UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET NIŠ ODSEK ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU Milena M. Miletić Antimikrobna svojstva lekovitog blata Master rad Niš, 2016.
UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU Master rad Antimikrobna svojstva lekovitog blata Mentor: Student: Prof Dr Tatjana Mihajilov-Krstev Milena M. Miletić 129 Januar 2016, Niš
UNIVERSITY OF NIŠ FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS DEPARTMENT OF BIOLOGY WITH ECOLOGY Master thesis Antimicrobial properties of healing mud Menthor: Candidate: Prof Dr Tatjana Mihajilov-Krstev Milena M. Miletić 129 January 2016, Niš
Zahvala Srdačno se zahvaljujem svom mentoru, prof. dr Tatjani Mihajilov-Krstev na izboru teme, nesebičnoj pomoći i sugestijama tokom izrade ovog master rada. Zahvaljujem se i asistentu, Nikoli Stankoviću, na pomoći tokom izvođenja eksperimentalnog dela rada u laboratoriji. Najveću zahvalnost dugujem svojoj porodici koja mi je omogućila školovanje, pružila mi neizmernu podršku i razumevanje tokom studiranja.
SADRŢAJ Saţ etak... 1 Summary... 2 I UVOD... 3 II OPŠTI DEO... 4 2.1. Mikroorganizmi... 4 2.2. Mikroorganizmi patogeni koţ e... 5 2.2.1. Gram pozitivne bakterije... 5 Rod Staphylococcus... 5 Rod Streptococcus... 6 Rod Enterococcus... 6 2.2.2. Gram negativne bakterije... 7 Rod Escherichia... 7 Rod Proteus... 7 Rod Enterobacter... 7 Rod Acinetobacter... 8 Rod Pseudomonas... 8 2.3. Lekovita svojstva blata i njihova antimikrobna aktivnost... 8 III CILJEVI RADA... 9 IV MATERIJAL I METODE... 10 4.1. Prikupljanje uzorka lekovitog blata... 10 4.2. Metode ispitivanja mikrobiološkog sastava blata... 10 4.2.1. OdreĎivanje ukupnog broja svih ţ ivih bakterija u 1ml uzorka... 10 4.2.2. Dokazivanje koliformnih bakterija u vodi... 11 MPN (Most Probably Number) metod Fermentacioni test... 11 Postupak za ukupne koliformne... 11 Postupak za fekalne koliformne... 13 Membran-filtar tehnika MF... 13 4.2.3. Dokazivanje fekalnih streptokoka... 15 MPN metoda... 15 MF metoda... 15 4.2.4. Dokazivanje Proteus vrsta u vodi... 17 Metode dokazivanja... 18 4.2.5. Dokazivanje sulfitoredukujućih sporogenih anaeroba... 19 MPN metoda... 19 MF metoda... 20 4.2.5. Dokazivanje Pseudomonas aeruginosa... 20 MPN metoda... 21 MF metoda... 21 4.3. Metode ispitivanja antimikrobnog delovanja blata... 21 4.3.1. Bakterijski sojevi... 21 4.3.2. Disk-difuziona metoda... 22 4.3.3. Mikrodiluciona metoda... 22 4.3.4. Statistička obrada podataka... 23 V REZULTATI I DISKUSIJA... 24 VI ZAKLJUČAK... 26 VII LITEARTURA... 27
SAŢETAK Cilj ovog rada je ispitivanje antimikrobnog dejstva lekovitog blata sakupljenog u blatnoj banji na Crnom moru u mestu Pomorie (Bugarska). Uzorak je sakupljen u leto 2015. godine i do daljih analiza je čuvan u friţ ideru na +4 C. Izvršene su analize mikrobiološkog sastava lekovitog blata, koje su pokazale prisustvo vrsta roda Bacillus. Antimikrobna aktivnost je ispitivana disk-difuzionom metodom i mikrodilucionom metodom. Kao test organizmi korišćeni su patogeni bakterijski sojevi iz grupe Gram (+) i Gram (-) bakterija koji izazivaju infekcije rana. Analize dobijenih rezultata pokazuju da blato ne poseduje antimikrobna dejstva prema ispitivanim vrstama bakterija. Ključne reči: lekovito blato, infekcije rana, antimikrobna aktivnost 1
SUMMARY The aim of this paper is the examination of the antimicrobial activity of the healing mud collected from a spa at the Black Sea in Pomorie, Bulgaria. The sample was collected in summer 2015 and was kept in the refrigerator at 4 C until further analysis. There has been performed analysis of the microbiological composition of the healing mud, which showed the presence of species of the genus Bacillus.The antimicrobial activity was examined by the disk-diffusion method and micro-dilution method. As test organisms some pathogenic bacterial strains from the groups of Gram (+) and Gram (-) bacteria that cause wound infections were used. The analyses of the obtained results show that the mud does not have any antimicrobial effect on the tested strains of bacteria. Key words: healing mud, skin infections, antimicrobial activity 2
I UVOD Lekovita blata u osnovi predstavljaju sedimente sačinjene od humusa (organske supstance) i minerala, koji su se formirali tokom veoma dugog vremenskog perioda delovanjem fizičkih, hemijskih, bioloških i geoloških procesa i koji se koriste u terapeutske svrhe (Suárez et al., 2010). Kupke u blatu su poznate i koriste se hiljadama godina. MeĎutim, mehanizmi kojima ova terapija ublaţ ava široki spektar bolesti još uvek nisu u potpunosti jasni. Verovatno obuhvataju hemijske, termalne, mehaničke i imunomodulatorne efekte (Matz et al., 2003). Blatne kupke koriste se u lečenju reumatizma i različitih bolesti koţ e. Korišćenje prirodnih kupki od blata za lečenje ovih bolesti poznato je kao fangoterapija i predstavlja deo balneoterapije (Chadzopulu et al., 2011). Balneoterapija predstavlja korišćenje vode, blata i lekovite gline u medicinske svrhe. Glavne dermatološke bolesti koje se često leče balneoterapijom sa visokom stopom uspešnosti su psorijaza i atopični dermatitis (Matz et al., 2003). Lekovito blato koristi se empirijski kod skeletno-mišićnih i inflamatornih bolesti zglobova. Dokazano je da indukuje antiinflamatornu aktivnost i utiče na antioksidativni sistem kod pacijenata sa osteoartritisom. Antiseptičko dejstvo i kapacitet razmene supstance uglavnom se pripisuju neorganskoj komponenti blata. Blato se moţ e primenjivati lokalno ili totalno. Efekti primene blata uključuju: povećanje električne provodljivosti membrane, apsorpciju, vodeno-elektrolitni balans, hiperemiju, znojne ţ lezde, aktivaciju enzima i hormona. Naučna istraţ ivanja su pokazala da terapija blatnim kupkama povećava temperaturu tela, utiče na kardiovaskularni sistem, neurotransmisiju, imuni sistem, aktivaciju enzima i metabolizam (Chadzopulu et al., 2011). O antimikrobnim svojstvima lekovitog blata protiv mikrooganizama koji izazivaju infekcije koţ e se veoma malo zna. U ovom radu je vršeno ispitivanje antimikrobne aktivnosti lekovitog blata protiv bakterijskih sojeva patogena koţ e u cilju lečenja infektivnih rana. 3
II OPŠTI DEO 2.1. Mikroorganizmi Mikroorganizmi (micros mali) predstavljaju organizme mikroskopskih veličina, sitnije od 0,1mm. MeĎutim, pored onih najsitnijih organizama, poput virusa, veličine 0,01µm, postoje i oblici koji dostiţ u veličinu i do nekoliko metara. Takve su neke višećelijske alge i neke gljive. Veličina ćelija najsitnijih mikroorganizama odreďena je tzv. molekularnom granicom. To znači da ćelija, da bi bila ţ iva, odnosno da bi rasla i razmnoţ avala se, mora da sadrţ i različite molekule: enzime i druge proteine, ugljene hidrate, nukleinske kiseline itd. Iz tog razloga ona mora da bude nekoliko stotina puta veća od dimenzija makromolekula koji učestvuju u njenoj graďi i metabolizmu. Pojam mikroorganizmi nije sistematska kategorija, već je to heterogena grupa koja obuhvata: viruse, bakterije, alge, gljive, lišajeve i protozoe. Zajedničke osobine ovih organizama jesu: mikroskopske razmere, brz metabolizam, brzo razmnoţ avanje, raznolikost enzima i biohemijskih procesa, kao i to da predstavljaju kosmopolitske, odnosno ubikvitarne organizme. Mikroorganizmi obuhvataju predstavnike acelularne graďe (virusi) i predstavnike celularne graďe, kako prokariotskog (bakterije i cijanobakterije), tako i eukariotskog tipa ćelije (protozoe, alge, gljive, lišajevi) (Petrović et al., 2007). Bakterije su prokariotski organizmi. Nemaju diferencirano jedro, već im je genetički materijal grupisan u obliku nukleotida; nemaju mitohondrije, hloroplaste, endoplazmatični retikulum i Goldţ ijev aparat (Mihajilov-Krstev, 2008). Mogu imati loptast, štapićast, izvijen i nitast oblik, a pored ova osnovna četiri, javljaju se i različiti izvedeni oblici. Izvedeni oblici bakterija su rezultat specifičnog rasporeda bakterijskih ćelija nakon deobe. Prema sastavu ćelijskog zida i bojenju postupkom po Gramu (metoda koju je predloţ io Hans Christian Gram 1884. godine) bakterije se dele na Gram-pozitivne i Gram-negativne. 4
2.2. Mikroorganizmi patogeni koţe Svaki mikroorganizam sposoban da uzrokuje oboljenje naziva se patogen, a sama sposobnost da uzrokuje oboljenje naziva se patogenost. Kvantitativno izraţ en stepen patogenosti mikroorganizma naziva se virulencija. Virulentnost bakterija se izraţ ava kao broj bakterijskih ćelija potreban da usmrti 50% populacije osetljivih laboratorijskih ţ ivotinja. Ova vrednost se dobija eksperimentalno i označava se kao LD 50. Minimalan broj ćelija patogena koji je potreban da uzrokuje oboljenje kod 50% članova populacije inokulisanih laboratorijskih ţ ivotinja naziva se infektivna doza (ID 50 ). Virulencija je rezultat mogućnosti mikroorganizma da adherira za domaćina, izvrši invaziju i/ili luči toksine. Sve ove karakteristike koje omogućavaju uzrokovanje oboljenja nazivaju se faktori virulencije (Petrović et al., 2007). Prisustvo bakterija ili drugih patogenih mikroorganizama na koţ i, ali bez oboljenja označava se kao kolonizacija. Reakcija domaćina na prisustvo mikroorganizama (oboljenje) je infekcija (Lalević-Vasić et al., 2010). 2.2.1. Gram pozitivne bakterije Gram pozitivne bakterije u svom ćelijskom zidu sadrţ e peptidoglukane, koje etanol ne rastvara i zato nakon postupka obezbojavanja etanolom ostaju obojene ljubičasto u metodi bojenja po Gramu. Osnovne karakteristike Gram (+) bakterija su: lipidna citoplazmatična membrana, debeo sloj peptidoglikana, prisustvo tejhojične i lipotejhojične kiseline, lanci peptidoglikana umreţ eni tako da formiraju čvrst ćelijski zid. Iako sadrţ e debeo sloj peptidoglikana, Gram (+) bakterije su veoma osetljive na antibiotike jer ne poseduju spoljašnju membranu. Rod Staphylococcus Rod Staphylococcus obuhvata Gram (+) bakterije loptastog oblika, najčešće rasporeďene u vidu grozdastih formacija. Nemaju flagele, asporogene su i svrstavaju se meďu fakultativno anaerobne bakterije. Na osnovu produkcije enzima katalaze, stafilokoke se dele na katalaza-pozitivne i katalaza-negativne. Stafilokoke mogu dugo da opstanu izvan tela domaćina i široko su rasprostranjene u prirodi (Ranin and Berger-Jekić, 2008). Staphylococcus aureus poseduje karakterističan pigment koji njegovim kolonijama daje zlatnoţ utu boju. U stanju je da izazove oboljenja gotovo svih organa i tkiva čoveka. Moţ e da produkuje beta-laktamaze i da poseduje druge mehanizme rezistencije na antibiotike, zbog čega se smatra jednim od najznačajnijih agenasa u medicini. 5
Koţ ne infekcije su jedne od najčešćih manifestacija stafilokoknih invazivnih oboljenja. Najčešća koţ na oboljenja koja izaziva ova vrsta jesu: panaricijum, folikulitis, furunkul, karbunkul, impetigo, flegmona. U većini slučajeva dejstvom imunskih mehanizama domaćina zaustavlja se prodor Staphylococcus aureus i dolazi do izlečenja. Kod malog broja pacijenata se proces nastavlja i dolazi do prodora Staphylococcus aureus u krvotok i nastanka bakterijemije. Staphylococcus epidermidis je dobro prilagoďen na parazitski način ţ ivota i lako kolonizuje gotovo sve dostupne regije čovekovog organizma ulazeći u sastav fiziološke mikroflore koţ e i sluzokoţ a. Pojedini sojevi produkuju visokoviskozne polisaharide koji čine biofilm. Biofilm olakšava adherenciju i štiti bakterije jer predstavlja mehaničku barijeru koja onemogućava pristup antibioticima i elementima imunskog sistema. Rod Streptococcus Streptokoke su Gram (+) loptaste bakterije, rasporeďene u vidu kraćih ili duţ ih lanaca. Spadaju u fakultativne anaerobe. Nepokretne su i ne sintetišu enzim katalazu. Streptokoke su veoma heterogena grupa bakterija. Mnogi bakteriolozi su pokušali da ih sistematizuju na različite načine. Streptococcus pyogenes (piogeni streptokok) produkuje veći broj biološki aktivnih materija, meďu kojima su: streptolizini - uništavaju ćelijsku membranu eritrocita i druge ćelije organizma; streptokinaza - enzim koji razlaţ e fibrin, eritrogeni toksin deluje na endotel kapilara i izaziva osip, hijaluronidaze - razlaţ e meďućelijske supstance, kao što su glikozaminoglikani u koje spada i hijaluronska kiselina, dezoksiribonukleaza - enzim koji razlaţ e DNK, proteaze, neuraminidaze, itd. Mogu izazvati upale nosa i ţ drela, anginu, šarlah, upalu bronhija i pluća, gnojne infekcije koţ e. Rod Enterococcus To su Gram (+) loptaste bakterije koje formiraju lance. Enterococcus faecalis ne formira kapsulu zbog nedostatka mukoidina, ali neke podgrupe mogu da je formiraju. Koristi plazmide za razmenu genetičke informacije. Moţ e formirati pile (posebno sojevi koji izazivaju endokarditis). Ovi mikroorganizmi nastanjuju debelo crevo, deo su crevne flore, a mogu se naći u zemlji, vodi zagaďenoj fekalijama i, reďe, biljkama. Mogu se prenositi i insektima. Pored endokarditisa izaziva infekcije creva, urinarnog trakta i abdomena i infekcije rana (Karakašević, 1987). 6
2.2.2. Gram negativne bakterije Gram negativne bakterije u svom ćelijskom zidu sadrţ e lipopolisaharide, koje rastvara etanol i zato dolazi do ispiranja ljubičaste boje prilikom postupka obezbojavanja etanolom u metodi bojenja po Gramu, tako da se u sledećem koraku boje u crveno. Osetljivost ovih bakterija na antibiotike je veoma mala, zbog nepropustnog ćelijskog zida. Rod Escherichia Predstavnici ovog roda su Gram (-) štapićaste bakterije. Većina je pokretna i kreće se peritrihalnim flagelama, ali ima i nepokretnih. Mogu biti aerobi ili fakultativni anaerobi. Vrsta Escherichia coli je Gram-negativni bacil, dug 2 6µm, pokretan, sa peritrihijalnim flagelama. Poseduje fimbrije ili pile koje imaju adhezivnu funkciju. Fakultativni je anaerob. Fermentuje veliki broj ugljenih hidrata do kiseline i gasa. Laktoza je pozitivna, fermentuje dekstrozu uz produkciju kiseline i gasa. Oksidaza je negativna. Pojedini sojevi, iako čine najbrojniju vrstu fakultativno anaerobne flore digestivnog trakta čoveka i ţ ivotinja, u odreďenim uslovima mogu da uzrokuju različita oboljenja (Pecić and Jelesić, 2008), kao što su: dijareja, infekcija urinarnog trakta, septikemija i meningitis (Petrović et al., 2007). Zbog toga se Escherichia coli svrstava u uslovno patogene bakterije ili tzv. oportuniste (Pecić and Jelesić, 2008). Rod Proteus Vrste roda Proteus su široko rasprostranjene u prirodi. Nalaze se u zemlji, otpadnim vodama i materijama i često u intestinalnom traktu ljudi i ţ ivotinja. Ovo su Gram (-) bacili. Izuzetno su pokretni zahvaljujući prisustvu brojnih peritrihijalnih flagela (Pecić and Jelesić, 2008). Nemaju kapsule i ne stvaraju spore (Petrović et al., 2007). RazgraĎuju glukozu i druge ugljene hidrate do kiselina. Ovo su oportunističke bakterije, koje mogu u odreďenim uslovima izazvati različita oboljenja ljudi. Infekcije urinarnog trakta su najčešće izazvane vrstom Proteus mirabilis (Pecić and Jelesić, 2008). Rod Enterobacter Vrtse roda Enterobacter su Gram (-) asporogeni bacili široko rasprostranjeni u prirodi. Nalaze se u zemlji, vodi, otpadnim vodama, na biljkama i u intestinalnom traktu ljudi i ţ ivotinja. Izazivaju oportunističke infekcije. Enterobacter aerogenes se javlja kao uzročnik infekcija respiratornog i urinarnog trakta, opekotina i rana, ponekad meningitisa i sepse (Karakašević, 1987). 7
Rod Acinetobacter Vrste iz roda Acinetobacter su aerobni, Gram (-) kokobacili (Đukić and Berger-Jekić, 2008). Ţive u zemlji, a povremeno se mogu izolovati sa koţ e, sluznica ili iz sekreta čoveka. Nemaju sporu ni flagele, ali imaju fimbrije (Kocić, 2008). Najčešće su komensali. Mogu izazvati pneumoniju, urinarne infekcije i infekcije koţ e (A. baumannii). Često se javlja otpornost na antimikrobne agense (Đukić and Berger-Jekić, 2008), dezinficijense i uticaje spoljašnje sredine (Kocić, 2008). Rod Pseudomonas Bakterije ovog roda su Gram (-) asporogeni štapići. Pokreću su uz pomoć jedne ili nekoliko monopolarnih flagela. Predstavnici ovog roda su aerobi, katalaza i oksidaza pozitivni i ne fermentišu ugljene hidrate. Vrsta Pseudomonas aeruginosa nema kapsulu i ne produkuje spore. Spada u nefermentujuće bakterije, ne razlaţ e laktozu i ne poseduje proteolitičke i saharolitičke enzime (Kocić, 2008). P. aeruginosa je veoma otporna bakterija prema faktorima spoljašnje sredine, antimikrobnim sredstvima i dezinficijensima. Uzročnik je brojnih infekcija kod ljudi (urinarne infekcije, opekotine, pneumonija, rane, sepsa). Ţivi u slobodnoj prirodi, najčešće u zemlji i površinskim vodama. Predstavlja deo normalne flore creva i koţ e kod oko 10% ljudi. Ovu vrstu karakteriše produkcija dva egzopigmenta: piocijanina (plavozelene boje) i fluorescina (zelenoţ ute boje). 2.3. Lekovita svojstva blata i njihova antimikrobna aktivnost Lekovito blato deluje na organizam termički, mehanički i hemijski. Termički efekat na organizam ogleda se u tome što dovodi do lokalne hiperemije tkiva izloţ enog toplom lekovitom blatu, ubrzava cirkulaciju krvi i pojačava metaboličke procese, što dovodi do smanjenja mišićnih spazama i bolova. Pri aplikaciji lekovitog blata uočeni su antiinflamatorni, antimikrobni, antivirusni i antineoplastični efekti. Mehanički efekat izraţ en je u kupkama od lekovitog blata i ogleda se u dejstvu potiska koji smanjuje telesnu masu, tako da otpor pruţ a samo lekovito blato i to u svim pravcima podjednako. Hemijski efekat lekovitog blata još uvek nije dovoljno istraţ en, ali smatra se da zavisi od ph vrednosti blata. Alkalno blato čini koţ u propustljivom za katjone, a kiselo za anjone. Prilikom dodira koţ e sa blatom dolazi do promene električnog potencijala koţ e i na tome se zasniva apsorpciona moć lekovitog blata (Potpara et al., 2009). 8
III CILJEVI RADA Ciljevi ovoga rada su definisani u sledećem: - Uzimanje uzorka blata iz lekovite blatne banje; - OdreĎivanje mikrobiološkog sastava lekovitog blata; - Ispitivanje antimikrobne aktivnosti lekovitog blata protiv bakterijskih patogena koţ e; - Statistička obrada dobijenih rezultata; - IzvoĎenje zaključaka i tumačenje rezultata u skladu sa postojećom literaturom. 9
IV MATERIJAL I METODE 4.1. Prikupljanje uzorka lekovitog blata Uzorak blata je uzet u sterilne boce sa lokaliteta blatne banje na Crnom moru u mestu Pomorie (Bugarska), u leto 2015. godine. Do daljih analiza je čuvan u friţ ideru na 4 C. 4.2. Metode ispitivanja mikrobiološkog sastava blata 4.2.1. OdreĎivanje ukupnog broja svih ţivih bakterija u 1ml uzorka OdreĎivanje ukupnog broja svih ţ ivih bakterija u 1ml uzorka vrši se radi orijentacije o osnovnom parametru prema kojem se ocenjuje higijenska ispravnost vode. Prema savremenim koncepcijama, brojanje bakterija u 1ml ima higijenski značaj ako se ponavlja u češćim vremenskim intervalima u redovnoj kontroli. Jedno jedino brojanje bakterija u vodi ima sasvim ograničenu vrednost i znatno zaostaje za kolimetrijom u pogledu higijenske ocene kvaliteta vode. MeĎutim, značaj brojanja bakterija u vodi je znatno veći u oceni kvaliteta tehnološkog postupka filtracija, hlorisanje, ozonizacija, kataliza pri čemu brojanje treba izvršiti pre i posle tehnološkog postupka prečišćavanja vode. Da bi ovaj značajan podatak bio autentičan, mora se obezbediti transport uzorka u laboratoriju u rashladnom ureďaju. Ukupan broj bakterija korisna je informacija o kvalitetu vode i podrška je rezultatu kolimetrije, jer je ustanovljena odreďena podudarnost ova dva nalaza. Moguća je i nepodudarnost ova dva nalaza, što se objašnjava tehničkom greškom u radu, kao i dejstvom količina (antibiotičkih proizvoda E. coli koji sprečavaju rast ostalih bakterija u vodi). Tehničke greške, koje su ipak verovatnije, mogu se lakše uočiti i moţ e se izvršiti korekcija ako se isti uzorak zasejava u duplikatu sa istom podlogom i pri istoj temperaturi i duţ ini inkubacije. Prema preporukama Supkomiteta za vode ISO potrebno je zasejavati po dve ploče: prva se čita posle 24 i 48 časova inkubiranja na 37 C, a druga posle 72 časa inkubacije na 20 C. Na porast bakterija utiču: vrsta i hranljivost podloge, temperatura i duţ ina inkubacije, koncentracija kiseonika i drugi činioci. Ukoliko se odstupa od preporučene metode, prilikom saopštavanja rezultata to treba navesti. 10
Za brojanje porasnih bakterija preporučuje se korišćenje raznih vrsta brojača bakterija, od najobičnijih lupa do modernih elektronskih ureďaja, nikako brojenje golim okom zbog mogućih grešaka. U okviru standarda priznaju se rezultati sa nalazom od 30 do 300 kolonija na ploči. Izbegavati izdavanje rezultata sa bezbroj, sliven porast i slično, jer to ukazuje samo na lošiji kvalitet analize. NaĎeni broj poraslih kolonija na ploči treba izraţ avati celim brojevima, uz obračunato razreďenje u kojem je uzorak vode zasejan. Tehnika odreďivanja: dobro promućkati bocu sa uzorkom vode, pipetom uzeti 1ml vode i uliti ga u Petri-ploču kroz malo odškrinut poklopac, preliti otopljenim i do 45 C ohlaďenim hranljivim agarom i izmešati sadrţ aj kruţ nim pokretima ploče, po stolu. Ostaviti da se podloga stegne na sobnoj temperaturi, a zatim staviti u termostat na 37 C. Za prirodne vode potrebno je praviti decimalna razreďenja i zasejati prema očekivanoj kontaminaciji uzoraka vode. Brojanje se vrši posle 48 časova. Porasle kolonije broje se lupom, broje se samo ploče koje imaju do 300 kolonija, a ukoliko ih ima više, potrebno je napraviti razreďenje da bi se kolonije mogle izbrojati. 4.2.2. Dokazivanje koliformnih bakterija u vodi Koliformne bakterije su Gram-negativni asporogeni štapići, sposobni da fermentiraju laktozu u tečnoj podlozi, uz proizvodnju kiseline i gasa u roku od 48 časova, na temperaturi od 37 C. Fekalne koliformne bakterije, pored već navedenih osobina, fermentiraju laktozu uz proizvodnju kiseline i gasa na 44 C u roku od 24 časa na tečnim podlogama: peptonskoj vodi sa laktozom i Mac Conceyevom bujonu. MPN (Most Probably Number) metod Fermentacioni test Postupak za ukupne koliformne: a) Prethodni ogled: količine vode se prema tabelama 4.1. 4.3. zaseju na podlogu i inkubiraju na 37 C u toku 24 48 časova. Proizveden gas označava pozitivan ogled. Negativan prethodni ogled, tj. odsustvo ili slaba proizvodnja gasa zahteva produţ etak inkubacije za još 24 časa. Ako se u tom roku proizvede gas nastavlja se potvrdni ogled. b) Potvrdni ogled: iz epruvete sa pozitivnim prethodnim ogledom presejava se na čvrstu podlogu endo agar ili EMB agar jedna eza kulture i inkubira se 48 časova na temperaturi 37 C. Potvrdni ogled se smatra pozitivnim ako su na površini čvrste podloge izrasle tipične kolonije. 11
c) Završni ogled: sastoji se u zasejavanju na tečne i čvrste podloge sa inkubacijom na 37 C od 24 48 časova, posle čega pojava gasa i porast tipičnih kolonija označava pozitivan test. Odsustvo gasa i kolonija koliformne grupe označava negativan test. Laktoza pozitivne kolonije sa čvrstih podloga se identifikuju biohemijskim testovima prema I M V C (tabela 4.3.). U obračunu MPN koliformnih bakterija u ispitivanom uzorku vode koriste se tabele za kolimetriju (tabela 4.1. i 4.2.) prema kojima je i zasejavana voda u odgovarajućim porcijama. Tabela 4.1. Kolimetrija prečišćenih voda po Swaroopu Broj epruveta sa pozitivnom reakcijom od 5 zasejanih sa 10ml vode Najverovatniji broj koliformnih bakterija u 100ml vode (MPN) Granične vrednosti Donja granica Gornja granica 0 0 0 6 1 2,2 0,1 12,6 2 5,1 0,5 19,2 3 9,2 1,6 29,4 4 16,0 3,3 52,9 5 Beskrajan 8,0 Beskrajan Tabela 4.2. Kolimetrija prečišćenih i prirodnih voda zatvorenog tipa po Swaroopu Broj epruveta sa pozitivnom reakcijom Granične vrednosti 1 epruveta od 50 ml 5 epruveta od 10 ml MPN Donja granica Gornja granica 0 1 1 0,5 4 0 2 2 0,5 6 0 3 4 0,5 11 0 4 5 1 13 1 0 2 0,5 6 1 1 3 0,5 9 1 2 6 1 15 1 3 9 2 21 1 4 16 4 40 Tabela 4.3. Varijeteti E. coli i koliformnih bakterija prema IMVC reakciji Vrste I M V C E. coli Variety I + + - - Variety II - + - - E. freundi Variety I - + - + Variety II + + - + Aerobacter Variety I - - + + Variety II ± - + + 12
Postupak za fekalne koliformne Uzorak ispitivane vode zasejava se kao prethodni test koristeći Mac Conkeyev bujon ili koristeći pozitivan prethodni test za ukupne koliformne, tako što se iz svake epruvete sa gasom, ezom prenese materijal na podlogu i inkubira 24 časa na temperaturi 44 C. Pozitivan ogled je promena boje indikatora u podlozi uz stvaranje gasa. Membran-filtar tehnika MF Aparat za filtraciju (tip Sartorius Membranfilter) sastoji se od sledećih delova od nerďajućeg metala: levkastog proširenja kapaciteta do 500mm postavljenog na vrhu na jedan srednji cilindrični deo i donjeg dela koji čini porozni filtar, prečnika 5cm. Ovi delovi se postavljaju jedan na drugi opisanim redom i povezuju u celinu okretanjem poluge na prstenu oblika bojoneta, postavljenog na stativ koji je istovremeno i odvodna cev vezana za bocu za sukciju, a koja je gumenim crevom vezana za vakuum-pumpu. Ovako izgleda aparat koji ima samo jedno mesto za filtriranje vode, a postoje i tipovi aparata gde je moguća simultana filtracija 3 6 uzoraka vode. Princip je isti, a rešenje je bolje za laboratorije koje obraďuju veliki broj uzoraka voda. Kod ovih trokrakih ili šestokrakih modela, svi stativi stoje na jednoj zajedničkoj metalnoj cevi, koja je odvodna za profiltriranu vodu. Uz aparat za stvaranje pritiska koristi se vakuum-pumpa, koja moţ e biti električna ili vodena, zatim boca za sukciju i Woulfova boca. Pri povezivanju delova celog sistema za filtraciju pomoću plastičnih cevi, Woulfovu bocu treba postaviti izmeďu boce za sukciju i vakuum-pumpe da se pumpa zaštiti od prodora vode iz boce za sukciju za vreme filtracije. Membrane za filtraciju načinjene su od ţ elatinske mase, a ima ih raznih veličina pora, namenjenih iznalaţ enju raznih vrsta bakterija. Mogu biti sterilisane u originalnom pakovanju, odnosno mogu se sterilisati u autoklavu, uz obezbeďenje dovoljne vlage, da ne bi izgubile elastičnost. Proizvode se i membrane u originalnom pakovanju, sa skoro suvom podlogom, naročito pogodne za terenske uslove uzorkovanja i obrade vode. Pre početka filtracije vode sterilizuju se metalni delovi. To se najčešće vrši plamenikom opaljivaljem, ali moţ e i suvom sterilizacijom, odnosno izlaganjem UV zracima. Da bi se opalili, metalni delovi se razdvoje i svaki se zasebno opali. Zatim se na porozni filtarski deo sterilnom pincetom postavlja membrana, a iznad nje srednji cilindrični deo i gornji levkasto prošireni deo, pričvršćuje se zatvarač, zatvara se slavina na stativu i uliva se voda koja se ispituje. Pre ulivanja vode u aparat plamenom se opali grlić boce u kojoj je voda doneta na analizu i malo vode se izlije izvan ureďaja. 13
Kad su izvršene opisane radnje, uključuje se pumpa, pošto se reguliše dovod za vazduh, i filtracija se obavlja za nekoliko sekundi. Po obavljenoj filtraciji, rasklapaju se metalni delovi (levkasti i srednji cilindrični), a sterilnom pincetom se skida membrana i postavlja u Petrijevu ploču na podlogu, vodeći računa o gornjoj strani membrane na kojoj su se po filtriranju zadrţ ale bakterije. Ploče sa membranama inkubiraju se na odreďenoj temperaturi 24 48 časova i porast se očitava lupom. Pri filtriranju više uzoraka vode radi obezbeďivanja sterilnosti, aparat treba oplaknuti destilovanom vodom izmeďu dva filtriranja i to isto profiltrirati. Ako se raspolaţ e malim količinama vode, a radi stvaranja boljih uslova za filtriranje i da bi se bakterije ravnomerno rasporedile po membrani, pre filtriranja treba usuti sterilne vode u levak, pa tek onda tu malu količinu uzorka kojom raspolaţ emo. Metodom MF dokazujemo totalne i fekalne koliformne primenom odgovarajućih podloga i temperature, kao i vremena inkubacije, koje su opisane kod MPN metoda. Primenom podloge Mac Conkey agar za dokazivanje fekalnih koliformnih na 44 C za 24 časa, dobijamo porast tipičnih fekalnih kolonija, koje su ljubičaste boje, a nefekalne su sivkasto-ţ ućkaste boje. To je najkraći postupak za dokazivanje koliformnih bakterija. U izračunavanju broja koliformnih bakterija prema MF metodi, koristi se formula: uz obračunavanje razreďenja, ako je ono vršeno. uz obračunavanje razreďenja, ako je ono vršeno. Dobijeni rezultat predstavlja totalni broj koliformnih bakterija u ispitivanoj količini vode i stvarni, a ne najverovatniji kao što je u slučaju fermentacionog testa. To je jedna od povoljnosti metoda MF u odnosu na metode najverovatnijeg broja. 14
4.2.3. Dokazivanje fekalnih streptokoka Drugu grupu bakterija indikatora fekalnog zagaďenja predstavljaju streptokoke D grupe po Lancefieldovoj. Po preporukama Supkomiteta za vode, raniji naziv enterokoke je izmenjen i usvojen je naziv fekalne streptokoke, kojim se ističe njihovo poreklo iz digestivnog trakta ljudi i ţ ivotinja. To su Gram-pozitivne koke, ovalnog oblika, rasporeďene u obliku diplokoka. Imaju skromne zahteve za hranom, te dobro rastu na običnim podlogama, štaviše i na podlogama koje sadrţ e 40% ţ uči, što se koristi za njihovo diferenciranje od ostalih streptokoka. Odlikuju se znatnom vitalnošću i otpornošću i zbog toga mogu da izdrţ e duţ e vreme u nepovoljnim uslovima spoljašnje sredine. Zbog toga njihov nalaz u vodi označava fekalno zagaďenje. U ovu grupu spadaju: Streptococcus faecalis sa varijetetima zymogenes i liquefaciena, zatim Streptococcus durans, Streptococcus bovis i Streptococcus equinus. Njihove biohemijske karakteristike i preţ ivljavanja na neprijateljskim podlogama prikazana su u tabeli 4.6. Detekcija fekalnih streptokoka u vodi prema preporukama Subkomiteta za vode vrši se metodom MPN sa višestrukim razreďenjima i membran-filtar metodom. MPN metoda a) Prethodni ogled: serija epruveta sa podlogom azid-dekstrozni bujon inokuliše se odreďenom količinom vode, prema tabelama koje se koriste za zasejavanje i izračunavanje najverovatnijeg broja (MPN) koliformnih bakterija u vodama. Ako se koristi jednostruka koncentracija podloge, odnos količine zasejanog inokulima i podloge je 1 : 10, a ako je podloga dvostruke koncentracije, odnos inokulima i podloge je 1 : 1. Inkubira se na 37 C 24 časa, odnosno 48 časova do pojave zamućenja. b) Potvrdni ogled: iz zamućenih epruveta uzima se jedna kap materijala i inokuliše se na čvrstu podlogu. Inkubacija je na 37 C 24 časa. Porast crnih sitnih kolonija pokazuje prisustvo fekalnih streptokoka. Dalja identifikacija se vrši prema tabeli 4.6. MF metoda a) Prethodni ogled: izvrši se filtracija vode (100ml direktno ili decimalnih razreďenja), kroz membranu veličine pora 0,2µ koja se postavlja na čvrstu podlogu. Inkubacija je na 37 C, 48 časova. Kolonije fekalnih streptokoka su crne boje. b) Potvrdni ogled: sastoji se u katalaza-testu koji se vrši tako da se navedene kolonije ezom skidaju sa membrane i na predmetnom staklu u 3% H 2 O 2 proverava se pojava mehurića. Negativan katalaza-test potvrďuje prisustvo fekalnih streptokoka. 15
c) Završni ogled: vrši se samo sa katalaza negativnim kolonijama (tabela 4.4.). Broj fekalnih streptokoka u ispitanoj količini vode izračunava se prema formuli: č kao i za koliformne. Završni ogled, tj. identifikacija biohemijskih osobina i sposobnosti preţ ivljavanja streptokoka na tzv. neprijateljskim podlogama (tabela 4.4.) vrši se samo sa katalaza negativnim kolonijama. Broj fekalnih streptokoka u ispitanoj količini vode izračunava se prema formuli: uz obračun razreďenja. 16
Tabela 4.4. Biohemijska ponašanja streptokoka D grupe i preživljavanje na neprijateljskim podlogama Redni broj Vrste Str. faecalis Str. faecium Str. durans Str. bovis Str. equinus 1 Vrsta hemolize gama alfa beta alfa alfa 2 Lithmus-mleko redukuje i - - - - zgrušava 3 Telurit + - - - - 4 Lactosa + + + + - 5 Sacch. + + + + - 6 Manit + ± - ± - 7 Esculin + - - - - 8 Sorbit - - - - - 9 Rafinoza + - - + + 10 Arabinoza + + - ± - 11 Likvef. ţ elatine -Str. faecalis - - - - -Var. zymogenes +Var. liquefaciens 12 Hidroliza arginina + - - - - 13 Redukcija + - - - - triphenyltetrazolium 14 6,5% NaCl + + + - - 15 40% ţ uč + + + + + 16 ph 9,6 + + + - - 17 30 na 60 C + + + - - 4.2.4. Dokazivanje Proteus vrsta u vodi Nalaz proteusa u vodi ukazuje ne samo na fekalno zagaďenje, nego i na zagaďenje organskim materijama u raspadanju. Prema tome, Proteus je značajniji i širi higijenski indikator nego koliformne bakterije i kriterijum za vode prema nalazu proteusa je veoma strog, naime, isključuje vodu iz upotrebe ako se naďe u bilo kojoj količini vode. Zbog toga je obavezno dokazivanje proteusa u vodi i ako je nalaz kolimetrije negativan. Gram-negativni bacili sa peritrihijalnim flagelama, bez spora i kapsula, dobro rastu na svim podlogama, uz fenomen rojenja, tj. brzog širenja na površini nekih čvrstih hranilišta. Po biohemijskim osobinama, tj. prema fermentativnoj aktivnosti na ugljene hidrate, zatim sposobnosti produkcije H 2 S i indola, razlikuju se pojedine vrste, a zajednička im je osobina da ne razlaţ u laktozu. U pogledu biohemijskih osobina, sve vrste roda Proteus imaju zajedničku osobinu da ne razlaţ u laktozu i hidrolizuju ureu. Po fermentativnoj aktivnosti prema drugim šećerima, kao i prema sposobnosti produkcije H 2 S i indola, razlikuju se pojedine vrste proteusa i te osobine, prikazane u tabeli 4.6, koriste se za diferencijaciju i klasifikaciju. 17
Metode dokazivanja a) Prethodni ogled: iz sadrţ aja epruveta za kolimetriju načini se nativni preparat, a uočavanje veoma pokretnih tankih bacilusa navodi na pretpostavku da su proteusi prisutni u vodi i zahteva dalji rad na dokazivanju. b) Potvrdni ogled: iz epruveta za kolimetriju ezom se inkuliše na krvni ili Endo agar, inkubira 24 časa na 37 C i vrši se identifikacija dobijenih kolonija. Identifikacija H- forme je lakša, označava Proteus u rojenju, a laktoza negativne kolonije na Endu zahtevaju diferenciranje i identifikaciju biohemijskim metodama. c) Završni ogled: sastoji se u zasejavanju sumnjivih kolonija iz potvrdnog ogleda na tečne i čvrste podloge prema tabelama 4.5. i 4.6. i diferenciranju vrste prema biohemijskim osobinama. Tabela 4.5. Rod Proteus Negativno Pozitivno Lactoza Urea Phenylalanin KCN MR Dextroza Tabela 4.6. Biohemijske odlike vrste Proteus (A aciditet, g gas, V varijabilno) Vrsta dextroza Sachar. maltoza manit indol Sim. citrat H2S ţ elatin Urea Proteus vulgaris Ag Ag Ag - + + + + + + Proteus mirabilis Ag V - - - + + + + + Proteus morgani Ag - - - + - + - + + Proteus rettgeti Ag Ag - + + + - - + + pokret 18
4.2.5. Dokazivanje sulfitoredukujućih sporogenih anaeroba Klostridije su široko rasprostranjene u prirodi, a pošto su stanovnici digestivnog trakta ljudi i ţ ivotinja, njihov nalaz u zemlji i vodi ukazuje na fekalno zagaďenje. Iz tih razloga je izmenjen stav u vezi sa dokazivanjem prisustva u vodi ne samo Cl. perfingens, nego i ostalih vrsta i Supkomitet za vode ISO doneo je zaključak da se ne sme dozvoliti nalaz SSA u 100ml prečišćene vode. Njihov nalaz u vodi dokazuje higijensku neispravnost vode, a upotreba takve vode je rizična, naročito kada se upotrebljava za pripremu ţ ivotnih namirnica u kojima se SSA mogu razmnoţ avati i uzrokovati trovanja. Gram-pozitivni sporogeni bacili, katalaza negativni, poseduju sposobnost redukovanja sulfita i sulfida koja postaje vidljiva kada se dodaje sulfit i gvoţ Ďe u hranljivu podlogu i manifestuje se promenom boje tečnih podloga, odnosno porastom crnih kolonija usled formiranja gvoţ Ďe-sulfida crne boje. Nalaz SSA u prečišćenoj vodi ukazuje na nedovoljnu obradu vode, jer su spore otporne na uobičajene koncentracije hlora. MPN metoda Pre zasejavanja, primerak ispitivane vode zagreva se 10 minuta u vodenom kupatilu na temperaturi 75 C da bi se uništili nesporogeni mikroorganizmi koji imaju sposobnost sulfitoredukcije. a) Prethodni ogled: u dve epruvete od 100ml usuti po 50ml vode za piće i zagrevati 15 minuta na 80 C. Zatim na navedenu količinu nasuti 50ml sulfitnog agara za anaerobe, dvostruke koncentracije, otopljenog i ohlaďenog na 50 C. Sadrţ inu epruvete dobro izmešati sa podlogom i ohladiti pod mlazom vode. Zasejanu podlogu inkubirati 48 časova na 37 C. Pojava crnih kolonija navodi na sumnju da su prisutne sulfitoredukujuće klostridije. Ukoliko se ne uoče crne kolonije, inkubaciju produţ iti još tri dana. b) Potvrdni ogled: od crnih kolonija iz sulfidnog agara napraviti mikroskopski preparat (Gram-pozitivni sporogeni štapići) i zasejati aerobno na krvni agar. Izostanak rasta posle 24 48 časova potvrda je da se radi o sulfitoredukujućim sporogenim anaerobima. Potvrdni ogled se takoďe vrši samo radi potvrďivanja Clostridium perfringens. Izvodi se tako da se iz svake promenjene (tj. Pocrnele) podloge iz prethodnoh ogleda prenese inokolum. 19
MF metoda Uzorak vode se takoďe zagreva u vodenom kupatilu da bi se inaktivisali nesporogeni mikroorganizmi koji imaju sposobnost sulfitoredukcije; zatim se voda profiltrira. Koristi se membrana veličine pore za koliformne (0,45 mikrona). Membrana sa profiltriranim bakterijama postavlja se na podlogu SPS i ostavlja se 30 minuta u termostatu da se suši da se kolonije ne bi razlile jer se preko membrane preliva sulfit-glukoza-fe-agar, a zatim se ploča ostavi da se stvrdne. Za stvaranje anaerobnih uslova bez specijalnog aparata dovoljno je preko ovog stegnutog sulfit-glukoza-fe-agara preliti otopljen i ohlaďen hranljivi agar i po njegovom stezanju staviti celu ploču u termostat na inkubaciju 48 časova na 37 C. Posle toga se očitava porast kolonija. Primena MF metode ima poseban značaj u dokazivanju sulfito SSA u prečišćenoj vodi u kojoj su one malobrojne, jer se ovom metodom dobija koncentracija bakterija na malom prostoru. Sa kolonijama se takoďe moţ e vršiti ogled na lithmus-mleku s ciljem dokazivanja Cl. perfingens. 4.2.6. Dokazivanje Pseudomonas aeruginosa Prilikom bakterioloških ispitivanja vode čest je nalaz hromogenih bakterija, naročito roda Pseudomonas, što ima odreďeni higijenski značaj, jer problem uvećava i saznanje o potencijalnoj patogenosti Pseudomonas aeruginosa. Zbog velike rasprostranjenosti u spoljnoj sredini njegov je nalaz u vodi tolerisan, odnosno izazvao je diskusije, ali bez odreďenog stava o ispravnosti takve vode. Prema savremenim koncepcijama, nalaz P. aeruginosa u prečišćenoj vodi označava se kao fekalno zagaďenje koje nalaţ e uporedo kontrolisanje vode izvorišta i mreţ e da bi se objasnio nalaz u mreţ i s obzirom na znatnu otpornost pseudomonasa na hlor. Pseudomonas aeruginosa su Gram-negativni bacili, pravi ili lako savijeni, pokretni sa jednom ili više polarnih flagela, asporogeni, aerobni, koriste molekularni kiseonik; neke vrste koriste denitrifikaciju kao alternativni anaerobni respiratorni mehanizam; svi su hemoorganotropni; neki su fakultativno hemolitotropni koji koriste vodonik kao izvor energije. Specijalna osobina P. aeruginosa jeste da raste na 42 C i da prozvodi pyocuanin. 20
MPN metoda U rutinskoj dijagnostici voda za dokazivanje prisustva P. aeruginosa koriste se tečne podloge iz prethodnog ogleda za koliformne bakterije, sa kojih se materijal presejava na Kingovu podlogu koja je ukošena u epruveti i posle inkubacije na 42 C u toku 24 časa konstatuje se pojava porasta kolonija i promene boje podloge u zelenkasto-plavu, usled proizvodnje pigmenta koji se moţ e proveriti na piacianin ukapavanjem na porast 2ml hloroforma. Pojava plave boje označava pozitivnu reakciju. MF metoda Po filtriranju vode, membrana se postavlja na podlogu u Petrijevu ploču i inkubira na 42 C, 48 časova. Porasle kolonije su tamno-zeleno-braon boje, zeleno-crnog centra, a blede spoljne ivice. Potvrdni ogled se moţ e vršiti kako je već opisano, ali se moţ e upotrebiti podloga sa mlekom na kojoj Pseudomonas proizvede hidrolizu kazeina i produkciju pigmenata za 24 časa, na temperaturi 35 37 C. Porasle kolonije se obračunavaju na isti način kao kod koliformnih bakterija. 4.3. Metode ispitivanja antimikrobnog delovanja blata Antimikrobna aktivnost lekovitog blata protiv bakterijskih patogena koţ e je ispitivana uz pomoć dve metode: disk-difuzione i mikrodilucione metode. Blato je pre sprovoďenja opisanih metoda bilo podeljeno u dve posude od kojih je jedna sterilisana u autoklavu. Cilj ovoga je bio da se ispita delovanje blata bez prisustva drugih mikrooganizama u njemu (samo abiotički deo blata). 4.3.1. Bakterijski sojevi Za ispitivanje antimikrobne aktivnosti korišćeni su sojevi iz ATCC kolekcije (American Type Culture Collection), Gram (+) bakterije: Staphylococcus aureus ATCC 6538, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Enterococcus faecalis ATCC 19433 i Gram (-) bakterije: Escherichia coli ATCC 9863, Proteus mirabilis ATCC 12453, Enterobacter aerogenes ATCC 13048, Klebsiella pneumoniae ATCC 10031, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Acinetobacter baumanii ATCC 196060, kao i odgovarajući sojevi izolovani iz briseva rana pacijenata (izvor: Institut za javno zdravlje Novi Sad). 21
4.3.2. Disk-difuziona metoda Od prekonoćnih kultura ispitivanih test-sojeva mikroorganizama uzgajanih na hranljivom agaru je, u sterilnom fiziološkom rastvoru, napravljena suspenzija turbiditeta 0,5 McFarlanda koja sardţ i 1,5x10 8 CFU/ml (NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards, 2003). Nakon toga je, prema priloţ enom uputstvu, napravljena odgovarajuća podloga, Müller-Hinton agar (Torlak). Podloga je sterilisana u autoklavu (u trajanju od 20 minuta, na temperaturi od 121 C) i razliveno je po 15ml u sterilne petri-kutije prečnika 100mm. Nakon hlaďenja podloga izvršena je inokulacija sa po 0,1ml od svih pripremljenih suspenzija test-mikroorganizama. Na inokulisanu površinu pločastog agara postavljeni su sterilni celulozni diskovi prečnika 5mm (Himedia, Milano, Italy) i na njih nanešeno po 15 l sledećih uzoraka: nerazblaţ enog blata i serija razreďenja u odnosu 1:10, 1:20 i 1:50. Kao pozitivna kontrola korišćen je disk sa odgovarajućim antibiotikom (hloramfenikol 30μg/mg - proizvoďač Torlak). Ceo postupak je izveden u tri ponavljanja. Nakon aplikacije svih uzoraka, petri kutije su inkubirane na odgovarajućoj temperaturi od 37 C u trajanju od 24h. Očitavanje zona inhibicije je izvršeno uz pomoć nonijusa u mm. 4.3.3. Mikrodiluciona metoda Za odreďivanje minimalne inhibitorne koncentracije (MIC) i minimalne baktericidne koncentracije (MBC) lekovitog blata korisćena je mikrodiluciona metoda. Od prekonoćnih kultura ispitivanih test-sojeva mikroorganizama uzgajanih na hranljivom agaru je, u sterilnom fiziološkom rastvoru, napravljena suspenzija turbiditeta (zamućenosti) 0,5 McFarlanda koja sardţ i 1,5x10 8 CFU/ml (NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards, 2003). Početni uzorak blata je napravljen tako što je 5g blata rastvoreno u 1l sterilnog fiziološkog rastvora. Zatim je napravljena serija duplih razreďenja uzoraka (pripremljeno u mikrotitar ploči sa 96 udubljenja) u rasponu od 500 0,02 l/ml. Ukupna zapremina u bunariću je iznosila 100 l, a gustina suspenzije 2x10 6 CFU/ml. Mikrotitarske ploče su inkubirane na 37 C u trajanju od 24 h. Postupak je izveden u dva ponavljanja. Slika 4.1. Mikrotitarska ploča sa inokulisanom hranljivom podlogom, tretirana serijom razblaţ enja uzoraka 22
Mikrobiološki rast je očitavan uz pomoć 20μl 0,5% vodenog rastvora trifenil tetrazolijum hlorida (TTC). Koncentracija u kojoj nema vidljivog rasta (nema crveno obojenih kolonija bakterija) predstavlja minimalnu inhibitornu koncentraciju (MIC). Da bi se odredila minimalna baktericidna koncetracija (MBC) iz svih bunarića u kojima nije bilo rasta, tj. iz onih koji se nalaze do bunarića sa minimalnom inhibitornom koncentracijom, sadrţ aj je prenesen na nove petri-ploče sa odgovarajućim čvrstim MH podlogama (Müller-Hinton agar). Nakon toga ploče su inkubirane 24 časa na 37 C. Nakon inkubacije vršeno je brojanje poraslih kolonija. MBC/MFC se definiše kao najniţ a koncentracija aktivne supstance koja ubija 99,5% bakterija (NCCLS standard National Committee for Clinical Laboratory Standards, 2003). 95% (p 0,05). 4.3.4. Statistička obrada podataka Svi rezultati su statistički obraďeni analizom varijanse (ANOVA) sa sigurnošću od 23
V REZULTATI I DISKUSIJA Rezultati analiza mikrobiološkog sastava lekovitog blata Crnog mora (odreďivanje ukupnog broja bakterija, odreďivanje ukupnog broja koliformnih bakterija, dokazivanje fekalnih streptokoka, dokazivanje Proteus vrsta, dokazivanje sulfitoredukujućih sporogenih anaeroba, dokazivanje Pseudomonas aerugynosa) su pokazali prisustvo samo vrsta roda Bacillus (slika 5.1.). Slika 5.1. Porast vrste iz roda Bacillus O antimikrobnim dejstvima lekovitih blata nije mnogo poznato, jer nije vršeno mnogo istraţ ivanja vezanih za ovu temu. Ma'or i saradnici (2006) istraţ ivali su antimikrobna svojstva crnog mineralnog blata iz Mrtvog mora. Oni su ustanovili da se na ovom blatu formira veoma mali broj kolonija mikroorganizama, od kojih najveći deo predstavljaju bakterije koje formiraju endospore. Kao test organizme koristili su vrste: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Propionibacterium acnes i Candida albicans. Zone inhibicije rasta javile su se oko diskova blata iz Mrtvog mora na podlozi inokulisanoj vrstama Candida ili Propionibacterium, ali ne i kod Staphylococcus ili Escherichia. Ovi istraţ ivači su zaključili da su antimikrobna svojstva ovog blata posledica fizičkih i hemijskih fenomena. Rezultati disk-difuzione metode su pokazali da lekovito blato nije dalo zone inhibicije bakterijskog rasta. Mikrodilucionom metodom je dokazano da blato ne poseduje antimikrobna dejstva prema ispitivanim vrstama bakterija. Nakon inkubacije od 24h na 37 C došlo je do porasta svih ispitivanih vrsta bakterija. 24
Slika 5.2. Porast vrsta Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa i Klebsiella pneumoniae presejanih iz bunarića sa najvećom koncentracijom blata Slika 5.3. Porast vrsta Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa i Klebsiella pneumoniae presejanih iz bunarića sa najmanjom koncentracijom blata Slika 5.4. Porast vrsta Acinetobacter boumanii, Proteus mirabilis i Escherichia coli presejanih iz bunarića sa najvećom koncentracijom blata Slika 5.5. Porast vrsta Acinetobacter boumanii, Proteus mirabilis i Escherichia coli presejanih iz bunarića sa najmanjom koncentracijom blata 25
VI ZAKLJUČAK Uzorak blata je uzet u sterilne boce sa lokaliteta blatne banje na Crnom moru u mestu Pomorie (Bugarska), u leto 2015. godine. Do vršenja daljih analiza uzorak je čuvan u friţ ideru, na temperaturi +4 C. Vršene su analize mikrobiološkog sastava lekovitog blata (odreďivanje ukupnog broja bakterija u 1ml uzorka blata, odreďivanje ukupnog broja koliformnih bakterija, dokazivanje fekalnih streptokoka, dokazivanje Proteus vrsta, dokazivanje sulfitoredukujućih sporogenih anaeroba, dokazivanje Pseudomonas aerugynosa). Analiza dobijenih rezultata je pokazala jedino prisustvo vrsta roda Bacillus u ispitivanom uzorku blata. Antimikrobna aktivnost lekovitog blata je ispitivana disk-difuzionom metodom i mikrodilucionom metodom. Kao test organizmi korišćene su različite patogene vrste iz grupe Gram (+) i Gram (-) bakterija koje izazivaju infekcije rana. Analizom dobijenih rezultata ustanovljeno je da ovo lekovito blato ne poseduje antimikrobnu aktivnost protiv ispitivanih vrsta bakterija. Na osnovu dobijenih rezultata se moţ e zaključiti da ukoliko lekovito blato deluje pozitivno na infekcije koţ e, to je usled nekih drugih mehanizama, a ne direktnim inhibitornim ili baktericidnim delovanjem na patogene koţ e. 26
VII LITEARTURA Chadzopulu, A., Adraniotis, J., Theodosopoulou, E. (2011): The therapeutic effects of mud. Progress in Health Sciences, 1(2): 132 136. Đukić, S., Berger-Jekić, O. (2008): Neisseriaceae. In: Švabić-Vlahović, M. (ed.): Medicinska bakteriologija. Savremena administracija a.d. Beograd. 219 231. Karakašević, B. (1987): Mikrobiologija i parazitologija. Medicinska knjiga. Beograd Zagreb. Kocić, B. (2008): Pseudomonas i druge nefermentujuće bakterije. In: Švabić- Vlahović, M. (ed.): Medicinska bakteriologija. Savremena administracija a.d. Beograd. 285 294. Lalević-Vasić, B., Medenica, Lj., Nikolić, M. (2010): Dermatovenerologija sa propedevtikom. Savremena administracija a. d. Beograd. Ma or, Z., Henis, Y., Alon, Y., Orlov, E., Sørensen, K. B., Oren, A. (2005): Antimicrobial properties of Dead Sea black mineral mud. International Journal of Dermatology,45: 504 511. Matz, H., Orion, E., Wolf, R. (2003): Balneotherapy in dermatology. Dermatologic Therapy, 16: 132 140. Mihajilov-Krstev, T. (2008): Radna sveska iz mikrobiologije. Univerzitet u Nišu, Prirodno-matematički fakultet, Odsek za biologiju i ekologiju. Niš. Pecić, J., Jelesić, Z. (2008): Porodica Enterobacteriaceae. In: Švabić-Vlahović, M. (ed.): Medicinska bakteriologija. Savremena administracija a.d. Beograd. 233 265. Pecić, J., Mihajlović-Ukropina, M. (2008): Citrobacter. In: Švabić-Vlahović, M. (ed.): Medicinska bakteriologija. Savremena administracija a.d. Beograd. 259. Petrović, O., Kneţ ević, P., Simeunović, J. (2007): Mikrobiologija. Univerzitet u Novom Sadu, Prirodno-matematički fakultet, Departman za biologiju i ekologiju. Novi Sad. Potpara, Z., Cupara, S., Marstijepović, N., Bojović, D. (2009): Medicinski peloid. Racionalna terapija,1(2): 25 30. Ranin, L., Berger-Jekić, O. (2008): Rod Staphylococcus. In: Švabić-Vlahović, M. (ed.): Medicinska bakteriologija. Savremena administracija a.d. Beograd. 285 294. Riyaz, N., Arakkal, F. R. (2011): Spa therapy in dermatology. Indian Journal of Dermatology, Venereology and Leprology,77: 128 134. 27
Suárez, M., Domínguez, R., Bravo, A., González, P., Melián, C., Pérez, M., Blanco, D., Fagundo, J. R., Herrera, I., Hernández, R. (2010): Analysis of anthropogenic organic compounds in San Diego de los Baños peloid, Pinar del Rio, Cuba. Revista CENIC. Ciencias Químicas, 41: 1 8. 28
BIOGRAFIJA Milena Miletić roďena je 14. 06. 1991. godine u Paraćinu. Završila je osnovnu školu Momčilo Popović Ozren 2006. godine i iste godine upisala Gimnaziju u Paraćinu, društveno-jezički smer. 2010. godine završila je srednju školu i upisala studije biologije na Prirodno-matematičkom fakultetu u Nišu. Osnovne studije završila je 2013. godine sa prosekom 8,31 i dobila zvanje biolog. Iste godine upisala je master studije, smer ekologija i zaštita prirode. 29
Прилог5/1 ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИФАКУЛТЕТ НИШ КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА Редни број, РБР: Идентификациони број, ИБР: Тип документације, ТД: Тип записа, ТЗ: Врста рада, ВР: Аутор, АУ: Ментор, МН: Наслов рада, НР: Монографска Текстуални / графички Мастер рад Милена Милетић Татјана Михајилов Крстев Антимикробна својства лековитог блата Језик публикације, ЈП: Језик извода, ЈИ: Земља публиковања, ЗП: Уже географско подручје, УГП: Српски Енглески Р. Србија Р. Србија Година, ГО: 2015 Издавач, ИЗ: Ауторски репринт Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33. Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога) Научна област, НО: Научна дисциплина, НД: Предметна одредница/кључне речи, ПО: 29 страна, 6 табела, 6 слика Биологија Микробиологија Лековито блато, инфекције рана, антимикробна активност УДК 579.6:615.838.7 Чува се, ЧУ: Библиотека Важна напомена, ВН: Извод, ИЗ: Циљ овог рада је испитивање антимикробног дејства лековитог блата сакупљеног у блатној бањи на Црном мору у место Поморие (Бугарска). Узорак је сакупљен у лето 2015. године и до даљих анализа је чуван у фрижидеру на +4 С. Извршене су анализе микробиолошког састава лековитог блата, које су показале присуство врста рода Bacillus. Антимикробна активност је испитивана диск-дифузионом методом и микродилуционом методом. Као тест организми коришћени су патогени бактеријски сојеви из групе Грам (+) и Грам (-) бактерија који изазивају инфекције рана. Анализе добијених резултата показују да блато не поседује антимикробна дејства према испитиваним врстама бактерија. Датум прихватања теме, ДП: 17.02.2016. Датум одбране, ДО: Чланови комисије, КО: Председник: Члан: Члан, ментор: ОбразацQ4.09.13- Издање