačke reke i to na početku cvetanja jer se tada očekuje najveći sadržaj etarskog ulja. Biljni material je determinisan od strane dr Bojana Zlatkovića. Herbarski primerak je deponovan u herbarijumu na Prirodno-matematičkom fakultetu u Nišu (broj vaučera 7304). Biljni material je sušen u periodu od dve nedelje na sobnoj temperaturi do konstantne mase. Nakon sušenja materijal je usitnjen a zatim rađena dalja obrada. 4.1.1. Dobijanje etarskog ulja Iz 200 g osušenih i samlevenih nadzemnih delova vrste Artemisia vulgaris destilovano je etarsko ulje u aparatu tipa Clavenger u toku 2,5 h (slika 4.1.). Ulje je ekstrahovano etrom, a etarski ekstrakt sušen anhidrovanim Na 2 SO 4 (European Pharmacopoeia, 1983). Posle odvajanja sredstva za sušenje filtracijom, etar je uklonjen uz pomoć rotacionog vakuum uparivača bez zagrevanja, a etarsko ulje je čuvano u zatopljenim kivetama na 4 C do analize. Prinos etarskog ulja je izražen preko zapreminskih procenata (%) tj. v/w, obračunato u odnosu na 100 g suvog biljnog materijala (Jovanović, 2011). Slika 4.1. Destilator tipa Clevenger 11
4.2. Metode za određivanje antioksidativne aktivnosti 4.2.1. DPPH metoda Određivnje potencijalne antioksidativne sposobnosti DPPH testom rađeno je spektrofotometrijski, metodom po Blois-u (Blois, 1958). Napravljen je rastvor DPPH radikala u metanolu koncentracije tolike da apsorpcija na 517 nm bude malo preko jedinice (koncentracija oko 5 μm), kako bi u reakciji sa potencijalnim antioksidansom (ispitivanim jedinjenjima) pala na vrednosti od 0.2 do 0.8 (usled potrošnje DPPH u reakciji). Koncentracije rastvora ekstrakata i ulja se biraju na osnovu probnih testova sa rastvorom DPPH po datom postupku. Ekstrakti se rastvaraju do odgovarajuće koncentracije (najčešče 1 mg/ml) i serijom razblaženja se dobijaju odgovarajući radni rastvori čija se apsorbanca meri spektrofotometrijski uz pomoć UV-Vis Shimadzu, PC 1650 spektrofotometra. Kao reagens se koristi 2,2-difenil, 1-pikril hidrazil (DPPH) u metanolu u koncentraciji 0.04 mg/ml. Postupak se sastoji u tome da se u 1800 μl rastvora DPPH doda 200 μl ispitivanog rastvora, promućka se i ostavi da stoji 30 min u mraku na sobnoj temperaturi. Nakon 30 min boravka na tamnom mestu mere se apsorpcije rastvora na talasnoj dužini 517 nm. Posle postavljanja bazne linije meri se apsorpcija slepe probe odnosno samog DPPH rastvora (A0). U kivetu se sipa 200 μl uzorka i 1800 μl rastvora DPPH (A1). Sve koncentracije se rade u tri ponavljanja, a na isti način su tretirani vitamin C i BHA, poznati antioksidansi. Smanjenje apsorpcije DPPH se izražava u %, a izračunava se preko sledeće formule: % smanjenja apsorpcije (na 517 nm) = (A0 - A1) x 100 / A0 A0 - srednja vrednost apsorpcije slepe probe; A1 - srednja vrednost apsorpcije uzorka Koncentracije koje smanjuju apsorpciju DPPH rastvora za 50% (EC50) su dobijene sa kalibracione krive gde je predstavljena zavisnost apsorpcije DPPH rastvora na 517 nm i koncentracije za svaki uzorak i kontrole. Za određivanje ovih vrednosti korišćen je Origin 7.0 softver (Džamić, 2010). 4.2.2. ABTS metoda Za dobijanje radne smeše korišćeno je 19.2 mg ABTS-a i 5 ml rastvora K2O8S2. Rastvor K2O8S2 se dobija tako što se 33.3 mg K2O8S2 doda u destilovanu vodu do 50 ml. Smeša se 12
ostavi da stoji 12-16 sati u mraku na sobnoj temperaturi. Pre svake analize vrši se probno merenje na talasnoj dužini od 734 nm. Tek onda dolazi do mešanja 75 μl razblaženog uzorka i 3 ml smeše ABTS-a (Miller i Rice-Evans, 1997). Sadržaj je izmešan na vorteksu, a epruvete su pokrivene i ostavljene 30 minuta na 30º u vodeno kupatilo. Osnovni standard vitamina C dobijen je rastvaranjem 50 mg vitamina C (Mr 176.12 g/mol) u 1 ml destilovane vode. Zatim se uzima 10 μl rastvora vitamina C i dodaje se destilovana voda do 10 ml. Rastvor vitamina C čuva se na ledu. Koncentracije 0.1, 0.25, 0.5, 1, 1.25, 1.5 i 2 mg/ml su korišćeni za konstrukciju kalibracione krive. Za kalibracionu krivu mereno je 6, 15, 30, 60, 75, 90 i 120 μl standardnog rastvora vitamina C i smeše ABTS-a. Slepa proba, umesto 75 μl uzorka, sadrži 75 μl destilovane vode. Na spektrofotometru su merene apsorbance na talasnoj dužini 734 nm prema blanku. Apsorbanca slepe probe je prethodno merena prema destilovanoj vodi. Koncentracija antioksidanata u originalnim uzorcima u ppm (mg/l) ekvivalentima vitamina C (VitC) su izračunate tako što su koncentracije dobijene na osnovu kalibracione krive pomnožene sa faktorom razblaženja. 4.3. Testiranje antimikrobne aktivnosti 4.3.1. Bakterijske kulture Za ispitivanje antimikrobne aktivnosti korišćeni su sledeće bakterije izolovane iz urina i iz rana pacijenata: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella oxytoca, Enterobacter aerogenes, Proteus mirabilis i Staphylococcus aureus. Takođe, ispitivani su i sledeći sojevi bakterija: Gram-negativne bakterije: Escherichia coli ATCC 8739, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 i Shigella sonnei ATCC 25931 i Grampozitivne bacterije: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Clostridium perfringens ATCC 19404, Sarcina lutea ATCC 9341 i Listeria monocytogenes ATCC 7644. 4.3.2. Mikrodiluciona metoda Od prekonoćnih kultura ispitivanih test-sojeva mikroorganizama uzgajanih na hranljivom agaru je, u sterilnom fiziološkom rastvoru, napravljena suspenzija turbiditeta 0,5 McFarlanda koja sardži 1,5x10 8 CFU/ml (NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards, 2003). Nakon toga su, prema priloženom uputstvu, napravljene odgovarajuće podloge, Muller-Hinton bujon i Muller-Hinton agar. 13
Tečna pologa je razlivena po 10ml u sterilne epruvete i inokulisana sa po 133 µl pripremljene suspenzije mikroorganizama da bi se dobio konačan broj CFU od 2x10 6 po 1 ml. Zatim je napravljena serija duplih razređenja ulja u 10 % DMSO-u (dimetilsulfoksidu), u rasponu od 1:2 (50µl/ml) do 1:4096 (0,02µl/ml). U svako od 96 udubljenja mikrotitarske ploče (slika 4.2.) je unešeno po 90 µl inokulisane podloge i po 10 µl od svakog razređenja etarskog ulja. Ukupna zapremina u bunariću je iznosila 100 µl, a gustina suspenzije je bila 2x10 6 CFU/ml. Mikrotitarske ploče su inkubirane na 37 0 C u trajanju od 24h. Postupak je izveden u tri ponavljanja. Kao pozitivna kontrola je korišćen antibiotik tetraciklin. Slika 4.2. Mikrotitarska ploča sa inokulisanom hranljivom podlogom, tretirana serijom razblaženja etarskih ulja Mikrobiološki rast je očitavan dodavanjem po 20 µl 20 %-nog TTC-a (trifeniltetrazolijum hlorida). Koncentracija bunarića u kojoj nema vidljivog rasta predstavlja MIC. Sadržaj svih bunarića koji se nalaze ispred te koncentracije je prenesen na nove petri ploče sa odgovarajućom čvrstom podlogom (MH agar) i nakon inkubacije na 37 0 C u trajanju od 24h vršeno je brojanje poraslih kolonija. MBC se definiše kao koncentracija aktivne supstance koja ubija 99,9% bakterijskih ćelija. 4.3.3. Statistička obrada podataka Svi rezultati su statistički obrađeni analizom varijanse (ANOVA) sa sigurnošću od 95% (p 0,05). 14
5. REZULTATI I DISKUSIJA 5.1. Hemijski sastav etarskog ulja biljne vrste A. vulgaris Postupkom hidrodestilacije je iz biljne vrste A. vulgaris izolovano ulje bledo žute boje, gustine d=0,7364 µg/µl. Sadržaj etarskog ulja ove biljne vrste se je u ranijim istraživanjima kretao od 0,08 % (Blagojević et al., 2006) do 0,40 % (Judžentiene and Buzelyte, 2006), a u našem slučaju je bio 0,48 % (v/w). Podaci o sadržaju i hemijskom sastavu etarskog ulja biljne vrste A. vulgaris koji su pronađeni u dostupnoj literaturi sumirani su i prikazani u tabeli 5.1. Tabela 5.1. Glavne komponente prisutne u etarskom ulju A. vulgaris (iz dostupne literature) Lokalitet Sadrzaj ulja (% v/w) Srbija 0,29-0,08 Severna Litvanija 0,20-0,40 Rumunija - Turska 0,40 Pensilvanija Hemotip A - Glavne komponente (%) 1,8-cineol (28,9) Sabinen (13,7) β-tujon (13,5) hrizantenil acetat (23,6) trans-tujon (20,2) 1,8-cineol (17,6) germakren D (41,46) β-kariofilen (11,94) trans-fitol (8,66) α-tujon (56,13) β-tujon (12,02) kariofilen oksid (10,19) β-kariofilen (17,5) santolinatrien (10,0) 1,8-cineol (9,5) Literatura Blagojević et al., 2006 Judžentiene and Buzelyte, 2006 Burzo et al., 2008 Erel et al., 2012 Williams, 2012 Pensilvanija Hemotip B - α-tujon (24,3) β-kariofilen (16,5) (z)-β-farnezen (8,1) Williams, 2012 Analizom podataka iz dostupne literature ustanovljeno je da su dominantna jedinjenja u etarskom ulju A. vulgaris bila: tujoni i to od 13,50 do 68,15 % (Blagojević et al, 2006; Judžentiene and Buzelyte, 2006; Baykan Erel et al, 2012, Williams, 2012), zatim 1,8 cineol (Blagojević et al, 2006; Judžentiene and Buzelyte, 2006; Williams, 2012), β-kariofilen (Burzo et 15
al, 2008; Williams, 2012), kao i sabinen (Blagojević et al, 2006), hrizantenil acetat (Judžentiene and Buzelyte; 2006), germacren D i trans-fitol (Burzo et al, 2008), karofilen oksid (Baykan Erel et al, 2012), santolinatrien (Williams, 2012) i (z)-β-farnesen (Williams, 2012). Dosadašnja istraživanja na teritoriji Srbije su pokazala da su u sastav etarskog ulja A. vulgaris bila nazastupljenija jedinjenja: 1,8-cineol, sabinen, β-thujon (Blagojević et al, 2006). 5.2. Antioksidativna aktivnost etarskog ulja biljne vrste A. vulgaris Antioksidativn aktivnost biljne vreste A. vulgaris je ispitivana uz pomoć dve metode: DPPH metoda i ABTS metoda. Dobijeni rezultati su prikazani u tabeli 5.2. Tabela 5.2. Antioksidativna aktivnost etarskog ulja biljne vrste A. vulgaris DPPH test IC 50 ABTS test Koncentracije Rezultati A. vulgaris etarsko ulje (μl/ml) 26,23 38,00 μl/ml 1,84±0,063 A. vulgaris etarsko ulje (mg/ml) 19,48 26,43 mg/ml 1,43+0,049 BHA* (mg/ml) 0,093 0,10 mg/ml 2,66±0,005 *10-3 Vitamin C (mg/ml) 0,054 *BHA - butilat hidroksianizol Etarsko ulje A. vulgaris je pokazalo relativno dobru antioksidativnu aktivnost. IC 50 vrednost etarskog ulja u DPPH testu je bila 19,48 mg/ml, dok je za BHA i vitamin C bila 0,093 mg/ml i 0,054 mg/ml. Rezultati u ABTS testu pokazuju efektivne koncentracije od 1,43 mg VitC/g i od 26,43 mg/ml (38,00 μl/ml) etraskog ulja A. vulgaris. Poznato je da etarska ulja bogata u fenolnim komponentama kao što su timol, karvakrol i eugenol imaju veliki antioksidativni potencijal (Alma et al. 2003; Miguel et al., 2003), kakav je slučaj i sa uljem Artemisia absinthium (Mihajilov-Krstev et al., 2015). Međutim i ulja koja ne sadrže fenolne komponente mogu imati dobru antioksidativnu aktivnost (El-Massry et al., 2002; Juteau et al., 2002; Yildirim et al., 2004) što pokazuju i rezultati ovoga rada. 5.3. Antimikrobna aktivnost etarskog ulja biljne vrste A. vulgaris U dostupnoj literaturi je pronađeno vrlo malo podataka o antibakterijskom, antikandidijaznom i antifungalnom delovanju etarskog ulja biljne vrste A. vulgaris (Blagojević, 2006; Hiremath, 2011; Baykan Erel, 2012; Yang, 2013). Ti podaci su sumirani i prikazani u tabeli 5.3. 16
Tabela 5.3. Antimikrobna aktivnsot etarskog ulja A. vulgaris dobijena disk-difuzionom metodom (podaci iz literature) Metoda Rastvarač Ispitivani sojevi disk-difuziona metoda Etanol, 1:10 Escherichia coli 95 Salmonella enteritidis ATCC13076 Pseudomonas aeruginosa ATCC9027 Klebsiella pneumoniae ATCC10031 Staphylococcus aureus ATCC6558 Candida albicans ATCC10231 Aspergilus niger ATCC16404 Etanol, 1:30 Escherichia coli 95 Salmonella enteritidis ATCC13076 Pseudomonas aeruginosa ATCC9027 Klebsiella pneumoniae ATCC10031 Staphylococcus aureus ATCC6558 Candida albicans ATCC10231 Aspergilus niger ATCC16404 disk-difuziona metoda Metanol, 1:10 Pseudomonas aeruginosa ATCC27853 Escherichia coli ATCC29998 Escherichia coli ATCC11230 Zona inhibicije (mm) 16-36 0-37 13,5-35 13,5-34 13,5-29 0-40 0-31 0-25 0-18 0-27,5 0-26 0-18 0-20 0-21 23 7 7 Literatura Blagojević et al., 2006 Blagojević et al., 2006 Erel et al., 2012 Čisto ulje Staphylococcus aureus ATCC6538/P Staphylococcus epidermidis ATCC12228 Enterococcus typhimurium CCM5445 Enterococcus faecalis ATCC29212 Enterobacter cloacae ATCC13047 Escherichia coli ATCC29998 Escherichia coli ATCC11230 Candida albicans ATCC10239 23 13 10 14 8 11 10 20 Erel et al., 2012 disk-difuziona metoda dimetil sulfoksid (DMSO) Escherichia coli Staphylococcus aureus 8 20 4-20 Hiremath et al., 2012 disk-difuziona metoda dimetil sulfoksid (DMSO) Escherichia coli ATCC25922 Pseudomonas aeruginosa ATCC27853 Acinetobacter baumannii ATCC19606 Staphylococcus aureus ATCC6538\P 14 12,5 13 22 Yang et al., 2013 Rezultati iz dostupne literature, dobijeni disk-difuzionom metodom, pokazuju da su zone inhibicije rasta mikroorganizama od strane ulja A. vulgaris bile od 7 do čak 40 mm. U svim ispitivanjima su korišćeni sojevi E. coli i S. aureus i kada se uporede ti rezultati vidimo da su se za E. coli zone kretale od 7 mm (Erel et al., 2012) do 36 mm (Blagojević et al., 2006), a za S. aureus od 4 mm (Hiremath et al., 2012) do 29 mm (Blagojević et al., 2006). Izmerena zona inhibicije od 40 mm od strane ulja A. vulgaris je za C. albicans. Na žalost u svim radovima je korišćena neprecizna disk-difuziona metoda tako se ne može uočiti neka generalna prvailnost ili povezanost sa razlikama u hemijskom sastavu. Na primer, uočene su velike razlike u zonama inhibicije između ulja koja u sličnom procentu sadrže β-tujon (Blagojević et al., 2006; Erel et al., 2012). 17
U ovom radu je ispitivanje antimikrobne aktivnosti vršeno mnogo preciznijom mikrodilucionom metodom. Etarsko ulje biljne vrste A. vulgaris je pokazalo antimikorbnu aktivnost protiv svih testiranih sojeva u koncentracijama od 0,29-18,41 mg/ml. Dobijeni rezultati su sumirani i prikazanai u tabeli 5.4. Tabela 5.4. Antmikrobna aktivnost etarskog ulja biljne vrste Artemisia vulgaris i antibiotika protiv patogenih sojeva izolovanih iz humanog materijala i tipskih ATCC sojeva Bakterijski sojevi Etarsko ulje Etarsko ulje* Tetraciklin MIC MBC MIC MBC MIC MBC Izolati iz humanog materijala Izvor (µl/ml) (µl/ml) (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) Escherichia coli Urin 1,56 3,13 1,18 2,36 64,00 64,00 Proteus mirabilis Urin <0,10 0,20 0,074 0,15 2,00 4,00 Pseudomonas aeruginosa Urin 0,10 0,20 0,074 0,15 4,00 4,00 Klebsiella oxytoca Urin 3,13 6,25 2,36 4,72 4,00 8,00 Enterobacter aerogenes Urin <0,10 <0,10 <0,074 <0,074 1,00 1,00 Pseudomonas aeruginosa Rane <0,10 0,78 0,074 0,57 8,00 8,00 Staphylococcus aureus Rane <0,10 <0,10 <0,074 <0,074 0,25 1,00 Enterobacter aerogenes Rane 0,20 0,20 0,15 0,15 2,00 2,00 Escherichia coli Rane 0,39 3,13 0,29 2,36 16,00 16,00 Klebsiella oxytoca Rane <0,10 <0,10 <0,074 <0,074 2,00 8,00 ATCC MIC MBC MIC MBC MIC MBC Tipski sojevi broj (µl/ml) (µl/ml) (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) Escherichia coli 8739 0,39 0,78 0,29 0,57 0,50 2,00 Staphylococcus aureus 25923 1,56 3,13 1,18 2,36 1,00 1,00 Pseudomonas aeruginosa 9027 0,20 0,39 0,15 0,29 4,00 32,00 Clostridium perfringens 19404 0,39 6,25 0,29 4,72 4,00 4,00 Shigella sonnei 25931 0,39 6,25 0,29 4,72 4,00 4,00 Sarcina lutea 9341 3,13 25,00 2,36 18,41 0.25 0,50 Klebsiella pneumoniae 10031 0,39 25,00 0,29 18,41 1,00 1,00 Listeria monocytogenes 7644 0,39 50,00 0,29 36,82 2,00 2,00 *Optička gustina ulja je d=0,7364 µg/µl U ovom rada je antimikrobno delovanje etarskog ulja A. vulgaris ispitovano protiv sojeva patogenih bakterija koje su izolovane iz humanog materijala (iz rana i urina), a radi poređenja su ispitivani i odgovarajući ATCC sojevi. Najbolje delovanje ulja A. vulgaris se pokazalo protiv bakterije E. aerogenes izolovane iz urina pacijenata gde je minimalna inhibitorna koncentracija (MIC) i minimalna baktericidna koncetracija (MBC) < 0,074 µg/ml i protiv S. aureus i K. oxytoca izolovane iz rana pacijenata MIC i MBC < 0,074 µg/ml. Protiv bakterija izolata iz urina pacijenata MIC je bila u opsegu od 0,074 µg/ml (P. mirabilis i P. aeruginosa) do 2,36 µg/ml (K. oxytoca), dok je MBC bila u opsegu od 0,15 µg/ml (P. mirabilis i P. aeruginosa) do 4,72 µg/ml (K. oxytoca). Dobri rezultati su zabeleženi i protiv bakterija izolovanih iz rana pacijenata gde je 18
MIC bila u opsegu od 0,074 µg/ml (P. aeruginosa) do 0,29 µg/ml (E. coli) dok je MBC bila u opsegu od 0,15 µg/ml (E. aerogenes) do 2,36 µg/ml (E. coli). Uočeno je da je kod bakterije P. aeruginosa MIC ista kod oba izolata iz urina i iz rana (0,074 µg/ml) dok se MBC razlikuje, kod izolata iz urina je 0,15 µg/ml a kod izolata iz rane 0,57 µg/ml. Protiv ATCC sojeva MIC je bila u opsegu od 0,15 µg/ml (P. aeruginosa) do 2,36 µg/ml (S. lutea). Kod najvećeg broja ispitivanih ATCC sojeva MIC je bila 0,29 µg/ml i to protiv E. coli, C. perfringens, S. sonnei, K. pneumonia i L. monocytogenes. MBC protiv ATCC sojeva bila je od 0,29 µg/ml (P. aeruginosa), 0,57 µg/ml (E. coli), do 36,82 µg/ml protiva L. monocytogenes. Iz dobijenih rezultata se može uočiti da su ispitivane bakterije izolovane iz humanog materijala osetljivije u odnosu na ATCC sojeve. 19
6. ZAKLJUČAK Biljna vrsta Artemisia vulgaris je prikupljana sa obale Gabrovačke reke tokom jula i avgusta 2013. godine, na početku cvetanja jer se tada očekuje najveći sadržaj etarskog ulja. Biljni material je sušen u periodu od dve nedelje na sobnoj temperaturi do konstantne mase. Postupkom hidrodestilacije je iz osušenog i usitnjenog materijala izolovano ulje bledo žute boje, gustine d=0,7364 µg/µl, a dobijeno ulje je imalo sadržaj 0,48 % (v/w). Etarsko ulje A. vulgaris je pokazalo relativno dobru antioksidativnu aktivnost. IC 50 vrednost etarskog ulja u DPPH testu je bila 19,48 mg/ml, dok je za BHA i vitamin C bila 0,093 mg/ml i 0,054 mg/ml. Rezultati u ABTS testu pokazuju efektivne koncentracije od 1,43 mg VitC/g i od 26,43 mg/ml (38,00 μl/ml) etraskog ulja A. vulgaris. U svim radovima iz dostupne literature korišćena je disk-difuziona metoda, dok je u ovom radu ispitivanje antimikrobne aktivnosti vršeno mnogo preciznijom mikrodilucionom metodom. Kao test organizmi uzeti su sojevi patogenih bakterija iz humanog materijala (urina i rana) a radi poredjenja ispitani su i odgovarajući ATCC sojevi. Analiza dobijebih rezultata pokazuje da je etarsko ulje biljne vrste A. vulgaris delovalo na sve testirane sojeva bakterija. Inhibitorne i baktericidne koncentracije etarskog ulja bile su u opsegu od <0,074 do 2,36 µg/ml (MIC) i <0,074 do 4,72 µg/ml (MBC) protiv bakterija izolovanih iz urina i koncentracije od <0,074 do 0,29 µg/ml (MIC) i <0,074 do 2,36 µg/ml (MBC) protiv bakterija izolovanih iz rana pacijenata. Etarsko ulje biljne vrste A. vulgaris predstavlja dobar izvor antimikrobnih i antiokisdativnih jedinjenja koja mogu naći primenu u fitoterapeutske svrhe. 20
7. LITERATURA 1. Alma M.H., Mavi A., Yildirim A., Digrak M., Hirata T. (2003): Screening chemical composition and in vitro antioxidant and antimicrobial activities of the essential oils from Origanum syriacum L. growing in Turkey. Biochem Pharm Bull, 26: 1725 1729 2. Baykan Erel S., Reznicek G., Şenol S.G., Karabay Yavasogulu N.U., Konyalioglu S., Zeybek A.U. (2012): Antimicrobial and antioxidant properties of Artemisia L. species from western Anatolia. Turk J Biol., 36: 75-84 3. Blagojević P., Radulović N., Palić R., Stojanović G. (2006): Chemical Composition of the Essential Oils of Serbian, Wild-Growing Artemisia absinthium and Artemisia vulgaris. J. Agric. Food Chem., 54: 4780-4789 4. Blois M.S. (1958): Antioxidant determinatios by the use of a stable free radical. Nature 181: 1199-1200 5. Burzo I., Ciocarlan V., Delian E., Dobrescu A., Badulescu L. (2008): Researches regarding the essential oil composition of some Artemisia L. species. Analele ştiinţifice ale Universităţii Al. I. Cuza Iaşi Tomul LIV, fasc. 2, s.ii a. Biologie vegetală 6. Džamić A. (2010): Sastav, antifungalna i antioksidativna aktivnost etarskih ulja i ekstrakata odabranih vrsta familije Lamiaceae. Doktorska disertacija, Biološki fakultet, Univerzitet u Beogradu. 7. El-Massry K.F., El-Ghorab A.H., Farouk A. (2002): Antioxidant activity and volatile components of Egyptian Artemisia judaica L. Food Chem. 79: 331 336 8. Gajić M. (1975): Flora Srbije, VII, Srpska akademija nauka i umetnosti, Beograd 9. Hiremath S.K., Kolume D.G., Muddapur U.M. (2011): Antimicrobial activitz of Artemisia vulgaris LINN (Damanaka). IJRAP 2011, 2 (6) 1674-1675 10. Jovanović M., Berger-Jekić O. (1997): Specijalna bakteriologija, udzbenik za studente medicine. Savremena administracija, Beograd 11. Judžentiene A. and Buzelyte J. (2006): Chemical composition of essential oils of Artemisia vulgaris L. (mugwort) from North Lithuania. CHEMIJA. 2006. T. 17. Nr. 1. P. 12 15 21
12. Juteau F., Masotti V., Bessiere J.M., Dherbomez M., Viano J. (2002): Antibacterial and antioxidant activities of Artemisia annua essential oil. Fitoterapia 73: 532-535. 13. Kitić, D. (2010): Etarska ulja. Studentski Medicinski Glasnik, 1(1): 149-156 14. Kovacević N. (2004): Osnovi Farmakognozije (Treće izdanje). Srpska školska knjiga, Beograd 15. Matović M. (2000): Lekovita moć bilja. EDITPRINT, Beograd 16. Miguel M.G., Figueiredo A.C., Costa M.M., Martins D., Duarte J., Barroso J.G., Pedro L.G. (2003): Effect of the volatile constituents isolated from Thymus albicans, Th. mastichina, Th. carnosus and Thymbra capitata. Nahrung, 47: 397 402 17. Mihailov-Krstev T. (2008): Radna sveska iz Mikrobiologije. Univerzitet u Nišu, Prirodnomatematički fakultet, Odsek za biologiju sa ekologijom, Niš 18. Mihajilov-Krstev T., Jovanović B., Jović J., Ilić B., Miladinović D., Matejić J., Rajković J., Đorđević Lj., Cvetković V., Zlatković B. (2014): Antimicrobial, Antioxidative, and Insect Repellent Effects of Artemisia absinthium Essential Oil. Planta Med., 80: 1 8 19. Mihajilov-Krstev T., Radnović D., Kitić D. (2010): Antimicrobial activity of Satureja L. essential oils against phytopathogenic bacteria Erwinia amylovora. Biologica nyssana, 1(1-2), 95-98.10th SFSES 17-20 June 2010, Vlasina lake 20. Miller N., Rice-Evans C. (1997): Factors influencing the antioxidant activity determined by the ABTS radical cation assay, Free Radical Research, 26: 195 199 21. NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards (2003): Performance standards for antimicrobial susceptibility testing: eleventh informational supplement. Document M100-S11. National Committee for Clinical Laboratory Standard, Wayne, PA, USA. 22. Nestorović- Živković J. (2013): Antioksidativno, antimikrobno i alelopatsko dejstvo tri endemične vrste roda Nepeta (Lamiaceae). Doktorska disertacija, Beograd 23. Petrović O., Knežević P., Simeunović J. (2007): Mikrobiologija, skripta za studente. Savremena administracija, Beograd. 24. Petrović S., Ristić M., Petrović N., Lazić M., Francišković M., Petrović S. (2014): Hemijski sastav i antioksidativna aktivnost etarskog ulja Thymus serpyllum L. Hem. Ind. 68 (3): 389-397 25. Pešić V. (2014): Antioksidativna aktivnost ekstrakata odabranih taksona roda Seseli L. Master rad, Niš 26. Ristić V. (2013): Hemijski sastav, akutna toksičnost i antimikrobna aktivnost etarskog ulja biljne vrste Artemisia absinthium L. Diplomski rad, Niš. 22
27. Simonović J. (2014): Antimikrobna aktivnost etarskog ulja biljne vrste Artemisia absinthium L. Master rad, Niš 28. Stojković M. (2014): Antioksidativna aktivnost, fenolni i mineralni sastav biljnih vrsta : Geranium macrorrhizum L., Allium ursinum L., Stachys germanica L. I Primula veris L. Doktorska disertacija, Niš 29. Švabic-Vlahović M. (2005): Medicinska bakteriologija. Savremena administracija, Beograd. 30. Tatić B. and Blečić V. (2002): Sistematika i filogenija visih biljaka. Zavod za udžbenike i nastavna sredstva, Beograd 31. Tucakov J. (1990): Lečenje biljem. Beograd. 32. Williams J. (2012): Artemisia vulgaris L. Influence of Geographical Origin, Harvest Time and Chemotypes on 1,8- Cineole Concentration. IJPHA Vol I Issue 2. 33. Yang C-H., Chang H-W., Lin H-Y., Chuang L-Y. (2013): Evaluation of Antioxidant and Antimicrobial Activities from 28 Chinese Herbal Medicines. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry IC Journal No: 8192 Volume 2 Issue 1 ISSN 2278-4136 ZDB- Number:2668735-5 34. Yildirim A., Cakir A., Mavi A., Yalcin M., Fauler G., Taskesenligil Y. (2004): The variations of antioxidant activities and chemical composition of essential oils of Teucrium orientale L. var. orientale during harvesting stages. Flavour Fragrance J., 19: 367 372 35. Životić D., Životić D., Životić S. (1982): Lekovito bilje u narodnoj medicine. Beograd 23
8. BIOGRAFIJA Jelena Cvetković, rođena 26.05.1987. godine u Nišu. Osnovnu školu završava 2002. godine i iste godine upisuje Medicinsku školu, smer stomatološka sestra. Osnovne akademske studije, Odsek za biologiju i ekologiju, po novom program studiranja upisuje 2007/2008 godine na Prirodno-matematičkom fakultetu u Nišu. 2011 godine završava osnovne studije sa zvanjem biolog i iste godine upisuje master akademske studije, smer Ekologija i zaštita prirode na istom fakultetu. 24
ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА Редни број, РБР: Идентификациони број, ИБР: Тип документације, ТД: Тип записа, ТЗ: Врста рада, ВР: Аутор, АУ: Ментор, МН: Наслов рада, НР: Језик публикације, ЈП: Језик извода, ЈИ: Монографска текстуални / графички мастер рад Jeлeнa Цветковић Татјана Михајилов- Крстев Антимикробнa и антиоксидативна активност eтaрскoг уља биљнe врсте Artemisia vulgaris L. Српски Енглески Земља публиковања, ЗП: Р. Србија Уже географско подручје, УГП: Р. Србија Година, ГО: 2016. Издавач, ИЗ: ауторски репринт Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33. Физички опис рада, ФО: 24 страна; 3 слике; 4 табеле (поглавља/страна/ Научна област, НО: Биологија Научна дисциплина, НД: Микробиологија Предметна одредница/кључне речи ПО: УДК Чува се, ЧУ: Важна напомена, ВН: Извод, ИЗ: Датум прихватања теме, ДП: Artemisia vulgaris L., eтaрскo уљe, антимикробна активност, антиоксидативна активност -- Библиотека Циљ овог рада је испитивање антимикробне и антиоксидативне активности етарског уља биљне врсте A. vulgaris. Етарско уље је било бледо жуте боје, а садржај уља је био 0,48% (v/w ). Антимикробна активност је испитивана микродилуционом методом. Инхибиторне и бактерицидне концентрације уља биле су у опсегу од <0,074 до 2,36 µg/ml (MIC) и <0,074 до 4,72 µg/ml (MBC) против Грам(-) бактерија и од <0,074 dдо 2,36 µg/ml (MIC) и <0,074 до 36,82 µg/ml (MBC) против Грам(+) бактерија. Етарско уље A. vulgaris је показало релативно добру антиоксидативну активност. IC 50 вредност етарског уља у DPPH тесту је била 19,48 mg/ml, док је за BHA и битамин Ц била 0,093 mg/ml и 0,054 mg/ml. Резултати у ABTS тесту показују ефективне концентрације од 1,43 mg VitC/g и у концентрацији од 26,43 mg/ml за уље A. vulgaris. датум прихватања теме на већу департмана Факултета Датум одбране, ДО: Чланови комисије, КО: Председник : Члан: Члан, ментор: 25
ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ KEY WORDS DOCUMENTATION Accession number, ANO: Identification number, INO: Document type, DT: Monograph Type of record, TR: Contents code, CC: Author, AU: Mentor, MN: Title, TI: textual / graphic Master thesis Jelena Cvetković Tatjana Mihaјilov-Krstev Antimicrobial and antioxidant activity of Artemisia vulgaris L. essential oil Language of text, LT: Serbian Language of abstract, LA: English Country of publication, CP: Republic of Serbia Locality of publication, LP: Serbia Publication year, PY: 2016 Publisher, PB: author s reprint Publication place, PP: Niš, Višegradska 33. Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes) Scientific field, SF: Scientific discipline, SD: Subject/Key words, S/KW: 24 p biology microbiology Artemisia vulgaris, essential oil, antimicrobial activity, antioxidant activity UC --- Holding data, HD: Note, N: Abstract, AB: Accepted by the Scientific Board on, ASB: library The aim of this paper is the examination of the antimicrobial and antioxidant activity of the essential oil of a plant spacies A. vulgaris. The essential oil w as pale yellow in color, oil content w as 0,48% (v/w ).The antimicrobial activity of the essential oil w as examined w ith the use the microdilution method. The inhibitory and bactericidal concentrations of essential oil w ere in the range from <0,074 to 2,36 µg/ml (MIC) and <0,074 to 4,72 µg/ml (MBC) against Gram(-) bakteria and from <0,074 to 2,36 µg/ml (MIC) and <0,074 to 36,82 µg/ml (MBC) against Gram(+) bakteria. The essential oil of A. vulgaris showed a relatively good antioxidant activity. The IC 50 value of the essential oil in the DPPH test w as 19.48 mg/ml, w hile for the BHA and vit C w as 0.093 mg/ml and 0.054 mg/ml. Results in the ABTS test show effective concentrations of 1.43 mg VitC/g and a concentration of 26.43 mg/ml of A. vulgaris oil. Defended on, DE: Defended Board, DB: President: Member: Member, Mentor: 26