UNIVERZITET U NIŠU Prirodno-matematički fakultet Departman za hemiju Fenolni sastav, antioksidativna i antimikrobna aktivnost delova ploda i lišća Prunus spinosa L. iz Jugoistočne Srbije - Master rad - Mentor: dr Blaga Radovanović Kandidat: Miljan Milenković Niš, 2013.
ПРИРОДНO-MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ Прилог5/1 КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА Редниброј, РБР: Идентификациони број, ИБР: Тип документације, ТД: Тип записа, ТЗ: Врста рада, ВР: Аутор, АУ: Ментор, МН: Наслов рада, НР: Језик публикације, ЈП: Језик извода, ЈИ: Земља публиковања, ЗП: монографска текстуални / графички мастер рад Миљан Миленковић др Блага Радовановић Фенолни састав, антиоксидативна и антимикробна активност делова плода и лишћа Prunus spinosa L. из Југоисточне Србије српски енглески Р. Србија Уже географско подручје, УГП: Р. Србија Година, ГО: 2013. Издавач, ИЗ: Ауторски репринт Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33. Физички опис рада, ФО: пог лавља 6 / страна 37 /цитата 17 / табела 4 / слика и графика 22 Научна област, НО: Научна дисциплина, НД: Предметна одредница/кључне речи, ПО: Хемија Органска хемија, Инструменталне методе у органској хемији Prunus spinosa L., фенолни састав, антиоксидативн, антимикробна активност УДК [547.56 + 547.972 + 579.66] : 634.22 (497.11) Чувасе, ЧУ: Важна напомена, ВН: Извод, ИЗ: Датум прихватања теме, ДП: Библиотека Рад је рађен у лабораторији Природно-математичког факултета у Нишу У овом раду одређена је концентрација укупних полифенола, естара винске киселине и флавонола, као и антиоксидативна активност делова плода и лишћa Prunus spinosa L. из Југоисточне Србије. Утврђено је присуство корелације између нађених фенолних једињења и антиоксидативне активности. Утврђена је антимикробна активност. 15.01.2013. Датум одбране, ДО: Чланови комисије, КО: Председник: Члан: Члан, ментор: ОбразацQ4.09.13- Издање 1
ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИФАКУЛТЕТ НИШ Прилог 5/2 KEY WORDS DOCUMENTATION Accession number, ANO: Identification number, INO: Document type, DT: Type of record, TR: Contents code, CC: Author, AU: Mentor, MN: Title, TI: Language of text, LT: Language of abstract, LA: Country of publication, CP: monograph textual / graphic University master degree thesis Miljan Milenković Blaga Radovanović Phenolic composition, antioxidant and antimicrobial activity of parts of the fruit and leaves of Prunus spinosa L. from Southeast Serbia Serbian English Republic of Serbia Locality of publication, LP: Serbia Publication year, PY: 2013 Publisher, PB: author s reprint Publication place, PP: Niš, Višegradska 33. Physical description, PD: chapters 6 / pages 37 / ref 17 /tables 4 / pictures and graphs 22 Scientific field, SF: Scientific discipline, SD: Chemistry Organic chemistry, Instrumental methods in organic chemistry Subject/Key words, S/KW: Prunus spinosa L., phenolic compound, antioxidant activity, antimicrobial activity UC [547.56 + 547.972 + 579.66] : 634.22 (497.11) Holding data, HD: Note, N: Abstract, AB: library Done in laboratory of Faculty of Science an Mathematics in Nish In this work determinated concentration of total phenolic compounds, esters of tartaric acid and flavonols, like the antioxidant activity parts of the fruit and leaves Prunus spinosa L. from Southeast Serbia. It was determinated present corelation between determinated phenolic compounds and antioxidant activity parts of the fruit Prunus spinosa L. It was determinated antimicrobial activity. Accepted by the Scientific Board on, ASB: 15.01.2013. Defended on, DE: Defended Board, DB: President: Member: Member, Mentor: ОбразацQ4.09.13- Издање 1
Ekperimentalni deo ovog master rada rađen je na Odseku za hemiju Prirodno matematičkog fakulteta u Nišu. Veliku i iskrenu zahvalnost, ovom prilikom, upućujem svom mentoru dr Blagi Radovanović na stručnoj pomoći, ukazanom strpljenju i razumevanju. Takođe se zahvaljujem profesorki Tatjani Mihailov Krstov i svima koji su mi na bilo koji način pomogli da završim ovaj rad. Posebnu zahvalnost bih ovom prilikom iskazao svojoj porodici i prijateljima na razumevanju i podršci koju su mi pružili tokom studiranja.
Uvod Sadržaj 1 UVOD... 1 2 TEORIJSKI DEO... 2 2.1 Trnjina (Prunus spinosa L.)... 2 2.1.1 Botaničke karakteristike... 2 2.2 Hemijski sastav... 3 2.2.1 Fenolna jedinjenja... 4 2.2.2 Taninske materije... 7 2.2.3 Ugljeni hidrati... 8 2.2.4 Pektinske materije... 8 2.2.5 Organske kiseline... 10 2.2.6 Vitamini... 10 2.2.7 Mineralne materije... 12 2.3 Antioksidansi... 13 2.3.1 Mehanizam dejstva antioksidanasa... 16 2.3.2 Slobodni radikali... 16 2.3.3 Metode određivanja antioksidativne aktivnosti... 18 2.3.4 Mikrobiološka aktivnost... 19 2.4 UV/VIS spektrofotometrija... 20 3 EKSPERIMENTALNI DEO... 23 3.1 Materijal... 23 3.2 Reagensi i hemikalije... 23 3.3 Aparatura... 23 3.4 Pripremanje uzoraka i ekstrakcija... 24 3.5 Metode... 24 3.5.1 Određivanje ukupnih fenola, flavonola i estara vinske kiseline... 24 3.5.2 Određivanje antocijana... 24 3.5.3 Određivanje antioksidativne aktivnosti... 24 3.5.4 Odredjivanje antimikrobne aktivnosti... 25 4 REZULTATI I DISKUSIJA... 27 4.1 Određivanje fenolnih jedinjenja u ekstraktima delova ploda i lišća trnjine... 27 4.2 Određivanje antioksidativne aktivnosti u ekstraktima delova ploda i lišća trnjine 30
Uvod 4.3 Antioksidativna aktivnost u delovima ploda i lišća trnjine i njena korelacija sa fenolnim jedinjenjima... 31 4.4 Određivanje antimikrobne aktivnosti u ekstraktima delova ploda i lišća trnjine.. 33 5 ZAKLjUČAK... 35 6 LITERATURA... 36
Uvod 1 UVOD Bobičasto voće takozvane crvene bobice obuhvata više od 1500 vrsta, većinom u obliku malih grmova. U domaće prepoznatljive vrste ubrajaju se: kupina, malina, jagoda, borovnica, ribizla, šipurak, glog, kleka, trnjina, trešnja, višnja i dud. Ono što je zajedničko svom bobičastom voću jeste prisustvo hranljivih, farmakološki aktivnih jedinjenja koja doprinose da voće kao hrana ima antioksidativno, antikancerogeno, antimikrobno i citotoksično dejstvo. Sami plodovi bobičastog voća su izuzetno bogati šećerom, kiselinama, vitaminima (C i A), mineralima, biljnim vlaknima i mnogim bioflavonoidima. Konzumiraju se u svežem ili prerađenom obliku, a poslednjih godina veliku primenu nalaze u farmaceutskoj industriji. Mnoge vrste bobičastog voća spadaju u prirodne samonikle biljke, plodovi divljih i gajenih biljaka mogu se preraditi na različite načine (voćni sokovi, džemovi, kompoti, marmelade, voćno vino) i svi ovi proizvodi su vitaminski mnogo vredniji od proizvoda od kultivisanog voća. Bobice sadrže esencijalnih kiselina i minerala, a kako najveće količine vitamina C i provitamina A koncentrisana je u samoj kori (opni) voća, ukazuje da sušenjem voća možemo dobiti čajne sirovine koje imaju antioksidativna svojstva. Postoje mnogobrojne studije o pozitivnim efektima bobičastih plodova na imuni sistem, krvni pritisak, sa dokazanim antibakterijskim i antivirusnim dejstvom, pre svega zbog visokog sadržaja antocijana. [14] U ovom radu biće ispitivan fenolni sadržaj delova ploda i lista trnjine (Prunus spinosa L.) iz Jugoistočne Srbije (okoline Bele Palanke) i određena njihova antioksidativna i antimikrobna aktivnost. Slika 1.1. Trnjina (Prunus spinosa L.)
Teorijski deo 2 TEORIJSKI DEO 2.1 Trnjina (Prunus spinosa L.) 2.1.1 Botaničke karakteristike na slici 2.1. Sistematika trnjine (Prunus spinosa L.) prikazana je u tabeli 2.1, a izgled trnjine Tabela 2.1 Sistematika trnjine (Prunus spinosa L.) Sistematika trnjine Carstvo: Plantae - Biljke Divizija: Magnoliophyta Razred: Magnoliopsida Red: Rosales Porodica: Rosaceae Potporodica: Prunoideae Rod: Prunus Slika 2.1. Trnjina (Prunus spinosa L.) Trnjina (Prunus spinosa L.) ponekad i nazivana trnula, trnavka, trn, crni trn, divlja šljiva, mačja šljiva je listopadna žbunasta i bodljikava biljka. Iz dubokog i razgranatog korena raste listopadni grm visine od 1 do 5 m s trnovitim granama. Listovi su naizmenični, imaju peteljke, jajoliki su, nazubljenog oboda, dlakavi po žilicama naličja. Cvetovi su dvopolni, petočlani, rastu pojedinačno na kratkim drškama, a cvetaju pre listanja u aprilu i maju a latice su bele boje. Plodovi su okrugle, tamnoplavo-sivkaste koštunice, oporog i kiselog ukusa, veličine oko 1 cm. 2
Teorijski deo Trnjina je rasprostranjena u skoro celoj Evropi, Maloj Aziji, Iranu i delu severne Afrike. Uspeva uz rubove šuma, na neplodnim zemljištima i pašnjacima, po brežuljcima, kraj puteva, naročito na suvom, kamenitom i sunčanom zemljištu. U našoj zemlji je široko rasprostranjena vrsta u pojasu hrastovih šuma. Raste i na području Stare planine. Kod nas je još ima pokraj Tamiša, kraj obodnih kanala i poljskih puteva. Nalazi se do 1000 odnosno do 1300 i 1500 m nadmorske visine. Podnosi niske temperature i do -30 C. Pogodna je za zaštitu strmih i jaružastih terena od erozije zbog obilja široko razvedenog korenovog sistema. Trnjina se koristi za pravljenje soka, sirupa, vina, a u nekim zemljama i za pravljenje žestokih pića (naročito likera). Može se stavljati i u voćne pite [15]. Od cvetova trnjine pravi se čaj. Cvet se bere od marta do aprila, plod u jesen, kad ga je mraz omrazio, a koren u proleće i jesen. Listovi su bogati viaminom C i koriste se za čaj. Beru se dok su još mladi, u drugoj polovini aprila i u maju. Trnjina se koristi i kao ukrasna biljka za žive ograde i za sprečavanje erozije tla. Semenka ploda je otrovna jer sadrži otrovni glukozid amigdalin koji se, u organizmu čoveka i životinja, dejstvom enzima razlaže na glukozu, benzaldehid i veoma otrovnu cijanovodoničnu kiselinu. Trnjina se, zbog svojih lekovitih osobina, ubraja u lekovite biljke. Lekovitost ispoljavaju: koren, kora, list, cvet i plod. Čaj od korena trnjine pomaže u lečenju groznice. Kora pomaže u lečenju dijareje i dizenterije. Listovi su bogati viaminom C i koriste se za čaj. Cvetovi jačaju želudac, umiruju grčeve želuca, pospešuju izlučivanje urina, kamenca u bubregu, sprečava hipertrofiju prostate, čiste krv, odstranjuju kožne osipe. Svež sok trnjine smiruje upalu želuca i izuzetno je delotvoran protiv žutice, a sirup je delotvoran u lečenju reume. Koktel od soka i čaja od korena trnjine je efikasno sredstvo za ispiranje i osvežavanje usta i umirenje krvarenja iz nosa. 2.2 Hemijski sastav Trnjina sadrži najviše vitamin C, ali vitamine A, B 1, B 2, B 6, E, ugljene hidrate (glukozu, fruktozu, saharozu), fenolna jedinjenja (antocijane, tanine) i organske kiseline (jabučnu i dr.) i vodu. Od mineralnih materija zastupljeni su natrijum, kalijum, kalcijum, magnezijum, gvožđe i fosfor. U plodu i kori ima tanina i gorkih materija, u stabljici i lišću ima kalijuma, kalcijuma i flavonoida, a u plodu ima pektina, jabučne i cijanovodonične kiseline, kao i vitamina C. 3
Teorijski deo 2.2.1 Fenolna jedinjenja Poslednjih godina su mnoga polifenolna jedinjenja privukla pažnju naučnika iz oblasti hemije, hrane i medicine zbog svojih antioksidativnih, antimutagenih, antikancerogenih i antibakterijskih osobina. S obzirom na veliku raznovrsnost biljnih fenola, njihova klasifikacija je veoma kompleksna. Podela fenolnih jedinjenja data je u tabeli 2.2. Tabela 2.2 Podela fenolnih jedinjenja Osnovni skelet C6 Klasa Jednostavni fenoli Benzohinoni Primer Katehol, hidrohinon, rezorcinol C6-C1 Fenolne kiseline p-hidroksibenzoeva kiselina, salicilna kiselina C6-C2 Fenilsirćetne p-hidroksifenilsirćetna kiselina kiseline C6-C3 Fenilpropeni Eugenol, mirsticin Kumarini Umbeliferon, eskuletin, skopolin Hromoni Eugenin C6-C4 Naftohinoni Juglon C6-C1-C6 Ksantoni Mangostin, mangiferin C6-C2-C6 Stilbeni Razveratrol Antrahinoni Emodin, hrizofanol, rein C6-C3-C6 Flavonoidi Flavoni Sinensetin, nobiletin, izosinensitin, tangeretin,diosmin Flavonoli Flavonol glikozidi Flavanoli Flavanoni Flavanon glikozidi Kvercetin, kempferol Rutin Dihidroksikvercetin i dihidroksikempferol glikoizdi Hesperidin, naringenin Neohesperidin, narirutin, naringin,eriocitrin Antocijanini Glikozidi pelargonidina, peonidina, delifinidina, petunidina, cijanidina Flavanoli (katehini) (+)-Katehin, (-)-epikatehin, (+)- galokatehin, (-)-epigalokatehin Halkoni Floridžin, arbutin, halkonaringenin (C6-C3) 2 Lignini Pinorezinol (C6-C3-C6) 2 Biflavonoidi Agatisflavon 4
Teorijski deo 2.2.1.1 Flavonoidi Flavonoidi su polifenoli široke rasprostranjenosti u biljnom svetu. To su rastvorljivi pigmenti koji se mogu naći u korenju, lišću, semenkama, pokožici voća i cvetu viših biljaka, a prilikom prerade voća i povrća prelaze u sok u kom su dobro rastvorljivi. Flavonoidi predstavljaju najveću grupu polifenolnih jedinjenja. Do danas je izolovano preko 4000 jedinjenja iz ove grupe. Flavonoidi ispoljavaju veliki broj biološki značajnih aktivnosti kao što je antioksidativna aktivnost. Antioksidsansi imaju zadatak da smanje oksidativna oštećenja kod ljudi izazvanih slobodnim radikalima i reaktivnim kiseoničnim vrstama u uslovima oksidativnog stresa. Ova jedinjenja čine najveću grupu biljnih polifenola, nalaze se u značajnim količinama u povrću i voću, kao i u biljnim prehrambenim proizvodima. Pokazuju širok spektar antioksidantnih svojstava in vitro. Sposobni su da vezuju metalne jone gradeći helate i da prekinu reakcije stvaranja slobodnih radikala. U poslednjih nekoliko godina flavonoidi i druga fenolna jedinjenja biljnog porekla imaju važno mesto, posebno u oblasti farmacije i medicine, zbog njihovog potencijala da spreče veliki broj hroničnih i degenerativnih bolesti, uključujući maligna oboljenja i kardiovaskularne bolesti. Različite studije, in vitro i in vivo pokazale su da flavonoidi poseduju antioksidativne, antimutagene, antivirusne, antimikrobne, antiinflamatorne, antikancerogene i imuno-modulatorske efekte. Kvercetin je najaktivniji od većine bioflavonoida, a biološka aktivnost brojnih biljaka upravo zavisi od njegovog sadržaja. Dobar je antiinflamatorni agens, jer učestvuje u blokiranju nekoliko inflamatornih procesa. Blokira sintezu, a samim tim i oslobađanje histamina i drugih medijatora upale. Veoma je jak antioksidans, pa štiti LDL-holesterol od oksidacije i smanjuje opasnost od njegovog nakupljanja na unutrasnjim zidovima arterija. Sprečava zgrušavanje krvi i stvaranje krvnih ugrušaka. Slika 2.2. Strukturna formula kvercetina 5
Teorijski deo U zavisnosti od stepena oksidacije centralnog piranovog prstena kao i od pozicije sekundarnog aromatičnog prstena flavonoidi su podeljeni u više klasa i potklasa: 1. Fenilhromoni (pravi flavonoidi), - flavoni, flavonoli (monomerni i dimerni) - flavanoni i dihidroflavonoli - izoflavoni i izoflavononi 2. Fenilhromani (gradivne jedinice tanina), - flavani - flavan-3-oli i flavan-3,4-dioli 3. Halkoni i dihidrohalkoni, 4. Auroni i antocijani. Strukturna raznolikost flavonoida rezultat je brojnih modifikacija osnovne skeletne strukture, koje su uslovljene reakcijama hidrogenizacije, hidroksilacije, O- metilacije hidroksilnih grupa, dimerizacije, vezivanja neorganskog sulfata i glikolizacijom hidroksilnih grupa ili flavonoidnog jezgra. Osnovnu strukturu flavonoida čini difenilpropan (C 6 -C 3 -C 6 ). Ugljenikov skelet flavonoida sadrži dva benzenova prstena (A i B) međusobno povezana tročlanim ugljeničnim nizom, koji sa atomom kiseonika formira heterociklični prsten. Slika 2.3. Struktura flavonoida U zavisnosti od tipa strukture flavonoidi se dele u šest podgrupa: 1. flavonoli, 2. flavoni, 3. izoflavoni, 4. flavanoni, 5. antocijanidini i 6. flavanoli (katehini i proantocijanidini). 6
Teorijski deo 2.2.1.2 Antocijani Antocijani su biljni pigmenti crvene do plave boje. Među svim biljnim pigmentima oni su najranije privukli pažnju mnogih istraživača. Naziv antocijani dolazi od grčke reči»antos«- cvet i»kyaneos«- plav. Nalaze se u cvetnim laticama i u drugim delovima viših biljaka. Antocijani su najviše prisutni u pokožici ploda trnjine. Antocijani pripadaju flavonoidima. U prirodi se ne pojavljuju u obliku aglikona (antocijanidina), već kao glikozidi i to najčešće kao 3-glikozidi. Šest aglikona su najrasprostranjeniji u prirodi a to su: cijanidin, delfinidin, petunidin, pelargonidin, peonidin i malvidin. Najzastupljeniji je cijanidin. Antocijanidini imaju u osnovi 2- fenilbenzopirilijum ili flavilijum jon i variraju jedino po broju OH i OCH 3 grupa. Derivati su benzopirilijum-hlorida. Slika 2.4. Strukturna formula benzopirilijum-hlorida Svi antocijanidini sadrže 3,5,7-trihidroksi-flavilijum-jon. Pelargonidi, cijanidin i delifinidin su jedinjenja koja se razlikuju samo po položaju hidroksilne grupa u prstenu B. Metilovanjem ovih hidroksilnih grupa dobijaju se novi pigmenti: peonidin, petunidin i melvinidin. 2.2.2 Taninske materije Tanini (polifenoli) ili štavne materije su složena jedinjenja biljnog porekla koja imaju opor ukus. Sa solima gvožđa obrazuju rastvore crne, plave i zelene boje. Mogu da ispunjavaju čitavu vakuolu biljne ćelije koja tada dobija naziv taninska vakuola. Nalaze se u stablima i listovima nekih biljaka a sadrže ih i zeleni plodovi koji zbog toga imaju opor ukus. Sazrevanjem plodova količina tanina u njima se smanjuje. Osim u medicinu, našli su primenu u industriji kože za štavljenje. 7
Teorijski deo Lekovitost tanina i njihova upotreba je višestruka: imaju dejstvo protiv bakterija i gljiva deluju hemostatično jer sužavaju krvne sudove i stvaraju čep od zgrušane krvi ublažavaju i leče dizenteriju protivotrovi su različitim materijama 2.2.3 Ugljeni hidrati U plodu trnjine prisutni su monosaharidi glukoza i fruktoza, kao i disaharid saharoza. Glukoza ili grožđani šećer je najrasprostranjeniji monosaharid. U slobodnom stanju se nalazi u biljnim plodovima i krvi sisara. Glukoza ima vrlo sladak ukus, lako je rastvorljiva u vodi, a takođe je i neophodna za održavanje života jer kada se razgradi u citoplazmi žive ćelije oslobađa velike količine energije potrebne za mnoge životne funkcije. Fruktoza ili voćni šećer je vrlo sladak šećer koji je dobro rastvorljiv u vodi. U prirodi se nalazi zajedno s glukozom u slatkom voću i medu. Sa glukozom čini saharozu gde se nalazi u D-furanoznom obliku. Slobodna fruktoza česta je u voću, a vezana za glukozu čini disaharid saharozu. Najslađa je od svih monosaharida, dva puta je slađa od glukoze, a 1,73 puta od saharoze. Saharoza, poznata kao običan šećer, je disaharid koji se sastoji od molekula glukoze i fruktoze. Neizbežni je dodatak namirnicama zbog slatkosti i zbog svojih funkcionalnih osobina. Saharoza je namirnica koju organizam lako usvaja i koja za organizam predstavlja brzi izvor energije dovodeći do naglog porasta koncentracije glukoze u krvi. Čista saharoza se najčešće dobija kao fini, kristalni prašak bez boje i mirisa, ugodnog slatkog ukusa. 2.2.4 Pektinske materije Pektinske materije su heteropolisaharidi koji se nalaze u ćelijskom zidu biljaka. Samo ime pektin potiče od grčke reči "pektos" što u prevodu znači želiran, ukrućen. Komercijalni pektin je beli amorfini prah. 8
Teorijski deo Pektinske materije su koloidne prirode, čija je osnovna gradivna jedinica anhidrogalakturonska kiselina, međusobno povezana α-1,4 glukozidnom vezom i ramnoza, povezana α-1,2 glukozidnim vezama za galakturonsku kiselinu. Karboksilne grupe galakturonske kiseline su delimično esterifikovane metanolom ili slobodne, odnosno delimično ili potpuno neutralisane jednom ili više baza. Sekundarne alkoholne grupe mogu biti parcijalno acetilovane. Pored galakturonske kiseline i ramnoze u molekulu pektinskih materija nalaze se i neutralni šećeri, kao što su arabinoza, galaktoza i ksiloza u bočnim lancima. Karakteristike sastava (vrsta i položaj neutralnih šećera, bočni lanci, stepen esterifikacije, molekulska masa) zavise od sirovine i stepena zrelosti. Prema nomenklaturi američkog hemijskog društva za različite oblike pektinskih materija koriste se sledeći izrazi: protopektin, pektininske kiseline i pektinske kiseline. Protopektin je u vodi nerastvorljiva frakcija, čijom ograničenom hidrolizom (kiselom, baznom, enzimskom) nastaju pektininska i pektinska kiselina. Protopektin predstavlja jedinjenje kompleksne građe. Danas se smatra da se protopektin sastoji od polimerizovanih jedinica galakturonske kiseline i ramnoze za koje su vezane celuloza, hemiceluloza, lignin i druge materije. Protopektin daje čvrstoću biljnom tkivu i nalazi se u većoj količini u nezrelim plodovima. Sazrevanjem plodova protopektin, dejstvom enzima protopektinaze, prelazi u rastvorljivi pektin što za posledicu ima omekšavanje plodova. Pektininske kiseline predstavljaju poligalakturonske kiseline sa karboksilnim grupama koje su potpuno ili delom esterifikovane metil alkoholom. Koloidno su rastvorljive u vodi. Jedan broj ovih kiselina pod pogodnim uslovima (prisustvo šećera i kiselina ili sa određenim metalnim jonima ako poligalakturonski lanac sadrži malo metoksilnih grupa) može da stvara gel. Pektininske kiseline sa metalima grade soli pektinate. Slika 2.5. Strukturna formula pektininske kiseline 9
Teorijski deo Pektininske kiseline koje imaju sposobnost stvaranja gela nazivaju se pektinima. Termin pektini ima više praktičan i komercijalan značaj. Prema stepenu esterifikacije pektini se dele na visokoesterifikovane i niskoesterifikovane. Pektinske kiseline su deesterifikovane pektininske kiseline i ne poseduju svojstvo želiranja. Sa metalima grade soli pektate. Slika 2.6. Strukturna formula pektinske kiseline Sadržaj pektinskih materija je značajan za one vrste voća koje se prerađuju u želirane proizvode kao i za proizvodnju kašastih sokova. [17] 2.2.5 Organske kiseline Od organskih kiselina, u trnjini je najzastupljenija jabučna kiselina. Jabučna kiselina, C 4 H 6 O 5, je dvobazna organska kiselina prisutna u kiselom voću. To su bezbojni igličasti kristali rastvorljiviu vodi i alkoholu. Nastaje, kao i druge organske kiseline, u listu, a u manjoj meri i u bobici dok je još zelena i dok obavlja funkciju asimilacije kao i list. 2.2.6 Vitamini Vitamini su složena organska jedinjenja koja se nalaze u malim količinama u biljnim i životinjskim tkivima. Nauka je poslednjih godina otkrila i dokazala ogromnu ulogu koju imaju vitamini u ishrani. Vitamin C ili L-askorbinska kiselina u prirodi se nalazi u obliku dehidroaskorbinske kiseline. Mogu ga sintetizovati biljke i neke životinje, a nalazi se u šipku, paprici, kupusu, spanaću i limunu. Ima veoma važnu ulogu u stvaranju kostiju i hrskavice, a neophodan je i za zarastanje rana. Dokazano je da smanjuje toksičnost nekih lekova. Fiziološko dejstvo ogleda se u učestvovanju u oksido-redukcionim procesima metabolizma ćelija. Nedostatak vitamina C u hrani dovodi do pojave skorbuta. 10
Teorijski deo Vitamin A je visokomolekularni alkohol, viskozna žuta, uljana tečnost rastvorljiva u mastima. Nastaje u organizmu iz karotena, žutog pigmenta iz biljaka. Dnevne potrebe organizma za ovim vitaminom iznose od 0,8 do 1,5 mg. Ima ga u šargarepi, zelenom povrću, buteru, siru, žumancu, ribljem ulju, peršunu, jegulji, kajsijama. Uništava se oksidacijom i delovanjem ultraljubičastih zraka. Vitamin A je neophodan za stvaranje kolagenih tkiva, u toku rasta. Učestvuje u regulaciji sinteze belančevina. Vitamin A učestvuje u reakcijama koje deluju na stabilnost ćelijske membrane i membrana ćelijskih organela (lizozoma i mitohondrija), tj. učestvuje u očuvanju strukturalnog integriteta i normalne propustljivosti ćelijske membrane. Neophodan je za normalnu funkciju i građu svih epitelnih ćelija, u borbi protiv infektivnih bolesti, za normalnu funkciju žlezda (naročito tiroidne i polnih žlezda), organa za varenje i jetre. Ima izraženu antioksidativnu ulogu, koja se najjasnije pokazuje prilikom zaštite od infekcija. Nedostatak uzrokuje noćno slepilo, promene na koži i probavnom sistemu, slabost organizma, deformacije kostiju, isušivanje i mekšanje rožnjače. Vitamina A ili beta-karotena ima u namirnicama i životinjskog i biljnog porekla. Vitamin B 1 ili tiamin predstavlja jedan od vitamina B grupe koji su rastvorljivi u vodi i učestvuju u mnogim metaboličkim procesima u organizmu. Vitamin B 1 je neophodan za stvaranje energije iz ugljenih hidrata, za pravilno funkcionisanje nervnih ćelija, za rad svih mišićnih vlakana. Glavni izvori vitamina B1 su: pivski kvasac, žitne klice i mekinje, žitna zrna, kupus, razno voće i plodovi. U današnje vreme nedostatak vitamina B 1 najčešće se javlja kod alkoholičara, jer velike količine alkohola smanjuju usvajanje tiamina u organizmu. Na taj način dolazi do nastanka bolesti beri-beri, pri čemu se oštećuju nervi, mozak i srčani mišić. Čoveku je potrebno dnevno da uzima oko 1 mg ovog vitamina, što je sasvim dovoljno ako se hranimo mešovitom hranom, pre svega svežom biljnom. [12] Vitamin B 2 ili riboflavin je vitamin B-kompleksa koji se primenjuje u obliku soli rastvorljivih u vodi. Ima važnu ulogu u metaboličkim procesima celog tela pa je neophodan u iskorišćavanju energije iz hrane. Izvori vitamina B 2 su jetra, bubreg, riba, jaja, mleko, zeleno povrće i razno voće. [13] Vitamin B 6 ili piridoksin je vitamin B-kompleksa rastvorljiv u vodi. To je beli kristalan prašak. Najviše ga ima u biljnom i životinjskom tkivu, naročito u jetri i bubrezima, zatim u kvascu, ribi, soji, jajima, voću i povrću. Preporučene dnevne količine 11
Teorijski deo za odrasle muškarce su 2 mg, a za odrasle žene 1,6 mg. Simpomi nedostatka se ispoljavaju na koži. Vitamin E je antioksidans u oksidoredukcionim procesima metabolizma ugljenih hidrata, masti, fosfata i kreatina. Rastvorljiv je u mastima i štiti supstance koje se lako oksiduju (npr. vitamin A). Potrebe organizma za vitaminom E dovode se u vezu sa sadržajem polunezasićenih masnih kiselina u telesnim tkivima (štiti od njihove peroksidne oksidacije); Smatra se da su životinje i čovek nesposobne da sintetišu ovaj vitamin. Vitamin E sprečava nastanak arterijskog plaka, suženje arterija i razvoj ateroskleroze. Takođe, sprečava oksidaciju masti i oštećenja krvnih sudova, ugradnju holesterola u arterijski plak, a na taj način sprečava i razvoj oboljenja srca i krvnih sudova. Smatra se da je vitamin E zajedno sa drugim antioksidansima iz hrane (vitamin C, flavonoidi) dobra prevencija za sprečavanje nastanka oboljenja srca i krvnih sudova, malignih oboljenja, a doprinosi i poboljšanju opšteg zdravlja. Depo vitamina E u organizmu se nalazi u masnom tkivu. Kao antioksidans, vitamin E sprečava oksidaciju poluzasićenih masnih kiselina (membranskih lipida) te reaguje sa slobodnim radikalima, i to pretežno sa peroksidnim radikalima. Tokoferoli su vrlo rasprostranjeni u hrani. Bogati izvor vitamina E su biljna ulja, a posebno suncokretovo, semenke, bademi, kikiriki, jaja i dr. Druge namirnice koje sadrže vitamin E su: orasi, lešnici, hladno ceđena biljna ulja (maslinovo, kukuruzno, sojino), spanać. Preporučene dnevne količine su za odraslu ženu 8 mg, a za odraslog zdravog muškarca su 10 mg. Vitamin E nije dobro držati u plastici ili uz plastiku jer se veže za nju što bi izazvalo razne probleme. 2.2.7 Mineralne materije Natrijum je najzastupljeniji katjon vanćelijske tečnosti. Ima važnu ulogu u regulaciji zapremine krvi, krvnog pritiska,osmotske ravnoteže i održavanja konstantne ph vrednosti. Kalijum je jedan od najčešće pripisivanih minerala. Koristi se u situacijama kada dolazi do gubitka kalijuma iz organizma, kao što je terapija diureticima. Reguliše metabolizam vode i soli unutar ćelije, osmotski pritisak, kiselo-baznu ravnotežu, normalizuje rad srca. Ima važnu ulogu u biosintezi proteina, aktivira veliki broj enzima, posebno onih koji učestvuju u stvaranju energije. 12
Teorijski deo Kalcijum je gradivni element kostiju i zuba, neophodan je za mišićne kontrakcije, prenošenje nervnih signala, za izlučivanje hormona i enzima. Stalan nivo kalcijuma u krvi je neophodan da bi se procesi u organizmu nesmetano odvijali. Magnezijum je mineral koji je uključen u preko 300 reakcija u organizmu. Važan je za sve organe, a naročito za pravilan rad srca, mišića, bubrega, izgradnju zuba i kostiju. Primenjuje se kod srčanih oboljenja, grčeva i slabosti mišića, zatvora, nedostatka magnezijuma, alkoholizma, dijabetesa, kod astme, hroničnog umora, osteoporoze, migrenskih glavobolja. Gvožđe je sastavni deo hemoglobina koji omogućava transport kiseonika u krvi. Anemija ili malokrvnost je nedostatak hemoglobina ili eritrocita. Anemija nastaje usled nedovoljnog unošenja gvožđa u organizam, kod povećanih potreba za gvožđem (trudnoća, dojenje, deca u periodu rasta i razvoja), smanjene apsorpcije gvožđa u crevima i kao posledica krvarenja. Fosfor je posle kalcijuma najzastupljeniji element u organizmu. U ljudskom organizmu ga ima približno 1% od njegove ukupne telesne težine. Prisutan je u svakoj ćeliji, ali ga najviše ima u kostima i zubima (oko 85% od ukupnog fosfora). 2.3 Antioksidansi U vreme pojave prvih živih bića, Zemljina atmosfera je bila siromašna kiseonikom i prva bića su bila anaerobna. Anaerobni organizmi su preživljavali takve uslove, ali im je razvoj bio zaustavljen. Evolucijom, razvojem fotosintetskim organizama, povećavao se sadržaj kiseonika u atmosferi, a živi organizmi su počeli da razvijaju antioksidativni odbrambeni sistem kako bi se zaštitili od kiseonikove toksičnosti. Kiseonik ima dvostuku funkciju u organizmu: neophodan je za život, ali je ujedno i izvor potencijalno štetnih čestica slobodnih radikala. Slobodni radikali nastaju kao rezultat zagađenja vazduha, radijacije, preteranog izlaganja suncu, stresa, ali i zbog prekomernog unosa industrijske hrane i hrane bogate zasićenim masnoćama. Savremena naučna istraživanja pokazuju da je oksidativni stres jedan od glavnih uzroka različitih neizlečivih oboljenja kao što su: ateroskleroza, dijabetes, maligna oboljenja, srčani infarkt, moždani infarkt i druge teške i hronične bolesti. Sredstva za lečenje ovih bolesti su antioksidansi. 13
Teorijski deo Da bi se proizvod očuvao od niza nepoželjnih oksidativnih promena usled kojih može doći do promena organoleptičkih i hemijskih svojstava hrane, dodaju se antioksidansi. Široko definisani, antioksidansi su jedinjenja koja inhibiraju ili odlažu oksidaciju substrata iako su prisutni u značajno manjoj količini od substrata koji podleže oksidaciji. Prema Pravilniku o kvalitetu i uslovima upotrebe aditiva u namirnicama i drugim zahtevima za aditive i njihove mešavine, antioksidansi su supstance koje produžavaju trajnost prehrambenih proizvoda štiteći ih od kvarenja prouzrokovanog oksidacijom, kao što su užeglost masti i promena boje, uključujući i sinergiste antioksidanasa. Dodati u malim količinama imaju sposobnost da spreče oksidaciju nekih sastojaka hrane, a da ne utiču na promenu svojstava hrane. U širem smislu ova jedinjenja spadaju u aditive hrane, a svaki antioksidans koji se koristi mora biti odobren propisima koji važe za taj proizvod. Oksidativne promene mogu da dovedu do: promene u ukusu i mirisu (na užeglost) potamnjivanje (promena boje) gubitka labilnih sastojaka (vitamina i sl.). Užeglost nastaje zbog oksidativnog razlaganja masnih kiselina. Ovu pojavu aktivira svetlost (naročito UV), prisustvo kiseonika i prisustvo metala (Pb, Cu, Fe) koji deluju katalitički. Oksidacioni procesi se odvijaju u nekoliko faza: najpre dolazi do dehidratacije, zatim vezivanja kiseonika i obrazovanja peroksida, a u završnoj fazi dolazi do izdvajanja peroksida, aldehida, ketona i kiselina koji su kao sekundarno nastala jedinjenja nosioci neprijatnog ukusa i užeglosti. Promene boje i potamnjivanje su uglavnom oksidacione promene fenolnih jedinjenja u prisustvu odgovarajućih fermenata, pri čemu nastaju jedinjenja tipa hinona. Nagomilavanjem i polimerizacijom ovih jedinjenja pojavljuje se najpre žuta do svetlomrka boja koja kasnije prelazi u mrku boju. Gubitak lako oksidujućih sastojaka prvenstveno se odnosi na vitamin C. Kako veliki broj voća i povrća sadrži vitamin C ili se on dodaje radi vitaminizacije proizvoda, ovaj gubitak može da bude značajan. Da bi se sprečile ove pojave koriste se antioksidansi. 14
Teorijski deo Antioksidansi se dele na dve grupe: pravi antioksidansi i sinergisti. Pravi antioksidansi su najčešće jedinjenja koja po hemijskom sastavu spadaju u orto- i para-difenole ili imaju sličnu elektronsku konfiguraciju. Oksidacione reakcije mogu proizvoditi slobodne radikale, izuzetno štetne, visokoreaktivne čestice koji u organizmu nastaju kao međuprodukti uobičajenih metaboličkih procesa. Slobodni radikali, čiji je najčešći izvor kiseonik, započinju lančane reakcije koje oštećuju ćelije. Antioksidansi zaustavljaju ove lančane reakcije tako što se sami oksiduju, pri čemu se mogu smatrati redukcionim sredstvima. U novije vreme pažnju zaokupljuju biljke sa antioksidativnom aktivnošću, usled pojave sve većeg broja malignih oboljenja, kardio-vaskularnih bolesti i infekcija. Smatra se da su ovi poremećaji izazvani, u najvećem broju slučajeva, štetnim delovanjem slobodnih radikala. Biljke i životinje poseduju kompleksne sisteme različitih antioksidanasa kao što je glutation, vitamin C i vitamin E, kao i enzimi: katalaza, superoksid dismutaza i različite peroksidaze. Nizak nivo antioksidanasa ili inhibicija enzima prouzrokuje antioksidativni stres i može oštetiti ili ubiti ćelije. Pošto oksidativni stres može biti uzrok ljudskih oboljenja kao što su: ateroskreloza, dijabetes, maligna obolenja, srčani infarkt, moždani infarkt i druge teške i hronične bolesti, primena antioksidanasa se u farmakologiji intenzivno proučava, delimično i kao tretman za neurodegenerativne bolesti. Antioksidansi se široko primenjuju kao sastojci u dijetetskim proizvodima. Pored primene u medicini, antioksidansi imaju primenu u prehrambenoj i kozmetičkoj industriji, (dodaci u hrani i kozmetici). Antioksidansi stabilizuju materije podložne oksidaciji tj. sprečavaju novu degradaciju. Od davnina je poznata antioksidativna osobina raznih začinskih biljaka. Korišćeni su kao dodaci hrani ne samo za poboljšanje arome već i za očuvanje kvaliteta. Postoji veliki broj prirodnih antioksidanata, a najvažniji među njima su vitamini (α-tokoferol-vitamin E, askorbinska kiselina-vitamin C, retinol-vitamin A, tiamin i riboflavin-vitamini B 1 i B 2, itd.), flavonoidi, fenolne kiseline, polifenolna jedinjenja biljaka, azotna jedinjenja (alkaloidi, amini i aminokiseline), hlorofil, glukozinolati i druge supstance kao npr. neki diketoni i glikozidi. Najpoznatiji sintetički antioksidansi su: askorbil-palmitat (AP), terc-butil-4- hidroksianizol (BHA), terc-butil-4-hidroksitoluen (BHT), propil-galat (PG), butil-galat (BG), oktil-galat (OG), dodecil-galat (DG), terc-butil-hidrohinon (TBHG) i limunska kiselina. [2] 15
Teorijski deo 2.3.1 Mehanizam dejstva antioksidanasa Hvatanje tj. neutralisanje reaktivnih kiseoničnih vrsta je jedan od mogućih mehanizama dejstva antioksidanasa. Drugi mehanizmi uključuju sprečavanje stvaranja reaktivnih kiseoničnih vrsta vezivanjem metala ili putem enzimske inhibicije. Antioksidansi deluju tako što sprečavaju lančane reakcije substrata sa slobodnim radikalima. Jedinjenja sa antioksidativnom sposobnošću mogu biti obnovljena unutar ćelije ili su nepovratno oštećena. Njihovi proizvodi oksidacije su manje štetni ili dalje mogu biti konvertovani do štetnih produkata. Na ćelijskom nivou ili nivou organizma, antioksidativna zaštita je obezbeđena brojnim enzimima i endogenim antioksidansima malih molekulskih masa kao što je askorbinska kiselina, glutation, tokoferoli i dr. [5] 2.3.2 Slobodni radikali Slobodni radikali su jaki oksidansi (teže da preotmu elektron drugim molekulima), a njih neutrališu antioksidansi, jer imaju elektrone koje mogu da daju oksidansima i tako ih stabilizuju (da ne budu reaktivni). Stvaranje slobodnih radikala u direktnoj je vezi sa reakcijama oksidacije u hrani i biološkim sistemima. Slobodni radikali su čestice koje sadrže jedan ili više nesparenih elektrona i sposobni su da samostalno egzistiraju. Slobodni radikali kao što su trihlormetil (CCl - 3 ), superoksid (O - ), hidroksil (HO - ), peroksil (ROO - ) i nitril-oksid (NO - ) su poznati produkti metabolizma u živim organizmima. Neki ne-radikalni derivati molekula kiseonika, vodonik peroksid (H 2 O 2 ), hipohlorna kiselina (HOCl), mogu se stvoriti u hrani i biološkim sistemima. Sve ove reaktivne čestice sa kiseonikom, učestvuju u reakcijama slobodnih radikala zbog čega se javlja potreba da se odredi sposobnost supstrata da neutrališe ( hvata ) čestice radikala, odnosno njegovu antioksidativnu aktivnost. 16
Teorijski deo Slika 2.7. Neutralizacija slobodnog radikala Slobodni radikali svakodnevno nastaju u svakom čoveku u ćelijama. Međutim, organizam ima mehanizme da ih neutrališe i da na taj način spreči njihovo razorno dejstvo. Postoje antioksdiansi u hrani koji se uspešno bore sa slobodnim radikalima. To su pre svega sastojci voća i povrća. Svo voće i povrće koje ima crvene, narandžaste i žute pigmente sadrži betakarotene, koji su moćni antioksidansi. Paradajz sadrži značajne količine likopena, jedne varijante beta-karotena, koja ima izrazito jako antioksidativno dejstvo. Svo voće koje je tamno-plave i ljubičaste boje sadrži antocijane, koji takođe ispoljavaju dejstvo protiv slobodnih radikala. Grožđe i vino sadrže moćne antioksidanse, kao i borovnice, kupine i drugo tamno-plavo i ljubičasto voće. Slobodni radikali pokreću lančane reakcije, jer kada nekom stabilnom molekulu preotmu elektron, on postaje slobodni radikal. Tada taj slobodni radikal napada druge molekule, da im preotme elektron i postane stabilan. Slobodni radikali oštećuju sve ćelijske strukture: ćelijsku membranu, ćelijske organele, a najveća šteta nastaje kada dođe do oštećenja genetskog materijala, DNK. Promene u genima vode ka mutacijama, a mutacije ćelija mogu biti i ka malignim ćelijama. Oštećenjem zidova krvnih sudova omogućava se razvoj i napredovanje ateroskleroze. Slobodni radikali oštećuju DNK i dovode do mutacija gena, na taj način dolazi do stvaranja kancerogenih ćelija. Ako kancerogene ćelije počnu da se razvijaju neograničeno nastaju tumori. U poslednje vreme došlo je do epidemije malignih oboljenja, a pretpostavlja se da je to velikim delom zbog mnogo veće izloženosti stanovništva zagađenjima vode, vazduha, hrane i životom pod stalnim stresom. 17
Teorijski deo Slika 2.8. Delovanje slobodnog radikala na zdravu ćeliju Slobodni radikali se stalno stvaraju i neutrališu u organizmu. Problem nastaje kada se oni stvaraju većom brzinom nego što organizam može da ih neutrališe, a do toga dolazi u uslovima stresa, kod povećanih fizičkih i umnih naprezanja, pod dejstvom otrova, pesticida, herbicida, duvanskog dima, zračenja, izduvnih gasova, prekomernog sunčanja, nekih lekova. Kada se slobodni radikali stvaraju većom brzinom nego što organizam može da ih neutrališe, nastaju uslovi za propadanje čelija i razvoj bolesti. Mnoga oboljenja nerava, krvnih sudova, srca, tumori povezuju se upravo sa povećnom izloženošću nekim štetnim agensima, koji su preko stvaranja slobodnih radikala doveli do razvoja bolesti. Slobodni radikali takođe ubrzavaju starenje organizma, jer dovode do ubrzanog propadanja ćelija. [13] 2.3.3 Metode određivanja antioksidativne aktivnosti Postoji veliki broj metoda za ispitivanje antioksidativnog kapaciteta pojedinih molekula. Za ispitivanje antioksidanasa kao potencijalnih hvatača slobodnih radikala veoma često se koristi savremena i veoma osetljiva metoda za određivanje koncentracije slobodnih radikala, tzv. elektron-spin rezonanca (ESR). Za određivanje antioksidativne aktivnosti ispitivanih jedinjenja često se koriste spektrofotometrijske metode. One se zasnivaju na spektrofotometrijskom praćenju promene koncentracije nekog od reaktanata ili produkata reakcije antioksidanasa sa slobodnim radikalima. Jedna od najčešće korišćenih je DPPH test, pored ove metode primenjuje se FRAP test i metoda redukcije H 2 O 2. 18
Teorijski deo 2.3.3.1 Određivanje antioksidativne aktivnosti DPPH testom DPPH metod je jednostavan, brz i osetljiv način da ispitujemo antioksidativnu aktivnost određenog jedinjenja ili biljnog ekstrakta. DPPH test pruža podatke o reaktivnosti potencijalnih antioksidanasa sa stabilnim, slobodnim 1,1-difenil-2-pikril-hidrazil radikalom (DPPH). Sam DPPH radikal je purpurne boje i ima maksimum apsorpcije na 517 nm. Reakcijom sa antioksidansima on vezuje vodonokov atom svojim nesparenim elektronom i na taj način prelazi u žut DPPH-H (slika 2.8) Slika 2.9. Mehanizam reakcije DPPH radikala sa antioksidansima DPPH test se zasniva na praćenju procenta obezbojavanja, odnosno smanjenja apsorbancije DPPH radikala na 517 nm, čime se dolazi do podataka o antioksidativnoj sposobnosti ispitivanog molekula, tj. o njegovoj sposobnosti da radikalu DPPH preda atom vodonika i na taj način ga dezaktivira. 2.3.4 Mikrobiološka aktivnost Pojedine biljne vrste se vekovima koriste za lečenje različitih bolesti zbog sadržaja mnogih komponenti koje su od velke terapeutske važnosti. Sve je veća primena tradicionalne medicine kao alternativnog oblika lečenja raznih bolesti zbog pojave rezistentnosti mikroorganizama na postojeće sintetske antibiotike. Pored velikog napretka u oblasti hemijske sinteze, u iznalaženju novih lekova sve je više onih koji potiču iz biljnih materijala. Mnoge od tih tradicionalno korišćenih biljaka su u istraživanjima pokazala svoje efikasno dejstvo, a bioaktivne komponente su ekstrahovane i izolovane. Različiti delovi biljaka (koren, list, cvet, plod, stabljika, kora) uspešno se koriste za lečenje mnogih bolesti. Oni svojim antioksidativnim i antimikrobnim delovanjem utiču 19
Teorijski deo na mnoge fiziološke procese u organizmu, te na taj način štite od slobodnih radikala i razvoja nepoželjnih mikroorganizama. Pored toga, mikroorganizmi dovode do čestog kvarenja hrane tako da je njihovo prisustvo jedan od najvećih problema sa kojim se susrećemo. Mnogi mikroorganizmi, kao što su Escherichia coli, Staphylococcus aureus i Listeria monocytogenes, su uzročnici kvarenja hrane i bolesti prenesenih konzumiranjem inficiranih životnih namirnica. Iz tog razloga nužno je koristiti hemijske konzervanse kao preventivnu meru za rast mikroba u procesu proizvodnje hrane. Zbog rezistentnosti bakterija na veliki broj antibiotika, ali i sposobnosti biljaka da sintetišu biološki aktivne materije, sve veći značaj dobija primena preparata biljnog porekla u kontroli i suzbijanju bakteija. Upotreba biljaka u prehrambenoj industriji, umesto sintetskih konzervanasa, antioksidanasa ili drugih prehrambenih aditiva, značajno je porasla poslednjih godina. U cilju pronalaženja novih, prirodnih antimikrobnih agenasa, veliki je broj istraživanja u kojima je utvrđena antimikrobna aktivnost prirodnih fenolnih antioksidanasa izolovanih iz biljaka. Biljni fenoli predstavljaju jednu od glavnih grupa jedinjenja odgovornih za antioksidantno ponašanje, kao i za antimikrobne efekte. Flavonoidi, koji su raznovrsna i rasprostranjena grupa prirodnih jedinjenja su najvažniji prirodni fenoli. Poseduju širok spektar biološke aktivnosti uključujući i antibakterijsko dejstvo. [3] 2.4 UV/VIS spektrofotometrija Spektrofotometrija je apsorpciona metoda koja se zasniva na proučavanju apsorbance (A) ili apsorptiviteta od talasne dužine zračenja (λ) koje je prošlo kroz analiziranu supstancu. Apsorbancija se može pratiti kako u ultravioletnoj (UV) i vidljivoj (VIS) oblasti, tako i u infracrvenoj (IC), mikrotalasnoj i radiofrekventnoj oblasti. U ovom radu je od interesa bila oblast od 200-1000 nm. 20
Teorijski deo Slika 2.10. Spektar elektromagnetnog zračenja UV/VIS spektrofotometrija je kvalitativna i kvantitativna metoda. Kvalitativna analiza zasniva se na činjenici da apsorpcioni spektar supstance zavisi od njenog sastava i strukture. Na osnovu zavisnosti apsorptiviteta talasne dužine ili vrednosti apsorptiviteta na određenoj talasnoj dužini moguće je identifikovati apsorbujuću supstancu. Kvantitativna analiza zasnovana je na Beerovom zakonu: A = a x b x c Gde je: a molarna apsorptivnost b debljina sloja c koncentracija Kako je kod spektrofotometra b jednako debljini kivete i konstantno je, to apsorbanca zavisi samo od koncentracije i apsorptiviteta. Za kvantitativnu analizu bitno je da se merenje vrši sa najvećom mogućom tačnošću i osetljivošću. Potreban je pravi izbor talasne dužine i ona mora da ispuni sledeće uslove: merenjem mora da se postigne maksimalna osetljivost, mala promena talasne dužine ne sme da utiče na reproduktivnost, mora da važi Beerov zakon. U zavisnosti od uslova, merenje apsorbance se može vršiti na: talasnoj dužini gde je maksimalna apsorpcija, λ max na talasnoj dužini optimalne apsorbance, λ opt na talasnoj dužini izobestičke tačke, λ izob 21
Teorijski deo Ako u posmatranoj oblasti spektra apsorbuje samo analizirana supstanca onda se merenje apsorbance vrši na λ max jer je tu osetljivost merenja najveća. Diferenciranjem Beerove jednačine dobija se: da/dc = a odakle sledi da je promena apsorbance rastvora sa promenom koncentracije utoliko veća ukoliko je veća vrednost apsorptiviteta ispitivanog rastvora. Apsortivitet je uvek najveći na talasnoj dužini maksimalne apsorpcije tj. na λmax, pa je i osetljivost merenja najveća na ovoj talasnoj dužini. Upotreba spektrofotometara obuhvata različite naučne oblasti, kao što su fizika, nauka o materijalima, hemija, biohemija i molekularna biologija. Oni su široko korišćeni u mnogim industrijama, uključujući proizvodnju poluprovodnika, lasera i optičkih materijala, štampanje i forenzičko ispitivanje, kao i u laboratorijama za proučavanje hemijskih supstanci. Spektrofotometrom se može odrediti, u zavisnosti od kontrole ili kalibracije, koje supstance su prisutne u uzorku, kao i u kojoj količini putem proračuna za posmatrane talasne dužine.[18] 22
Eksperimentalni deo 3 EKSPERIMENTALNI DEO 3.1 Materijal Za analizu su korišćeni plod (pokožica, pulpa i koštica) i listovi trnjine (Prunus spinosa L. ) sa prosora oko Bele Palanke (Jugoistočna Srbija). 3.2 Reagensi i hemikalije Za analizu su korišćeni sledeći reagensi: metanol, etanol, 5% sirćetna kiselina, hlorovodonična kiselina, 0.9% natrijum-hlorid, 1.1-difenil-2-pikrilhidrazil radikal (DPPH), galna kiselina, kafeinska kiselina, kvercetin i malvidin-3-glukozid (Sigma Aldrich, Nemačka). Sve korišćenje hemikalije su bile analitičkog stepena čistoće. 3.3 Aparatura Određivanje sadržaja fenolnih jedinjenja kao i praćenje antioksidativne aktivnosti vršeno je snimanjem apsorpicionih spektara na aparatu UV/VIS spektrofotometru Agilent 8453 (slika 3.1). Slika 3.1. UV/VIS spektrofotometar 23
Eksperimentalni deo 3.4 Pripremanje uzoraka i ekstrakcija Plodovi i listovi trnjine su brani krajem septembra meseca na prostorima Bele Palanke. Od ploda se odvoja pokožica, pulpa i koštica. Koštice i listovi su usitnjeni pre analize. Odmerena količina uzorka je rastvarana u smeši rastvarača metanol, voda i 5% sirćetna kiselina i nakon 72 h čuvanja na tamnom i na sobnoj temperaturi, vršeno je centrifugiranje 10 min na 3000 obrtaja/min. Dobijeni ekstrakt ponovo je ekstrahovan sa istom smešom rastvarača i pod istim uslovima. Dobijeni ekstrakti su skupljeni i se koriste za dalju spektrofotometrijsku analizu. 3.5 Metode 3.5.1 Određivanje ukupnih fenola, flavonola i estara vinske kiseline Ukupni sadržaj fenola, flavonola i estara vinske kiseline u ekstraktima ploda trnjine i lišća određivano je po modifikovanoj Mazza metodi [10]. Spektrofotometrijski su praćene promene apsorbance na 280, 320 i 360 nm. Ukupna količina fenola u datom uzorku je proračunata na osnovu kalibracione krive standarda galne kiseline, ukupna koncentracija flavonola na osnovu kalibracione krive kvercentina, a ukupna količina estara vinske kiseline na osnovu kalibracione krive kafeinske kiseline. Rezultati su izraženi u mg/g suvog uzorka. 3.5.2 Određivanje antocijana Određivanje ukupnih antocijana vršeno je po modifikovanoj di Stefano metodi [11]. Spektrofotometrijski je praćena promena apsorbance na 540 nm. Kao standard korićen je malvidin-3-glukozid i rezultati su izraženi u mg/g suvog uzorka. 3.5.3 Određivanje antioksidativne aktivnosti Antioksidativna aktivnost uzoraka je analizirana pomoću DPPH testa [11]. Ovaj antioksidativni test se zasniva na merenju gubitka boje DPPH. radikala u metanolu promenom apsorpcije na 517 nm, koju je izaziva reakcija DPPH. i uzorka. Ekstrakti razblaženi metanolom su mešani sa sveže pripremljenim DPPH-radikalom koncentracije 24
Eksperimentalni deo 1. 10-4 M, u zapreminskom odnosu 1:1, zaštićeni od svetlosti, na sobnoj temperaturi. Nakon perioda inkubacije od 20 minuta, očitana je apsorbanca na 517 nm. Inhibicija DPPH u procentima (%) za svaki uzorak je izračunat po sledećoj jednačini: Antioksidativna aktivnost(%) =100 - ((A uzorak A blank ) / A kontrola ) x 100, gde je: A blank - apsorpcija blanka (uzorak u metanol) na 517 nm A kontrola - apsorpcija kontrolne probe (DPPH. u metanol) na 517 nm A uzorak - apsorpcija uzoraka sa DPPH. na 517 nm. 3.5.4 Odredjivanje antimikrobne aktivnosti Antimikrobna aktivnost ekstrakata je ispitivana na tri gram-negativne i tri grampozitivne bakterije (ATCC sojevi): Escherichia coli 25922, Salmonella enteritidis 13076, Proteus mirabilis 12453, Staphylococcus aureus 25923, Enterococcus faecalis 19433 i Sarcina lutea 9341. Bakterijske vrste su gajene na kosom hranljivom agaru (Mikrobiološka laboratorija, Departman za biologiju i ekologiju, Prirodno-matematički fakultet, Niš). 3.5.4.1 Priprema suspenzije Bakterijske kulture su presejane na sveži hranljivi agar i inkubirane 18 h na 37 C. Zatim su napravljene suspenzije u fiziološkom rastvoru (0.9 % NaCl) i podešene turbidimetrom na 0.5 McFarland-a, čime je postignuta gustina ćelija 1.0-1.5 x 10 8. 3.5.4.2 Antimikrobni test Antimikrobna aktivnost je testirana u mikrotitracionim pločama sa 96 bunarčića. U prvim bunarčićima (za svaki soj) je uneto 100 µl ekstrakta početne koncentracije, a zatim je napravljena serija duplih razblaženja u tečnoj podlozi MHB (Mueller Hinton Broth). Testirane koncentracije uzoraka su bile: 36.55-0.02 (pulpa), 35.87-0.02 (koštice), 35.78-0.02 (lišće), 35.91-0.02 (pokožica), 72.04-0.04 mg/ml. Ploče su inokulisane bakterijskim sojevima gde je postignuta finalna gustina ćelija od 1-2 x 10 6 CFU/mL (eng. colony forming units).posle inkubacije 24 h na 37 C i dodavanja reagensa TTC (trifenil-tetrazolium hlorid), očitana je minimalna inhibitorna koncentracija (MIC). MIC je definisan koncentracijom u prvom bunarčiću u kojem nema 25
Eksperimentalni deo vidljivog rasta i crvenog obojenja. Sadržaji bunarčića bez vidljivog rasta su prenešeni na MHA (Mueller Hinton Agar), a posle inkubacije (24 h na 37 C) je očitana i minimalna baktericidna koncentracija (MBC). Eksperiment je rađen u tri ponavljanja, sa kontrolom rasta mikroorganizama (inokulisana podloga bez ekstrakta), sterilnosti podloge (čista podloga) i pozitivnom kontrolom-antibiotikom (tetraciklin). 26
Rezultati i diskusija 4 REZULTATI I DISKUSIJA 4.1 Određivanje fenolnih jedinjenja u ekstraktima delova ploda i lišća trnjine Ukupni sadržaj fenola, flavonola i estara vinske kiseline u ekstraktima ploda trnjine i lišća određivano je po modifikovanoj Mazza metodi. Za određivanje sadržaja ukupnih fenola korišćena je galna kiselina kao standard. Sadržaj ukupnih fenola u ispitivanim uzorcima trnjine dat je na slici 4.1. Slika 4.1. Sadržaj ukupnih fenola Najmanja količina ukupnih fenola nalazi se u košticama trnjine koje a najveća količina pronađena je u lišću trnjine. 27
Rezultati i diskusija Za određivanje sadržaja estara vinske kiseline korišćena je kafeinska kiselina kao standard. Sadržaj estara vinske kiseline u ispitivanim uzorcima trnjine dat je na slici 4.2. Slika 4.2. Sadržaj estara vinske kiseline Najmanja količina estara vinske kiseline nalazi se u košticama trnjine, a najveća količina je pronađena u lišću trnjine. Za određivanje sadržaja ukupnih flavonola korišćen je kvercetin kao standard. Sadržaj ukupnih flavonola u ispitivanim uzorcima trnjine dat je na slici 4.3. Slika 4.3. Sadržaj ukupnih flavonola Najmanja količina ukupnih flavonola nalazi se u pulpi trnjine, a najveća količina pronađena je u lišću trnjine. 28
Rezultati i diskusija Određivanje ukupnih antocijana vršeno je po modifikovanoj di Stefano metodi. Za određivanje ukupnih antocijana kao standard korišćen je malvidin-3-glukozid. Sadržaj antocijana u pokožici trnjine dat je na slici 4.4. Slika 4.4. Sadržaj ukupnih antocijana Prisustvo antocijana utvrđeno je samo u pokožici trnjine a sadržaj antocijana iznosi 0.48015 mg/g suvog uzorka. Ako izvršimo upoređenje nađenih fenolnih jedinjenja u delovima ploda trnjine dobijaju se rezultati prikazani na slici 4.5. Slika 4.5. Sadržaj fenola, estara vinske kiseline i flavonola u delovima ploda trnjine 29
Rezultati i diskusija Najveća količina ukupnih fenola nađena je u pokožici a najmanja u košticama. Najveća količina estara vinske kiseline nađena je u pokožici a najmanja u košticama. Ako izvršimo upoređenje nađenih fenolnih jedinjenja u plodu trnjine u celini sa fenolnim jedinjenjima prisutnih u lišću dobijaju se rezultati prikazani na slici 4.6. Slika 4.6. Sadržaj fenolnih jedinjenja u plodu i lišću trnjine U lišću je prisutna veća količina ukupnih fenola, estara vinske kiseline i ukupnih flavonola u odnosu na plod u celini. 4.2 Određivanje antioksidativne aktivnosti u ekstraktima delova ploda i lišća trnjine Antioksidativna aktivnost uzoraka je analizirana pomoću DPPH testa. Rezultati antioksidativne aktivnosti u ispitivanim uzorcima trnjine dati su na slici 4.7. 30