Универзитет у Београду - Хемијски факултет Наставно-научно веће Предмет: Образложење теме докторске дисертације 1. Научна област: Биохемија 2. Предмет научног истраживања Предмет истраживања ове докторске дисертације је хемијска модификација полисахарида алгината, целулозе и пектина, различитим фенолним једињењима са једном и више фенолних група као што су тирамин, тирозин, допамин, 3,4- дихидроксифенилаланин итд., у циљу добијања модификата способних да граде хидрогелове различитим типовима умрежења (хемијским и ензимским) и који представљају добар матрикс за енкапсулацију ћелија, малих молекула и ензима. Добијени хидрогелови би били испробани као матрикси за енкапсулацију ћелија и ензима, у циљу добијања биокатализатора који би могли да се користе при деградацији текстилних боја, и као материјали за производњу нановлакана техником електроспининга у циљу добијања погодних материјала за ткивни инжењеринг. 3. Основне хипотезе Хидрогелови су нерастворни, тродимензионални полимери који имају способност задржавања велике количине воде. Особине биополимерних хидрогелова, као што су хидрофилност, биокомпатибилност, нетоксичност, биодеградабилност, их чине веома погодним материјалима за биомедицинске и биотехнолошке сврхе. Данас се хидрогелови користе у ткивном инжењерингу, достави лекова, као матрикси за имобилизацију ензима и малих молекула, биосензори, итд. Ова научна област је у развоју и представља изазов пронаћи 1
нови материјал способан да формира хидрогел, са особинама погодним за неку од наведених примена. Природни полимери (алгинат, целулоза и пектин), због своје распрострањености, и због већ наведених карактеристика биополимера, су највише изучавани у овој грани науке. Умрежавање полимера у форму хидрогела може бити извршено хемијским путем (ковалентним или јонским интеракцијама) и ензимским путем. Од типа умрежења зависе и саме особине хидрогела. Да би било могуће умрежавање, вршене су различите хемијске модификације биополимера, са циљем качења различитих функционалних група преко којих би долазило до умрежавања. Развој нових деривата полисахарида, који имају способност умрежавања хемијским и ензимским путем, представља актуелну област истраживања. Једна од главних примена деривата полисахарида је у имобилизацији ензима. Неке од мана коришћења ензима, нарочито у индустријске сврхе, су њихова осетљивост на агресивне услове, као што су промена ph вредности, температуре, присуство органских растварача, хелирајућих агенаса, инхибитора, као и губитак активности током складиштења. Током коришћења ензима у реакцијама, проблем представља и немогућност њиховог одвајања из реакционе смеше ради поновне употребе. Један од начина да се превазиђу овакви проблеми је имобилизација ензима, која може бити извршена методом енкапсулације, адсорпције, ковалентног везивања, итд. До сада су за ове сврхе коришћени различити природни полисахариди и њихови деривати, што се показало као веома успешна метода. Један представник ензима из групе оксидоредуктаза је лаказа, која користи кисеоник као електрон акцептор и доводи до оксидације различитих супстрата, међу које спадају и фенолна једињења. Она проналази примену у различитим областима, као што су прехрамбена, папирна индустрија, органске синтезе, деколоризација боја, итд. Претходних година, лаказа је веома испитивана као ензим који врши успешну деколоризацију различитих врста боја. Предност овакве ензимске биокатализе је висока ефикасност при нормалним условима (температура и притисак), ниска токсичност, ниска цена, једноставна контрола процеса, итд. Када се ензимска биокатализа надогради имобилизацијом ензима, добија се стабилнији систем који веома лако може да се поново искористи у више циклуса деколоризације. 2
Поред имобилизације ензима, деривати биополимера се у великој мери користе и за имобилизацију ћелија и ткивни инжењеринг, где имају битну улогу у регенерацији и замени ткива, при чему је веома битно направити материјал који ће поред задовољавајуће структуре и механичких особина бити инертан и самим тим неће произвести одговор имуног система. Због тога природни полисахариди проналазе примену и у овој области. Са појавом нанотехнологије и методе електроспининга којом се под дејством електричног поља извлаче влакна дијаметара мањих од 100 nm, расте заинтересованост за особине биополимера. Због своје велике површине и пора малих величина, нановлакна имају могућност примене у ткивном инжењерингу, за производњу филтера, завоја, итд. 4. Циљ истраживања и очекивани резултати Научни циљ планираних истраживања је хемијска модификација природних полисахарида алгината, целулозе и пектина фенолним једињењима као што су тирамин, тирозин, допамин и 3,4-дихидроксифенилаланин, у првом кораку перјодатном оксидацијом, а затим редуктивном аминацијом оксидованих полисахарида у присуству амино деривата фенолних једињења. Добијени модификати би били окарактерисани употребом структурних инструменталних метода, у циљу потврде успешности модификације. Успешно модификовани полисахариди би се тестирали за добијање хидрогелова различитим методама, а затим искористили за имобилизацију пречишћене лаказе добијене експресијом у Е. coli, унутар микрокуглица добијених умрежавањем у емулзионим системима вода у уљу. Имобилизација би била рађена у циљу добијања препарата лаказе са повећаном стабилношћу у односу на слободан ензим, погодног за употребу у већем броју циклуса деградације текстилних боја. Такође би била испитана имобилизација унутар хидрогелова ћелијских зидова квасца који за себе имају закачен ензим лаказу, добијених експресијом лаказе на површини ћелија Saccharomyces cerevisiae и даљом лизом у присуству органског растварача. Умрежавање би било вршено хемијским и ензимским путем, у присуству двовалентних катјона, са модификованим и немодификованим алгинатом. Добијени имобилизати би такође могли да 3
пронађу примену у деградацији текстилних боја, са способношћу поновне употребе куглица током већег броја циклуса. Добијени полисахаридни деривати би били испитани и за добијање нановлакана, техником електроспининга и накнадним умрежавањем, са циљем добијања материјала погодних за ткивни инжењеринг и имобилизацију ћелија. 5. Методе истраживања Методе које ће бити коришћене: - Хемијске методе: Хемијска модификација полисахарида (алгината, пектина и целулозе) перјодатном оксидацијом и редуктивном аминацијом, киселинско-базна титрација модификованих полисахарида у циљу провере модификације, одређивања врсте и концентрације јонизабилних група. - Спектроскопске методе: УВ/ВИС спектрофотометрија за структурну карактеризацију модификованих полисахарида и мерење ензимске активности, инфрацрвена спектрофотометрија (ФТИР) и нуклеарна магнетна спектроскопија (НМР) за структурну карактеризацију модификованих полисахарида. - Молекуларно-биолошке методе: SDS-PAGE електрофореза за проверу експресије и пречишћавања протеина. - Микробиолошке методе: методе за узгој ћелија квасаца и бактерија. - Остале методе: Електроспининг метода за добијање нановлакана и СЕМ микроскопија за снимање и одређивање димензија нановлакана. 6. Литература 1. Buwalda S., Boere K., Dijkstra P., Feijen J., Vermonden T., Hennink W., Hydrogels in a historical perspective: From simple networks to smart materials, Journal of Controlled Release 190, 2014., pp. 254-273. 2. Prokopijević M., Prodanović O., Spasojević D, Kovačević G., Polović N., Radotić K., Prodanovic R., Tyramine-modified pectins via periodate oxidation for soybean hull peroxidase induced hydrogel formation and immobilization. Applied Microbiology and Biotechnology 101, 2016, pp. 2281-2290 4
3. Fernandez-Fernandez M., Sanroman M.A., Moldes D., Recent developments and applications of immobilized laccase, Biotechnology Advances, 31(8), 2013, pp. 1808-1825. 4. Chen Y., et al., Cell Surface Display Fungal Laccase as a Renewable Biocatalyst for Degradation of Persistent Micropollutants Bisphenol A and Sulfamethoxazole, Environmental Science & Technology, 50 (16), 2016, pp. 8799-8808. 5. Daassi D., Rodriguez-Couto S., Nasri M., Mechichi T., Biodegradation of textile dyes by immobilized laccase from Coriolopsis gallica into Ca-alginate beads, International Biodeterioration & Biodegradation 90, 2014, pp. 71-78. 6. Jeong S., Krebs M, Bonino C., Khan S., Alsberg E, Electrospun alginate nanofibers with controlled cell adhesion for tissue engineering, Macromol. Biosci. 10 (8), 2010, pp. 934-43 5