Univerzitet u Nišu Prirodno-matematički fakultet Departman za hemiju Hemijska analiza i određivanje antimikrobne aktivnosti etarskog ulja biljne vrste Artemisia scoparia Waldst. & Kit. -Master rad- Kandidat Marija Ivanović Mentor prof. dr Ivan Palić Niš, 2018.
ПРИРОДНO-MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ Прилог5/1 КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА Редниброј, РБР: Идентификациониброј, ИБР: Типдокументације, ТД: Типзаписа, ТЗ: Врста рада, ВР: Аутор, АУ: Ментор, МН: Насловрада, НР: Језикпубликације, ЈП: Језикизвода, ЈИ: Земљапубликовања, ЗП: Уже географско подручје, УГП: монографска текстуални / графички мастер рад Марија Ивановић Иван Палић Хемијска анализа и одређивање антимикробне активности етарског уља биљне врсте Аrtemisia scoparia Waldst. & Kit. српски српски Р. Србија Р. Србија Година, ГО: 2018 Издавач, ИЗ: ауторскирепринт Местоиадреса, МА: Ниш, Вишеградска 33. Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога) Научнаобласт, НО: Научнадисциплина, НД: Предметна одредница/кључне речи, ПО: 5 поглавља, 38 стране, 4 табела, 7 графичких приказа Хемија Органска хемија и биохемија хемијски састав, етарско уље, антимикробна активност, GC/MS, Artemisia scoparia
УДК Чувасе, ЧУ: Важнанапомена, ВН: Извод, ИЗ: 581.192 : 582.998.16 579.6 : 582.998.16 Библиотека Експериментални део рада рађен је у лабораторијама за органску хемију и биохемију ПМФ-а у Нишу у оквиру пројекта ОИ 172047 Надземни делови биљне врсте Аrtemisia scoparia Waldst. et Kit. прикупљена су у Нишкој Бањи, у близини Ниша, у фази пуног цветања. Из сувог узорка је добијено етарско уље хидродестилацијом по Clevenger у. Хемијски састав је одређен анализом GC i GC/MS. Идентификовано је 65 једињења што чини 98,6%. Најзаступљенија класа једињења етарског уља су фенилдиацетилени, са уделом од 46,3%. Једињење које је доминатно у етарском уљу је капилен са уделом од 35,2%, што чини приближно 1/3 етарског уља. Резултати антимикробне активности етарског уља на четири врсте бактерија и једну врсту гљивица су испитивани диск дифузионом методом. Етарско уље је било неактивно на грам-негативне бактерије, али је показало одређену активност према грам-позитивним бактеријама. Испитивани узорак је имао висок антифунгални потенцијал и показао је веома високу активност у односу на Нистатин (29 мм), који је коришћен као позитивна контрола. Датумприхватањатеме, ДП: 17.1.2018. Датумодбране, ДО: 30.10.2018. Члановикомисије, КО: Председник: др Горан Петровић Члан: Члан, ментор: др Александра Ђорђевић др Иван Палић ОбразацQ4.09.13- Издање 1
ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИФАКУЛТЕТ НИШ KEY WORDS DOCUMENTATION Прилог 5/2 Accession number, ANO: Identification number, INO: Document type, DT: Type of record, TR: Contents code, CC: Author, AU: Mentor, MN: Title, TI: Language of text, LT: Language of abstract, LA: Country of publication, CP: monographic textual / graphic master work Marija Ivanović Ivan Palić Chemical analysis and determination of antimicrobial activity of essential oil of plant species Artemisia scoparia Waldst. & Kit. serbian english Serbia Locality of publication, LP: Serbia Publication year, PY: 2018 Publisher, PB: Publication place, PP: Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes) Scientific field, SF: Scientific discipline, SD: Subject/Key words, S/KW: author s reprint Niš, Višegradska 33 5 chapters, 38 pages, 4 tables, 7 graphic representations Chemistry Organic chemistry and biochemistry chemical composition, antimicrobial activity, GC/MS,Artemisia scoparia
UC 581.192 : 582.998.16 579.6 : 582.998.16 Holding data, HD: Note, N: Abstract, AB: library The experimental part of this master work was performed in laboratories for organic chemistry and biochemistry of Faculty of Sciences and Mathematics as a part of the grant 172047 Aerial parts of plant species Artemisia scoparia Waldst. et Kit. were collected in Niška Banja, near Niš, in the stage of full flowering. From the dry sample, essential oil was isolated by Clevenger type hydrodistillation. The chemical composition was determined by analysis using GC/MS. 65 compounds were identified, which makes 98.6%. The major class of compounds in the essential oil is phenyldiacetilene, with percentage of 46.3%. The major component of oil was capillene, with percentage of 35.2%, which makes nearly 1/3 oil mass. The results of antimicrobial activity of the essential oil against four bacteria and one fungus species were determined using disc-diffusion method. Essential oil was inactive against gram-negative bacteria, but it showed some activity against gram-positive bacteria. The studied sample had high antifungal potential and showed very high activity in comparison of Nystatin (29 mm), which was used as positive control. Accepted by the Scientific Board on, ASB: 17.01.2018. Defended on, DE: 30.10.2018. Defended Board, DB: President: dr Goran Petrović Member: Member, Mentor: dr Aleksandra Djordjević dr Ivan Palić ОбразацQ4.09.13- Издање 1
Eksperimentalni deo ovog master rada odrađen je u laboratoriji za organsku hemiju i biohemiju (Departman za hemiju, Prirodno-matematički fakultet, Univerzitet u Nišu) i predstavlja deo istraživanja u okviru projekta 172047. Posebnu zahvalnost dugujem svom mentoru, dr Ivanu Paliću, vanrednom profesoru Prirodnomatematičkog fakulteta, Univerziteta u Nišu, na ukazanom poverenju, korisnim savetima i sugestijama tokom izrade master rada. Veliku zahvalnost dugujem doktorantkinjama Jovani Ickovskii Katarini Stepić na izdvojenom vremenu i stručnoj pomoći tokom izrade ovog master rada. Zahvaljujem se svim prijateljima i kolegama na pruženoj podršci tokom studiranja. Na kraju, neizmernu zahvalnost dugujem svojoj porodici na pruženoj podršci i motivaciji tokom studiranja da istrajem do kraja. HVALA VAM!
SADRŽAJ 1. UVOD I CILJEVI RADA...1 2. TEORIJSKI DEO...4 2.1. SISTEMATIKA BILJAKA... 5 2.1.1. Uvod u sistematiku biljaka... 5 2.1.2. Familija Asteraceae... 6 2.1.3. Artemisia scoparia... 7 2.2. ETARSKA ULJA... 8 2.2.1. Opšte karakteristike etarskih ulja... 8 2.2.2. Fizičke osobine etarskih ulja... 9 2.2.3. Hemijski sastav etarskih ulja... 9 2.2.4. Biološka aktivnost i primena etarskih ulja... 9 2.2.5. Postupci dobijanja etarskog ulja... 10 2.3.DOSADAŠNJA ISPITIVANJA ETARSKOG ULJA BILJKE ARTEMISIA SCOPARIA... 12 2.4. GASNA HROMATOGRAFIJA... 13 2.4.1. Parametri identifikacije... 14 2.5. GASNA HROMATOGRAFIJA / MASENA SPEKTROMETRIJA... 16 2.5.1. Kvantitativna GC/MS analiza... 17 2.6. ANTIMIKROBNA AKTIVNOST... 18 3. EKSPERIMENTALNI DEO... 22 3.1. POREKLOI PRIPREMA BILJNOG MATERIJALA... 23 3.2. IZOLOVANJE ETARSKOG ULJA... 23 3.3. PARAMETRI I IDENTIFIKACIJE KOMPONENATA ETARSKOG ULJA GC/MS ANALIZOM... 25 3.4. PARAMETRI DISK-DIFUZIONE METODE I BAKTERIJSKE KULTURE ZA TESTIRANJE ANTIMIKROBNE AKTIVNOSTI ETARSKOG ULJA BILJNE VRSTE A. SCOPARIA... 26 4.REZULTATI I DISKUSIJA... 27 4.1. HEMIJSKA ANALIZA ISPITIVANIH UZORAKA... 28 4.1.1. Sadržaj i hemijski sastav etarskog ulja biljne vrste Artemisia scoparia... 28 4.1.2. Antimikrobna aktivnost etarskog ulja biljne vrste Artemisia scoparia... 33 5.ZAKLJUČAK... 34 LITERATURA... 36
1. UVOD I CILJEVI RADA
Upotreba bilja u lečenju vodi poreklo iz daleke prošlosti. Veština lečenja biljem razvijala se kod svih naroda i sačuvala se, negde više, negde manje, kao tradicionalna ili narodna terapija, popularno nazvana narodna medicina, sve do danas. Mnoge biljke su se uspešno vekovima upotrebljavale u tradicionalnoj terapiji, a prihvaćene su i u medicini i predstavljaju važne lekovite sirovine u savremenoj medicini [1]. Veština lečenja je kod primitivnih naroda bila povezana sa religijskim i ritualnim obredima, što se i danas sreće tamo gde su očuvani tradicionalni oblici ljudske zajednice. Istorija počinje pisanim spomenicima; prvi zapisi o korišćenju biljaka za lečenje sreću se kod Kineza (Šen-Nung,2737-2698 god. p.n.e), Indusa (Vede, 2000-1000 god. p.n.e), Egipćana (Papirus Ebers, 1500 god. p.n.e) i kasnije kod Grka i Rimljana[2]. Mogu se naći u svim raznovrsnim delovima biljke, uključujući seme, koren, list, cvet, stablo, balzam, koru, smolu. Širok spektar aromatičnih materija dobijenih iz prirodnih izvora i umetnostnjihove ekstrakcije i upotrebe vremenom se sporo razvijala, ali njihovo poreklo datira čakod početka najstarijih civilizacija. U poslednje dve decenije primećuje se porast interesovanja za komplementarnim metodama lečenja i upotrebom prirodno dobijenih produkata kao što su etarska ulja. Aromaterapija se nekada smatrala primarnom praksom, postala je široko prihvaćena i poštovana i sve više se nudi bolničkim pacijentima kao deo njihove terapije. Proizvođači mediciskih proizvoda, kozmetike i parfema sve više prepoznaju vrednost etarskih ulja u poboljšanju kvaliteta i privlačnosti svojih proizvoda. Istovremeno, kućna upotreba etarskih ulja je u porastu, jer ljudi otkrivaju terapeutske prednosti i jedinstveno estetsko uživanje u uljima. Trenutna naučna istraživanja u vezi sa hemijskim i medicinskim upotrebama određenih etarskih ulja su pomogla da se potvrdi i objasninjihov lekoviti potencijal [3]. Aktivnost etarskih ulja predstavlja mešavinu aktivnosti njegovih sastojaka. Međutim, teško je ispitivati aktivnost određenih, pojedinačnih komponenti ulja i većinom se definiše farmakološka aktivnost ukupnog ulja. Pored velike raznovrsnosti, moguće je izdvojiti nekoliko dejstava koje poseduje veći broj etarskih ulja, od kojih je značajno antimikrobno delovanje etarskih ulja, pa se koriste kao dezinficijensi i antiseptici [2]. Familiji Asteraceae pripada rod Artemisia,koji obuhvata preko 800 vrsta. Najveći broj vrsta se javlja u stepama Evrope, Azije, kao i u stepskim oblastima Severne i Srednje Amerike. U Srbiji je pronađeno 9 vrsta. 2
Predstavnici ovog roda su zeljaste ili polužbunaste biljke. Listovi su naizmenično raspoređeni, retko celi, najčešće su jednostavno ili više puta perasto deljeni. Glavice su često viseće, cilindrične ili loptaste, grupisane u metličaste ili grozdaste cvasti. Plod je ahenija po obliku cilindrična ili spljoštena [4]. Najznačajnije vrste roda Artemisia su: Artemisiapetrosa, Artemisiavulgaris, Artemisiaabsinthium, Artemisia maritima, Artemisia pontica, Artemisia lobelii, Artemisiaannua, Artemisiacampestris i Artemisia scoparia. Rod Artemisia, poznat kao rod pelina, je jedan od najvec ih u porodici Asteraceae, koji se sastoji od više od 800 vrsta koje se mogu naći širom sveta, naročito na jugozapadu Azije i centralne Evrope. Značaj ove vrste se može pripisati prisustvu fitotoksina i etarskih ulja, pored ostalih neisparljivih sekundarnih metabolita. Utvrđeno je da etarsko ulje dobijeno iz delova Artemisia scoparia ima medicinsku vrednost [5]. Biljka ima antiholesterolemično, antipiretičko, antiseptično, holagogno, diuretičko i vazodilatatorno dejstvo.ima antibakterijsku aktivnost koja sprečava raststaphylococcus aureus, Streptococci, Bacillusdysenteriae, Salmonella Typhi, Bacillus subtilis, Pneumococci, Corynebacterium diphtheriae, Mycobacterium.Koristi se u lečenju žutice, hepatitisa i upale bešike. Biljka se takođe koristi u mešavini sa drugim lekovima kao holagog [6]. Istraživanja su vršena korišćenjem sledećih metoda: za izolovanje etarskog ulja koristila se hidrodestilacija po Clevenger-u, za razdvajanje i analizu etarskog ulja gasna hromatografija (GC) i gasna hromatografija/masena spektrometrija (GC/MS). 3
2. TEORIJSKI DEO
2.1. SISTEMATIKA BILJAKA 2.1.1. Uvod u sistematiku biljaka Sistematika biljaka je botanička disciplina koja proučava raznovrsnost biljnog sveta i traži puteve da se ta raznovrsnost svede u logički uređen sistem. Zajedno sa tim, savremena sistematika kao biološka disciplina izučava ne samo raznovrsnost (i podjedinice unutar vrsta), već i uzroke njihovog nastanka. Krajnji cilj sistematike biljaka sastoji se u raspoređivanju u sistematske kategorije, na osnovu stvarnog srodstva svih sadašnjih i ranije živelih biljaka (fosilnih), kao i u raspoređivanju tih grupa u takav logički sistem, koji bi odražavao tok istorijskog razvoja biljnog sveta, njegovu evoluciju [7]. Sistematika biljaka pruža potporu i važan konceptualni doprinos drugim biološkim disciplinama koji inače eksperimentalnim biolozima ne bi bio na raspolaganju. Ona predstavlja fundamentalnu botaničku disciplinu od koje u velikoj meri zavisi rad drugih bioloških disciplina kao što su: fiziologija, ekologija, geografija biljaka, populaciona biologija, biohemija, genetika, molekularna biologija i drugo, koje često kao predmet svojih istraživanja biraju biljke. Za sve navedene oblasti nauke, veoma su značajne informacije o preciznoj identifikaciji i poznavanju sistematskog položaja biljnih vrsta. Svojim velikim delom ona se podudara sa taksonomijom, granom biologije koja podrazumeva identifikaciju, deskripciju, nomenklaturu i klasifikaciju recentnih i fosilnih organizama. U skladu sa taksonomskim pravilima, srodni organizmi se svrstavaju u formalne sistematske, odnosno taksonomske jedinice, taksone, koji su organizovani po hijerarhijskom principu. U skladu sa tradicionalnim konceptom, vrsta (Species) predstavlja osnovnu taksonomsku jedinicu koja obuhvata sve jedinke istoga porekla, sličnog izgleda i anatomske građe, koje međusobnim ukrštanjem daju plodno potomstvo. Nadalje, vrste klasifikujemo u više taksonomske jedinice, od kojih su glavne: rod (Genus), porodica (Familia), red (Ordo), klasa (Classis), razdeo (Phylum, Divisio) i na kraju carstvo (Regnum). Često se koriste i pomoćne taksonomske kategorije, kod kojih se dodaje prefiks pod- odnosno sub-, nad- ili super- odnosno supra-. Taksonomske jedinice niže od vrste su: podvrsta (Subspecies), varijetet (Varietas) i oblik (Forma), a predstavljaju skup pripadnika jedne vrste koje se razlikuju od ostalih [8]. 5
Idući od roda ka carstvu sve je manji broj zajedničkih osobina koje karakterišu određene taksonomske jedinice. Taksonomske jedinice se označavaju latinskim nazivom, pri čemu se koriste ustaljeni nastavci pri imenovanju. Tabela 1.Taksonomija vrste Artemisia scoparia Taksonomske kategorije Carstvo (regnum) Podcarstvo (subregnum) Odeljak (phylum) Klasa (classis) Podklasa (subclassis) Red (ordo) Familija (familia) Podfamilija (subfamilia) Pleme (tribus) Rod (genus) Epitet Vrsta Taksoni Plantae Tracheobionta Magnoliophita Magnoliopsida Asteridae Asterales Asteraceae Asteroideae Anthemideae Artemisia Scoparia Artemisia scoparia 2.1.2. Familija Asteraceae Najbrojnija familija u okviru klase Magnoliopsida je porodica Asteraceae kojoj pripada oko 1/3 vrsta.u okviru klase dikotiledonih skrivenosemenica najobimnija je familija glavočika (Asteraceae, Compositae), a ujedno i jedina familija reda Asterales. Asteraceae su ogromna kosmopolitska familija od 920 rodova i 19 000 vrsta. Asteraceae su većinom zeljaste jednogodišnje ili višegodišnje biljke, ređe šiblje i drveće, jastučaste forme.najstariji fosilni ostaci datiraju iz doba oligocena [9].Predstavnici ove familije najčešće naseljavaju umerene oblasti i planinske regione, a nalaze se i na otvorenim i često suvim staništima. Na prostoru Srbije i Crne Gore nalazi se više od 80 rodova sa preko 800 vrsta [10]. Familija Asteraceae čini posebnu prirodnu celinu i nemoguće ih je podeliti u posebne familije, pa čak ni u podfamilije [7]. 6
2.1.3. Artemisia scoparia Rod Artemisia, poznat pod nazivom rod-pelina, je rod gorkih aromata. Artemisia obuhvata oko 800 vrsta koje su široko rasprostranjene u Južnoj Africi i Južnoj Americi, a 34 vrste su pronađene u Indiji. Ovaj rod je naziv dobio po grčkoj boginji čednosti (Artemis) [11]. Artemisia scopariawaldst. & Kit., poznatija pod nazivom bezlisni pelin ili žuta metla, je visoka, razgranata biljna vrsta blagog mirisa. Sama biljka popularna je među baštovanima kao kultivisani ukras. U iranskoj tradicionalnoj medicini neki delovi biljke koristili su se za hiperlipemiju, hipoglikemiju, a utvrđena je i njena antibakterijska, anti-inflamatorna aktivnost i diuretičkodejstvo. Takođe, sveže listove stanovnici Irana upotrebljavali su i kao začine. Ekstrakt biljke koristi se kao purgativ, za lečenje ušiju i groznice. Poznato je da je jedinjenje skoparon,koje je pronađeno u A.scoparia, veoma značajno za razvoj boljih imunosupresivnih agenasa.etarska ulja pokazuju snažnu insekticidnu aktivnost [12]. Biljka je poznata po svojoj upotrebi u domac em sistemu medicine kao diuretik i spazmolitik i kao lek za snižavanje temperature. Štaviše, infuzije napravljene od cele biljke se tradicionalno koriste za lečenje žutice i drugih poremećaja jetre. Fitohemijskim ispitivanjima biljnog materijala utvrđeno je prisustvo brojnih jedinjenja uključujuc i flavonoide (kvercetin, rutin i kempferol), fenolna jedinjenja (hlorogenična kiselina, kofeinska kiselina, pirogalol i vanilin), karotenoide, L-askorbinska kiselinu i holin. Međutim, biljni ekstrakt ili njegovi sastojci nisu široko proučavani farmakološki [13]. A.scoparia je jednogodišnja do dvogodišnja termofilna biljka, visoka 30-100 cm. Stabljika ove biljke je gusto razgranata, crvenkasta. Listovi su sivkastozeleni, goli ili svilasto dlakavi. Listovi rozete su dvostruko, perasto deljeni a režnjevi lancetasti, u vreme cvetanja odsutni. Cvetovi su u crvenkastim piramidalnim cvastima. Glavice su okrugle, veličine 1,5-2 mm i vise na kratkim drškama. Biljka raste mestimično pored puteva, na strnjini, na rudinama, od nizija pa sve do planinskih oblasti. To je lekovita, ali alergena biljka. U nekim Evropskim zemljama je zakonom zaštićena kao retkost [14]. 7
Slika 1.Artemisia scopariawaldst.& Kit. 2.2. ETARSKA ULJA 2.2.1. Opšte karakteristike etarskih ulja Etarska ulja predstavljaju specifične, najčešće tečne produkte biljnog tkiva. To su više ili manje složene smeše različitih isparljivih mono-, seskviterpena i fenilpropanskih jedinjenja. Najjednostavniji način da se ove tečnosti izoluju iz biljne sirovine je destilacija vodenom parom, postupak koji se koristi već hiljadama godina. Pored destilacije, vekovima se etarsko ulje agruma dobija presovanjem, ceđenjem svežeg tkiva. Etarska ulja su uglavnom produkti viših biljaka. Ove biljke su raspoređene u preko pedeset familija, a najpoznatije su aromatične biljke familija Asteraceae, Lamiaceae, Apiaceae, Rutaceae, Myrtaceae i Lauraceae.Etarska ulja su lokalizovana u različitim delovima biljaka, tako da se kao droga koristi cvast kamilice i pupoljak cveta karanfilića, list nane i matičnjaka, kora cimetovog drveta, sandalovo i klekovo drvo. Etarska ulja lokalizovana u različitim delovima iste biljke, mogu biti sličnog sastava, ali se mogu i značajno razlikovati. 8
2.2.2. Fizičke osobine etarskih ulja Na sobnoj temperaturi, etarska ulja su najčešće tečnosti, ređe imaju viskoznu ili polučvrstu konzistenciju. Lako su pokretljiva, bezbojna ili slabo obojena, bistra. Već na nižim temperaturama, pojedini sastojci etarskih ulja isparavaju i zato ulja imaju specifičan, prijatan ili neprijatan miris. Etarska ulja su lipofilna, rastvaraju se u nepolarnim organskim rastvaračima, etanolu, mastima i masnim uljima. Generalno, etarska ulja se ne rastvaraju u vodi. U stvari, samo mali broj sastojaka ulja je rastvorljiv i ovakvi proizvodi se nazivaju aromatične vode. 2.2.3. Hemijski sastav etarskih ulja Etarska ulja su složene mešavine dve različite klase jedinjenja: terpena i fenilpropanskih derivata. U okviru terpenske frakcije, zastupljeni su isparljivi mono- i seskviterpeni. Monoterpeni se javljaju u obliku acikličnih (linearnih), mono- i bicikličnih, alifatičnih i aromatičnih struktura. Na osnovu uvedenih funkcionalnih grupa, sastojci ulja mogu biti ugljovodonici, alkoholi, aldehidi, ketoni, kiseline, estri, fenoli, etri, oksidi, peroksidi, epoksidi. U okviru frakcije seskviterpena, formirane su još raznovrsnije strukture osnovnog skeleta: zbog dužine ugljovodoničnog lanca veća je mogućnost različitih ciklizacija. I ova grupa terpena javlja se u obliku ugljovodonika, oksida, alkohola, ketona i estara. U etarskim uljima su aromatični, fenilpropanski sastojci zastupljeni u znatno manjim količinama [2]. 2.2.4. Biološka aktivnost i primena etarskih ulja Biološka uloga etarskih ulja jeste da privlače insekte i pomažu u oprašivanju, mogu da inhibiraju klijanje semena, kako drugih, tako i sopstvenih biljaka, štite biljku od napada insekata i drugih životinja, stvaraju specifičnu mikroklimu koja ih štiti od prekomerne transpiracije, sprečavaju razvoj mikroorganizama (štite biljku od infekcije) [15]. 9
Etarska ulja se primenjuju u medicini, farmaciji, prehrambenoj, kozmetičkoj industriji, zatim industriji alkoholnih i bezalkoholnih pića, kao i u industriji boja i lakova. Mikrobiološka ispravnost, poboljšane fizičko-hemijske i organoleptičke osobine proizvoda od etarskih ulja čine ih prihvatljivim, organizam ih usvaja, bez neželjenih posledica, što nije slučaj sa nekim prehrambenim proizvodima koji često u sebi sadrže sintetičkim putem proizvedena mirisna i antioksidativna jedinjenja. Zbog toga se etarska ulja najviše koriste u proizvodnji izuzetno cenjenih i vrednih biološki zdravih proizvoda. Aromaterapija je jedan kompleksan tretman koji izaziva duboki efekat na um, telo i emocije. U aromaterapiji kombinuju se efekti vezani za pokrete prisutne u masaži sa terapeutskim osobinama etarskih ulja koja se koriste pri masaži. Mnoga ulja se jako dugo koriste u ove svrhe, kao što su ulja iz limuna, kedra, eukaliptusa, lavande, majčine dušice, i druga. U farmakologiji, etarska ulja se koriste kao antispazmolitici, za jačanje organizma, protiv katara želuca, za poboljšanje apetita, antiflogistici, za opekotine i rane, za smirenje upala kože i sluzokože, za lokalnu anesteziju, za umirenje, protiv nazeba. U kozmetičkoj industriji etarska ulja su značajne komponente koje ulaze u sastav parfema, mirisnih ulja, kolonjskih voda, balsama, pomada i pasti za zube. U prehrambenoj industriji etarska ulja se koriste kao aromatični začini, u industriji likera, u industriji peciva i slatkiša, kao konzervansi, kao i aditivi u industriji mesa. 2.2.5. Postupci dobijanja etarskog ulja Uobičajena su četiri postupka dobijanja etarskih ulja: Hidrodestilacija Hladno presovanje Ekstrakcija pomoću organskih rastvarača Nadkritična ekstrakcija Destilacija je opšti pojam postupka za dobijanje etarskih ulja iz biljnog materijala mada se ona izvodi na tri posebna načina: destilacija vodom, destilacija vodom i vodenom parom, destilacija vodenom parom. 10
Kod postupka destilacije vodom, biljni materijal je potopljen sve vreme u ključalu vodu. Grejanje suda sa biljnim materijalom ostvaruje se direktno ispod dna suda (čvrsto gorivo, gas) ili indirektno kroz duplikator, grejan dodatnim grejnim medijumom. Formirana vodena para odnosi lako isparljive aromatične komponente iz materijala. Ovaj postupak ne daje etarsko ulje dobrog kvaliteta, pošto tokom kuvanja često dolazi do dogradacije estara iz biljnog materijala. Destilacija vodom i vodenom parom je prikladna za sudove zapremine do 300L. U ovom slučaju znatno je manji kontakt biljnog materijala i vode nego u prothodnom primeru. Vreme destilacije za jednu šaržu je kraće nego kod destilacije vodom. Potrošnja energije za izdvajanje etarskih ulja je najmanja u poređenju sa ostalim postupcima. Destilacijavodenom parom je jedan odnajčešće korišćenih postupaka za dobijanje etarskih ulja iz biljnog materijala. Preporučuje se u slučajevima da polazna sirovina sadrži relativno visok procenat etarskog ulja i kada su komponente ulja stabilne na povišenim temperaturama. Ako je sadržaj ulja ispod 0,1%ili je neka komponenta ulja rastvorljiva u vodi, postupak se ne preporučuje. Postupak hladnog presovanja koristi se kod proizvodnje ulja iz kore ploda limuna, pomorandže, grejpfruta i mandarina. Presovanje se vrši pomoću mašina koje ljušte koru sa ovih plodova, iz koje se zatim pod pritiskorn izdvaja ulje. Hladno presovani tečni proizvod predstavlja zapravo smešu vode i etarskog ulja. Ekstrakcija ulja pomoću organskih rastvarača (petroletar, benzen, heksan ili aceton) primenjuje se za biljni materijal koji sadrži termodegradabilna jedinjenja (jasmin, cvet lipe i drugo). Proces ekstrakcije se odvija u kolonskom uređaju, pri čemu se biljni materijal nalazi na perforiranoj pregradi. Naime, materijal se višestruko ispira organskim rastvaračem. Na ovaj način u rastvaraču se iz biljnog materijala rastvaraju ekstraktivne materije, kao sto su: nearomatični voskovi, pigmenti i visoko isparljive aromatične komponente. Ekstrakcija pomoću tečnog gasa (najčešće CO2) ili nadkritičnog fluida, poznata je pod nazivom nadkritična ekstrakcija, pošto se koriste fluidi koji se nalaze na temperaturi i pritisku iznad njihovih kritičnih vrednosti. Tečni CO2 se može koristiti kao vrlo inertan, bezbedan tečni rastvarač, koji vrlo efikasno ekstrahuje aromatične komponente iz biljnog materijala. Prednost ovog postupka u odnosu na klasičnu ekstrakciju organskim rastvaračima je u tome što se CO2nakon kontakta sa materijalom ne zadržava u produktu, pošto se on na normalnoj temperaturi i pritisku ekspanzijom pretvara u gas i odvodi u atmosferu [15]. 11
2.3.DOSADAŠNJA ISPITIVANJA ETARSKOG ULJA BILJKE ARTEMISIA SCOPARIA Prinos i sastav etarskog ulja variraju u zavisnosti od vrste zemljišta, starosti biljke, klimatskih faktora i teritorije sa koje je biljka sakupljena. To se može potvrditi na osnovu navedenih dosadašnjih ispitivanja etarskog ulja biljne vrste Artemisia scoparia. Autor Singh sa saradnicima [16,5,17] je sproveo više ispitivanja etarskog ulja biljne vrste Artemisia scopariawaldst. & Kit. sa teritorije Indije. Prvim ispitivanjem etarskog ulja dobijenog hidrodestilacijom biljnog materijala A.scoparia(prinos 0,2%, m/v) identifikovanoje 48 komponenata, što čini 99,3% ukupne mase ulja. Najzastupljenija klasa jedinjenja bili su monoterpeni (56,7%). Citronelal (15,2%) i β-citronelol (11,0%) bilisu glavni monoterpenski sastojci ulja [16]. Drugo ispitivanje sprovedeno od strane ove grupe istraživača sastojalo se iz određivanja hemijskog sastava i antioksidativne aktivnosti etarskih uljadobijenih hidrodestilacijom mladog i zrelog lišća biljne vrste Artemisia scoparia. GC/MS analizaje pokazala veliki procenat monoterpena (64,0-67,0%) i identifikovana je 31 komponenta u etarskom ulju dobijenom iz zrelog lišća i 44 komponente u ulju dobijenom iz mladog lišc a. Dominantna jedinjenja etarskog ulja bili su β-mircen (24,1%) i p-cimen (27,1%) [5]. Treće ispitivanje ovih istraživača zasnivalo se na analizi hemijskog sastava i fitotoksičnosti etarskog ulja Artemisia scoparia. GC i GC/MS analizom su identifikovana 33 jedinjenja koja predstavljaju 99,8% ulja. Etarsko ulje bilo je bogato monoterpenima (71,6%), a najzastupljeniji su bili β-mircen (29,3%), limonen (13,3%), (Z)-β-ocimen (13,4%) i γ-terpinen (9,5%) [17].Sva tri istraživanja okarakterisala su monoterpenekao dominantnu klasu jedinjenja. Analizom hemijskog sastava etarskog ulja Artemisia scopariasa područja Irana, sprovedenom od strane Negahbana i saradnika [18], ispitana je fumigantna i repelentna aktivnost na tri vrste insekata koji se pojavljuju tokom skladištenja: Callosobruchusmaculatus (Fab.), Sitophilus orizae (L.) i Triboliumcastaneum (Herbst). GC/MS analizom identifikovano je 12 komponenata, što čini 99,5% ukupnog etarskog ulja. Jedinjenja koja su zastupljena u najvećem procentu bila su β-pinen (19,0%), kapilin (17,5%), limonen (15,1%) i mircen (11,0%). 12
Morteza-Semnani i saradnici [19]izolovali su hidrodestilacijom etarsko ulje A. scopariaiz Irana i analizirali ga pomoću GC i GC/MS. Glavna jedinjenja etarskog uljabila sukamfor (37,9%), 1,8-cineol (27,8%) i borneol (21,1%). Mirjalili i saradnici [20]su vršili ispitivanja količine i sastava etarskog ulja biljne vrste Artemisia scoparia Waldst.& Kit. sa područja Irana, u različitim fazama razvića biljke, uključujući vegetativnu fazu, fazu formiranja pupoljakai fazu cvetanja. Prinosi dobijenih etarskih ulja iznosili su: faza cvetanja(0,9%) > faza formiranja pupoljaka (0,7%) > vegetativna faza (0,4%). GC i GC/MS analizom identifikovano je 25 komponenata iz etarskog ulja biljke u vegetativnoj fazi, 23 jedinjenja iz ulja u fazu formiranja pupoljakai 18 jedinjenja iz ulja u fazi cvetanja, što predstavlja 98,4%, 98,5% i 98,7% ulja. Kao dominantna jedinjenja etarskog ulja identifikovani suα-tujon,β-tujon i 1,8-cineol. Ispitivanjebioherbicidne aktivnosti etarskih ulja biljne vrsteartemisia scopariasa teritorije Indijena pet različitih vrsta korova (viz. Achyranthes aspera, Cassia occidentalis, Parthenium hysterophorus, Echinochloa crus-galli iageratum conyzoides)kaur-a i saradnika [21], pokazalo je da je etarsko ulje ispitivane biljne vrste imalo najveći inhibitorni efekat na rast P. hysterophorus, a najmanji na rast C. Occidentalis. Cha i saradnici iz Južne Koreje[22] analizirali su etarsko ulje A. scoparia pomoću GC/MS.Najzastupljenija jedinjenja bila su: kamfor (11,0%), 1,8-cineol (21,5%) i β-kariofilen (6,8%). Istraživanje pokazuje dosta sličnosti sa istraživanjima Morteza-Semnani-a i saradnikau pogledu hemijskog sastava ulja i dobijenih najzastupljenijih jedinjenja (kamfor i 1,8-cineol), ali se ta jedinjenja javljaju u različitim procentima u datim uljima. 2.4. GASNA HROMATOGRAFIJA Gasna hromatografija (GC) predstavlja hromatografsku metodu razdvajanja i detekcije hemijskih jedinjenja na osnovu različitih raspodela između dve faze-pokretne i nepokretne. Nepokretna faza je tečna ili čvrsta, a pokretna je gasovita i nju čine inertan noseći gas i pare jedinjenja koja se razdvajaju. U gasnohromatografskoj koloni dolazi do dodira između ove dve faze. 13
Kod najvećeg broja gasnohromatografskih analiza primenjuje se takozvana tehnika eluiranja koja se sastoji u neprekidnom proticanju nosećeg gasa konstantnom brzinom kroz gasnohromatografski sistem: isparivač-kolona-detektor. Kriva zavisnosti jačine signala od vremena naziva se gasni hromatogram. U uslovima kada je postignuto dobro razdvajanje, svaki signal (maksimum) odgovara jednom hemijskom jedinjenju i okarakterisan je vremenom zadržavanja (retencionim vremenom) i površinom. Kao noseći gas najčešće se koriste H2, He, N2 i Ar. Neophodno je da on bude visoke čistoće i da je hemijski inertan u odnosu na uzorak i tečnu fazu. Upravo od osobina nosećeg gasa u velikoj meri zavisi osetljivost detekcije i u manjoj meri efikasnost GC kolona je cev u kojoj se nalazi nepokretna faza. Izrađuje se od metala (nerđajućeg čelika, bakra ili aluminijuma) ili stakla. Metali (naročito bakar) nisu pogodni zato što katalizuju hemijske reakcije na jedinjenjima koje sadrže osetljive funkcionalne grupe. Uobičajene dužine pakovanih analitičkih kolona su 0,5-4 m, a unutrašnji prečnici su 1-4 mm. Sa dužim kolonama postižu se bolja razdvajanja, ali se produžava vreme trajanja analize. U poređenju sa pakovanim kolonama, znatno efikasnije kapilarne kolone imaju višestruko veće dužine (30-150 m) i znatno manje unutrašnje prečnike (0,25-0,75 mm). Detektor je direktno povezan sa izlazom iz kolone, tako da sve što je sa njega eluirano (i noseći gas i pare ispitivanih jedinjenja) prolazi kroz njega. Uglavnom se primenjuju diferencijalni detektori čiji se princip rada zasniva na neprekidnom merenju nekog fizičkog svojstva nosećeg gasa, koje je u direktnoj vezi sa koncentracijom pare u njemu. Najviše se primenjuju termoprovodljivi i jonizacioni detektori. Metode identifikacije jedinjenja pomoću gasne hromatografije se mogu podeliti na: GC metode bez primene drugih metoda i GC metode u kombinaciji sa drugim metodama (instrumentalnim ili hemijskim). 2.4.1. Parametri identifikacije Retenciono vreme predstavlja vreme koje protekne od ubrizgavanja smeše do pojave maksimuma njegovog signala. Preko njega se najčešće izražava dužina boravka nekog jedinjenja u GC koloni. 14
Retencioni indeksi se primenjuju kod identifikacije organskih jedinjenja. Nazivaju se još i Kovats-evi indeksi. Te veličine su izvedene u cilju standardizacije GC podataka i one povezuju retenciona vremena organskih jedinjenja sa odgovarajućim vrednostima za n-parafine koji se uzimaju kao standardi. Za izotermalne uslove analize koristi se jednačina Kováts-a, a za linearno programirane temperaturne uslove analize Van den Dool i Kratz-a jednačina gasnohromatografske kolone. Kováts-eva jednačina za izračunavanje retencionih indeksa: RI x = 100n + 100(log t R(x) log t R(n) ) log t R(n+1) log t R(n) RIx- retencioni indeks ispitivane supstance, n - broj C-atoma alkana koji se eluira neposredno pre ispitivane supstance, tr(x)- retenciono vreme ispitivane supstance, tr(n)- retenciono vreme alkana koji se eluira neposredno pre ispitivane supstance, tr(n+1)- retenciono vreme alkana koji se eluira neposredno posle ispitivane supstance. Van den Dool i Kratz-ova jednačina za izračunavanje retencionih indeksa: RI x = 100n + 100(t R(x) t R(n) ) t R(n+1) t R(n) RIx- retencioni indeks ispitivane supstance, n - broj C-atoma alkana koji se eluira neposredno pre ispitivane supstance, tr(x)- retenciono vreme ispitivane supstance, tr(n)- retenciono vreme alkana koji se eluira neposredno pre ispitivane supstance, tr(n+1) - retenciono vreme alkana koji se eluira neposredno posle ispitivane supstance. 15
2.5. GASNA HROMATOGRAFIJA / MASENA SPEKTROMETRIJA Kombinacija GC/MS postala je u zadnje vreme jedna od najmoćnijih metoda identifikacije sastojaka složenih smeša organskih jedinjenja. Velika osetljivost masenog spektrometra (potrebna količina uzorka je reda veličine 10-10g), kao i mogućnost brzog snimanja masenog spektra (za manje od 1s) omogućavaju povezivanje GC kolone sa masenim spektrometrom i direktno snimanje masenih spektara svih eluiranih jedinjenja. Uloga gasne hromatografije se svodi na razdvajanje, a uloga masene spektrometrije na identifikaciju komponenti smeše. U ovom GC/MS sistemu maseni spektrometar ima i ulogu detektora. Neprekidnim merenjem ukupne jonske struje dobija se gasni hromatogram. Maseni spektar se dobija merenjem struja koje potiču od jona razdvojenih prema m/z (masa/naelektrisanje) vrednostima. Do razdvajanja jona dolazi u analizatorskoj cevi koja se nalazi između polova magneta. Maseni spektar se predstavlja kao zavisnost jonske struje od m/z vrednosti. Slika 2.Šema GC/MS aparata 16
Pre početka analize podešavaju se osnovni GC i MS radni uslovi (temperaturni program, brzina snimanja masenih spektara, opseg m/z vrednosti u kojima se snimaju maseni spektri itd.). Tokom hromatografisanja se neprekidno snimaju maseni spektri, a podaci iz njih se akumuliraju u digitalnom obliku u memoriji računara. Nakon završenog snimanja, moguće je prikazivanje svih izmerenih GC/MS podataka i to u različitim oblicima. Najčešće se rezultati prikazuju kao promena ukupne jonske struje (tj. sume svih maksimuma u snimljenim masenim spektrima) u zavisnosti od vremena i rednog broja spektra. Odabrani maseni spektri se dobijaju direktno (uz pomoć računara) u standardnom obliku u kome su obilnosti jona izražene u procentima u odnosu na najobilniji jon-osnovni jon (100%). 2.5.1. Kvantitativna GC/MS analiza Kod kvantitativne GC/MS analize maseni spektrometar se koristi isključivo kao GC detektor. Njegove prednosti nad konvencionalnim GC detektorom su u većoj univerzalnosti, kao i mogućnosti selektivne detekcije pojedinih jedinjenja. Upravo zbog toga se ova analitička metoda koristi za određivanje mikrokoličina organskih jedinjenja u složenim smešama. Mnogobrojni primeri primene ove metode jesu kvantitativna određivanja biološki aktivnih jedinjenja kao što su steroidi, prostaglandini, alkaloidi i mnoga druga. Kako bi se postigla selektivna detekcija pojedinih jedinjenja, što je od naročitog interesa kod kvantitativnog određivanja mikrokoličina, koje vrlo često ne mogu da segasnohromatografski odvoje od pratećih jedinjenja, neophodno je merenje promene jonske struje koja potiče samo od jednog jona, karakterističnog za jedinjenje koje se kvantitativno određuje. Postoje tri načina merenja intenziteta izabranih jonskih struja: 1. Masena hromatografija 2. Detekcija jednog jona 3. Masena fragmentografija ili detekcija više jona [23]. 17
2.6. ANTIMIKROBNA AKTIVNOST Testiranje antimikrobne osetljivosti može se koristiti za otkrivanje lekova, epidemiologiju i predviđanje terapijskog ishoda. Nakon revolucije u "zlatnom dobu", kada su otkrivene gotovo sve grupe važnih antibiotika (tetraciklini, cefalosporini, aminoglikozidi i makrolidi), a glavni problemi hemoterapije su rešeni u 1960-im, istorija se danas ponavlja i ova uzbudljiva jedinjenja su u opasnosti od gubitka njihove efikasnosti zbog povec anja otpornosti mikroba. Trenutno, njegov uticaj je značajan kod neuspeha lečenja koji su povezani sa bakterijama otpornim na višestruku grupu lekova, i postala je globalna briga za javno zdravlje. Zbog toga je otkrivanje novih antibiotika isključivo važan cilj. Prirodni proizvodi su i danas jedan od glavnih izvora novih molekula lekova. Izvode se iz prokariotskih bakterija, eukariotskih mikroorganizama, biljaka i raznih životinjskih organizama. Mikrobni i biljni proizvodi zauzimaju najvec i deo antimikrobnih jedinjenja otkrivenih do sada. Biljke i drugi prirodni izvori mogu pružiti veliki broj kompleksnih i strukturno različitih jedinjenja. Nedavno su se mnogi istraživači fokusirali na istraživanje biljnih i mikrobioloških ekstrakata, etarskih ulja, čistih sekundarnih metabolita i novih sintetizovanih molekula kao potencijalnih antimikrobnih agenasa. Međutim, poređenje rezultata iz objavljenih članaka o antimikrobnom efektu ovih prirodnih proizvoda je često teško, zbog korišćenja različitih nestandardizovanih pristupa tehnike pripreme inokuluma, veličine inokuluma, medijuma za rast, uslova inkubacije i određivanja krajnjih tačaka. Različite laboratorijske metode mogu se koristiti za procenu ili ekranizaciju in vitro antimikrobne aktivnosti ekstrakta ili čistog jedinjenja. Najpoznatije i osnovne metode su diskdifuzione i dilucione. Ostale metode se koriste posebno za antifungalne testove, kao što je tehnika trovanja hrane. Da bi se dalje proučavala antimikrobna aktivnost agensa u dubinu, preporučuje se testiranje vremenskih uboda i citofluorimetrijska metoda protoka koji pružaju informacije o prirodi inhibitornog efekta (baktericidnog ili bakteriostatičkog) (zavisno od vremena ili zavisnosno od koncentracije) i šteta nanetih ćelijama testiranog mikroorganizma. Zahvaljujuc i novim privlačnim svojstvima novih antimikrobnih proizvoda kao što je borba protiv bakterija rezistentnih na više lekova, važno je razviti bolje razumevanje trenutnih metoda dostupnih za skrining i/ili kvantifikaciju antimikrobnog efekta ekstrakta ili čistog 18
jedinjenja za upotrebu u zdravlju ljudi, poljoprivredi i životnoj sredini. Prema tome, u ovom pregledu detaljno su razmatrane tehnike za procenu in vitro antimikrobne aktivnosti. Mikro- ili makro-dilucija je jedna od najosnovnijih metoda ispitivanja antimikrobne aktivnosti. Postupak podrazumeva pripremu dvostrukih dilucija antimikrobnih sredstava (na primer 1, 2, 4, 8, 16 i 32 mg/ml) u rastvaraču za rastuc e tečnosti izdatih u cevima koji sadrže minimalnu zapreminu od 2 ml (makrodiluciju) ili sa manjim zapreminama sa mikrotitracionom pločom od 96 rupa (mikrodilucija). Zatim, svaka cev ili sud se inokulira mikrobnim inokulumom pripremljenim u istom medijumu nakon razblaživanja standardizovane mikrobiološke suspenzije podešene na 0,5 McFarland skale. Nakon dobrog mešanja, inokulirane cevi ili ploča za mikrotitraciju sa 96 rupa inkubiraju (uglavnom bez mešanja) pod odgovarajuc im uslovima u zavisnosti od testiranog mikroorganizma. MIC je najniža koncentracija antimikrobnog agensa koja potpuno inhibira rast organizma u tubama ili bunarima za mikrodilaciju golim okom. Za razliku od metoda mikrodilacije, glavni nedostaci metode makrodilacije su mukotrpno, manuelno preduzimanje, rizik od grešaka u pripremi antimikrobnih rešenja za svaki test i relativno velika količina potrebnih reagensa i prostora. Stoga, reproduktivnost i ekonomičnost reagensa i prostora koji se javljaju usled miniaturizacije testa su glavne prednosti metode mikrodilacije. Ipak, na konačni rezultat značajno utiče pristup, koji se mora pažljivo kontrolisati ako se postignu ponovljivi rezultati (intralaboratorni i međulaboratorijski). Za određivanje krajnje tačke MIC-a, uređaji za gledanje mogu olakšati testove mikrodilacije čitanja i rezultate snimanja sa visokom sposobnošc u da prepoznaju rast u bunarima. Štaviše, razvijeno je nekoliko kolorimetrijskih metoda zasnovanih na upotrebi reagensa za bojenje. Tetrazolijum soli, 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)- 2,5-difeniltetrazolium bromid (MTT) i 2,3-bis{2-metoksi-4-nitro-5-[(sulfenilamino)-karbonil]- 2H-tetrazolium-hidroksid} (KSTT), često se koriste u određivanju konačne tačke MIC za antimikotične i antibakterijske mikrodilucione analize. U ovu svrhu se takođe može koristiti Alamar plava boja (rezazurin), koja je efikasan pokazatelj rasta. 19
Slika 3. Mikrotitarska ploča sa inokulisanom hranljivom podlogom, tretirana serijom razblaženja etarskih ulja Testiranje diferencijalnog diska agara razvijeno je 1940. godine, službeni je metod koji se koristi u mnogim kliničkim laboratorijama za mikrobiologiju za rutinsko testiranje antimikrobne aktivnosti. Danas, mnoge prihvac ene i odobrene standarde objavljuje Klinički i laboratorijski institut za standarde (CLSI) za ispitivanje bakterija i gljivica. Iako se ovom metodom ne mogu precizno testirati sve prekomerne bakterije, standardizacija je napravljena kako bi se testirali određeni brzi bakterijski patogeni kao što su streptokoke, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae, Neisseria gonorrhoeae i Neisseria meningitidis, koristec i specifične medijume za kulturu, različite uslove inkubacije i kriterijume interpretacije za zone inhibicije. U ovoj dobro poznatoj proceduri, agar ploče se inokuliraju standardizovanim inokulumom testnog mikroorganizma. Zatim se na površinu agara stavljaju diskovi od papira (prečnika oko 6 mm), koji sadrže testirano jedinjenje u željenoj koncentraciji. Petrijeva šolja se inkubira pod odgovarajuc im uslovima. Generalno, antimikrobni agens difunduje u agar i inhibira klijanje i rast testnog mikroorganizma, a zatim se mere prečnici zona rasta inhibicije. Ipak, disk difuziona metoda nudi mnoge prednosti u odnosu na druge metode: jednostavnost, niske troškove, sposobnost testiranja ogromnog broja mikroorganizama i antimikrobnih sredstava i lakoc a interpretiranja dobijenih rezultata. Pored toga, nekoliko studija pokazalo je veliko interesovanje za pacijente koji pate od bakterijske infekcije antibiotske terapije zasnovane na antibiogramu [24]. 20
Slika 4. Disk-difuziona metoda 21
3. EKSPERIMENTALNI DEO
3.1. POREKLOI PRIPREMA BILJNOG MATERIJALA U cilju ispitivanja sastava etarskog ulja biljnog materijala prikupljeni su nadzemni delovi Artemisia scopariawaldst. & Kit. u Niškoj Banji, u blizini Niša, Srbija, 2017. u fazi punog cvetanja. Biljni materijal je identifikovao profesor dr Bojan Zlatković i vaučer primerak broj 13814 je deponovan u herbarijumu Prirodno-matematičkog fakulteta (Niš, Srbija).Za hidrodestilaciju u laboratorijskim uslovima biljni materijal je seckan na sitne komade dužine oko 5 mm. 3.2. IZOLOVANJE ETARSKOG ULJA Biljni materijal je uskladišten u zatvorenom kontejneru na sobnoj temperaturi (25 C ± 2), bez izlaganja direktnoj Sunčevoj svetlosti, godinu dana pre izolovananja ulja. Iseckani biljni materijal Artemisia scopariamase 164 g je kvantitativno prenet u balon zapremine 4000 ml i dodato je 2000 ml destilovane vode. Aparatura po Clevenger-u je sklopljena, puštenaje voda za hlađenje i uključeno grejanje. Proces hidrodestilacije je izvođen 3h, tokom kojih se etarsko ulje sakupljalo u graduisanom delu separatora, a višak vode je recirkulisao preko povratne cevi. Na kraju procesa hidrodestilacije očitavana je zapremina izdvojenog etarskog ulja. Etarsko ulje je zatim ispušteno u odmerni erlenmajer i ekstrahovano dietil etrom, sa ponavljanjem od tri puta. Dietil etarski ekstrakt ulja se potom sušio anhidrovanim MgSO4. Erlenmajer sa etarskim uljem i MgSO4 je zatvoren zatvaračem ili folijom i ostavljen 24h da odstoji. Posle 24h sredstvo za sušenje je odvojeno od etarskog ulja ceđenjem u balon koji je osušen i prethodno izmeren. Na kraju se dietil etar uparavao na rotacionom vakuum uparivaču. Dobijeno je 144,8 mg etarskog ulja koje je spremno za dalju analizu. Prinos(%) = masa ulja masa droge 100 Masa ulja: 0,1448 g Masa droge: 164g 23
Slika 5. Aparatura za hidrodestilaciju po Clevenger-u: 1 - balon za destilaciju sa nastavkom, 2 - slavina sa nastavkom, 3 - graduisana cev za merenje zapremine etarskog ulja, 4 - odvazdušenje sa zapušačem, 5 - kondenzator 24
3.3. PARAMETRI I IDENTIFIKACIJA KOMPONENATA ETARSKOG ULJA GC/MS ANALIZOM Hemijski sastav etarskog ulja analiziran je pomoću GC/MS. GC/MS analiza je izvedenakorišćenjem Agilent Technologies 7890A gasnog hromatografa opremljenog kapilarnom kolonom HP-5MS (5% fenilmetilsiloksan, 250 µm x25 m, debljina filma 0,25 µm, Agilent Technologies, Santa Clara, USA) kuplovanog sa 7000 MS/MS QQQmasenimspektrometrom u MS1 scan modu. Režim rada GC/MS aparatabio je sledeći: temperature injektora i interfejsaodržavane su na 250 C i 280 C; temperatura peći je programirana linearno, 50 C-290 C,sa brzinomzagrevanja od 4 C/min, a zatim je izotermalno držana 10 minuta; kao noseći gas korišćen je helijum, pri konstantnom protoku od 1,0 ml/min; 1 μl rastvora ulja u etru jeinjektovan bez splitovanja. Uslovi rada elektron impakt (EI) detektora su sledeći: jonizacioni potencijal 70 ev, pun maseni sken beležen je u intervalu m/z 35 500 (brzina skeniranja 5 skena/s), vreme skeniranja 0,32 s.procentualni sastav komponenata je određen na osnovu površina pikova, bez korišćenja korekcionih faktora. Hemijski sastav ispitivanih uzoraka određen je upoređivanjem linearnih retencionih indeksa pojedinih sastojaka, izračunatih u odnosu na retenciona vremena C8-C20 i C21-C40 n- alkana [25], sa literaturnim vrednostima, poređenjem masenih spektara sa spektrima jedinjenja iz bibliotekawiley 6, NIST11, Agilent Mass Hunter Workstation B.06.00, Adams[26]. Podaci su obrađeni pomoću AMDIS softvera (Ver. 2.1, DTRA/NIST, 2011) koji je korišćen za dekonvoluciju masenog skena. 25
3.4. PARAMETRI DISK-DIFUZIONE METODE I BAKTERIJSKE KULTURE ZA TESTIRANJE ANTIMIKROBNE AKTIVNOSTI ETARSKOG ULJA BILJNE VRSTE A. SCOPARIA Antimikrobna aktivnost A. scoparia etarskih ulja procenjena je na dve Gram-pozitivne bakterije: Bacillus subtilis(atcc 6633) i Staphilococcus aureus (ATCC 6538) i dve Gramnegativne bakterije: Escherichia coli (ATCC 8739) i Salmonella aboni (NCTC 6017). Antifungalna aktivnost je testirana na Candida albicans (ATCC 10231). Mikrobiološki sojevi pripadali su American Type Culture Collection (ATCC, Gaithersburg, Mariland, SAD), osim S. aboni, koji pripada National Collection of Type Cultures(NCTC, Public Health England, London, Velika Britanija). Korišc ena je metoda disk-difuzije za određivanje antimikrobne aktivnosti etarskog ulja, prema National Committee for Clinical Laboratory Standards [27]. Inokulati bakterijskih i gljivičnih sojeva su pripremljeni iz kultura preko noći, a suspenzije su prilagođene na 0,5 McFarland standardne zamuc enosti. Zapremina od 100 μl suspenzije sadrži 1.0 x 108 CFU/ml bakterije ili 1.0 x 104 CFU/ml gljivičnih spora premazanih na Mueller-Hinton agaru (Torlak, Srbija) ili sabouraud dextrose agaru (Torlak), u sterilisanoj Petrijevoj šolji (dijametar 90 mm), čineći sloj debljine 4 mm.diskovi (dijametar 9 mm, Antibiotica Test Blattchen"-Schleicher i Schull, Dassel, Nemačka) su impregnirani sa 30 μl ulja (koncentracija 50 mg/ml) za bakterijske sojeve i 20 µl (koncentracija 50 mg/ml) za gljivične sojeve, i postavljeni su na inokularni agar. Negativne kontrole su pripremljene pomoc u heksana. Hloramfenikol (30 µg, Torlak), Streptomicin (10 µg, Torlak) i Nistatin (30 µg, Torlak) su korišc eni kao pozitivni standardi. Inokulisane ploče su držane na 4 C tokom 2 sata i inkubirane na 37 C (24 h) za bakterijske sojeve i na 28 C (48 h) za gljivične sojeve. Antimikrobna aktivnost je procenjena merenjem zona (u milimetrima) inhibicije protiv testnih mikroorganizama pomoc u uređaja "Fisher-Lilli Antibiotic Zone Reder" (Fisher Scientific Co. USA).Heksan nije pokazao nikakvu aktivnost na testirane mikroorganizme kod diskova koji su služili kao negativna kontrola.antimikrobna analiza je izvršena u tri ponavljanja i prikazane su srednje vrednosti. 26
4.REZULTATI I DISKUSIJA
4.1. HEMIJSKA ANALIZA ISPITIVANIH UZORAKA 4.1.1. Sadržaj i hemijski sastav etarskog ulja biljne vrste Artemisia scoparia Prinos etarskog ulja, dobijenoghidrodestilacijom nadzemnih delova biljne vrste Artemisia scoparia, koja je bila skladištena u periodu od jedne godineiznosi 0,088%. Prinos(%) = m u 100 = 0,1448 g 100 = 0,088 m d 164 g mu- masa ulja md- masa droge Procenat etarskog ulja je dobijen na osnovu upotrebljene količine ispitivanog biljnog materijala (md=164 g), koji smo hidrodestilovali u aparaturi po Clevenger-u, i dobijene količine etarskog ulja dobijenog nakon procesa hidrodestilacije (mu=0,1448 g). Slika 6. Hromatogram etarskog ulja nadzemnih delova biljne vrste Artemisia scoparia 28
Tabela 2. Sastav (%) etarskog ulja nadzemnih delova biljne vrste Artemisia scoparia Jedinjenja RT RI RIa % Klasa 1. (E)-2-Heksenal 7,44 850 846 0,2 O 2. α-pinen 10,06 934 932 0,1 M 3. Benzaldehid 10,95 960 952 1,1 O 4. Sabinen 11,45 974 969 tr M 5. β-pinen 11,57 977 974 1,4 M 6. Mircen 12,03 990 988 0,5 M 7. α-terpinen 12,98 1017 1014 0,1 M 8. p-cimen 13,26 1025 1020 2,4 M 9. Limonen 13,41 1029 1024 1,3 M 10. 1,8-Cineol 13,51 1032 1026 1,6 MO 11. (Z)-β-Ocimen 13,71 1037 1032 0,8 M 12. Benzen acetaldehid 13,94 1044 1036 tr O 13. (E)-β-Ocimen 14,09 1048 1044 0,1 M 14. γ-terpinen 14,50 1059 1054 0,4 M 15. Acetofenon 14,76 1066 1059 0,3 O 16. Izoterpinolen 15,60 1090 1085 tr M 17. Linalol 15,94 1099 1095 tr MO 18. n-nonanal 16,10 1104 1100 tr O 19. trans-pinen hidrat 16,79 1123 1119 tr MO 20. α-kamfolenal 16,94 1127 1122 tr MO 21. Nopinon 17,36 1139 1135 0,3 MO 22. trans-pinokarveol 17,42 1141 1135 0,3 MO 23. trans-verbenol 17,61 1146 1140 tr MO 24. Pinokarvon 18,26 1165 1160 0,1 MO 25. Lavandulol 18,36 1167 1165 0,8 MO 26. Terpinen-4-ol 18,78 1179 1174 0,3 MO 27. p-cimen-8-ol 19,01 1185 1179 0,1 MO 29