UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO-MATEMATIĈKI FAKULTET DEPARTMAN ZA HEMIJU UTICAJ TEMPERATURE ČUVANJA NA SADRŽAJ UKUPNIH FLAVONOIDA I MONOMERNIH ANTOCIJANA

UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO-MATEMATIĈKI FAKULTET DEPARTMAN ZA HEMIJU UTICAJ TEMPERATURE ČUVANJA NA SADRŽAJ UKUPNIH FLAVONOIDA I MONOMERNIH ANTOCIJANA U SOKU I SIRUPU OD ARONIJE - MASTER RAD - MENTOR: STUDENT: dr Aleksandra Pavlović, vanr. prof. Milica Branković, 54

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА Редни број, РБР: Идентификациони број, ИБР: Тип документације, ТД: Тип записа, ТЗ: Врста рада, ВР: Аутор, АУ: Ментор, МН: Наслов рада, НР: Језик публикације, ЈП: Језик извода, ЈИ: Земља публиковања, ЗП: Уже географско подручје, УГП: Монографска текстуални / графички Мастер рад Милица Бранковић Александра Павловић Утицај температуре чувања на садржај укупних флавоноида и мономерних антоцијана у соку и сирупу од ароније Српски Енглески Р. Србија Р. Србија Година, ГО: 2015. Издавач, ИЗ: ауторски репринт Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33 Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ Научна област, НО: 52 стр., 9 табелa, 41 сликa, 23 референце Хемија Научна дисциплина, НД: Аналитичкa хемија Предметна одредница/кључне речи, ПО: аронија, укупни мономерни антоцијани, укупни флавоноиди, кинетика деградације, антиоксидативна активност УДК 544.032.4 : (547.56 + 663.8 + 582.711.71) Чува се, ЧУ: Важна напомена, ВН: 544.032.4 : (547.972.2 + 663.8 + 582.711.71) Библиотека

Извод, ИЗ: Праћен је утицај температуре (4 С, 22 С и 30 С) у току 45 дана на очуваност садржаја укупних флавоноида и мономерних антоцијана у комерцијално доступном соку и сирупу од ароније. Паралелно је мерена и антиоксидативна активност, DPPH методом. Добијени резултати су показали да брзина деградације прати кинетику реакције првог реда. У раду је испитана и деградација катехина ((- )-епикатехина и (+)-катехина) и четири антоцијана, деривата цијанидина. Датум прихватања теме, ДП: Датум одбране, ДО: Чланови комисије, КО: Председник: Члан: Члан, ментор:

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ KEY WORDS DOCUMENTATION Accession number, ANO: Identification number, INO: Document type, DT: Type of record, TR: Contents code, CC: Author, AU: Mentor, MN: Title, TI: Language of text, LT: Language of abstract, LA: Country of publication, CP: Locality of publication, LP: Monograph textual / graphic University Degree Thesis Milica Branković Aleksandra Pavlović The influence of storage temperature on total flavonoids and monomeric anthocyanins in chokeberry juice and syrup Serbian English Republic of Serbia Serbia Publication year, PY: 2015 Publisher, PB: author s reprint Publication place, PP: Niš, Višegradska 33 Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes ) Scientific field, SF: Scientific discipline, SD: Subject/Key words, S/KW: 52 p., 9 tables, 41 figures, 23 references Chemistry Analytical Chemistry aronia, total monomeric anthocyanins, total flavonoids, kinetic of degradation, antioxidant activity UC 544.032.4 : (547.56 + 663.8 + 582.711.71) Holding data, HD: Note, N: 544.032.4 : (547.972.2 + 663.8 + 582.711.71) Library

Abstract, AB: The effect of the temperature (4 С, 22 С and 30 С) during 45 days on the preservation of total content of flavonoids and monomeric anthocyanins in commercially available chokeberry juice and syrup was tested. Antioxidant, DPPH activity was also measured. The obtained results were shown that the rate of degradation followed first order reaction kinetics. Degradation of catechins ((-)- epicatechin and (+)-catechin) and four of anthocyanins, cyanidin derivatives, was also investigated. Accepted by the Scientific Board on, ASB: Defended on, DE: Defended Board, DB: President: Member: Member, Mentor:

Sadržaj: 1. Uvod... 1 2. Teorijski deo... 2 2.1. Polifenolna jedinjenja... 3 2.1.1. Flavonoidi... 4 2.1.1.1. Struktura flavonoida i antioksidativna aktivnost... 5 2.1.1.1.1.Uticaj hidroksilnih grupa na antioksidativnu aktivnost... 6 2.1.1.1.2.Uticaj 2,3-dvostruke veze i 4-keto grupe na antioksidativnu aktivnost... 8 2.1.1.1.3.Uticaj O-metilovanja na antioksidativnu aktivnost... 8 2.1.1.1.4.Uticaj graċenja glikozida... 9 2.1.1.1.5.Helatiranje metalnih jona... 9 2.1.2. Antocijani... 9 2.1.2.1. Metode izolovanja, preĉišćavanja i odreċivanja antocijana...11 2.1.2.2. Metabolizam, bioraspoloţivost i biološka aktivnost...12 2.2. Faktori koji utiĉu na smanjenje ukupnih antocijana u voću i voćnim proizvodima...12 2.2.1. Uticaj povišene temperature...12 2.2.2. Uticaj skladištenja...13 2.2.3. Uticaj sušenja i zamrzavanja...13 2.3. Aronija...13 2.3.1. Fenolna jedinjenja u crnoj aroniji...14 2.4. Instrumentalne tehnike...14 2.4.1. UV/VIS spektrofotometrija...15 2.4.2. Teĉna hromatografija visokih performansi (HPLC)...17 3. Eksperimentalni deo...19 3.1. Reagensi...20 3.2. Aparatura...20 3.3. Uzorci...20 3.4. Priprema uzoraka...20

3.5. OdreĊivanje sadrţaja ukupnih i monomernih antocijana...21 3.6. OdreĊivanje sadrţaja ukupnih flavonoida...22 3.7. OdreĊivanje antioksidativne aktivnosti...24 3.8. OdreĊivanje pojedinaĉnih polifenolnih jedinjenja korišćenjem HPLC metode...26 3.9. Statistiĉka obrada rezultata...27 4. Rezultati i diskusija...28 4.1. HPLC analiza soka i sirupa...29 4.2. Uticaj temperature ĉuvanja na sadrţaj ukupnih flavonoida u soku i sirupu od aronije...34 4.3. Uticaj temperature ĉuvanja na sadrţaj ukupnih antocijana u soku i sirupu od aronije...40 4.4. Uticaj temperature ĉuvanja na antioksidativnu aktivnost soka i sirupa od aronije...45 5. Zakljuĉak...48 6. Literatura...50

- 1-1. UVOD

Flavonoidi su grupa polifenolnih jedinjenja koja su prisutna u mnogim biljkama. U samim biljkama deluju antioksidativno, antimikrobno, štite od UV zraka i daju jarke boje plodovima biljaka. Flavonoidi imaju niz pozitivnih efekata i na ljudski organizam. Pripisuje im se antibakterijsko, antimutageno, antioksidativo dejstvo i još mnoga druga delovanja. Širok dijapazon pozitivnih delovanja se pripisuje njihovoj strukturi, zahvaljujući kojoj imaju sposobnost hvatanja elektrona slobodnih radikala, sposobnost vezivanja jona prelaznih metala koji deluju kao promotori pri nastajanju aktivnih radiklanih vrsta, sposobnost aktiviranja antioksidacionih enzima i inhibiranja oksidaza. Najĉešći radikali koji štete organizmu su kiseoniĉne i azotne reaktivne vrste, kao što su peroksidni radikal-anjon [O 2 -. ], hidroksi radikal [OH. ], hidrogenperoksidni radikal [HO 2. ], HOONO, NO, NO 3. Reaktivne vrste nastaju kao normalna posledica odvijanja biohemijskih procesa u organizmu, ali i kao posledica sve ĉešćeg izlaganja ksenobioticima. U organizmu postoji ravnoteţa izmeċu oštećenja koje izazivaju radikali tzv. oksidativnog stresa i antioksidativne reparacije, zahvaljujući razliĉitim antioksidativnim mehanizmima. MeĊutim, zbog sve većeg izlaganja organizma štetnim dejstvima, na znaĉaju dobija unošenje prirodnih antioksidanasa kao što su jedinjenja iz grupe flavonoida, pri ĉemu se najveća paţnja posvećuje antocijanima. Pokazalo se da antocijani pomaţu kod hroniĉnih bolesti i razliĉitih stanja oslabljenog imuniteta. Poznat je francuski paradoks, gde Francuzi koji redovno konzumiraju vino imaju manji procenat obolevanja od bolesti srca. Ograniĉenje eksploatacije antocijana iz prirode je njihova nestabilnost na razliĉite faktore, pogotovu na klasiĉne naĉine konzervisanja hrane tj. na temperaturnu obradu. Istraţivanja su pokazala da povišena temperatura i dugotrajno skladištenje na sobnoj temperaturi, preraċenih voćnih proizvoda, loše utiĉu na oĉuvanost antocijana. Aronija je jedna od biljaka koja je najbogatija polifenolima, pogotovu antocijanima. Crna aronija (Aronia melanocarpa) ima viši sadrţaj antocijana od ljubiĉaste (Aronia prunifolia) ili crvene aronije (Aronia arbutifolia), dok je sadrţaj ukupnih polifenola veći u ljubiĉastoj i crvenoj aroniji, nego u crnoj. Zbog visokog sadrţaja kondenzovanih tanina plodovi imaju opor ukus pa se aronija obiĉno konzumira kao preraċena u vidu kompota, dţemova, sokova ili sirupa. Tokom prerade voća gubi se odreċeni sadrţaj flavonoida. Cilj ovog rada je da se utvrdi na koji naĉin i u kojoj meri temperatura ĉuvanja soka i sirupa od aronije utiĉe na oĉuvanost flavonoida. Za praćenje uticaja temperature na stabilnost ukupnih flavonoida i antocijana korišćena je UV/Vis spektrofotometrija, a za identifikaciju i odreċivanje pojedinaĉnih polifenolnih jedinjenja korišćena je teĉna hromatografija visokih performansi (HPLC). Promena antioksidativne aktivnosti ispitivanih uzoraka tokom vremena ĉuvanja praćena je spektrofotometrijski DPPH metodom.

2 2. TEORIJSKI DEO

2.1. Polifenolna jedinjenja Polifenolna jedinjenja su supstance koje u strukturi imaju jedan ili više aromatiĉnih prstenova sa jednom ili više hidroksilnih grupa. Mogu se naći u slobodnom obliku ili ĉešće u obliku glikozida sa razliĉitim šećernim ostacima ili u obliku kompleksa sa organskim kiselinama, aminima, lipidima, ugljenim hidratima i drugim polifenolnim jedinjenjima. Prema osnovnoj hemijskoj strukturi dele se na: Flavonoide Neflavonoide- fenolne kiseline, fenole i ostala srodna jedinjenja. Najĉešća podela polifenola je prema sloţenosti molekula, tj. prema broju ugljenikovih atoma koji ĉine osnovni aromatiĉni skelet, kao što je prikazano u tabeli 2.1.1 (Robards i sar., 1999). Tabela 2.1.1. Klasifikacija polifenolnih jedinjenja Osnovni skelet C 6 Klasa Jednostavni fenoli Benzohinoni Primer Katehol, hidrohinon, rezorcinol C 6 -C 1 Fenolne kiseline p-hidroksibenzoeva kiselina, salicilna kiselina C 6 -C 2 Fenilsirćetne p-hidroksifenilsirćetna kiselina kiseline C 6 -C 3 Fenilpropeni Eugenol, mirsticin Kumarini Umbeliferon, eskuletin, skopolin Hromoni Eugenin C 6 -C 4 Naftohinoni Juglon C 6 -C 1 -C 6 Ksantoni Mangostin, mangiferin C 6 -C 2 -C 6 Stilbeni Razveratrol Antrahinoni Emodin, hrizofanol C 6 -C 3 -C 6 Flavonoidi Flavoni Sinensetin, nobiletin, izosinensitin Flavonoli Flavonol glikozidi Flavanoli Flavanoni Flavanon glikozidi Antocijanini Kvercetin, kempferol Rutin Dihidroksikvercetin i dihidroksikempferol glikoizdi Hesperidin, naringenin Neohesperidin, narirutin, naringin,eriocitrin Glikozidi pelargonidina, peonidina, 3

delifinidina, petunidina, cijanidina Flavanoli (katehini) (+)-Katehin, (-)-epikatehin, (+)- galokatehin, (-)-epigalokatehin Halkoni Floridţin, arbutin, halkonaringenin (C 6 -C 3 ) 2 Lignini Pinorezinol (C 6 -C 3 -C 6 ) 2 Biflavonoidi Agatisflavon 2.1.1. Flavonoidi Flavonoidi su grupa polifenolnih jedinjenja, razliĉite hemijske strukture i karakteristika, koji se nalaze u raznim vrstama biljaka. Osnovnu strukturu flavonoida ĉine tri prstena, dva aromatiĉna razdvojena heterocikliĉnim prstenom (slika 1). Slika 1. Osnovna struktura flavonoida Iz ove strukture se izvode ostale, koje se razlikuju po broju i poloţaju hidroksilnih grupa, njihovom oksidacionom nivou (slika 2). Slika 2. Podklase flavonoida Što se tiĉe zastupljenosti flavonoida u biljnom carstvu, moţe se reći da u svakoj biljci postoje flavonoli. Flavanoni i flavoni se ĉesto sreću zajedno, dok se npr. flavoni i flavonoli meċusobno iskljuĉuju. Najĉešći su flavoni i flavanoli sa hidroksilnim grupama u poloţaju 3 i 4. 4

Glikozidovanje se najĉešće vrši u poloţaju 3, nešto manje u poloţaju 7. Najzastupljeniji šećeri koji se javljaju u strukturama flavonoida su glukoza, galaktoza, ramnoza i ksiloza. 2.1.1.1. Struktura flavonoida i antioksidativna aktivnost Antioksidansi su supstance koje u niskim koncentracijama odlaţu, ili spreĉavaju nastanak slobodnih radikala i time štite ćelije od oksidacionog delovanja. Flavonoidi mogu na nekoliko naĉina da ispolje antioksidativnu aktivnost. Mogu da hvataju elektrone slobodnih radikala, vezuju jone prelaznih metala koji deluju kao promotori pri nastajanju aktivnih radikalnih vrsta, mogu da aktiviraju antioksidacione enzime i inhibiraju oksidaze (Kazazić, 2004). Najvaţniji naĉin je kada deluju kao hvataĉi slobodnih radikala, prekidajući lanĉanu reakciju. ROO + Flavonoid-OH ROOH + Flavonoid-O OH + Flavonoid-OH H 2 O + Flavonoid-O Flavonoid kao antioksidans treba da da stabilan radikal, da ne bi podsticao lanĉanu reakciju. Radikali se obiĉno stabilizuju delokalizacijom primljenog elektrona ili graċenjem intramolekulskih vodoniĉnih veza (slika 3). Slika 3. Stabilizacija fenoksil radikala rezonancijom Glavni strukturni delovi flavonoida, znaĉajni za antioksidativnu aktivnost su: 1. o-dihidroksilna (kateholna) struktura prstena B koja daje stabilnost radikalu i omogućuje delokalizaciju elektrona; 2. 2,3-dvostruka veza u konjugaciji s 4-keto grupom, što omogućuje delokalizaciju elektrona iz B-prstena; 3. hidroksilne grupe na poloţaju 3- i 5- koje osiguravaju vodonikovu vezu s keto-grupom (slika 4). 5

Slika 4. Strukturne grupe znaĉajne za hvatanje slobodnih radikala Za odreċivanje antioksidativne aktivnosti se koriste metode hvatanja veštaĉki stvorenih radikala. Antioksidativna aktivnost se najĉešće izraţava preko TEAC vrednosti u mmol/dm 3. TEAC (trolox equivalent antioxidant activity) vrednost se definiše kao sposobnost sparivanja slobodnog elektrona ABTS radikal-katjona, od strane antioksidansa, u odnosu na istu sposobnost troloksa (hidrosolubilan analog vitamina E). ABTS radikal-katjon je plavo-zelene boje i apsorbuje u bliskom IC podruĉju na 734 nm. Antioksidansi smanjuju apsorbancu na734 nm i procenat smanjenja se koristi za odreċivanje antioksidativne aktivnosti. Isti je princip odreċivanja antioksidativne aktivnosti i u reakciji sa DPPH radikalom (1,1-difenil-2-pikrilhidrazin), koji jako apsorbuje u vidljivom delu spektra na 517 nm (ljubiĉasta boja). 2.1.1.1.1. Uticaj hidroksilnih grupa na antioksidativnu aktivnost Antioksidativnu aktivnost uglavnom odreċuje raspored supstituenata. Najviše utiĉu hidroksilne grupe sa prstena B. Doniranjem vodonikovih atoma i elektrona aktivnim kiseoniĉnim vrstama, hidroksilne grupe stabilizuju iste. Oni flavonoidi koji imaju kateholnu strukturu prstena B su najjaĉi hvataĉi radikala i imaju najviše TEAC vrednosti (slika 5). Takav je kvercetin, dok je kempferol koji ima samo jednu hidroksilnu grupu na prstenu B, najslabiji hvataĉ i ima najniţu TEAC vrednost. Morin, koji kao i kvercetin ima dve hidroksilne grupe na prstenu B, ima znatno niţu TEAC vrednost, jer su te grupe u meta, a ne orto poloţaju. U prilog kateholnoj strukturi, u odnosu na ukupan broj hidroksilnih grupa, ide i ĉinjenica da miricetin, pored jedne hidroksilne grupe više, ima manju TEAC vrednost od kvercetina. Kada je u strukturi flavonoida prisutan katehol, tada se on oksiduje na prstenu B dajući delokalizacijom elektrona stabilizovani o- semihinonski radikal. Flavoni koji nemaju kateholnu ili vic-trihidroksilnu (pirogalolnu) strukturu stvaraju relativno nestabilne radikale i slabi su hvataĉi. 6

Slika 5. Uticaj broja i rasporeda hidroksilnih grupa na prstenu B, na antioksidativnu aktivnost Struktura prstena C takoċe doprinosi antioksidativnoj aktivnosti i to prisustvom slobodne hidroksilne grupe u poloţaju 3 i omogućavanjem konjugacije izmeċu prstenova A i B (slika 6). Flavonoidi sa hidroksilnom grupom u poloţaju 3, 2,3-dvostrukom vezom konjugovanom sa keto grupom i kateholnom strukturom su najjaĉi hvataĉi radikala (kvercetin). Hidroksilna grupa u poloţaju 3 omogućava planarnost ĉitavog sistema, a time i delokalizaciju elektrona i stabilnost radikala. Slika 6. Uticaj hidroksilne grupe u poloţaju 3 na antioksidativnu aktivnost 7

2.1.1.1.2. Uticaj 2,3-dvostruke veze i 4-keto grupe na antioksidativnu aktivnost Postojanje 2,3-dvostruke veze omogućava rezonanciju preko većeg broja aromatiĉnih jezgara i veću stabilnost (slika 7). Prikazani su flavonoidi sa istim brojem hidroksilnih grupa i njihovim rasporedom, ali sa razlikom u prstenu C. Kvercetin u prstenu C ima 2,3-dvostruku vezu i 4- keto grupu i pokazuje najvišu TEAC vrednost (4,7 mmol/dm 3 ), dok katehin sa zasićenim prstenom C ima upola niţu TEAC vrednost (2,4 mmol/dm 3 ). Cijanidin sa svojim antocijanidinskim prstenom C koji omogućava konjugaciju pokazuje gotovo jednaku TEAC vrednost kao i kvercetin. Ovo dokazuje da su postojanje nezasićenosti prstena C i mogućnost delokalizacije elektrona vaţni za stabilnost radikala. Slika 7. PoreĊenje strukture i antioksidativne aktivnosti 2.1.1.1.3. Uticaj O-metilovanja na antioksidativnu aktivnost Razlika u antioksidativnoj aktivnosti polihidroksilnih i polimetilovanih flavonoida, potiĉe od razlike u hidrofobnosti i planarnosti molekula, jer O-metilovanje narušava koplanarnost. Kvercetin, kao i u prethodnim sluĉajevima je najjaĉi antioksidans, a onda slede njegovi O- metilovani i O-glikozidovani derivati. 8

2.1.1.1.4. Uticaj graďenja glikozida Aglikoni su snaţniji antioksidansi od odgovarajućih glikozida. PoreĊenje TEAC vrednosti luteolina (2,1 mmol dm-3), luteolin-4 -glukozida (1,7 mmol/dm 3 ) i luteolin-3-7-diglukozida (0,8 mmol/dm 3 ) to pokazuje. Sa porastom broja glikozidnih grupa antioksidativna aktivnost opada. 2.1.1.1.5. Helatiranje metalnih jona Još jedan naĉin antioksidativnog delovanja flavonoida je graċenje helata sa jonima prelaznih metala. Vezivanje ovih jona, spreĉava njihovo ukljuĉivanje u reakcije koje stvaraju reaktivne kiseoniĉne vrste: H 2 O 2 + Cu + OH + OH + Cu 2+ Cu 2+ + O 2 Cu + + O 2 O 2 + Fe(III) O 2 + Fe(II) Fe(II) + H 2 O 2 Fe(III) + HO + HO Sposobnost polifenola da reaguju sa jonima ih ĉini prooksidansima. Takav efekat je vaţan in vivo, gde postoje slobodni joni, dok u zdravom organizmu joni metala nisu slobodni, pa ne mogu da katalizuju reakcije nastajanja radikala. Za vezivanje jona su bitne 4-keto grupa i hidroksilna grupa u poloţaju 3. 2.1.2. Antocijani Podklasa flavonoida su antocijanidini, koji strukturno predstavljaju aglikone, dakle neglikozidovane molekule. Sastoje se od aromatiĉnog prstena, kondenzovanog sa heterociklusom sa kiseonikom, koji je vezan za treći aromatiĉni prsten (slika 8). Slika 8. Struktura antocijanidina 9

U prirodi je poznato šest antocijanidina: pelargonidin, cijanidin, peonidin, delfinidin, petunidin i malvidin (slika 9). Razlikuju se po broju i poloţaju hidroksilnih grupa, kao i broju metilovanih hidroksilnih grupa. Varijacije u strukturi potiĉu i od glikozidnih delova, kao i zbog acilovanja šećernih grupa razliĉitim kiselinama. Najzastupljeniji u prirodi su glikozidni derivati cijanidina, delfinidina i pelargonidina. Smatra se da ĉine 80 % pigmenata u lišću, 50 % pigmenata u cveću. Slika 9. Strukture najzastupljenijih antocijanidina Antocijani su glikozidovani antocijanidini. Reĉ antocijani, potiĉe od grĉke reĉi antho, što znaĉi cvet i kyanos, što znaĉi plav. To su prirodni pigmenti koji daju jarke boje razliĉitim biljkama. Konjugovane veze u njihovoj strkturi uzrokuju apsorpciju svetlosti na oko 500 nm, što je osnova pojave boja kao što je plava, crvena ili ljubiĉasta. Glavni izvori antocijana u jestivim biljkama su porodice biljaka Vitaceae (groţċe), Rosaceae (višnja, šljiva, jagoda, malina, kupina), Saxifragaceae (crvena i crna ribizla) i Ericaceae (borovnica i brusnica). Antocijani su vaţni zbog svoje antioksidativne aktivnosti, ali se sve više koriste i kao prirodne boje u prehrambenoj industriji. Vrlo su nestabilni i brzo se razlaţu do bezbojnih derivata, a na kraju do nerastvornih braon pigmenata. Veliki je broj faktora koji utiĉu na stabilnost antocijana, ukljuĉujući ph, svetlost, kiseonik, enzime, askorbinsku kiselinu, šećere, metalne jone i kopigmente. Temperaturna obrada je najĉešći naĉin konzervisanja hrane. To je ujedno i najznaĉajniji faktor koji utiĉe na stabilnost antocijana, a time i na njihovu boju i nutritivne osobine. Što se tiĉe uticaja 10

ph, antocijani reverzibilno trpe strukturne promene sa promenom ph, što se najviše odraţava na boju (slika 10). Pojavu i promenu boja je prvi objasnio Poling, navodeći da je rezonantna struktura flavijum katjona odgovorna za boju. Flavijum katjon je stabilan jedino na niskoj ph vrednosti. Kako ph vrednost raste do ph=4-5 boja flavijum katjona (crvena) prelazi u bezbojnu (hromenol). Na ph=6-7 boja je ljubiĉasta zbog hinoidalne anhidrobaze, na ph=7-8 je tamnoplava zbog jonske anhidrobaze. Nakon ph=8, jonska anhidrobaza se otvara i dobija se halkon ţute boje. Na višim ph vrednostima, boja se moţe stabilizovati viševalentnim katjonima (Al 3+, Fe 3+ ). TakoĊe je utvrċeno da povećanje broja hidroksilnih grupa vodi ka plavoj boji, a graċenje glikozida i metilovanje ka crvenoj. Slika 10. Uticaj ph na stabilnost antocijana 2.1.2.1. Metode izolovanja, prečišćavanja i odreďivanja antocijana Antocijani su polarni molekuli, pa se efikasno ekstrahuju polarnim rastvaraĉima (etanol, metanol, aceton). Pored antocijana, ekstrahuju se i druga polarna jedinjenja iz materijala, pa je potrebo preĉistiti ih. Najefikasnije tehnike preĉišćavanja su ekstrakcija na ĉvrstoj fazi (SPE), kao i hromatografske tehnike tipa teĉne hromatografije visokih performansi (HPLC). Antocijani se najĉešće odreċuju hromatografskim tehnikama. Kao skrining tehnike se mogu koristiti tankoslojna i papirna hromatografija, kao i spektrofotometrijsko odreċivanje na 528 nm, na kontrolisanoj ph vrednosti. Same skrining tehnike su pogodne za procenu koliĉine antocijana, ne i za precizna odreċivanja. Taĉniji rezultati se dobijaju HPLC-PDA tehnikom. Antocijani se na koloni razdvajaju zbog razliĉite polarnosti, pa se javljaju na razliĉitim retencionim vremenima. Kvantitativno se odreċuju primenom standarda, to su antocijanidini (najĉešće cijanidin-3- glikozid) koji su komercijalno dostupni. Iz tog razloga priprema uzorka za HPLC analizu ukljuĉuje korak kisele hidrolize antocijana, pri ĉemu nastaju antocijanidini. 11

2.1.2.2. Metabolizam, bioraspoloživost i biološka aktivnost Digestivni trakt je region sa razliĉitom ph vrednošću i mikroflorom, što znaĉajno moţe da izmeni antocijane. ph vrednost u ţelucu je niska i tu se antocijani nalaze u vidu stabilnog flavijum katjona. U drugim delovima digestivnom sistema, gde je ph vrednost viša, antocijani su manje stabilni, pogotovu aglikonski deo koji se pri neutralnoj ph vrednosti razlaţe na fenolne kiseline i aldehide. Antocijani se, u suštini, slabo resorbuju i slabo metabolišu, tako da im je bioraspoloţivost mala (Ćujić i sar., 2013). Ispitivanja bioraspoloţivosti su vršena na ţivotinjama. Ispitivanje na pacovima je pokazalo da su antocijani naċeni u plazmi nakon 15 minuta, a dostigli su maksimum koncentracije nakon 1,5 h od unošenja. Izluĉuju se putem urina u vidu glikozida. Širok je dijapazon biološke aktivnosti antocijana. Mogu delovati antiinflamatorno, antikancerogeno, antidijabetozno itd. Deluju pozitivno kod hroniĉnih bolesti, pogotovu kod bolesti srca. Jedno od najznaĉajnijih dejstava je antioksidativno, pri ĉemu antocijani i antocijanidini imaju višu antioksidativnost nego npr. vitamini C i E. 2.2. Faktori koji utiču na smanjenje ukupnih antocijana u voću i voćnim proizvodima Kao što je poznato, antocijani imaju širok opseg pozitivnih delovanja na zdravlje ljudi, ali su vrlo nestabilni. Zbog toga se velika paţnja posvećuje ispitivanju faktora koji utiĉu na njihovo smanjenje i optimizaciji naĉina preraċivanja bobiĉastog voća, ne bi li se oni u što većoj meri oĉuvali. Razgradnja antocijana je primarno uzrokovana oksidacijom ili kidanjem kovalentnih veza usled termalne obrade. Relativno malo se zna o mehanizmu razgradnje, ali svakako da veliki uticaj ima njihova struktura (neki su više odrţivi od drugih) i prisustvo organskih kiselina. Ispitivan je uticaj povišene temperature, skladištenja, sušenja i zamrzavanja na oĉuvanost antocijana. 2.2.1. Uticaj povišene temperature Termalna razgradnja antocijana prati kinetiku reakcije prvog reda, koja se moţe izraziti preko jednaĉina: c1 c0 exp( k t) t ln(0.5) / k 0,693/ k 1/ 2 12

Razgradnja antocijana je praćena u soku od borovnice i utvrċeno je da raste sa porastom temperature (Patras i sar., 2010). 2.2.2. Uticaj skladištenja Ispitivan je uticaj skladištenja na oĉuvanost antocijana u razliĉitim proizvodima od borovnice (slatko, kompot, sok, pire). Dobijeni rezultati su pokazali da se sadrţaj ukupnih antocijana tokom vremena ĉuvanja smanjuje. Najveći gubitak antocijana u svim voćnim proizvodima je nakon šest meseci skladištenja. Procenat polimerne boje je vrlo nizak u sveţem voću, dok sa stajanjem znaĉajno raste i to proporcionalno duţini stajanja (Brownmiller i sar., 2008). Gubitak ukupnih antocijana je praćen porastom polimerne boje, što ukazuje da se antocijani polimerizuju tokom ĉuvanja. Gubitak antocijana i porast polimerne boje mogu biti uzrokovani faktorima kao što su rezidualna enzimska aktivnost i reakcije kondenzacije sa drugim polifenolnim jedinjenjima. 2.2.3. Uticaj sušenja i zamrzavanja Ispitivan je uticaj sušenja i zamrzavanja na oĉuvanost antocijana i njihovu antioksidativnu aktivnost kod sveţih borovnica, sveţih borovnica koje su ĉuvane dve nedelje na 5 C, netretiranih sušenih borovnica, sušenih borovnica tretiranih rastvorom šećera i natrijum hlorida i smrznutih borovnica nakon jednog i tri meseca ĉuvanja na -20 C. Sušenje dovodi do smanjenja koliĉine antocijana, pri ĉemu tretirani uzorci pokazuju veće smanjenje, verovatno zbog toga što tokom tretiranja voća iz njega iscuri odreċena koliĉina antocijana. Zamrzavanje nema negativnih uticaja na sadrţaj antocijana (Lohachoompol i sar., 2004). Na osnovu rezultata ovih istraţivanja, pretpostavljeno je da bi dugotrajno ĉuvanje i povišena temperatura negativno uticatali na oĉuvanje flavonoida u proizvodima od aronije. 2.3. Aronija Aronija je vrsta listopadnog ţbunja iz porodice Rosaceae, poreklom iz Severne Amerike i najĉešće raste u vlaţnim šumskim i moĉvarnim predelima. Postoje dve vrste aronije i to crvena aronija (A. arbutifolia) (slika 10) i crna aronija (A. melanocarpa) (slika 11). Vrste se pored boje i veliĉine bobica razlikuju i po listovima i visini stabljika. Plodovi crvene aronije sazrevaju u septembru ili oktobru i opstaju tokom zime, a crne u julu ili avgustu i ne opstaju tokom zime (Bran, 2010). 13

Slika 10. Crvena aronija (A. arbutifolia) Slika 11. Crna aronija (A.melanocarpa) Bobice imaju opor ukus zbog visokog sadrţaja kondenzovanih tanina. Pored tanina postoji i visok sadrţaj drugih polifenolnih jedinjenja. Biljka proizvodi ove pigmente uglavnom u listovima i kori bobica, da bi se zaštitila pulpa i seme od UV zraĉenja. TakoĊe jarka pigmentacija privlaĉi ptice i druge ţivotinje da jedu bobice i raznose seme. 2.3.1. Fenolna jedinjenja u crnoj aroniji Aronija poseduje znatno viši nivo antocijana i drugih fenolnih jedinjenja nego borovnica, brusnica i drugo voće. U crnoj aroniji je odreċeno ĉetiri antocijana (3-O-galaktozid, 3-Oglukozid, 3-O-arabinozid, 3-O-ksilozid-cijanidin), dve fenolne kiseline (hlorogenska i neohlorogenska) i pet derivata kvercetina. TakoĊe, ima više kondenzovanih tanina nego u drugim bobicama. Uglavnom su to procijanidini sa (-)-epikatehinom kao subjedinicom. U aroniji ima najviše proantocijanidina sa udelom od 66 %. Sledeći su antocijani sa udelom od 25 %, gde najviše ima cijanidin-3-galaktozida. Hlorogenske i neohlorogenske kiseline ima 7,5 % i to nešto više hlorogenske kiseline (Oszmianski i Wojdylo, 2005). Što se tiĉe raspodele fenolnih jedinjenja u voću, najviše ih ima u mesnatom delu, a znatno manje u soku. Antioksidativna aktivnost je u skladu sa sadrţajem ukupnih polifenola i najveća je za pulpu. Aronija je bogata o-difenolima, kao što su (-)-epikatehin, cijanidin i derivati kvercetina koji su najznaĉajniji kao antioksidansi zbog kateholne strukture prstena B. TakoĊe su i visoko molekularni procijanidini, koji imaju veliki broj aromatiĉnih jezgara i hidroksilnih grupa, bitni za antioksidativnu aktivnost, što ukazuje da tanini mogu biti mnogo moćniji antioksidansi od prostih monomernih polifenola. 2.4. Instrumentalne tehnike Kvalitativno i kvantitativno odreċivanje pojedinaĉnih polifenolnih jedinjenja i praćenje uticaja temperature ĉuvanja soka i sirupa od aronije na sadrţaj ukupnih flavonoida i monomernih antocijana je vršeno pomoću teĉne hromatografije visokih performansi (HPLC) i UV/VIS spektrofotometrije. 14

2.4.1. UV/VIS spektrofotometrija Spektrofotometrija je metoda koja izuĉava apsorpciju taĉno definisanog monohromatskog zraĉenja dobijenog specijalnim prizmama ili rešetkama. Slika 12. Spektar elektromagnetnog zraĉenja i vidljiva oblast spektra Apsorbovano zraĉenje prouzrokuje energetske promene u molekulu. Od ukupne koliĉne zraĉenja supstancija apsorbuje samo one frekvencije, odnosno onu energiju zraĉenja koja moţe izazvati energetske promene stanja u atomu ili molekulu date supstancije. UV oblast elektromagnetnog spektra obuhvata opseg talasnih duţina od 200 do 400 nm, a VIS oblast od 400 do 800 nm (slika 12). Apsorpcija zraĉenja u ultraljubiĉastoj (UV) i vidljivoj (VIS) oblasti izaziva pobuċivanje elektrona, pa se UV/VIS apsorpciona spektroskopija naziva još i elektronska spektroskopija. Ovom metodom prouĉavaju se spektri supstancija u molekulskom stanju, pa se na osnovu analize spektra mogu protumaĉiti i strukture molekula. Nosioci apsorpcije u molekulu su male atomske grupe, tzv.hromofore. Apsorpcija hromofora potiĉe od elektronskih prelaza sa osnovnog na viši nivo (n σ*,n π*,π π*), koji se dešavaju zbog apsorpcije odreċenih frekvencija zraĉenja. Ukoliko molekul sadrţi više hromofora, tada se i spektar sastoji iz više traka i naziva se apsorpcioni spektar ili kriva spektralne raspodele. Kvantitativna analiza UV/VIS spektrofotometrijom se zasniva na Lamber-Berovom zakonu. Za izraĉunavanje koncentracije analiziranog rastvora najĉešće se koristi metoda kalibracione krive. Merenje apsorbancije vrši se na talasnoj duţini na kojoj analizirani rastvor najviše apsorbuje (ili nekoj drugoj optimalnoj talasnoj duţini), ĉime se postiţe najveća osetljivost metode, koja je data koeficijentom A/ c.za niz rastvora poznatih koncentracija izmere se apsorbancije na talasnoj duţini λ max i konstruiše dijagram A = f(c) (slika 13). Iz izmerene apsorbancije A x za rastvor nepoznate koncentracije, sa kalibracione krive se grafiĉkim putem odredi c x, kako je oznaĉeno na slici 13. 15

Slika 13. Primer kalibracione krive Za snimanje spektara se koriste optiĉki ureċaji spektrofotometri (slika 14). Spektrofotometri mogu biti jednokanalni i dvokanalni. Prednost dvokanalnih je u istovremenom merenju slepe probe i analiziranog rastvora, ĉime se izbegava promena intenziteta upadnog zraĉenja, koja moţe nastati izmeċu pojedinaĉnog merenja slepe probe i uzorka. Osnovni delovi spektrofotometra su: izvor svetlosti, monohromator i fotodetektor (slika 15). Kod apsorpcione spektrofotometrije koriste se izvori sa kontinualnim zraĉenjem termiĉki (volframovo vlakno) i izvori sa elektriĉnim praţnjenjem (vodoniĉna i deuterijumova lampa). Kao monohromatori najĉešće se koriste optiĉke prizme i difrakcione rešetke. U vidljivoj oblasti mogu se koristiti prizme od optiĉkog stakla, jer ne apsorbuju vidljivu oblast spektra. U UV oblasti se koriste samo prizme od kvarca. Od fotodetektora se najĉešće koristi fotomultiplikator - ureċaj za merenje malih intenziteta svetlosti. Koristi se da bi se pojaĉao signal, odnosno intenzitet primarne fotostruje (Medenica i Malešev, 2002). Slika 14. UV/VIS spektrofotometar 16

Slika 15. Šema dvokanalnog spektrofotometra 2.4.2. Tečna hromatografija visokih performansi (HPLC) Hromatografija je postupak koji omogućava razdvajanje, izolovanje, identifikaciju i odreċivanje sastojaka smeše na osnovu procesa koji se dešavaju na granici dve faze koje se ne mešaju. Jedna faza je stacionarna i moţe biti porozno ili granulisano ĉvrsto telo, teĉnost, tanak sloj teĉnosti adsorbovan na ĉvrstom telu i jonoizmenjivaĉ. Druga faza je mobilna i moţe biti gas ili teĉnost. Hromatografski proces sastoji se u tome što se rastvor smeše u mobilnoj fazi propušta kroz stacionarnu fazu, pri ĉemu dolazi do raspodele komponenata smeše izmeċu mobilne i stacionarne faze. Razdvajanje supstancija uzrokovano je fiziĉkohemijskim procesima kao što su adsorpcija, razliĉita raspodela (rastvorljivost) sastojaka smeše izmeċu dve teĉne faze i jonska izmena (Medenica i Malešev, 2002). Prema ovim procesima hromatografija se deli na: adsorpcionu, podeonu (particionu) i jonoizmenjivaĉku. HPLC se moţe svrstati u podeonu hromatografiju na koloni. Mobilna faza je izloţena dejstvu visokog pritiska. Visok pritisak omogućava kontinuirani protok mobilne faze i uspostavljanje dinamiĉke ravnoteţe sa stacionarnom fazom, koja je uslov dobre selektivne raspodele komponenti u ispitivanom uzorku. Dejstvo visokog pritiska dovodi i do efikasnog i brzog eluiranja komponenti smeše sa kolone. Osnovni delovi HPLC sistema (slika 16) su: Rezervoar mobilne faze Pumpa Injektor Kolona Detektor 17

Slika 16. HPLC apparat Kao rastvaraĉi se koriste, voda, metanol, organski rastvaraĉi. Voda moţe sadrţati i neki pufer kako bi se poboljšalo razdvajanje. Moguće je koristiti i gradijentno eluiranje, što podrazumeva promenu sastava mobilne faze u toku eluiranja. Prema tipu kolone koji se koristi HPLC tehnika se moţe podeliti na hromatografiju na normalnoj fazi (polarna stacionarna faza i nepolarna mobilna faza; koristi se kada je supstanca koja se analizira polarna) i hromatografiju na reverznoj fazi (nepolarna stacionarna faza i polarna mobilna faza). Komponente se na koloni razdvajaju prema polarnosti, tj. jaĉini interakcija sa nosećom fazom i javljaju na razliĉitim retencionim vremenima, na osnovu kojih se i identifikuju (poreċenjem sa retencionim vremenima standarda). Kvantitativno se mogu odrediti na razliĉite naĉine, što zavisi od primenjenog detektora. Detektor ima vaţnu ulogu da odreċivanja komponenti koje izlaze iz kolone nakon eluiranja. Detektor generiše elektriĉni signal koji je proporcionalan intenzitetu neke osobine mobilne faze ili supstance koja se eluira. Tipovi detektora u HPLC-u su: UV-VIS detektor Fluorescentni detektor Elektrohemijski detektor 18

3. EKSPERIMENTALNI DEO 19

3.1. Reagensi DPPH: 2,2-difenil-1-pikrihidrazil, C 18 H 12 N 5 O 6 (Sigma-Aldrich, CHEMIE, GmbH, Steinheim, Germany) heksan, sirćetna kiselina, mravlja kiselina, acetonitril i aceton (Merck, Darmstadt, Germany) 5% NaNO 2 (Merck, KGaA, Darmstadt, Germany) 1% AlCl 3 (Merck, KGaA, Darmstadt, Germany) 1 M NaOH (Merck, KGaA, Darmstadt, Germany) dejonizovana voda (λ = 0,05 µs/cm) KCl CH 3 COONa 3.2. Aparatura i pribor UV/Vis spektrofotometar (Agilant 8453, Agilant Technologies, Santa Clara, California, USA) kiveta (1 cm) HPLC (model 1200, Agilant Technologies, Santa Clara, California, USA) analitiĉka kolona (5μm, 4,6 x 150mm, C 18 Zorbax Eclipse XDB-C18, Agilant Technologies, Santa Clara, California, USA) aparat za dejonizovanu vodu (MicroMed, TKA Wasseraufbereitungs systeme GmbH, Niederelbert, Germany) analitiĉka vaga Mettler Toledo AB-204-S varijabilne automatske pipete 3.3. Uzorci Kao uzorci korišćeni su kupovni sok i sirup sa bobicama aronije. Uzorci su ĉuvani na tri razliĉite temperature (4 C, 22 C i 30 C). Praćen je sadrţaj ukupnih flavonoida, monomernih antocijana i antioksidativna aktivnost uzoraka tokom 45 dana od otvaranja, vršenjem merenja 7, 14, 21, 30 i 45 dana. 3.4. Priprema uzoraka Odmereno je 1 ml soka/sirupa u normalnom sudu od 10 ml i razblaţeno do crte dejonizovanom vodom. 20

3.5. OdreĎivanje sadržaja monomernih antocijana Sa vremenom, kao i pod uticajem razliĉitih faktora, dolazi do degradacije monomernih antocijana, ili do njihove meċusobne kondenzacije ili sa drugim prisutnim jedinjenjima. Kvantitativno odreċivanje ukupnih antocijana (nedegradiranih monomera i proizvoda njihove degradacije) zasniva se na osobini antocijana, da pri promeni ph sredine, reverzibilno menjaju svoju strukturu, pri ĉemu dolazi do promena apsorpcionog spektra. Sadrţaj ukupnih antocijana odreċuje se singl metodom, po kojoj je izmerena apsorbancija rastvora antocijana pri ph 1,0, proporcionalna sadrţaju ukupnih antocijana. OdreĊivanje sadrţaja monomernih antocijana izvodi se ph diferencijalnom metodom, koja se zasniva na osobini monomernih antocijana da su pri ph 1,0 u obliku oksonijum jona (crveno obojeni), dok su pri ph 4,5 u poluketalnom obliku (bezbojni) (Guisti i Wrolstad, 2001) (slika 17). Slika 17. Apsorpcioni spektar antocijana Reagensi: 0,025 M KCl pufer; 0,4 M CH 3 COONa pufer KCI pufer (ph=1): 1,86 g KCl se rastvori u 980 ml vode. Izmeri se ph i podesi na ph=1 koncentrovanom HCI. Prebaci u normalni sud od 1l i dopuni vodom do crte. CH 3 COONa pufer (ph=4.5): 54,43 g CH 3 COONa H 2 O se rastvori u 960 ml vode. Izmeri se ph i podesi na ph=4,5 koncentrovanom HCI. Prebaci se u normalni sud od 1l i dopuni vodom do crte. 21

Postupak: Odmereno je po 0,5 ml uzorka u dva normalna suda od 10 ml i dodato je po 5 ml pufera ph=1,0, odnosno ph=4,5. Nakon 15 min stajanja na sobnoj temperaturi, izmerena je apsorbanca oba rastvora na dve talasne duţine: λ=520 nm i λ=700 nm (zbog korekcije zamućenja). Koncentracija nedegradiranih, monomernih antocijana izraĉunava se kao ekvivalent cijanidin-3- O-glukozida prema formuli: gde je: A Amon Mr D f mg( cy 3 gly) / l 10 l A520 A700 A520 A700 ph 1,0 ph 4, 5 mon. Mr(cy-3-gly) = 449,2 g/mol ε = 26900 dm 3 /mol cm l = 1 cm, debljina kivete D f faktor razblaţenja 3 Koncentracija ukupnih antocijana u uzorku izraĉunava se kao ekvivalent cijanidin-3-glukozida (mgcge/l) prema formuli: Auk Mr D f mg( cy 3 gly) / l 10 l gde je: 3 A uk A520 A700 ph 1, 0 3.6. OdreĎivanje sadržaja ukupnih flavonoida Flavonoidi i flavonglikozidi imaju osobinu da sa metalima grade odgovarajuće metalne komplekse. Naroĉito je vaţan kompleks sa Al 3+. Koncentracija flavonoida odreċena je primenom AlCl 3 kao reagensa, spektrofotometrijskom metodom (Yang i sar., 2004). 22

Rastvori i reagensi: 5% NaNO 2 2% AlCl 3 1M NaOH Standardni rastvor katehina Standardni rastvor katehina pripremljen je na sledeći naĉin: 5 mg katehina rastvoreno je u u 5 ml etanola i dopunjeno dejonizovanom vodom do crte u normalnom sudu od 10 ml. Koncentracija tako dobijenog rastvora bila je 0,5 mg/ml. Od ovog rastvora je pripremljena serija standardnih rastvora pomoću kojih je konstruisana kalibraciona kriva. Postupak: Reakciona smeša je pripremljena mešanjem 0,25 ml uzorka, 3 ml dejonizovane vode i 0,3 ml 5% NaNO 2. Nakon 5 min dodato je 1,5 ml AlCl 3, nakon 5 min još 2 ml NaOH i dejonizovana voda do 10 ml. Apsorbanca je merena na = 510 nm. Kalibraciona prava za odreċivanje sadrţaja ukupnih flavonoida data je na slici 18 (katehin, λ = 510 nm). 0.30 A 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 0 2 4 6 8 10 c katehin, mg/l Slika 18. Kalibraciona prava za odreċivanje sadrţaja ukupnih flavonoida u soku i sirupu od aronije Primenom kompjuterskog programa ORIGIN 7.0 dobijena je jednaĉina prave: A = 0,02486c x - 0,00507 R = 0,99941 23

gde je c x nepoznata koncentracija u mg/l, a R koeficijent korelacije. Sadrţaj ukupnih flavonoida u ispitivanim uzorcima izraĉunat je na osnovu jednaĉine prave i sadţaj je izraţen kao miligram ekvivalenta katehina po litru uzorka (mg CE/l). 3.7. OdreĎivanje antioksidativne aktivnosti Antioksidativna/antiradikalska aktivnost ispitivanih uzoraka je odreċivana DPPH metodom (Brand-Williams i sar., 1995; Karori i sar., 2007). Slika 19. Strukturna formula DPPH (di(fenil)-(2,4,6-trinitrofenil)iminoazanijum radikala Metanolni rastvor DPPH je intenzivne ljubiĉaste boje. Po dodatku uzorka koji sadrţi hvataĉe slobodnih radikala smanjuje se koncentracija slobodnog DPPH, a raste koncentracija uhvaćenog DPPH tj. reakcija je praćena porastom apsorbance rastvora na 520 nm (slika 20). Slika 20. Princip odreċivanja antioksidativne aktivnosti DPPH metodom 24

Napravljen je osnovni rastvor DPPH-a koncentracije 1 10-3 mol/dm 3 tako što je 0,0039 g DPPH rastvoreno u 25 ml metanola. Radni rastvor koncentracije 1 10-4 mol/dm 3 je dobijen razblaţivanjem 10 ml osnovnog rastvora DPPH do 100 ml. Osnovni rastvor Trolox-a koncentracije 4 10-3 mol/dm 3 dobijen je rastvaranjem 0,0515 g 97 % Trolox-a u 50 ml metanola. Radni rastvor koncentracije 1 10-4 mol/dm 3 je dobijen razblaţivanjem 1,25 ml osnovnog rastvora Trolox-a do 50 ml. Radna kriva je dobijena merenjem apsorbancije na 515 nm, serije standardnih rastvora u kojima je varirana zapremina Trolox-a od 0,2 do 1 ml (koncentracija 2-10 10-6 mol/dm 3 ). OdreĊenoj zapremini Trolox-a je dodato je 5 ml DPPH i dopunjeno metanolom do 10 ml. Aspsorbancija je merena nakon 30 min i data kao srednja vrednost tri merenja. Slepu probu, od ĉije apsorbancije su oduzimane apsorbancije serije standarda, ĉini 5 ml DPPH dopunjeno metanolom do 10 ml. Kalibraciona prava je data kao: A f ( c Trolox ), pri ĉemu je A A0 Ast Priprema slepe probe 5 ml DPPH rastvora koncentracije 1 10-4 mol/dm 3 preneto je u normalni sud od 10 ml i dopunjeno metanolom do crte. Aprorbancija rastvora je merena nakon 30 min na 520 nm. Priprema uzorka 0,1 ml uzorka preneto je u normalni sud od 10 ml, dodato je 5 ml rastvora DPPH koncentracije 1 10-4 mol/dm 3 i dopunjeno metanolom do crte. Aprorbancija rastvora je merena nakon 30 min na 520 nm. Kalibraciona prava za odreċivanje antioksidativne, radikalske (DPPH), aktivnosti data je na slici 21 (Trolox, 515 nm): 0.35 0.30 0.25 0.20 A 0.15 0.10 0.05 0.00 2 4 6 8 10 c Trolox M Slika 21. Kalibraciona prava za odreċivanje antioksidativne (DPPH) aktivnosti soka i sirupa od aronije 25

Primenom kompjuterskog programa ORIGIN 7.0 dobijena je jednaĉina prave: ΔA = 0,0313c x - 0,01 R = 0,99986 gde je c x nepoznata koncentracija u µmol/l, a R koeficijenat korelacije. Nivo antioksidativne aktivnosti u ispitivanim uzorcima izraĉunat je na osnovu jednaĉine prave i sadrţaj je izraţen kao milimolovi Trolox ekvivalenta po litru uzorka (mmol TE/l). 3.8. OdreĎivanje pojedinačnih polifenolnih jedinjenja korišćenjem HPLC metode Teĉna hromatografija sa UV/VIS i fluorescentnim detektorom visoke rezolucije primenjena je za razdvajanje i kvantifikaciju polifenolnih jedinjenja u pripremljenim uzorcima. Hromatografsko razdvajanje izvršeno je na koloni Zorbax Eclipse C18 (XDB-C18, 5μm, 4,6 150 mm) koja je termostatirana na 25 o C. Protok mobilne faze iznosio je 0,8 ml/min, a pomoću autosemplera injektovano je 20 μl uzorka. Od fenolnih kiselina detektovana je kafena kiselina na 320 nm i protokatehinska na 260 nm, flavonoli (rutin i morin) su detektovani na 360 nm, flavanoli ((+)- katehin i (-)-epikatehin) i procijanidin B1 na fluorescentnom detektoru i antocijani na 520 nm. Binarna mobilna faza se sastojala od rastvaraĉa A (5% mravlja kiselina u vodi) i rastvaraĉa B (80% acetonitril i 5% mravlja kiselina u vodi). Razdvajanje komponenti je izvedeno primenom 45-o minutnog linearnog gradijenta: 0-10 min, 0% B; 10-28 min, 0-25% B; 28-30 min, 25% B; 30-35 min, 25-50% B; 35-40 min, 50-80% B; 40-45 min, 80-0% B. Pojedinaĉna polifenolna jedinjenja su analizirana u toku 50 minuta. Identifikacija je izvršena poreċenjem njihovih retencionih vremena i spektara sa retencionim vremenom i spektrom standarda za svaku komponentu. Kvantitativno odreċivanje pojedinaĉnih polifenola izvršeno je korišćenjem kalibracione prave za svaki standard. Rezultati kvalitativne HPLC analize soka i sirupa su dati u tabeli 3.8.1. Tabela 3.8.1. Retenciona vremena polifenolna jedinjenja koja su identifikovana u soku i sirupu od aronije Klasa polifenolnih jedinjenja Retenciono vreme (min) 18,937 27,601 18,548 fenolne kiseline kafena kiselina a,b protokatehinska kiselina а 9,545 flavonoli rutin a,b morin b 33,633 flavanoli (+)-katehin a,b (-)-epikatehin a,b 22,228 oligomeri flavanola procijanidin B1 a 20,249 antocijani cijanidin-3-o-galaktozid a,b cijanidin-3-o-glukozid a,b cijanidin-3-o-arabinozid a,b cijanidin-3-o-ksilozid a,b 22,86 23,336 24,103 25,835 a Sok; b Sirup 26

3.9. Statistička obrada rezultata Sva merenja su izvršena u najmanje dva ponavljanja, a rezultati predstavljeni kao srednja vrednost dva ponavljanja (c sr ± SD). Interval poverenja iznosio je 95% (Miller i Miller, 2005). 27

4. REZULTATI I DISKUSIJA 28

4.1. HPLC analiza soka i sirupa Rezultati sadrţaja ĉetiri antocijana, derivata cijanidina, u ispitivanim uzorcima dati su u tabeli 4.1.2. Na osnovu dobijenih rezultata moţe se videti da sadrţaj antocijana opada sa vremenom ĉuvanja na razliĉitim temperaturama. Tabela 4.1.2. Uticaj temperature ĉuvanja na sadrţaj* antocijana (mg/l) u soku i sirupu od aronije Temperatura čuvanja soka/sirupa Dan Cijanidin-3-Ogalaktozid Cijanidin-3-Oglukozid Cijanidin-3-Oarabinozid Cijanidin-3-Oksilozid 4 C sok sirup sok sirup sok sirup sok sirup 7 10440±283 941±18 624±16 69±12 4325±76 282±6 565±10 53±10 15 9242±217 854±17 581±13 68±12 4216±71 259±5 488±8 39±7 21 8307±184 843±15 435±11 65±11 3587±62 255±5 394±9 33±6 30 8127±196 824±15 406±10 58±10 3532±65 240±4 385±8 32±6 45 6989±174 544±13 348±7 32±6 2976±54 156±3 328±6 21±4 22 C 7 15 21 30 45 9646±178 8250±163 7417±156 7274±149 4298±87 831±15 681±13 655±13 600±12 310±6 545±11 485±9 409±8 348±6 249±5 60±10 55±9 44±8 37±7 18±4 4152±79 3531±58 3097±44 3241±51 1740±35 232±5 199±4 197±4 168±3 87±2 529±11 413±7 364±7 330±6 198±4 39±7 27±6 26±6 20±4 11±3 30 C 7 15 21 30 8689±179 7457±168 6431±165 5898±114 4241±79 774±14 636±13 510±10 440±8 308 ±6 511±10 435±9 376±8 266±6 227±4 45 *c sr ±SD, n = 2 56±11 46±10 39±9 22±5 18±4 3979±69 3224±55 2691±43 2270±41 1662±29 220±5 162±4 151±4 122±3 86±2 469±9 327±8 341±8 291±6 167±4 32±6 23±5 19±4 17±4 11±2 Hromatogram uzorka soka za derivate cijanidina dat je na slici 22. Kao što se moţe uoĉiti sa hromatograma (slika 22) i iz tabele 4.1.2., od ĉetiri derivata cijanidina, najzastupljeniji je cijanidin-3-o-galaktozid. Identifikovani derivati cijanidina i njihov sadrţaj je u skladu sa literaturnim podacima koji se odnose na sveţe bobice aronije (Oszmlanski i Sapis, 1988; Oszmianski i Wojdylo, 2005; Bräunlich i sar., 2013). Tokom ĉuvanja sirupa i soka smanjuje se sadrţaj antocijana i to više što je temperatura ĉuvanja veća (slika 23 i 24). Isti, trend promene pojedinaĉnih i ukupnih antocijana je uoĉen i u dţemovima od jagoda (García-Viguera i sar., 1999). 29

mau 1 2000 1500 3 1000 500 2 4 0 5 10 15 20 25 30 35 t (min) Slika 22. Hromatogram uzorka soka snimljen na Vis detektoru (520 nm): 1- cijanidin-3-ogalaktozid, 2- cijanidin-3-o-glukozid, 3- cijanidin-3-o-arabinozid, 4- cijanidin-3-o-ksilozid Slika 23. Uticaj temperature i vremena ĉuvanja na sadrţaj antocijana u soku od aronije 30

Slika 24. Uticaj temperature i vremena ĉuvanja na sadrţaj antocijana u sirupu od aronije Hromatogram uzorka soka za (+)-katehin, procijanidin B1, i (-)-epikatehin dat je na slici 25. mau 7 12 10 5 8 6 4 6 2 0 5 10 15 20 25 30 35 40 t (min) Slika 25. Hromatogram uzorka soka snimljen na fluorescentnom detektoru: 5- (+)-katehin, 6- procijanidin B1, 7- (-)-epikatehin 31

Što se tiĉe zastupljenosti flavonola, sok je bogatiji i (+)-katehinom i (-)-epikatehinom u odnosu na sirup (tabela 4.1.3). Negativan uticaj ĉuvanja i temperature se odraţava i na njihov sadrţaj, pri ĉemu postoje nešto znaĉajniji gubici (-)-epikatehina (slike 26 i 27). Tako, ako se uporede uzorci soka drţani na istoj temperaturi (4 C), uoĉava se da dvonedeljno ĉuvanje (od 7. do 21. dana) vodi gubitku (+)-katehina od 10 %, a (-)-epikatehina od 32,6 %. Degradacija (+)-katehina i (-)- epikatehina uoĉene su i tokom ĉuvanja i obrade razliĉitog voća (jabuke, višnje, jagode, groţċa) i voćnih sokova (Armarowicz, 2009). Tabela 4.1.3. Uticaj temperature ĉuvanja na sadrţaj* (µg/ml) (+)-katehina i (-)-epikatehina u soku i sirupu od aronije Temperatura čuvanja soka/sirupa 4 C 22 C 30 C *c sr ±SD, n = 2 Dan (+)-katehin (+)-epikatehin sok sirup sok sirup 7 18,1 ± 0,3 10,1 ± 0,2 32 ± 3 9,9 ± 0,9 15 16,7 ± 0,2 9,0 ± 0,1 23 ± 2 8,2 ± 0,8 21 16,3 ± 0,2 8, 8± 0,1 22 ± 2 7,4 ± 0,7 30 15,6 ± 0,2 7,2 ± 0,1 20 ± 2 7,2 ± 0,7 45 14,3 ± 0,2 5,7 ± 0,1 / 5,7 ± 0,6 7 17,2 ± 0,2 9,2 ± 0,1 23±2 9,5 ± 0,9 15 15,9 ± 0,2 8,7 ± 0,1 21±2 8,1 ± 0,8 21 15,3 ± 0,2 8,5 ± 0,1 19±2 7,2 ± 0,7 30 15,3 ± 0,2 6,8 ± 0,1 17±2 7,2 ± 0,7 45 13,4 ± 0,2 5,6 ± 0,1 / 5,6 ± 0,5 7 15,9 ± 0,2 9,0 ± 0,1 21 ± 2 8,5 ± 0,8 15 15,7 ± 0,2 8,2 ± 0,1 20 ± 2 7,8 ± 0,7 21 14,2 ± 0,2 8,0 ± 0,1 18 ± 1 6,7 ± 0,7 30 14,3 ± 0,2 6,5 ± 0,1 16 ± 1 6,6 ± 0,6 45 12,9 ± 0,2 5,1 ± 0,1 / 5,2 ± 0,5 32

Slika 26. Uticaj temperature i vremena ĉuvanja na sadrţaj (+)-katehina i (-)-epikatehina u soku od aronije Slika 27. Uticaj temperature i vremena ĉuvanja na sadrţaj (+)-katehina i (-)-epikatehina u sirupu od aronije 33

4.2Uticaj temperature čuvanja na sadržaj ukupnih flavonoida u soku i sirupu od aronije Sadrţaj ukupnih flavonoida je veći u soku nego u sirupu od aronije. Sa porastom temperature i vremena ĉuvanja sadrţaj flavonoida se smanjuje i u soku i u sirupu (tabela 4.2.1). Isti trend u promeni ukupnih polifenolnih jedinjenja je uoĉen u sokovima od crne ribizle i mešavine crne ribizle i aronije (Piljac-Žegarac i sar., 2012). Tabela 4.2.1. Uticaj temperature ĉuvanja na stabilnost ukupnih flavonoida u soku i sirupu od aronije Temperatura čuvanja soka Vreme (dan) c sr ±SD mgce/l RSD (%) Temperatura čuvanja sirupa Vreme (dan) c sr ±SD mgce/l RSD (%) 7 6190 ± 33 0,53 7 2640 ± 45 1,70 14 6075 ± 56 0,92 14 2584 ± 35 1,35 4ºC 21 5923 ± 45 0,76 4ºC 21 2519 ± 57 2,26 30 5689 ± 57 1,01 30 2431 ± 68 2,79 45 5415 ± 58 1,07 45 2286 ± 45 1,97 7 6066 ± 45 0,74 7 2576 ± 47 1,82 14 5794 ± 69 1,19 14 2415 ± 69 2,86 22ºC 21 5513 ± 57 1,03 22ºC 21 2270 ± 45 1,98 30 5358 ± 47 0,89 30 2173 ± 45 2,07 45 5198 ± 23 0,44 45 2085 ± 34 1,63 7 5937 ± 23 0,39 7 2455 ± 34 1,38 15 5433 ± 80 1,47 15 2246 ± 33 1,47 30ºC 21 5037 ± 45 0,89 30ºC 21 2084 ± 79 3,79 30 4917 ± 57 1,16 30 1980 ± 68 3,43 45 4651 ± 45 0,97 45 1900 ± 45 2,37 c 0 = 6375 ± 48 mg/l c 0 = 2713 ± 33 mg/l Promena sadrţaja ukupnih flavonoida tokom ĉuvanja soka i sirupa je data i grafiĉki, gde se uoĉava da linearni trend opadanja koncentracije flavonoida postoji do 21. dana ĉuvanja (slike 28 i 29). Do tog perioda u soku ĉuvanom na 4, 22 i 30ºC je ostalo oĉuvano 92,9 %, 86,5 % i 79,0 %, a u sirupu 92,6 %, 83,7 % i 76,8 % ukupnih flavonoida, respektivno. Na osnovu dobijenih podataka moţe se zakljuĉiti da su promene sadrţaja flavonoida u soku i sirupu pribliţno iste. 34

Sadržaj ukupnih flavonoida, mgce/l Sadržaj ukupnih falvonoida, mgce/ 6200 6000 5800 5600 4 o C 22 o C 30 o C 5400 5200 5000 4800 4600 4400 7 14 21 28 35 42 49 Vreme (dan) Slika 28. Promena sadrţaja ukupnih flavonoida u soku tokom ĉuvanja na razliĉitim temperaturama 2700 2600 2500 2400 4 o C 22 o C 30 o C 2300 2200 2100 2000 1900 1800 7 14 21 28 35 42 49 Vreme (dan) Slika 29. Promena sadrţaja ukupnih flavonoida u sirupu tokom ĉuvanja na razliĉitim temperaturama 35