Negica Kostadinović Master rad

Транскрипт

1 UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO-MATEMATIĈKI FAKULTET DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU Negica Ĉ. Kostadinović Uticaj razliĉitih rastvaraĉa na vijabilnost ćelija Staphylococcus aureus, Escherichia coli i Candida albicans Niš, 2016

2 UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO-MATEMATIĈKI FAKULTET DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU Uticaj razliĉitih rastvaraĉa na vijabilnost ćelija Staphylococcus aureus, Escherichia coli i Candida albicans Student Negica Ĉ. Kostadinović Mentor dr. Zorica Z. Stojanović-Radić Niš, 2016

3 UNIVERSITY OF NIŠ FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY The effect of different solvents on cell viability of Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Candida albicans Master thesis Student Negica Ĉ. Kostadinović Mentor PhD. Zorica Z. Stojanović-Radić Niš, 2016

4 Sažetak Globalni problem sve veće rezistencije mikroorganizama na antibiotike uzrok je potrage za novim antimikrobnim agensima. Tokom ovih istraţivanja, potrebno je da se uzorci koji se ispituju rastvore u odgovarajućem rastvaraĉu koji će omogućiti njihovo potpuno rastvaranje, dobro mešanje sa vodenom podlogom i u isto vreme što manji efekat na vijabilnost ispitivanih mikroorganizama. Cilj master rada bio je da se istraţi antimikrobni potencijal razliĉitih organskih rastvaraĉa na rast i vijabilnost mikroorganizama. Antimikrobna aktivnost datih rastvaraĉa ispitana je odreċivanjem minimalne inhibitorne koncentracije (MIK) na tri soja mikroorganizama: Escherichia coli, Staphylococcus aureus i Candida albicans. Nakon odreċivanja inhibitorne koncentracije, ispitan je efekat razliĉitih koncentracija rastvaraĉa na vijabilnost tretiranih mikroorganizama, kako bi se došlo do zakljuĉka o koncentraciji rastvaraĉa na kojoj ĉitanje MIK testirane supstance neće biti kombinacija efekta testirane supstance i rastvaraĉa. Rezultati su pokazali da rastvaraĉi imaju znaĉajno razliĉit efekat u zavisnosti od vrste mikroorganizama koji su tretirani njima. Na Gram pozitivnu bakteriju najveći efekat na vijabilnost pokazali su alkoholi, Gram negativna bakterija je imala najveću redukciju vijabilnosti nakon tretmana etil acetatom i acetonitrilom, dok je aceton najviše uticao na vijabilnost kvasca. Najmanje invazivan rastvaraĉ u sluĉaju bakterija bio je hloroform, dok je najmanji efekat na obnovljen rast populacije kvasca pokazao metanol. Kljuĉne reĉi: Antimikrobna aktivnost rastvaraĉa, aceton, acetonitril, etanol, DMSO

5 Abstract The global problem of an increasing microbial antibiotic resistance is the cause for further investigations, designed to find novel antimicrobial agents. During this testing, it is necessary to dissolve the samples in a suitable solvent. The solvent has to enable complete dissolving of the tested agent, a good mixing with an aqueous medium and the least possible influence to the viability of microorganisms as well. The goal of the master thesis was to investigate antimicrobial potential of various organic solvents on the growth and viability of microorganisms. The antimicrobial activity of the given solvent is tested by determination of minimal inhibitory concentration (MIC) of the three strains of microorganisms: Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Candida albicans. After this, in order to find the concentration of the solvent that will not affect (involve combination of effects of treated substance and solvent) reading of the MIC of investigated substance, the effect of different concentrations to the cell viability of solvent was tested. The results have shown that the effect of solvent significantly depends on the type of microorganisms which have been treated. Alcohols have had the largest effect on the viability of Gram positive bacteria. The treatment with ethyl acetate and acetonitrile resulted in the largest reduction of cell viability of Gram negative bacteria, while the acetone had the greatest influence on the viability of the yeast. In the case of bacteria, chloroform had the lowest effect to viability, while methanol caused the lowest reduction of the yeast population. Key words: Antimicrobial activity of solvents, acetone, acetonitrile, ethanol, DMSO

6 ZAHVALNICA Najsrdačnije se zahvaljujem svom mentoru dr. Zorici Stojanović-Radić na ugodnoj saradnji, velikoj pomoći i strpljenju tokom laboratorijskih istraživanja i izrade ovog master rada. Beskrajnu zahvalnost dugujem svojim roditeljima, na neizmernoj ljubavi, moralnoj podršci i razumevanju tokom studiranja. Hvala!

7 1. UVOD Antimikrobna aktivnost Mehanizam antimikrobnog delovanja Rezistencija Dimetil sulfoksid (DMSO) Acetonitril Aceton Dietil etar Etil acetat Etanol Metanol Hloroform Dosadašnja istraţivanja Opšte karakteristike ispitivanih mikroorganizama Escherichia coli Staphylococcus aureus Candida albicans CILJ ISTRAŽIVANJA MATERIJALI I METODE BAKTERIJSKI SOJEVI RASTVORI I PODLOGE MIKRODILUCIONA METODA ODREĐIVANJE VIJABILNOSTI ĆELIJA NAKON TRETMANA RAZLIĈITIM KONCENTRACIJAMA RASTVARAĈA REZULTATI I DISKUSIJA ZAKLJUĈAK LITERATURA:... 31

8 1. UVOD Poslednjih godina, širom sveta, uĉestalost rezistencije na pojedine antibiotike, postojanje rezidua antimikrobnih agenasa u namirnicama posle procesa obrade, pojava preosetljivosti na lekove, poremećaj normalne mikrobne zajednice kao i brojni negativni efekti nastali upotrebom lekova uzrokuju velike probleme u oblasti humane medicine (Nikolić et al., 2013). Razvoj antimikrobne rezistencije je prirodan fenomen. Ipak, odreċeni ljudski postupci ubrzavaju njenu pojavu i širenje. Neodgovarajuća upotreba antimikrobnih lekova, kod ljudi i ţivotinja, ide u prilog pojavi i selekciji rezistentnih sojeva, a loša prevencija infekcija i kontrola doprinose daljoj pojavi i širenju antimikrobne rezistencije. Zbog sve uĉestalije pojave rezistencije patogenih mikroorganizama javlja se potreba za novim antimikrobnim sredstvima, pri ĉemu se nauka tokom poslednjih decenija u velikoj meri posvetila prouĉavanju prirodnih metabolita, prevashodno izolovanih iz biljaka. Pri tome se najĉešće koristi metoda dilucije i to mikrodilucije, kojom se odreċuje parametar znaĉajan za procenu jaĉine antimikrobne aktivnosti testiranog agensa, a koji se zove minimalna inhibitorna koncentracija. Minimalna inhibitorna koncentracija (MIK) predstavlja najniţu koncentraciju antimikrobnog agensa koja inhibira vidljiv rast mikroorganizama nakon adekvatnog perioda inkubacije za testirani mikroorganizam. U dijagnostiĉkim labaratorijama minimalana inhibitorna koncentracija je vaţna pri odreċivanju otpornosti mikroorganizama na antimikrobni agens, kao i pri praćenju aktivnosti novih antimikrobnih agenasa (Andrews, 2001). Razliĉiti organski rastvaraĉi ĉesto se koriste za ekstrakciju kako prirodnih tako i sintetiĉkih antimikrobnih jedinjenja u cilju odreċivanja njihovih minimalnih inhibitornih koncentracija. Druga njihova primena je rastvaranje dobijenih ekstrakata koji su najĉešće u ĉvrstom stanju, a za testiranje koje se vrši u teĉnoj podlozi neophodno je da i testirane supstance budu u teĉnom stanju. Pri tome se rastvaranje ekstrakata vrši u rastvaraĉu koji je ĉist ili u rastvoru gde je njegov udeo u visokom procentu, a u cilju oĉuvanja potencijala za rastvaranje ţeljene supstance. Zbog toga se tokom testiranja javljaju problemi sa ĉitanjem rezultata jer se ispostavilo da mnogi rastvaraĉi imaju znaĉajan uticaj na redukciju vijabilnosti 1

9 ćelija i samim tim oĉitani rezultati ne mogu se pripisati samo ispitivanom ekstraktu/sintetiĉkoj supstanci, već kombinaciji efekta ispitivane supstance sa efektom rastvaraĉa, koji nazivamo sinergistiĉkim efektom. Iz navedenog razloga, bitno je ispitati uticaj ovih rastvaraĉa na rast mikroorganizama, uzimajući u obzir njihovo uĉestalo korišćenje prilikom odreċivanja MIK potencijalno novih antimikrobnih agenasa Antimikrobna aktivnost Poznato je da je upotreba supstanci sa antimikrobnim svojstvima uobiĉajena praksa najmanje par hiljada godina. Antiĉki Egipćani i antiĉki Grci koristili su specifiĉne ekstrakte iz buċi i biljki za tretiranje infekcija (Wainwright, 1989). Pod antimikrobnom aktivnošću podrazumeva se sposobnost nekih agenasa da eliminišu mikroorganizme delujući na razliĉite metaboliĉke i strukturne ciljeve npr. ometanjem sinteze nukleinskih kiselina ili inhibicijom sinteze peptidoglikana (Bobbarala, 2012). S obzirom da se u svakodnevnoj praksi antimikrobni agens i antibiotik poistovećuju, odnosno koriste kao sinonimi, potrebno je ukazati na oba pojma. Pojam antibiotik podrazumeva supstancu koju stvara neki mikroorganizam, a koja u niskoj koncentraciji zaustavlja rast ili ubija jednu ili više drugih vrsta mikroorganizama. Pojam antimikrobni agens obuhvata, uz antibiotike, bilo koju supstancu prirodnog, polusintetskog ili sintetskog porekla koja koĉi rast ili ubija mikroorganizam (uglavnom više razliĉitih vrsta mikroorganizama) (Mejuzović, 2011). 2

10 1.2. Mehanizam antimikrobnog delovanja Antimikrobni agensi poput antibiotika ostvaruju svoje delovanje na razliĉite naĉine. Neki od njih dovode do poremećaja permeabilnosti ćelijske membrane, dok neki inhibiraju sintezu ćelijskog zida, proteina, nukleinskih kiselina i metabolizma bakterija. Inhibicija sinteze ćelijskog zida Struktura koja daje ĉvrstoću ćelijskom zidu i rezistenciju na osmotsku lizu kod Gram pozitivnih i Gram negativnih bakterija je peptidoglikan. Kod Gram pozitivnih bakterija, peptidoglikan predstavlja spoljašnji sloj ćelijske membrane, dok kod Gram negativnih bakterija postoji i spoljašnja membrana izvan vrlo tankog peptidoglikanskog sloja (Ivanĉević et al. 1997). Antimikrobni agens inhibira, odnosno zaustavlja stvaranje hemijskih veza izmeċu peptidoglikana u ćelijskom zidu patogena. Ova inhibicija se ostvaruje aktiviranjem enzima koji kida veze peptidoglikana i na taj naĉin dolazi do degradacije zida, što dovodi do inhibicije rasta i u većini sluĉajeva smrti bakterije (Bulat et al. 1999). Inhibicija sinteze proteina Većina antimikrobnih supstanci koje koĉe proteosintezu deluju na bakterijske ribosome što dovodi do prekida njihove regularne aktivnosti. Aminoglikozidi postiţu baktericidni efekat ireverzibilnim vezivanjem za 30S subjedinicu ribozoma bakterija, ĉime blokiraju poĉetak sinteze proteina (Ivanĉević et al. 1997). Inhibicija nukleinskih kiselina Do inhibicija sinteze nukleinskih kiselina dolazi tako što antibiotik direktno degradira DNK i RNK molekule ili se vezuje na enzime koji upravljaju DNK replikacijom, tipa DNK polimeraza I (Bulat et al. 1999). Inhibicija metabolizma bakterije Metabolizam je jedan od najvaţnijih procesa svih organizma, pomoću kojeg ćelije dolaze do energije za razne druge procese. U sluĉaju da doċe do degradacije enzima koji uĉestvuju u metabolizmu, ćelije su nesposobne za normalno funkcionisanje (Bulat et al. 1999). Antimetaboliti su jedinjenja koji interferiraju sa bakterijskom sintezom folne kiseline. 3

11 Inhibicija sinteze folata dovodi do prestanka rasta, a u nekim sluĉajevima i do smrti bakterijske ćelije (Ivanĉević et al. 1997). Poremećaj permeabilnosti ćelijske membrane U ovom sluĉaju antimikrobni agensi ponašaju se kao katjoni, površinski aktivne komponente koje remete permeabilnost spoljašnje i citoplazmatske membrane Gram negativnih bakterija (Ivanĉević et al. 1997). 4

12 1.3. Rezistencija Rezistencija tj. otpornost na antibiotike je forma otpornosti na antimikrobne agense pri kojoj populacije mikroorganizama, obiĉno bakterijskih vrsta, imaju sposobnost preţivljavanja prilikom izlaganja jednom ili grupi antibiotika. Patogeni koji su otporni na višestruke antibiotike smatraju se multirezistentnim mikroorganizmima. Antimikrobni agensi, kao što su antibiotici, dramatiĉno su povećali mogućnost preţivljavanja infektivnih bolesti od njihovog uvoċenja. Sintetiĉki antibiotici od svog otkrića u dvadesetom veku u velikoj meri su uticali na smanjenje rizika od pojave zaraznih bolesti. MeĊutim, njihovom prekomernom upotrebom, mnogi mikroorganizmi postali su rezistentni na njih. Poslednjih godina bakterijske infekcije poput meningitisa i polnih bolesti sve su uĉestalije, što je posledica pojave rezistencije bakterija na sintetiĉke antibiotike (Russell, 2003). Ta otpornost mikroorganizama postala je globalna pretnja. Rezistencija se moţe razviti mutacijom postojećih ili nastankom novih gena. Novi geni koji posreduju rezistenciju obiĉno se šire od ćelije do ćelije pomoću mobilnih genetskih elemenata kao što su plazmidi, transpozoni ili bakteriofagi. Glavni mehanizmi koje bakterije koriste u odbrani od delovanja antimikrobnih agenasa su destrukcija agensa, alteracija, smanjenje permeabilnosti ćelijskog omotaĉa za agens i aktivna eliminacija jedinjenja iz unutrašnjosti ćelije. U jednostavnijim sluĉajevima, organizmi otporni na lekove stekli su otpornost na antibiotike prve linije, pa je neophodna primena agenasa druge linije. Tipiĉno, agens prve linije se bira na osnovu nekoliko faktora ukljuĉujući bezbednost, dostupnost i cenu. Agens druge linije obiĉno ima širi spektar, manje povoljan odnos profila rizika i koristi kao i višu cenu. U sluĉaju pojedinih multirezistentnih patogena, došlo je do sticanja rezistencije na antibiotike druge, ili ĉak treće linije. Dobar primer takvog organizma je Staphylococcus aureus u pojedinim intrahospitalnim sredinama. Situacija je ozbiljna jer su antimikrobni agensi postali osnovni lek u modernoj medicini, što bi moglo da ostavi trajne posledice na zdravstvenu industriju. 5

13 1.4. Dimetil sulfoksid (DMSO) Slika. 1 Dimetil sulfoksid Dimetil sulfoksid (CH 3 SOCH 3 ) je organosumporno jedinjenje. Ova bezbojna teĉnost je vaţan visoko polarni aprotonski rastvaraĉ, koji jako dobro rastvara polarna i nepolarna jedinjenja i meša se sa širokim nizom organskih rastvaraĉa, kao i sa vodom. DMSO se ĉesto koristi kao rastvaraĉ za hemijske reakcije u kojima uĉestvuju soli, na primer Finkelsteinove reakcije i druge nukleofilne supstitucije. On se ekstenzivno koristi kao ekstraktant u biohemiji i ćelijskoj biologiji. Zbog svoje visoke taĉke kljuĉanja (189 C), DMSO sporo isparava pod normalnim atmosferskim pritiskom. DMSO nalazi sve veću primenu u proizvodnim procesima mikroelektronskih ureċaja. Zbog njegovih sposobnosti rastvaranja mnogih vrsta jedinjenja DMSO je uobiĉajeni rastvaraĉ u menadţmentu hemikalija i testiranju visokog kapaciteta koji su integralni deo procesa razvoja lekova. Koristi se i kao promotor penetracije leka kroz koţu, jer je utvrċeno da povećava efikasnost idosuridina na herpes simpleks infekcije (Randhawa, 2006). U koncentraciji od 5%, DMSO se dodaje suspenzijama gljiva kao krioprotektant za ĉuvanje štok kultura na jako niskim temperaturama (-80 C). 6

14 1.5. Acetonitril Slika 2. Acetonitril Acetonitril (CH 3 CN) je organsko jedinjenje koje sadrţi dva ugljenikova atoma. Ovaj najjednostavniji organski nitril je bezbojna teĉnost koja se uglavnom dobija kao nusprodukt proizvodnje akrilonitrila. Rastvara se u vodi i meša se sa nizom organskih rastvaraĉa, ali ne i sa zasićenim ugljovodonicima. Koristi se kao polarni rastvaraĉ u organskim sintezama i u preĉišćavanju butadiena u rafinerijama. Acetonitril ima znaĉajnu ulogu kao dominantan rastvaraĉ koji se koristi u proizvodnji DNK oligonukleotida iz monomera. Kao rastvaraĉ primenjuje se i u farmaceutskoj industriji, kao i u proizvodnji fotografskog filma Aceton Slika 3. Aceton Aceton (CH 3 COCH 3 ) je najednostavnije organsko jedinjenje u klasi ketona. To je bezbojna, isparljiva i lako zapaljiva teĉnost. Aceton se rastvara u vodi, koristi se kao rastvaraĉ i u proizvodnji plastike, lekova i drugih hemikalija, a u labaratoriji ĉesto sluţi kao sredstvo za dezinfekciju. TakoĊe se koristi u proizvodnji metil metakrilata i bisfenola A. U domaćinstvima se ĉesto koristi kao odstranjivaĉ laka za nokte i kao razreċivaĉ boja i lakova. 7

15 1.7. Dietil etar Slika 4. Dietil etar Dietil etar (CH 3 CH 2 OCH 2 CH 3 ) je bezbojna, visoko isparljiva, zapaljiva teĉnost sa karakteristiĉnim mirisom. U labaratoriji se koristi kao rastvaraĉ, a svojevremeno se koristio kao opšti anestetik. Delimiĉno se rastvara u vodi. Kao rastvaraĉ vaţnu ulogu ima i u proizvodnji celulozne plastike. Zbog visoke isparljivosti i niske temperature samozapaljivanja koristi se kao poĉetni fluid dizel i benzinskih motora Etil acetat Slika 5. Etil acetat Etil acetat (C 4 H 8 O 2 ) je organsko jedinjenje, vizuelno bezbojno, specifiĉnog prijatnog mirisa. Predstavlja estar etanola i sirćetne kiseline. Meša se sa svim ostalim organskim rastvaraĉima, uz potpuno mešanje sa vodom. Koristi se kao rastvaraĉ u raznim sferama industrijske proizvodnje kao npr. u kozmetiĉkoj, farmaceutskoj, industriji boje i lakova kao i u industriji ulja i maziva. TakoĊe se koristi za dekofeinizaciju kafe i ĉajeva. 8

16 1.9. Etanol Slika 6. Etanol Etanol (CH 3 CH 2 OH) je organsko jedinjenje koje ĉine ugljenik, vodonik i jedna OHgrupa, odnosno predstavnik alkohola. Etanol je lako isparljiva, zapaljiva bezbojna teĉnost specifiĉnog oštrog mirisa. Dobar je rastvaraĉ, meša se sa vodom u svim odnosima, a rastvara veliki broj kako polarnih tako i nepolarnih jedinjenja. Glavni je sastojak svih alkoholnih pića. U koncentraciji od 70%, etanol je visoko efikasan antiseptik. Koristi se za dezinfekciju radnih površina, instrumenata i koţe Metanol Slika 7. Metanol Metanol (CH 3 OH) je alkohol sa jednim ugljenikovim atomom, bezbojna, zapaljiva, veoma isparljiva teĉnost neprijatnog mirisa. Meša se u svim odnosima sa vodom, etanolom, etrom i mnogim drugim organskim rastvaraĉima. Rastvara mnoge neorganske soli, a u manjoj meri masti, ulja i smolne kiseline. Najviše se upotrebljava za proizvodnju formaldehida i antifriza. Metanol se takoċe koristi kao sirovina za proizvodnju sirćetne kiseline, nekih polimernih i plastiĉnih masa, zatim kao organski rastvaraĉ i razreċivaĉ u proizvodnji uljanih boja. Upotebljava se kao pogonsko gorivo i za denaturaciju etanola. 9

17 1.11. Hloroform Slika 8. Hloroform Hloroform (CHCl 3 ) je organsko jedinjenje, bezbojna, gusta teĉnost, intenzivnog mirisa. Upotrebljava se kao rastvaraĉ za širok spektar organskih supstanci, a ranije se upotrebljavao i u proizvodnji freona za rashladne ureċaje. Koristi se u formulaciji pesticida, kao rastvaraĉ masti, ulja, smole i voskova, kao sredstvo za ĉišćenje, u gašenju poţara i industriji guma. U medicini se nekada koristio kao opšti anestetik. 10

18 1.12. Dosadašnja istraživanja U cilju ispitivanja antimikrobne aktivnosti razliĉitih biljnih metabolita, za njihovu ekstrakciju koriste se razliĉiti organski rastvaraĉi, meċutim u dostupnoj literaturi nema mnogo podataka o njihovoj samostalnoj antimikrobnoj aktivnosti. U istraţivanju koje je obuhvatilo 43 vrste mikroorganizama ukljuĉujući i Escherichia coli, Candida albicans, Staphyilococcus aureus, DMSO je pokazao visoki inhibitorni efekat. Minimalna inhibitorna koncentracija DMSO-a za C. albicans i S. aureus bila je 8.00%, dok je za E. coli 10.00%. U ovom radu takoċe je odreċena minimalna mikrobicidna koncentracija (MMK) DMSO-a. MMK dimetil sulfoksida za E. coli bila je 20.00%, dok je za C. albicans i S. aureus 30.00% (Basch & Gadebusch, 1968). Ispitivanje antimikrobne aktivnosti dimetil sulfoksida (DMSO) koje je godine sproveo Howard sa saradnicima na tri mikroorganizma: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa i Bacillus megaterium, pokazalo je da sa povećanjem koncentracije DMSO inhibira rast sve tri vrste bakterija, a da pri koncentraciji od 15.00% u potpunosti eliminiše ove bakterije. Najmanju otpornost na ovaj rastvaraĉ pokazala je Pseudomonas aeruginosa, kod koje DMSO pri koncentraciji od 8.00% inhibira rast preko 90% populacije. Hili et al. je godine utvrdio da primena DMSO-a kao rastvaraĉa moţe da ima loš uticaj na aktivnost ispitivanih etarskih ulja. U istraţivanju koje je ukljuĉivalo odreċivanje antimikrobne aktivnosti pedeset i jednog etarskog ulja, pomenuti istraţivaĉi su utvrdili da je etarsko ulje cimeta najaktivnije i testirali niţe koncentracije ovog ulja korišćenjem metode mikrodilucije, u kojoj je ulje bilo nerastvoreno i rastvoreno korišćenjem DMSO-a. Rezultati su pokazali da je ulje u ĉistom stanju imalo 50 puta bolji antimikrobni efekat nego kada je rastvarano u DMSO-u. Istraţivanje koje je ispitivalo uticaj razliĉitih koncentracija (2.0, 1.0 i 0.5%) DMSO-a na rast osam Candida vrsta pokazalo je da on pri koncentraciji od 2.0% znaĉajno redukuje njihov rast. Suprotan sluĉaj je utvrċen za koncentraciju od 1.0% i niţe, koje nisu pokazale znaĉajan efekat na kinetiku rasta (Rodriguez-Tudela et al., 2001). U studiji koja je ipitivala efekat DMSO-a u koncentracijama % na dermatofite (Trichophyton mentagrophytes, T.rubrum, Epidermophyton floccosum i Microsporum canis). Pri koncentraciji od 10.00%, rast svih gljiva bio je inhibiran, dok su koncentracije izmeċu 1.00% i 5.00% pokazivale dozno zavistan inhibitorni efekat. Koncentracije niţe od 1.00% pokazale su varijabilni efekat u zavisnosti od vrste, dok je 0.25% DMSO veoma znaĉajno redukovao rast Microsporum canis. UtvrĊeno je da niţe koncentracije utiĉu na povećanje aktivnosti antifungalnih lekova (Randhawa, 2006). 11

19 Rezultate antimikrobne aktivnosti DMSO-a protiv bakterija E. coli i S. aureus koji su bili sliĉni rezultatima iz godine, pokazala je studija koju je sproveo Hassan (2014). U ovom radu rezultati su pokazali da je minimalna inhibitorna koncentracija za E. coli bila 25.00%, a za S. aureus 28.00%. Najnovije istraţivanje vezano za efekat DMSO-a na mikroorganizme vršeno je tretiranjem Escherichia coli ovim jedinjenjem, koje se smatra antioksidansom. Efekat je bio takav da je tretman DMSO-om inhibirao letalni efekat antimikrobnih lekova ampicilina, kanamicina i dva kvinolona. UtvrĊena zaštita pripisana je smanjenoj akumulaciji slobodnih radikala zbog tretmana antioksidansom (DMSO-om), a rezultati ovog istraţivanja sugerisali su oprez pri rastvaranju antimikrobnih supstanci za ciljeve brzih antimikrobnih testova (Mi et al., 2016). Studija u kojoj je ispitivan efekat razliĉitih koncentracija (1.0% - 6.0%) organskih rastvaraĉa (DMSO, etanol, metanol) na rast 5 vrsta bakterija (Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas oleovorans, Vibrio cholerae, Shigella flexner, Salmonella paratyph), pokazala je da svi rastvaraĉi znaĉajno inhibiraju rast bakterija pri koncentraciji od 4.0% i više, s tim što najveću otpornost pokazuje vrsta S. Flexner (Wadhwani et al., 2008). 12

20 1.13. Opšte karakteristike ispitivanih mikroorganizama Mikroorganizmi su veoma velika i raznovrsna grupa organizama koja obuhvata jednoćelijske, višećelijske organizme, ali i organizme bez ćelijske graċe. U ovu grupu se ubrajaju virusi, bakterije, alge, gljive, lišajevi i protozoe. Pored velike heterogenosti, ove organizme karakteriše nekoliko zajedniĉkih osobina, kao što su, velika brzina razmnoţavanja, mikroskopska razmera, brz metabolizam, ali i velika raznolikost enzima i biohemijskih procesa. Od svih mikroorganizama bakterije su najzastupljenije u prirodi. Bakterije su najbrojnija grupa organizama, imaju veoma jednostavnu graċu (Malkoviĉ & Stanojević, 2013). Mogu imati loptast, štapićast, konĉast i spiralni oblik, ali pored ova ĉetiri osnovna oblika javljaju se i mnogi izvedeni oblici. Izvedeni oblici su rezultat specifiĉnog rasporeda bakterijskih ćelija nakon deoba. Najveći broj bakterija obrazuje jedna ćelija, meċutim ima i bakterija koje predstavljaju konĉaste ili grozdaste skupine velikog broja ćelija-kolonije. Ima ih u vodenoj, vazdušnoj sredini, zemljištu, pa ĉak i u sredinama gde drugi organizmi ne bi opstali (jako kisele ili bazne sredine, sredine sa visokim salinitetom, termalni izvori). Prema sastavu ćelijskog zida i bojenju postupkom po Gramu bakterije se dele na Gram pozitivne i Gram negativne bakterije. Gram negativne bakterije imaju jedan sloj lipopolisaharida koji pokriva njihov ćelijski zid, dok Gram pozitivne bakterije nemaju taj sloj, zbog ĉega se Gram negativne boje crveno, a Gram pozitivne boje ljubiĉasto. Osim razlike u graċi ćelijskog zida ove dve grupe bakterija se razlikuju i po mnogim drugim osobinama, a najvaţnija je njihova razliĉita osetljivost na antibiotike. 13

21 Escherichia coli Slika 9. Escherichia coli Escherichia coli je Gram-negativna bakterija pokretni fakultativno anaerobni bacil, sa peritrihalnim flagelama. To su pravi štapići, preĉnika μm, duţine 2-4 μm, rasporeċeni su pojedinaĉno ili u nepravilnim skupinama. Escherichia coli je najvaţniji pripadnik crevne flore ĉoveka i ţivotinja (Švabić-Vlahović, 2005). Mesecima moţe ţiveti u vodi i zemlji, a na razliĉitim namirnicama se veoma brzo razmnoţava. Na ĉvrstim podlogama stvara okrugle, glatke kolonije. Sojevi sa kapsulom razvijaju sluzave kolonije. Na nekim podlogama kolonije imaju metalni sjaj, a na krvnom agaru neki sojevi formiraju zonu hemolize (Radulović, 2012). Otporna je na temperature ispod nule, a toplota od 60 C je ubija za minuta (Jovanović & Berger-Jekić, 1997). Escherichia coli moţe da izazove brojna gnojna i crevna oboljenja. Escherichia coli je normalni deo mikroflore crevnog trakta toplokrvnih ţivotinja. Naseljava crevni trakt ĉoveka gde sintetiše vitamine (B12), antibiotike, uĉestvuje u transformaciji ugljenih hidrata i proteina. E. coli je klasifikovana na veći broj serotipova na osnovu prisustva somatskog (O), kapsularnog (K) i flagelarnog (H) antigena (Petrović et al., 2007). Sojevi koji imaju enterotoksin i druge faktore virulencije uzroĉnici su dijareje, infekcija urinarnog trakta, septikemije i meningitisa. Zbog toga se E. coli svrstava u uslovno patogene bakterije ili tzv. oportuniste (Pecić & Jelesić, 2008). 14

22 Staphylococcus aureus Slika 10. Staphylococcus aureus Predstavnici ovog roda su loptastog oblika, najĉešće rasporeċeni u vidu grozdastih formacija. Gram pozitivna je. Spada u fakultativno anaerobne bakterije, jer joj je za dobijanje energije potreban kiseonik, ali moţe opstati i bez njega. Nemaju organele za kretanje dok neki sojevi imaju kapsulu. Sojevi sa kapsulom su virulentniji od sojeva bez nje, jer ih ona štiti od fagocita. Staphylococcus aureus raste na većini hranljivih podloga. Na ĉvrstim podlogama formira okrugle, neprozirne, glatke, sjajne kolonije veliĉine 2 mm posle inkubacije do 24 h. Kolonije mogu biti pigmentisane. Tako se razlikuju zlatnoţute, svetloţute, krem ili bele kolonije (Radulović, 2012). Izuzetno je otporna, moţe dugo da opstane van tela domaćina i široko je rasprostranjena u prirodi. Obzirom da S. aureus ispoljava veliku tolerantnost prema visokim koncentracijama kuhinjske soli i šećera, ĉesto se javlja kao kontaminant slanih i slatkih namirnica. Staphylococcus aureus je producent ekstracelularnih, termostabilnih enterotoksina (Samardţija et al., 2007). Moţe da izazove oboljenja gotovo svih organa i tkiva ĉovekovog organizma. Produkuje beta-laktamaze i druge mehanizme rezistencije na antibiotike. Neke od bolesti koje S. aureus moţe da izazove su: koţne infekcije, respiratorne infekcije, endokarditis, osteomijelitis (Švabić-Vlahović, 2005). Bolesti koje izaziva ovaj stafilokok mogu biti invazivne (prodorom bakterije u organizam), intoksikacije (izluĉuje toksine koji su odgovorni za poremećaje, npr. konzumiranje pokvarenih namirnica) i kombinacijom ove dve grupe (Jovanović, 1999). 15

23 Candida albicans Slika 11. Candida albicans Rod Candida je vrstama brojan i vrlo heterogen rod, obuhvata nesavršene forme kvasca, svrstane u podrazdeo Ascomycotina. Vrste koje pripadaju ovom rodu razmnoţavaju se vegetativno-pupljenjem. Usled neodvajanja pupoljaka, obrazuju pseudomiceliju sa razliĉitim stepenom prelaska ka pravoj miceliji. Na pseudomiceliji se uoĉavaju karakteristiĉna suţenja na mestima pregrada. U procesu analognom pupljenju, mogu da formiraju blastospore (Carlile et al., 2006). Ćelije Candida su ovalnog oblika, glatke, beloţute boje, dijametra oko 4 μm. Optimalna temperatura za rast je 25 C, a dobro uspeva i na 37 C. Vrsta je pleomorfna, što znaĉi da moţe imati više morfoloških formi (blastokonidije i hifalne forme) (Stojanović-Radić, 2011). Promena oblika zavisi od velikog broja faktora: temperature, ph, odnosa koncentracije CO 2 i O 2, veliĉine inokuluma i sastava podloge za rast (Deva, 2010). Dovodi do kvarenja mleĉnih proizvoda, voća i povrća. Candida albicans izaziva oboljenja poznata kao kandidijaze. Nalazi se u koţi, ustima i unutrašnjim organima (Ranković, 1996). Infekcije nastaju onda kada ostala bakterijska kompetitorska flora biva limitirana upotrebom antibiotika koji nemaju fungicidno delovanje. 16

24 2. CILJ ISTRAŽIVANJA UtvrĊivanje antimikrobne aktivnosti acetona, acetonitrila, dietil-etra, etil-acetata, dimetil-sulfoksida (DMSO), etanola, metanola i hloroforma na rast bakterija Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans u in vitro uslovima. OdreĊivanje minimalne inhibitorne (MIK) i minimalne baktericidne koncentracije (MBK) ispitivanih rastvaraĉa OdreĊivanje efekta inhibitornih i subinhibitornih koncentracija pomenutih rastvaraĉa na vijabilnost ispitivanih mikroorganizama Donošenje zakljuĉka o najboljem rastvaraĉu za rastvaranje biljnih ekstrakata dobijenih razliĉitim rastvaraĉima za potrebe njihovog antimikrobnog testiranja (mikro)dilucionom metodom 17

25 3. MATERIJALI I METODE 3.1. BAKTERIJSKI SOJEVI Za ispitivanje antimikrobne aktivnosti razliĉitih rastvaraĉa korišćeni su sledeći mikroorganizmi, koji predstavljaju referentne sojeve iz Ameriĉke kolekcije kultura sojeva (American Type Culture Collection ATCC): Escherichia coli (Gram-negativna bakterija), ATCC 8739 Staphylococcus aureus (Gram-pozitivna bakterija), ATCC 6538 Candida albicans (kvasac), ATCC RASTVORI I PODLOGE Organski rastvaraĉi: Aceton, Acetonitril, Dietil etar, Dimetil-sulfoksid (DMSO), Etanol, Etil-acetat, Hloroform, Metanol. Fiziološki rastvor je 0.9% (m/v) rastvor natrijum hlorida u destilovanojsterilisanoj vodi. Dobija se rastvaranjem 0.9 g NaCl u 100 ml destilovane vode. Hranljivi agar je homogen, rastresit prah svetlo ţute boje. Primenjuje se za kultivisanje velikog broja mikroorganizama. Jedan litar gotove podloge sadrţi: pepton g, mesni ekstrakt 3.00 g, natrijum hlorid (NaCl) 5.00 g, kalijum fosfat 0.3 g, agar-agar g. Priprema ove podloge vršena je suspendovanjem g suve podloge u 1000 ml destilovane vode. Nakon stajanja od 15 minuta i inicijalnog zagrevanja na rešou radi potpunog rastvaranja, vršena je sterilizacija podloge autoklaviranjem u trajanju od 20 minuta na 121 C. Miler Hinton bujon je podloga namenjena za odreċivanje minimalnih inhibitornih koncentracija (MIK) antimikrobnih agenasa metodom dilucije u bujonu. Jedan litar gotove podloge sadrţi: mesni ekstrakt g, kazein hidrolizat g, štirak 1.50 g. Priprema ove podloge vršena je suspendovanjem g suve podloge u 1000 ml destilovane vode. Nakon stajanja od 15 minuta i inicijalnog zagrevanja na rešou radi potpunog rastvaranja, vršena je sterilizacija podloge autoklaviranjem u trajanju od 20 minuta na 121 C. 18

26 Saburo dekstrozni agar je podloga koja sadrţi 4.0% dekstroze i korišćena je za kultivaciju Candida albicans. Priprema ove podloge vršena je suspendovanjem g praha podloge u 1000 ml hladne destilovane vode. Nakon stajanja od 15 minuta i inicijalnog zagrevanja na rešou radi potpunog rastvaranja, vršena je sterilizacija podloge autoklaviranjem u trajanju od 20 minuta na 121 C MIKRODILUCIONA METODA Za ispitivanje antimikrobne aktivnosti organskih rastvaraĉa (aceton, acetonitril, dietiletar, etil-acetat, etanol, metanol, hloroform, dimetil sulfoksid) korišćena je mikrodiluciona metoda na mikrotitarskim ploĉama. OdreĊivana je minimalna inhibitorna koncentracija (MIK) serijskim razreċivanjem organskih rastvaraĉa u zasejanom bujonu. Od prekonoćne kulture E. coli, S. aureus i C. albicans napravljena je suspenzija u sterilnom fiziološkom rastvoru. Turbiditet suspenzije je podešen tako da odgovara turbiditetu 0.5 McFarland-a koji odgovara koncentraciji bakterija od ~2 x 10 8 CFU/ml (Colony Forming Units - jedinica za formiranje kolonija). Za podešavanje turbiditeta suspenzije korišćen je McFarland - densitometar (DEN-1, Biosan). Mikrodilucioni test izvoċen je na mikrotitar ploĉama sa 96 bunarĉića. 19 Slika 12. Mikrotitar ploĉa Test mikrodilucije raċen je u Miler Hinton bujonu. Zasejavanje podloge vršeno je pomoću suspenzije prethodno podešenog turbiditeta. Nakon pravljenja suspenzije,

27 mikrotitarske ploĉe punjene su sa po 150 μl Miler Hinton bujona kome je dodat odgovarajući volumen pripremljene suspenzije u cilju dobijanja finalne koncentracije ćelija od ~ 10 6 CFU/ml. Ovako pripremljenoj podlozi mikrotitar ploĉa dodati su organski rastvaraĉi u ĉetiri opadajuće koncentracije (20.0%, 10.0%, 5.00%, 2.50%) i ona je inkubirana 24 h na 37 C. Nakon perioda inkubacije, oĉitavani su rezultati ODREĐIVANJE VIJABILNOSTI ĆELIJA NAKON TRETMANA RAZLIĈITIM KONCENTRACIJAMA RASTVARAĈA U cilju odreċivanja vijabilnosti ćelija mikroorganizama tretiranih razliĉitim subinhibitornim koncentracijama rastvaraĉa, iz tretiranih bunarĉića mikrotitar ploĉe u kojima je primećen vidljiv rast, uziman je uzorak unapred odreċenog volumena, pravljeno serijsko razreċenje (faktor razreċenja 10 x) i iz svakog razreċenja mikropipetom je vršeno zasejavanje uzorka (10 µl) na ĉvrst Hranljivi agar. Zatim su ploĉe inkubirane 24 h pri temperaturi od 37 C. Nakon inkubacije, vršeno je brojanje poraslih kolonija i proraĉun broja ćelija po mililitru u poĉetnom uzorku ćelija tretiranih ispitivanim rastvaraĉima. Preraĉunavanje broja ćelija po ml vršeno je korišćenjem sledeće formule: N = broj kolonija x faktor korekcije do 1 ml x razblaţenje Isti postupak je ponovljen za sve ispitivane rastvaraĉe. Zasejavanje svakog uzorka vršeno je u triplikatu i prezentovane vrednosti predstavljaju srednju vrednost ova tri ponavljanja. 20

28 4. REZULTATI I DISKUSIJA U ovom radu ispitivana je antimikrobna aktivnost osam organskih rastvaraĉa u ĉetriri razliĉitih koncentracija na mikroorganizme: Staphylococcus aureus, Escherichia coli i Candida albicans. Mikrodilucionom metodom odreċene su minimalna inhibitorna koncentracija (MIK) i minimalna baktericidna koncentracija (MBK). Tabela 1. Antimikrobna aktivnost (MIK/MBK) razliĉitih koncentracija organskih rastvaraĉa na Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus MIK MBK ACETON ACETONITRIL DIETIL-ETAR ETIL-ACETAT ETANOL METANOL HLOROFORM DIMETIL SULFOKSID U Tabeli 1. prikazani su rezultati antimikrobne aktivnosti ispitivanih rastvaraĉa u odnosu na bakteriju Staphylococcus aureus, dobijeni mikrodilucionom metodom. Rezultati su pokazali da je ova bakterija pokazala izuzetnu otpornost na delovanje većine rastvaraĉa, koji su uglavnom inhibitorno delovali tek pri visokim koncentracijama od 20.0%. Za razliku od većine ispitivanih rastvaraĉa, etanol i metanol su pokazali najveću toksiĉnost u odnosu na ovu Gram pozitivnu bakteriju, delujući inhibitorno pri 10.0% (metanol) i 5.0% (etanol). Posmatrajući rezultate mikrobicidne aktivnosti, samo tri rastvaraĉa (dietil etar, etanol i dimetil sulfoksid) su je pokazali u testiranom opsegu koncentracija i to pri najvišoj koncentraciji od 20.0%. 21

29 Vijabilnost vrste Staphylococcus aureus nakon kontakta sa razliĉitim koncentracijama rastvaraĉa 1.00E E E E E E E E E E+00 Aceton Acetonitril Dietil etar Etil acetat Etanol Metanol Hloroform DMSO IN 20% 10% 5% 2.50% Control Grafik 1. Uporedni prikaz minimalnih inhibitornih koncentracija organskih rastvaraĉa na vrstu Staphylococcus aureus Iz Grafika 1. mogu se videti rezultati dobijeni brojanjem ćelija izraslih iz uzorka bujona sa ćelijama tretiranim razliĉitim koncentracijama testiranih rastvaraĉa. UtvrĊeno je da u odnosu na inicijalni i krajnji broj ćelija, rastvaraĉi pokazuju razliĉite obrasce inhibicije rasta tretirane populacije stafilokoke. Pri koncentraciji od 2.50%, brojnost ćelija je bila znaĉajnije razliĉita u odnosu na kontrolu samo u sluĉajevima DMSO-a i metanola, a što je iznosilo oko tri puta manje u odnosu na netretiranu kontrolu. Ovakva razlika statistiĉki ne predstavlja znaĉajnu razliku izmeċu tretiranih i netretiranih populacija i moţe se svesti na nivo sluĉajne greške. Zbog toga sa velikom sigurnošću moţemo reći da nijedan od testiranih rastvaraĉa pri ovoj koncentraciji nema inhibitorni efekat na stafilokoku i da su svi rastvaraĉi pri ovoj koncentraciji bezbedni za testiranje antimikrobnog efekta neke supstance. Posmatrajući efekat 5.0% koncentracije razliĉitih rastvaraĉa, moţe se uoĉiti da su aceton, acetonitril, hloroform i DMSO imali najmanji efekat na vijabilnost ćelija, dok su dietil etar, etil acetat, metanol i etanol redukovali veliĉinu tretirane populacije za oko 10 puta u poreċenju sa kontrolom, netretiranom populacijom. Pri koncentraciji od 10.0% rastvaraĉa, koju većina istraţivaĉa koristi kao bezbednu pri testiranju antimikrobne aktivnosti, ispostavilo se da su svi ispoljili efekat na vijabilnost i redukovali veliĉinu populacije za oko 22

30 10 puta. MeĊutim, meċu njima bila su dva rastvaraĉa koja su pokazala još veću toksiĉnost na ćelije, i to metanol, koji je redukovao brojnost ćelija sa 3.6 x 10 8 na 4 x 10 5 (redukcija od 1000 puta) i etanol koji je populaciju iste veliĉine smanjio na 3.7 x 10 6 (100 puta). Zbog navedenih rezultata, ova dva rastvaraĉa se pri koncentraciji od 10.0% nikako ne smeju koristiti kao finalne koncentracije rastvaraĉa za antimikrobno testiranje, jer bi došlo do interferencije pri ĉitanju rezultata za testiranu supstancu (laţnog povećanja efekta testirane supstance što bi se greškom moglo pripisati samo njoj, a u pitanju je sinergizam sa rastvaraĉem). Najveća testirana koncentracija od 20.0% imala je mikrobicidni efekat u sluĉaju tri rastvaraĉa (dietil etar, etanol i DMSO), pa pri njima nije ni bilo nikakvog porasta. Sa druge strane, kao rastvaraĉi sa izuzetno slabim efektom na vijabilnost (posmatrajući konkretnu visinu koncentracije), pokazali su se aceton, acetonitril i hloroform, pri ĉemu je redukcija kod najmanje aktivnog hloroforma pri najvišoj koncentraciji od 20% iznosila svega 10 puta u odnosu na kontrolnu veliĉinu populacije bakterija. Ovo ukazuje na potencijal ovog jedninjenja za korišćenje u svrhe rastvaranja pri testiranju antimikrobne aktivnosti prirodnih jedinjenja. Jedini problem koji moţe biti ograniĉavajući za njegovu primenu je slabija sposobnost rastvaranja (manja polarnost) u odnosu na druge rastvaraĉe, kao i niska temperatura evaporacije, što moţe uticati na homogenost rastvorene supstance u bujonu nakon odreċenog vremena inkubacije. Sliĉna situacija je i sa acetonitrilom, dok aceton ima bolje navedene karakteristike u odnosu na hloroform i acetonitril, a u isto vreme moţe biti korišćen u uobiĉajenoj koncentraciji od 10% na ovaj organizam zbog odsustva znaĉajnog dejstva na vijabilnost stafilokoke. U radu (Wadhwani et al., 2008) u kojem je ispitivan uticaj razliĉitih koncentracija (1.0%-6.0%) organskih rastvaraĉa (DMSO, etanol i metanol) na rast bakterija (Staphyilococcus epidermidis, Pseudomonas oleovorans, Vibrio cholerae, Shigella flexneri, Salmonella paratyphy) u cilju odreċivanja minimalne inhibitorne koncentracije raznih antimikrobnih agenasa metanol je na inhibiciju bakterija uticao pri koncentraciji od 4.0% ili 4.0%, što pokazuje da metanol ima visok inhibitorni potencijal. Etanol je u ovom radu inhibirao rast bakterija već pri koncentraciji od 3.0%, a DMSO pri koncentraciji od 4.0% ili pri koncentraciji 4.0%. Za razliku od ovog rada (Wadhwani et al., 2008) u kom je DMSO imao visok inhibitorni potencijal pri koncentraciji od 4.0% i 4.0% u ovom radu DMSO je imao znaĉajan inhibitorni potencijal na stafilokoku tek pri koncentraciji od 10.0%. TakoĊe, u istraţivanju koje je obuhvatilo 43 vrste mikroorganizama ukljuĉujući i S. aureus, ispitivan je 23

31 uticaj DMSO-a pri razliĉitim koncentracijama i on je pokazao visok inhibitorni potencijal jer je minimalna inhibitorna koncentracija DMSO-a za S. aureus bila pri koncentraciji od 8.0% (Basch & Gadebusch, 1968). Ovi rezultati pokazuju da minimalna inhibitorna koncentracija nekog rastvaraĉa ne moţe biti prihvaćena kao standard jer ona zavisi od organizma na koji oni deluju i moţe se razlikovati ĉak i meċu sojevima koji pripadaju istoj vrsti. Tabela 2. Antimikrobna aktivnost (MIK/MBK) razliĉitih koncentracija organskih rastvaraĉa na Escherichia coli Escherichia coli MIK MBK ACETON ACETONITRIL DIETIL-ETAR ETIL-ACETAT ETANOL METANOL HLOROFORM DIMETIL SULFOKSID U Tabeli 2. prikazani su rezultati antimikrobne aktivnosti ispitivanih rastvaraĉa u odnosu na bakteriju Escherichia coli, dobijeni mikrodilucionom metodom. Sudeći po rezultatima, bakterija pokazuje visok stepen otpornosti na ĉetiri primenjena rastvaraĉa (aceton, dietil etar, etanol i hloroform), koji su inhibitorno delovali tek pri visokim koncentracijama od 20.0%. Ono što je neoĉekivano je veća senzitivnost ove Gram negativne bakterije na testirane rastvaraĉe, gde je ona bila inhibirana pri niskom koncentracijama od svega 2.5% ĉak dva od testiranih osam rastvaraĉa. Za razliku od ovih rastvaraĉa, metanol i dimetil sulfoksid pokazali su visok inhibitorni efekat u odnosu na ovu Gram negativnu bakteriju delujući inhibitorno pri 10.0%, dok su acetonitril i etil acetat pokazali najveću toksiĉnost pri koncentraciji od 2.50%. Posmatrajući rezultate mikrobicidne aktivnosti, samo dva rastvaraĉa (acetonitril i etil acetat) su je pokazali u testiranom opsegu koncentracija i to pri najvišoj koncentraciji od 20.0%. 24

32 Vijabilnost vrste Escherichia coli nakon kontakta sa razliĉitim koncentracijama rastvaraĉa 1.00E E E E E E E E E E E+00 Aceton Acetonitril Dietil etar Etil acetat Etanol Metanol Hloroform DMSO IN 20% 10% 5% 2.50% Control Grafik 2. Uporedni prikaz minimalnih inhibitornih koncentracija organskih rastvaraĉa na vrstu Escherichia coli Iz Grafika 2. mogu se videti rezultati dobijeni brojanjem ćelija izraslih iz uzorka bujona sa ćelijama tretiranim razliĉitim koncentracijama testiranih rastvaraĉa. U odnosu na inicijalni i krajnji broj ćelija, rastvaraĉi pokazuju razliĉit uticaj na bakteriju Escherichia coli. Pri koncentraciji od 2.5% brojnost ćelija nije bila znaĉajno razliĉita u odnosu na kontrolu samo u sluĉaju dietil etra i etanola, dok je kod ostalih rastvaraĉa bila 10 puta manja u odnosu na kontrolu. Kod testirane petopostotne koncentracije razliĉitih rastvaraĉa, moţe se uoĉiti da su dietil etar, etanol, hloroform i dimetil sulfoksid imali znatno manji efekat na vijabilnost ćelija u odnosu na etil acetat i metanol koji su redukovali veliĉinu populacije za oko 100 puta u poreċenju sa kontrolom. MeĊutim, pri ovoj koncentraciji još veću toksiĉnost na ćelije pokazao je aceton koji je veliĉinu populacije smanjio za oko puta i acetonitril koji je redukovao veliĉinu populacije više stotina hiljada puta. Pri koncentraciji od 10.0% većina testiranih rastvaraĉa redukovalo je veliĉinu populacije oko 1000 puta, dok je aceton pri ovoj koncentraciji redukovao brojnost ćelija sa 9.0 x 10 9 na 1.9 x 10 4, a acetonitril populaciju iste veliĉine smanjio na 4.0 x Mikrobicidni efekat pri ovoj koncentraciji postigao je etil acetat. U sluĉaju najveće testirane koncentracije od 20.0% mikrobicidni efekat pokazali su acetonitril i etil acetat, pa pri njima 25

33 nije ni bilo nikakvog porasta, dok su aceton i DMSO smanjili veliĉinu populacije pribliţno milion puta, a ostali rastvaraĉi (dietil etar, etanol, metanol, hloroform) za oko puta. MeĊu rastvaraĉima koji su se pokazali kao oni koji slabo redukuju vijabilnost ćelija sa kojima su inkubirani su hloroform, etanol, metanol i dietil etar, što je situacija potpuno razliĉita u odnosu na stafilokoku. TakoĊe, ovo je iznenaċujuć rezultat s obzirom na ĉinjenicu da je efekat alkohola znaĉajniji na Gram negativne bakterije zbog lipopolisaharida koji se u njima rastvaraju i ostavljaju unutrašnji, tanak sloj peptidoglikana izloţen uticajima spoljašnje sredine. MeĊutim, pri niţim koncentracijama koje su ovde testirane, a i u odsustvu drugih antimikrobnih faktora, moţda je efekat na samu fosfolipidnu membranu u smislu poremećaja njene funkcije, kao i dokazan efekat alkohola na poremećaj bakterijskog metabolizma od većeg znaĉaja nego njihovo dejstvo na spoljašnju membranu Gram negativnih bakterija. Sa druge strane, poznato je da postoje sojevi E. coli koji se koriste za industrijsku proizvodnju acetona, dok je soj konkretno testiran u ovom istraţivanju pokazao izuzetnu netoleranciju, tj. znaĉajnu redukciju vijabilnosti u prisustvu niskih koncentracija (5.0, 10.0 i 20.0%) ovog organskog rastvaraĉa. U studiji (Basch & Gadebusch, 1968) u kojoj je ispitivan uticaj DMSO-a u razliĉitim koncentracijama na 43 mikroorganizma meċu kojima je i E. coli, minimalna inhibitorna koncentracija DMSO-a bila je pri koncentraciji od 10.0%, na šta ukazuju i rezultati ove studije. MeĊutim, u istraţivanju antimikrobne aktivnosti DMSO-a protiv bakterije E. coli i S. aureus koje je sproveo Hassan godine se navodi da je minimalna inhibitorna koncentracija za E. coli bila 25.0%. TakoĊe, studija koju je Howard sa saradnicima godine, u kojoj je ispitivana antimikrobna aktivnost DMSO-a protiv tri mikroorganizma ukljuĉujući i E. coli, pokazala je da ovaj rastvaraĉ pri koncentraciji od 15.0% u potpunosti eliminiše ovu bakteriju, što opet ukazuje da minimalna inhibitorna koncentracija nekog rastvaraĉa ne moţe biti prihvaćena kao standard i da se svaki soj iste vrste mora testirati na efekat rastvaraĉa koji se primenjuje u tekućem istraţivanju. 26

34 Tabela 3. Antimikrobna aktivnost (MIK/MBK) razliĉitih koncentracija organskih rastvaraĉa na Candida albicans Candida albicans MIK MBK ACETON ACETONITRIL DIETIL-ETAR ETIL-ACETAT ETANOL METANOL HLOROFORM DIMETIL SULFOKSID U Tabeli 3. prikazani su rezultati antimikrobne aktivnosti ispitivanih rastvaraĉa u odnosu na kvasac Candida albicans, dobijenih mikrodilucionom metodom. Rezultati su pokazali da je ovaj kvasac bio osetljiviji od prethodno ispitivanih bakterija na dejstvo organskih rastvaraĉa. Hloroform na ovu vrstu nije imao inhibitorno delovanje pri testiranim koncentracijama do 20.0%. Za razliku od hloroforma, aceton, acetonitril, dietil etar i etil acetat su pokazali toksiĉnost u odnosu na ovaj kvasac, delujući inhibitorno pri 10.0%, etanol i metanol pri 5.0%, a najveću toksiĉnost pokazao je dimetil sulfoksid koji je pokazao efekat pri svim testiranim koncentracijama. Posmatrajući rezultate mikrobicidne aktivnosti, aceton, etil acetat, etanol i hloroform su je pokazali u tretiranom opsegu koncentracija i to pri najvišoj koncentraciji od 20.0%. 27

35 Vijabilnost vrste Candida albicans nakon kontakta sa razliĉitim koncentracijama rastvaraĉa 1.00E E E E E E E E E E+00 Aceton Acetonitril Dietil etar Etil acetat Etanol Metanol Hloroform DMSO IN 20% 10% 5% 2.50% Control Grafik 3. Uporedni prikaz minimalnih inhibitornih koncentracija organskih rastvaraĉa na vrstu Candida albicans Iz Grafika 3. mogu se videti rezultati dobijeni brojanjem ćelija izraslih iz uzorka bujona sa ćelijama tretiranim razliĉitim koncentracijama testiranih rastvaraĉa. UtvrĊeno je da u odnosu na inicijalni i krajnji broj ćelija, rastvaraĉi pokazuju razliĉite obrasce inhibicije rasta tretiranog kvasca. Pri koncentraciji od 2.50% najveći uĉinak u pogledu smanjenja ćelijske populacije pokazao je aceton koji je redukovao populaciju pribliţno 100 puta, dok su je dietil etar i metanol smanjili za oko 5 puta, a ostali rastvaraĉi za 10 puta. Posmatrajući efekat 5.0% koncentracije razliĉitih rastvaraĉa moţe se uoĉiti da su metanol i dietil etar imali najmanji uĉinak na vijabilnost ćelija, dok su dimetil sulfoksid, hloroform, etil acetat i acetonitril redukovali veliĉinu tretirane populacije za oko 100 puta u poreċenju sa kontrolom. Etanol je pri ovoj koncentraciji redukovao veliĉinu populacije za oko 1000 puta, a najveću toksiĉnost pri istoj koncentraciji pokazao je aceton koji je smanjio veliĉinu populacije kvasca pribliţno puta. Rastvaraĉi acetonitril i dietil etar, su pri koncentraciji od 10.0% redukovali veliĉinu populacije za oko 100 puta, etil acetat, hloroform i dimetil sulfoksid za oko 1000 puta. Metanol je pri ovoj koncentraciji pokazao najmanji uĉinak jer je redukovao veliĉinu populacije za oko 10 puta. MeĊutim, meċu njima bila su dva rastvaraĉa aceton i etanol koji su pokazali mikrobicidni efekat, pa pri njima nije ni bilo nikakvog porasta. Najveća testirana koncentracija od 20.0% imala je mikrobicidni efekat u 28

36 sluĉaju ĉetiri rastvaraĉa (aceton, etil acetat, etanol i hloroform), sa druge strane, metanol i dietil etar redukovali su veliĉinu populacije za oko 100 puta, a acetonitril i dimetil sulfoksid za oko puta. Navedeni rezultati antimikrobne aktivnosti DMSO-a protiv C. albicans jasno se razlikuju od rezultata navedenih u studiji koju su sproveli Basch & Gadebusch godine, u kojoj je ispitivana antimikrobna aktivnost DMSO-a protiv 43 vrste mikroorganizama ukljuĉujući i C. albicans. Naime, rezultati ove studije pokazali su da je minimalna inhibitorna koncentracija DMSO-a za C. albicans bila 8.0%, dok je minimalna mikrobicidna koncentracija ovog rastvaraĉa prema C. albicans bila 30.0%. 29

37 5. ZAKLJUĈAK Na osnovu rezultata prezentovanih u ovom radu mogu se doneti sledeći zakljuĉci: Rastvaraĉi pokazuju izuzetno razliĉit efekat u zavisnosti od vrste mikroorganizma koji su tretirani njima. Rast Gram pozitivne bakterije Staphylococcus aureus najviše su inhibirali alkoholi etanol i metanol. Na istu bakteriju najniţi efekat u smislu smanjenja vijabilnosti imao je hloroform. Najveću antimikrobnu aktivnost na Gram negativnu bakteriju Escherichia coli pokazali su acetonitril i etil-acetat. Hloroform se i u ovom sluĉaju pokazao kao rastvaraĉ koji ima najmanji uticaj na vijabilnost tretirane bakterije. Antifungalnu aktivnost na kvasac Candida albicans najviše je ispoljio dimetilsulfoksid, ali su i ostali rastvaraĉi pri niţim koncentracijama takoċe inhibirali rast ovog kvasca. Ispitivani kvasac je pokazao najmanju redukciju vijabilnosti nakon tretmana metanolom, dok je aceton imao najnegativniji efekat na vijabilnost ove gljive. Pošto se rezultati znaĉajno razlikuju meċu razliĉitim vrstama mikroorganizama, ali isto tako rastvaraĉi mogu imati razliĉit efekat i na razliĉite sojeve iste vrste, kontrole koje će ispitivati i efekat na vijabilnost ćelija bi trebale da budu ukljuĉene u svako istraţivanje antimikrobne aktivnosti. Ovakav pristup će spreĉiti ĉitanje laţno boljih rezultata, koji su u stvari posledica sinergistiĉkog dejstva ispitivane supstance i rastvaraĉa. 30