Univerzitet u Nišu Prirodno-matematički fakultet Departman za hemiju GC/MS analiza pesticida: Procena matriks efekta u ekstraktima jabuke na bazi različitih rastvarača - - Mentor: Prof. dr Tatjana Anđelković Student: Marija Stamenković Niš, 2018.
ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА Редни број, РБР: Идентификациони број, ИБР: Тип документације, ТД: Тип записа, ТЗ: Врста рада, ВР: Аутор, АУ: Ментор, МН: монографска текстуални / графички мастер рад Марија Стаменковић Татјана Анђелковић Наслов рада, НР: ГЦ/МС анализа пестицида: Процена матрикс ефекта у екстрактима јабуке на бази Језик публикације, ЈП: различитих растварача српски Језик извода, ЈИ: енглески Земља публиковања, ЗП: Р. Србија Уже географско подручје, Р. Србија УГП: Година, ГО: 2018 Издавач, ИЗ: ауторски репринт Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33. Физички опис рада, ФО: 46 стр. ; 15 слика ; 6 табела (поглавља/страна/ Научна област, НО: Хемија цитата/табела/слика/графика/пр Научна дисциплина, НД: Аналитичка хемија, Хемија животне средине илога) Предметна одредница/кључне речи, ПО: Гасна хроматографија, масена спектрометрија, анализа пестицида, воће, матрикс ефекат УДК 632.95.02 : 634.11 Чува се, ЧУ: Важна напомена, ВН: библиотека
Извод, ИЗ: U GC/MS analizi, jedinstveni odziv analita je presudan za prihvatljive kvantitativne rezultate. U analizi pesticida u složenim matriksima, njihov odgovor je podložan varijaciji zbog brojnih interakcija komponenata matriksa, bilo direktno sa pesticidima ili sa sistemom GC/MS. Tema ovog master rada je analiza ovih interakcija, zvana matriks efekat, nakon ekstrakcije rastvaračima različitih polarnosti. Odziv pirimetanila, trifloksistrobina, bifentrina i boskalida koji se koriste za zaštitu jabuka, je praćen u heksanskom, dihlormetanskom i metiltercbutil etarskom ekstraktu Zlatnog Delišesa. Dobijene vrednosti za matriks efekat se krecu od -57 do 120 %. Jak matriks efekat pokazuje boskalid, a slab pirimetanil. Reproduktivnost rezultata (RSD) je dobra. Prisustvo matriks efekta u analizi GC/MS pesticida je bilo očigledno. Potrebna je bila primena kalibracije u skladu sa matriksom u postupcima kvantifikacije pesticida. Датум прихватања теме, ДП: Датум одбране, ДО: Чланови комисије, КО: Председник: Члан: Члан,ментор :
ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ KEY WORDS DOCUMENTATION Accession number, ANO: Identification number, INO: Document type, DT: Type of record, TR: Contents code, CC: Author, AU: Mentor, MN: Title, TI: monograph textual / graphic university degree thesis Marija Stamenković Tatjana Anđelković GC/MS pesticide analysis: Evaluation of matrix effect in apple extracts based on different solvents Language of text, LT: Serbian Language of abstract, LA: English Country of publication, CP: Republic of Serbia Locality of publication, LP: Serbia Publication year, PY: 2018 Publisher, PB: author s reprint Publication place, PP: Niš, Višegradska 33. Physical description, PD: 46 p. ; 15 pictures; 6 tables (chapters/pages/ref./tables/pictures/gr Scientific field, SF: Chemistry aphs/appendixes) Scientific discipline, SD: Analytical chemistry, Environmental chemistry Subject/Key words, S/KW: UC 632.95.02 : 634.11 Gas chromatography, mass spectrometry, pesticide analysis, fruit, matrix effect Holding data, HD: Note, N: library
Abstract, AB: Accepted by the Scientific Board on, ASB: In the GC / MS analysis, the unique analytical response is crucial for acceptable quantitative results. In the analysis of pesticides in complex matrixes, their response is subject to variation due to numerous interactions of matrix components, either directly with pesticides or with the GC / MS system. The theme of this master's paper is the analysis of these interactions, called the matrix effect, after extraction with solvents of different polarities. The reaction of pyrimethanil, trifloxystrobin, bifenthrin and boscalids used for the protection of apples was monitored in hexane, dichloromethane and methylterebutyl ether extract of Golden Delicious. The values obtained for the matrix effect range from -57 to 120%. The strong matrix effect shows boscalid, and weak pyrimethanil. The reproducibility of the results (RSD) is good. The presence of a matrix effect in the analysis of GC / MS pesticides was apparent. The application of calibration in accordance with the matrix in pesticide quantification procedures was required. Defended on, DE: Defended Board, DB: President: Member Member,Mentor :
Eksperimentalni deo ovog master rada urađen je u istraživačkoj laboratoriji Katedre za Primenjenu hemiju Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu. Ovom prilikom bih iskazala veliku zahvalnost svom mentoru, prof. dr Tatjani Anđelković, na prihvaćenoj saradnji, pomoći oko izbora teme i definisanju njenih okvira. Takođe, zahvaljujem se i dr Darku Anđelkoviću, naučnom saradniku, na stručnoj pomoći, kao i Milici Branković, studentu doktorskih studija, na pomoći, korisnim savetima i uputstvima tokom izrade eksperimentalnog dela master rada. Neizmerno se zahvaljujem i porodci, ocu Ljubi, majci Svetlani i bratu Marku, kao i prijateljima na pruženoj ljubavi, pomoći, podršci i motivaciji tokom studiranja.
Sadržaj 1. Uvod... 1 2. Teorijski deo... 3 2.1. Pesticidi... 4 2.1.1. Usvajanje pesticida od strane biljaka... 5 2.1.2. Štetni efekti primene pesticida... 6 2.2. Zaštita useva jabuke... 8 2.2.1. Bifentrin... 12 2.2.2. Trifloksistrobin... 12 2.2.3.Ciprodinil... 13 2.2.4. Boskalid... 14 2.2.5. Pirimetanil... 15 2.3. Gasna hromatografija sa masenom spektrometrijom... 15 2.3.1. Princip rada... 16 2.3.2. Matriks efekat... 18 3. Eksperimentalni deo... 19 3.1. Pribor i aparatura... 20 3.2. Reagensi... 20 3.3. Uzorci... 21 3.4. Program i metodika eksperimenta... 21 3.5. Eksperimentalni postupak... 21 3.5.1. Priprema rastvora pesticida... 21 3.5.2. Priprema blank ekstrakata jabuke... 22 3.5.3. Postupak evaluacije matriks efekta... 22 3.5.4. Evaluacija prinosa ekstrakcije... 23 3.5.5. GC/MS analiza... 24 4. Rezultati i diskusija... 25
4.1. Profil organskih ekstrakata jabuke... 26 4.2. Matriks efekat... 28 4.3. Prinos ekstrakcije... 30 5. Zaključak... 32 6. Literatura... 34 7. Biografija... 37
Uvod 1. Uvod 1
Uvod Pod pesticidima podrazumevamo proizvode hemijskog ili biološkog porekla koji su namenjeni zaštiti biljaka od korova, bolesti, štetnih insekata, grinja itd. Prvi podaci o korišćenju određenih hemijskih jedinjenja u službi zaštite bilja vezuju se za XVII vek i primenu bakar-sulfata u zaštiti vinograda od truleži. Danas imaju široku primenu, kada je reč o sprečavanju širenja korova i drugih nepoželjih vrsta, kao i širenju bolesti. Pored dominantne primene u poljoprivredi (90%), pesticidi se primenjuju i u šumarstvu i drvnoj industriji, industriji prehrambenih tehnologija, veterini i komunalnoj higijeni. Treba imati u vidu i da svako korišćenje pesticida sa sobom nosi negativne posledice na ekosistem u kome se primenjuje kao i na okolne ekosisteme. Šteta može biti i ekonomskog tipa kao što je smanjenje prinosa useva ili količine/kvaliteta dobijene hrane, što dalje utiče na industrijsku proizvodnju hrane. Ono čemu se teži je smanjenje upotrebe pesticida. Za zaštitu useva jabuke se najčešće koriste sredstva iz klase insekticida i fungicida. Pošto je jabuka jedno od najrasprostranjenijih voća, koje se opsežno konzumira i na tržištu se može naći tokom čitave godine, od značaja je stalna kontrola ostataka pesticida u ovom voću. Jedna od vrlo čestih instrumentalnih tehnika određivanja ostataka pesticida je gasna hromatografija sa masenom spektrometrijom (GC/MS). Putem ove instrumentalne tehnike se može odrediti i do 200 različitih pesticida, srednje polarnosti i malih i srednjih molekulskih masa. Jedan od koraka u analizi ostataka pesticida u jabukama je ekstrakcija pesticida iz matriksa. Cilj ovog master rada je evaluacija matriks efekta u GC/MS analizi prilikom ekstrakcije pesticida iz jabuke rastvaračima različite polarnosti. 2
Teorijski deo 2. Teorijski deo 3
Teorijski deo 2.1. Pesticidi U današnje vreme upotreba pesticida na usevima u cilju zaštite biljaka od štetočina je nužnost, uslovljena potrebom za očuvanjem prinosa. Do 2014. godine, u Srbiji je registrovano 413 aktivnih supstanci u vidu 986 preparata, za primenu na semenu, zemljištu, nadzemnim delovima biljaka, plodovima ili na drugi način. Komercijalni pesticidi sadrže i aktivne i inertne (neaktivne) supstance. Aktivne supstance imaju ulogu da spreče, unište, odbiju štetočinu ili ublaže njeno dejstvo ili su biljni regulatori, stabilizatori azota. Ostale supstance se nazivaju neaktivnim, one određuju osobine i upotrebljivost proizvoda [1]. Aktivni sastojci su hemikalije koje služe za kontrolu štetočina i njihovog dejstva. Moraju biti navedeni po imenu na etiketi proizvoda pesticida zajedno sa procentom po težini. Postoji nekoliko kategorija aktivnih sastojaka: Konvencionalni, sastojci bioloških pesticida i antimikrobnih pesticida; Antimikrobna sredstva, supstance ili smeše supstanci koje se koriste za uništavanje ili suzbijanje rasta štetnih mikroorganizama bilo bakterija, virusa ili gljiva; Biopesticidi, vrste sastojaka dobijenih od određenih prirodnih materijala. [2] Inertni sastojci su hemikalije, jedinjenja i druge supstance, uključujući i prehrambene proizvode kao što su jestiva ulja, začini, lekovito bilje i neki prirodni materijali (pčelinji vosak, celuloza). To što se nazivaju inertnim ne znači da nisu toksični sastojci. Svi inertni sastojci moraju biti odobreni od strane EPA (Environmental Protection Agency) pre nego što se uključe u pesticid. Veoma je bitna tolerancija za svaki sastojak koji se primenjuje u ishrani ljudi ili životinja. Inertni sastojci igraju ključnu ulogu u efikasnosti pesticida i performansama proizvoda. Primeri funkcija: neki sastojak može delovati kao rastvarač koji pomaže aktivnom sastojku da prodre na površinu lista biljke, poboljšava jednostavnost nanošenja, produžava rok trajanja, štiti pesticid od degradacije zbog dejstva svetlosti. Inertni sastojci ne moraju biti navedeni po imenu na etiketi, dovoljno je da se navede samo procenat svih inertnih sastojaka [2]. 4
Teorijski deo Pesticidi se prema nameni mogu podeliti u nekoliko klasa: Akaricidi - sredstva za suzbijanje štetnih grinja Fungicidi - sredstva za suzbijanje gljiva Herbicidi - sredstva za suzbijanje korova Insekticidi - sredstva za suzbijanje štetnih insekata Limacidi - sredstva za suzbijanje puževa Nematocidi - sredstva za suzbijanje štetnih nematoda Rodenticidi - sredstva za suzbijanje štetnih glodara Repelenti - sredstva za odbijanje divlači Regulatori rasta - sredstva za regulaciju rasta biljaka Okvašivači - sredstva za poboljšavanje kvašljivosti i lepljivosti 2.1.1. Usvajanje pesticida od strane biljaka Da bi pesticidi ispoljili svoje delovanje na biljke, ali i na patogene koji se nalaze u biljci, moraju doći u kontakt sa živim ćelijama biljke. Nakon apsorpcije pesticidi se prenose do mesta delovanja. Apsorpcija pesticida se može odvijati preko korena, stabla i lista, a translokacija može biti na kratka rastojanja i na duga rastojanja. U mnogim slučajevima samo mala količina primenjenih pesticida stiže do mesta delovanja. Nekada je pri određenim uslovima onemogućena maksimalna apsorpcija i translokacija pesticida i zato su neke biljke tolerantne na određene pesticide. Tolerancija je fenomen prilagođavanja izmenjenim uslovima sredine. Propustljivost za molekule pesticida zavisi od više faktora: vrste pesticida, temperature, stanja ćelije, prisustva elektrolita, ph, a kada se apsorpcija vrši preko korenovog sistema, onda zavisi i od sadržaja vode u zemljištu, koncentracije i sastava zemljišnog rastvora, aeracije itd. [3] Postoji veliki broj primera tolerancije jedne vrste i osetljivosti druge vrste kao rezultat različite apsorpcije i translokacije. Razlike u karakteristikama klijanja i nicanja, morfološke razlike korena i stabla, debljina kotikule i druge karakteristike biljaka su osnova za apsorpciju i toleranciju, kao i osetljivost. Ako se pesticid primarno apsorbuje korenom onda selektivnost može biti rezultat razlika u masi korenovog sistema gajenih i korovskih biljaka. Seme jednogodišnjih korovskih biljaka se nalazi na samoj površini i za vreme klijanja i odmah posle toga korenov sistem će biti u 5
Teorijski deo kontaktu sa pesticidom koji je takođe na površini. Dužina korenovog sistema je takođe značajan selektivni mehanizam za mnoge višegodišnje drvenaste biljke. Takođe, postoji razlika u apsorpciji kod travnih i širokolisnih vrsta. Za primenu pesticida, posle nicanja biljaka količina koja se apsorbuje zavisi od površine preko koje se vrši apsorpcija. Apsorpcija zavisi od površinskog napona tečnosti, površine lista, orijentacije lista, veličine kapi, zapremine tečnosti, folijarnih karakteristika [3]. Načini delovanja su povezani sa inhibicijom ili stimulacijom važnih reakcija koje se odvijaju na svojim primarnim lokacijama. Inhibicija, bila kompetativna ili nekompetativna, zavisi od koncentracije pesticida [3]. 2.1.2. Štetni efekti primene pesticida Upotreba pesticida pokreće niz ekoloških problema. Preko 98% prskanih insekticida i 95% herbicida postiže odredište koje nije ciljna vrsta, uključujući i neciljne vrste, vazduh, vodu i tlo. Padanje pesticida se javlja kada su pesticidi suspendovani u vazduhu dok se čestice prenose vetrom drugim područjima i potencijalno ih zagađuju. Pesticidi su jedan od uzroka zagađenja vode, a neki pesticidi su organski zagađivači i doprinose kontaminaciji zemljišta [4]. Da bi se smanjili negativni uticaji, poželjno je da pesticidi budu razgradivi ili barem brzo deaktivirani u okruženju. Takav gubitak aktivnosti ili toksičnost pesticida dolazi zbog urođenih hemijskih osobina jedinjenja i okolnih procesa ili uslova. Na primer, prisustvo halogena unutar hemijske strukture često usporava degradaciju u aerobnom okruženju. Adsorpcija u zemljište može da zadrži kretanje pesticida, ali takođe može smanjiti bioraspoloživost mikrobioloških degradera [4]. Postoje i alternative pesticidima i obuhvataju metode kultivacije, korišćenje bioloških kontrola štetočina (kao što su fermoni i mikrobni pesticidi), genetski inženjering itd. Primena komunalnog otpada u dvorištu se takođe koristi kao način kontrole štetočina. Praksa kultivacije obuhvata polikulturu, sadnju useva gde štetočine koje bi ih oštetile ne žive i upotreba zamki za štetočine. Oslobađanje drugih organizama koji se bore protiv štetočina predstavlja još jedan primer alternative [5]. 6
Teorijski deo Poslednjih decenija, a u skladu sa širenjem organske proizvodnje i očuvanjem životne sredine razvila se posebna grupa biopesticida. Biopesticidi su određeni tipovi pesticida koji su dobijeni iz prirodnih materijala kao što su mikroorganizmi (gljive, bakterije, virusi), biljnog (ekstrakti iz biljaka) i životinjskog sveta (nematode) i nekih minerala. Osnovne karakteristike biopesticida su da su manje toksični, odnosno nisu toksični za čoveka, aktivni su samo prema ciljanom štetnom organizmu i efikasni su u malim količinama te se brzo razgrađuju i nemaju rezidualno delovanje i za sada nije utvrđena rezistentnost ciljanih štetnih organizama prema njima [5]. Biopesticidi nisu savršeni, za delovanje im je potrebno više vremena i slabija im je perzistentnost (kraće delovanje), pa se kao prioritet stavlja njihovo unapređenje i usavršavanje kao mogućim zamenama konvencionalnim pesticidima [5]. Prateći problem su štetni efekti pesticida na ljudsko zdravlje, počevši od iritacije očiju i kože do ozbiljnijih efekata kao što je uticaj na nervni sistem, uticaj na hormone i izazivanje problema sa reprodukcijom kao i uzrokovanje raka, koji zavise od vrste pesticida. Neki pesticidi, kao što su organofosfatni i karbamatni, utiču na nervni sistem. Drugi mogu iritirati kožu ili oči. Pesticidi mogu izazvati akutne zdravstvene probleme, kao i one koji se ispoljavaju kasnije, kod ljudi koji su izloženi istim [6]. Značajan izvor unošenja pesticida je putem hrane. Ostaci pesticida odnosi se na pesticide koji mogu ostati na hrani ili u hrani nakon primene. Maksimalno dozvoljeni nivoi ovih ostataka u hranama često propisuju regulatorna tela u mnogim zemljama. Propisi kao što su intervali pred žetvom takođe često sprečavaju žetvu useva ili stočnih proizvoda ako se nedavno tretiraju da bi se omogućilo smanjenje koncentracije ostataka tokom vremena na sigurne nivoe pre žetve. Izlaganje opšte populacije ovim rezidualima najčešće se javlja putem konzumiranja tretiranih izvora hrane ili u bliskom kontaktu sa područjima tretiranim pesticidima kao što su farme ili travnjaci. Mnogi od ovih hemijskih ostataka, posebno derivata hlorisanih pesticida, pokazuju bioakumulaciju koja može da se poveća na štetne nivoe u organizmu i okolini. Postojeće koncentracije pesticida se mogu uvećati kroz lanac ishrane i otkrivene su u proizvodima od mesa, živine i ribe, do biljnih ulja, oraha i raznog voća i povrća. Jabuke su među voćem sa najvećom detektovanom količinom ostatka pesticida [5]. 7
Teorijski deo 2.2. Zaštita useva jabuke Postoje razne bolesti koje se javljaju kod jabuke, neke na listu, neke na plodu. Najčešće bolesti do čije pojave dolazi su: Alternarijska lisna pegavost jabuke - U početku se na zaraženom lišću uočavaju sitne, ovalne pege, ljubičaste do crne boje, veličine 1,5-5 mm u prečniku, sa obodom ljubičasto-smeđe boje. Sa napretkom oboljenja može doći do spajanja pega ili do njihovog uvećanja kada poprimaju nepravilan oblik ili izgled žabljeg oka. Ukoliko se pege jave na peteljci lišća, lišće žuti i javlja se defolijacija, i to ponekad i preko 50%. U uslovima intenzivne defolijacije dolazi do prevremenog opadanja plodova. Alternarijska pegavost lišća se javlja uglavnom na sortama iz grupe Delišesa ali je ne treba mešati sa pegama koje nastaju nepravilnom primenom kaptana (kaptanove pege), crnim rakom jabuke (simptomi na lišću) ili sa nekrotičnom pegavošću lišća koja se javlja na Zlatnom Delišesu. Kaptanove pege na lišću javljaju se kada se preparati na bazi kaptana primenjuju u uslovima vlažnog vremena. U uslovima velikih oscilacija zemljišne vlage tokom jula i avgusta na lišću sorte Zlatni Delišes javljaju se nekritične pege kao posledica fiziološkog stresa biljaka. Primarne zaraze se obično dešavaju u toku precvetavanja i prvog opadanja plodova. Bolest se brže razvija u uslovima vlažnog vremena, pri temperaturama od 25-30 C. Do infekcije dolazi kada su prisutne optimalne temperature i vlaženje lišća u trajanju od 5,5 sati, a prve pege se mogu uočiti dva dana nakon infekcije. Patogen proizvodi specifičan toksin koji pospešuje intenzitet zaraze i razvoj oboljenja na osetljivim sortama [7]. Slika 1. Prikaz alternarijske lisne pegavosti kod jabuke 8
Teorijski deo Pepelnica jabuke - Napada list, cvet i plodove jabuke. Razvija se na svim zelenim delovima stvarajući karakterističnu brašnastu belosivu navlaku. Prema simptomima, oboljenje se manifestuje na dva različita načina: o beli mladari - razvijeni iz zaraženih pupoljaka, potpuno pokriveni belom navlakom, su proizvod primarnih infekcija. o pojedinačno zaraženo lišće tokom vegetacije su posledice sekundarnih infekcija. Zaraženi cvet se deformiše, zadeblja i na njemu se formira karakteristična belosivkasta navlaka. Na plodu je zaraza manje vidljiva. Na pokožici ploda se stvara tanka rđasta mrežica utisnuta u epidermis. U toku proleća dolazi do razvitka infekcije. Da bi se ostvarile infekcije nije potrebna voda, dovoljno je da relativna vlaga vazduha bude viša od 60%. Optimalne temperature su od 15 C do 25 C. Mlad list je osetljiv na infekcije, ali za vreme vegetacije dolazi do zaraze pupoljka, dok su otvoreni [7]. Slika 2. Prikaz bolesti Pepelnica jabuke Zelena plesan jabuke - Najčešće se javlja na uskladištenim plodovima. Ovo oboljenje prouzrokuje gljiva Penicilium expansum. Početni simptomi se manifestuju u vidu pega, svetlo braon boje. Zaraženo tkivo je meko, vodenaste strukture i ima karakterističan miris i ukus. U uslovima visoke relativne vlažnosti na površini zaraženog dela ploda pojavljuje 9
Teorijski deo se masa spora patogena sivo-plave boje. Najčešće se javlja kod prezrelih plodova ili plodova izloženih stresu (prekomerno navodnjavanje). Na sobnoj temperaturi, zaraženi plod može da propadne za dve nedelje [7]. Slika 3. Izgled zelene plesni kod jabuke Čađava krastavost - Ova bolest napada list, cvet i plodove. Infekcije lista nastaju čim se mlado lišće pojavi iz pupoljka. Svetlo smeđe i maslinasto mrke pege se pojavljuju na listu i na lisnim drškama. Mlado zaraženo lišće opada, a kod starijeg pege poprimaju zagasitiju boju. Cvet može da bude zaražen jos u ranoj fazi otvaranja cvetnog pupoljka, nakon toga potamni, osuši se i otpadne. Razvitak bolesti se odigrava na proleće [7]. Slika 4. Izgled bolesti Čađava krastavost kod jabuke Pored ovih bolesti, javljaju se i bakteriozna plamenjača, crna pegavost, gorka trulež itd. Prilikom proizvodnje jabuka se koriste pesticidi kao i kokteli pesticida, zbog toga su i jabuke među voćem sa najvećom detektovanom količinom ostatka pesticida. Najmanje 70% utvrđenih i korišćenih pesticida predstavlja visoku toksičnost po ljudsko zdravlje i zdravlje životinja. Kada je reč o tlu, najčešće se pronalazi boskalid i DDT koji je zabranjen. U vodi su najčešći boskalid i hlorantraniliprol. 10
Teorijski deo Za zaštitu useva jabuke, najčešće upotrebljivani pesticidi, sa pratećim komercijalnim preparatom su: Boskalid (Signum, Emerald)- spada u karboksamide, jedna od karakteristika jeste da ima nisku pokretljivost u tlu. Bifentrin (Talstar) - kontaktni i digestivni insekticid. Deluje na centralni nervni sistem. Pirimetanil (Botrystock) - je nesistematik i spada u grupu anilinpirimidina. Učestvuje u sintezi metionina. Ciprodinil (Cormax) - pripada grupi anilinpirimidinima, deluje protektivno i kurativno. Slabo se ispira i dospeva u biljke preko lišća. Trifloksistrobin (ZATO) - deluje preventivno i kurativno. Spada u strobulirine, čija je jedna od karakteristika da ne isparavaju sa površine jer imaju nizak napon pare. Hlorpirifos (Dursban, Lorsban), organofosfatni insekticid. Često se primenjuje i na kukuruz. Može dovesti do oštećenja nervnog sistema. Kaptan (Kricaptan) se koristi na jabukama kao fungicid. Primenjuje se tokom rasta kako bi se sprečile gljivice. Negativni efekat primene ovog pesticida jeste konjuktivitis i dermatitis kada se unese u malim količinama, gastrointestinalni stres u većim količinama. Postoje i mnogi drugi pesticidi koji se koriste prilikom proizvodnje jabuka. Koriste se i proizvodi spinosada protiv štetočina, kada je uzgoj jabuka u pitanju, prihvatljivi su u organskom vrtlarstvu. Insekticidni sapun koji se takođe koristi protiv štetočina, nije prihvatljiv u organskom vrtlarstvu [5]. Tabela 1. Osobine ispitivanih pesticida Naziv pesticida Komercijalni preparat Tip pesticida Molarna masa (g/mol) Hemijska formula MDK ( g/g) Retenciono vreme (min) Fragmenti (m/z) Bifentrin Talstar Insekticid 422,87 C 23H 22ClF 3O 2 0,3 17,28 165, 166, 181 Trifloksistrobin ZATO Fungicid 408,37 C 20H 19F 3N 2O 4 0,5 15,66 116, 131, 145 Ciprodinil Cormax Fungicid 225,29 C 14H 15N 3 1 12,43 224 Boskalid Signum Fungicid 343,21 C 18H 12Cl 2N 2O 2 21,97 140 Pirimetanil Botrystock Fungicid 199,26 C 12H 13N 3 5 10,27 198 11
Teorijski deo 2.2.1. Bifentrin Bifentrin je kontaktni i digestivni insekticid iz grupe piretroida. Kao i ostali insekticidi iz ove grupe i ovo jedinjenje deluje na centralni i periferni nervni sistem insekata izazivajući na taj način poremećaje u protoku nervnih impulsa i paralizu. Početni simptomi veoma brzo nastupaju i insekt je već nakon par minuta onesposobljen za kretanje i letenje. Ovaj efekat se naziva T-sindrom trovanja i karakterističan je samo za piretroide, po čemu se i razlikuju od ostalih insekticida. Treba imati u vidu i da ne dolazi do smrti, zbog toga što se piretroidi veoma brzo razgrađuju, kod jednog broja insekata dolazi do preživljavanja. Zbog toga se u kombinaciji sa piretroidima koriste i organofosfati ili karbamati, u cilju sigurnijeg uništenja insekata [3]. S obzirom da spada u treću generaciju sintetičkih piretroida, bifentrin poseduje dobru fotostabilnost i dužu perzistentnost. Slabo je rastvorljiv u vodi i ostaje u tlu. Poluživot u zemljištu je između 7 dana i 8 meseci, u zavisnosti od vrste tla, uz nisku pokretljivost. Bifentrin je bela, voskasta supstanca sa slatkim mirisom. Hemijski se sintetiše u vidu granula, praha i paleta, a u prirodi se ne pojavljuje [8]. Slika 5. Hemijska struktura bifentrina 2.2.2. Trifloksistrobin Trifloksistrobin je prema hemijskoj klasifikaciji organski sistemični fungicid iz grupe strobulirina, koji deluje i preventivno i kurativno. Razlika između sistemičnih i nesistemičnih fungicida je ta što sistemični fungicidi naneti na biljku, jednim delom funkcionišu kao površinski ili kontaktni fungicidi, a veći deo biva usvojen od površinskih ćelija lista i prenet u druge delove biljke. To im daje izvesnu prednost i učestalost u upotrebi, pogotovu u kišnim krajevima [9]. 12
Teorijski deo S obzirom na veoma nizak napon pare, strobilurini ne isparavaju sa lista. Spiranje sa lišća se teško može desiti, budući da imaju vrlo malu rastvorljivost u vodi. Iako se vezuju za zemljišne čestice, ipak se određeni mali procenat ispira, ali ne ide dublje od 15cm, tako da nema opasnosti od zagađenja podzemnih voda. Trifloksistrobin fungicidna svojstva ispoljava inhibicijom ćelijskog disanja, blokiranjem prenosa elektrona u mitohondrijama ćelija izazivača bolesti. Koristi se u zasadu jabuke, od faze mišijih ušiju pa do faze kada su plodovi veličine 40 mm i to za suzbijanje izazivača: čađave pegavosti lista i krastavosti plodova jabuka (Venturia inaequalis); pepelnice (Podosphaera leucotricha), truleži na uskladištenim plodovima (Penicillium spp., Gleosporium spp., Monilia spp.) Slika 6. Hemijska struktura trifloksistrobina 2.2.3.Ciprodinil Ciprodnil pripada grupi anilin-pirimidinima. Oni slabo isparavaju i slabo se ispiraju. Ciprodinil je sistematik, deluje protektivno i kurativno i dospeva u biljke preko lišća. Transportuje se kroz biljke ksilemom. Deluje tako što inhibira biosintezu metionina, što sprečava obrazovanje proteina i deobu ćelija kod fitopatogenih gljiva. Ne sme se mešati sa insekticidima izrazito kisele reakcije. Deluje i na niskim temperaturama [9]. Ciprodinil predstavlja veoma mali rizik po ljudsko zdravlje. Zbog niske doze koja se upotrebljava, predstavlja nizak rizik za podzemne vode. Prilikom testiranja mutagenosti, utvrđeno je da najverovatnije on neće izazvati rak ili uzrokovati nasledne genetske defekte. Nije toksičan. Najčešće se koristi u smešama sa fludioksonilom, propiokonazolom i difekonazolom. Sprečava pojavu sive truleži kod jabuka, a primenjuje se pre berbe, najkasnije 3 dana pre iste. Koristi se i za suzbijanje prouzrokovača čađave pegavosti lista i krastavosti ploda (Venturia inequalis). 13
Teorijski deo Primenjuje se od faze otvaranja prvih lisnih pupoljaka, pa do završetka cvetanja, uz interval između dva tretiranja od 7 do 10 dana[8]. Slika 7. Hemijska struktura ciprodinila 2.2.4. Boskalid Boskalid je fungicidna klasa karboksamida. Postoje različiti mehanizmi delovanja ove grupe fungicida, ali svaki ima za rezultat inhibiciju rasta stabla i/ili korena. Boskalid ima nisku pokretljivost u tlu ali može da se prenese i na površinske vode. Nije utvrđena njegova kancerogenost. Nije toksičan za kopnene životinje i umereno je otrovan za vodeni živi svet. Što se tiče algi, utvrđeno je korišćenjem različitih koncentracija boskalida, da je rast algi i sadržaj hlorofila i karotenoida značajno inhibiran boskalidom. Može uticati na proces fotosinteze [3]. Kod jabuka sprečava pojavu najčešćih bolesti, a to su čađava krastavost i pepelnica. Može se primenjivati u toku hladnijeg i vlažnijeg vremena do 35 dana pre berbe. Najbolji periodi za primenu su oko roze pupoljka i početka cvetanja, kao i po završenom cvetanju - u periodu primarnih zaraza i najkritičnijem periodu za zaštitu jabuke od čađave krastavosti i pepelnice [9]. Slika 8. Hemijska struktura boskalida 14
Teorijski deo 2.2.5. Pirimetanil Pirimetanil pripada grupi anilin-pirimidinima. Spada u nesistematike. Sprečava formiranje haustorija patogena i izlučivanje enzima koji imaju ulogu u izgradnji ćelijskog zida (pektinaze, kutinaze, laktaze itd.). Na biohemijskom nivou ciljno mesto fungicida je sinteza metionina. Na taj način utiče na formiranje proteina i naknadnu podelu ćelija. Pirimetanil najbolje deluje kada su u pitanju mlade gljivice. Najčešće se koristi u smeši sa hlortalonilom i fluvikonazolom. Nije kancerogen. Sprečava pojavu čađave pegavosti lišća i krastavost plodova (Venturia inequalis). Primenjuje se tokom listanja, cvetanja i formiranja plodova, a može se koristiti i u drugom delu vegetacije [8][9]. Slika 9. Hemijska struktura pirimetanila 2.3. Gasna hromatografija sa masenom spektrometrijom Gasna hromatografija sa masenom spektrometrijom (GC/MS) je instrumentalna tehnika koja kombinuje osobine gasno-tečne hromatografije i masene spektrometrije kako bi identifikovala različite supstance u nekom uzorku. Ova tehnika se primenjuje za detekciju lekova, ispitivanje uzoraka iz životne sredine kao i praćenje organskih polutanata, za identifikaciju nepoznatih uzoraka, u forenzičkoj analizi, detekciji narkotika ili u hemijskom inženjeringu. Kompleksne smeše se mogu veoma lako razdvojiti gasnom hromatografijom, a masena spektrometrija se koristi za identifikaciju individualnih komponenata jer maseni spektar daje informacije o njihovoj strukturi. Pojedinačne komponente smeše se pojavljuju na gasnom hromatogramu u vidu zasebnih pikova. Retenciono vreme može poslužiti kao veličina za kvalitativno definisanje ali ovo nije pouzdan način, pa se nikako ne sme koristiti za određivanje sastava nepoznatih i ranije neidentifikovanih jedinjenja [10]. 15
Teorijski deo 2.3.1. Princip rada Instrument se sastoji iz dva dela: gasnog hromatografa, koji služi za međusobno razdvajanje komponenti (analita i drugih prisutnih supstanci) i masenog spektrometra koji omogućava identifikaciju i kvantifikaciju analita. Celokupni sistem se može podeliti u nekoliko segmenata: noseći gas; hromatograf (sistem za uvođenje analita na kolonu hromatografa, kolona hromatografa); maseni spektrometar (jonski izvor, maseni analizator); detektor. Slika 10. Šematski prikaz instrumenatalne tehnike Pripremljeni uzorak, najčešće u tečnom stanju, se uz pomoć šprica unosi u injektor aparata, koji je zagrejan na visoku temperaturu, pri čemu dolazi do isparavanja uzorka (analita i rastvarača). Pare uzorka se uz pomoć nosećeg gasa (helijum, azot) odvode do kolone (takođe zagrejana) gde se vrši razdvajanje. Princip razdvajanja analita je njihova različita raspodela između tečne stacionarne faze (kolone) i nosećeg gasa (mobilne faze). Brzina kojom jedinjenje prolazi kolonu zavisi od više faktora, a karakteriše se veličinom koja se naziva retenciono vreme (vreme koje protekne od unošenja analita na kolonu, do njegovog izlaženja sa kolone). Sa kolone analit ulazi u jonski izvor (segment gde se stvaraju joni uzorka, koji se kasnije analiziraju masenim analizatorom). Načini jonizacije uzorka su različiti (elektronska, hemijska jonizacija...). 16
Teorijski deo Nastali joni se usmeravaju u maseni analizator, koji razdvaja jone prema odnosu mase i naelektrisanja jona (m/z). Kao i načina jonizacije i analizatora je mnogo: single/triple quadrupole, time of flight analizator, sektorski analizator itd. Nakon razdvajanja joni se usmeravaju na detektor, proizvodeći različit signal u zavisnosti od zastupljenosti, koji se beleži i softverski obrađuje [10][11]. Slika 11. Agilent HP 6890/MSD 5973 gasni hromatograf sa masenom detekcijom na kome je rađen master rad Tabela 2. Karakteristike Agilent HP 6890/MSD 5973 instrumenta Noseći gas Tip kolone Način jonizacije Maseni analizator Detektor Helijum 1,4-bis(dimetilsiloksi)fenilen dimetil polisiloksan * [DB-5ms] ** Jonizacija visoko-energetskim elektronima (EI) Single quadrupole Elektronski multiplikator * visoko porozni inertni prah, na bazi silicijum oksida (čvrsta faza). Sa impregniranim tankim slojem teško isparljivog tečnog polimera (tečna stacionarna faza) čini kolonu; ** Komercijalna (Agilent) oznaka kolone 17
Teorijski deo 2.3.2. Matriks efekat U analizi kompleksnih uzoraka su ekstrakti identifikovani kao veoma važni u uticaju na jonizaciju analita i odziv detektora, koji mogu biti podložni promenama. Ove promene zvane "matriks efekat" mogu biti pozitivne, kada dolazi do povećanja signala ili negativne, kada se javlja supresija hromatografskog signala. Takođe, ovi efekti proizilaze iz interferencije analita i komponenti matriksa u injektoru, detektoru ili hromatografskoj koloni (Hajslova i Zrostlikova 2003). Na primer, kada se standardni rastvori pripremljeni u čistom rastvaraču analiziraju gasnom hromatografijom, smanjena količina analita se prenosi u kolonu i naknadno detektuje jer se analiti mogu vezati za aktivna mesta injektora, dok u analizi standarda pripremljenih u matriksu, ekstrakti se "takmiče" sa analitima za ta mesta, uzrokujući veću količinu analita prenetu na kolonu nego u prethodnom slučaju (De Sousa et al., 2012.). Obim matriks efekta zavisi od nekoliko faktora kao što su vrsta matriksa, način prečišćavanja uzorka ili tip hromatografske kolone (Silvestro, Tarcomnicu i Savu 2013). Da bi se smanjio efekat matriksa, primenjuje se mnogo različitih procedura, kao što su modifikacije procedura prečišćavanja, dodavanje internih standarda, kalibracija u matriksu, dodavanje zaštite analita ili faktora korekcije kalibracije (De Sousa i sar., 2012). U GC/MS analizi ostataka pesticida, na kvantitativne rezultate negativno utiče matriks efekat. Iako se priprema standarda u matriksu smatra jednom od najefikasnijih rešenja za ovaj problem, potpuno uklanjanje matriks efekta je teško u složenim uzorcima, kao što je voće. Kao rezultat, matriks efekti mogu predstaviti analitičke greškе. 18
Eksperimentalni deo 3. Eksperimentalni deo 19
Eksperimentalni deo 3.1. Pribor i aparatura U toku eksperimentalnog rada korišćeni su sledeći pribor i aparatura: 1. Analitička vaga, KERN 2. Centrifuga, ThermoScientific 3. Blender, TEFAL 4. Čase od 100 ml 5. Erlenmajeri od 250 ml 6. Stakleni štapić 7. Kašičica 8. Nož 9. Automatske pipete (100 µl, 1000 µl, 5000µL) 10. Avan sa tučkom 11. Plastične epruvete sa zatvaračem 12. Menzura 13. Viale od 1.5 ml 3.2. Reagensi U toku eksperimentalnog rada korišćeni su sledeći reagensi: 1. Heksan, Fisher 2. Dihlormetan, CarloErba 3. Metil-tercbutil etar, Fisher 4. Etanol, CarloErba 5. Etil-acetat, CarloErba 6. Anhidrovani magnezijum-sulfat, Zorka Šabac 7. Hinolin 8. Bifentrin (Talstar, Galenika Fitofarmacija) 9. Trifloksistrobin (ZATO, Bayer) 10. Ciprodinil (Cormax, Agromarket) 11. Boskalid (Signum, BASF) 20
Eksperimentalni deo 12. Pirimetanil (Botrystock, Stockton USA) 3.3. Uzorci Jabuke sorte Zlatni Delišes su kupljene na Zelenoj pijaci. Preliminarna screening analiza je pokazala da jabuke ne sadrže testirane pesticide. 3.4. Program i metodika eksperimenta Predmet ovog diplomskog rada je procena matriks efekta u GC/MS analizi ostataka pesticida u jabukama. Osnova pripreme uzorka za analizu je ekstrakcija rastvaračem. Primenjene su tri različite metode: ekstrakcija pesticida heksanom, ekstrakcija dihlormetanom (DCM) i ekstrakcija metil-tercbutil etrom (MTBE). Kao rezultat, izvršena je evaluacija matriks efekta i evaluacija prinosa ekstrakcije pesticida za tri metode. Program eksperimentalnog dela master rada se sastojao iz sledećih faza: Priprema radnih rastvora pesticida i rastvora internog standarda Priprema blank ekstrakata jabuke, na bazi tri rastvarača Konstrukcija kalibracionih krivi i evaluacija matriks efekta Evaluacija prinosa ekstrakcije za tri metode 3.5. Eksperimentalni postupak 3.5.1. Priprema rastvora pesticida Početni rastvori pojedinačnih pesticida su napravljeni rastvaranjem određene mase/zapremine komercijalnih pesticida u odgovarajućem rastvaraču sa rezultujućom koncentracijom pesticida od 1000 g/ml. U eksperimentima je korišćen rastvor smeše ispitivanih pesticida, dobijen mešanjem odgovarajuće zapremine početnih rastvora pojedinačnih pesticida, u finalnoj koncentraciji od 100 g/ml u heksanu. Daljim razblaživanjem ovog rastvora heksanom napravljeni su rastvori potrebni za konstrukciju kalibracionih krivi, u sledećim koncentracijama: 0,1; 0,25; 0,5; 1; 2,5; 5; 10; 25 i 50 g/ml. 21
Eksperimentalni deo Kao interni standard korišćen je hinolin. Od postojećeg rastvora hinolina u etanolu, koncentracije 1000 g/ml, napravljen je radni rastvor hinolina u heksanu u koncentraciji 10 g/ml. 3.5.2. Priprema blank ekstrakata jabuke 200 g uzorka, dobijenog od nekoliko plodova jabuke je usitnjeno u blenderu. 15 g dobijene kaše je odmereno i prebačeno u tri erlenmajera. Zatim je u jedan erlenmajer dodato 15 ml heksana, u drugi 15 ml dihlormetana, u treći 15 ml metil-tercbutil etra. Vršena je ekstrakcija mućkanjem u trajanju od 15 minuta. Tečna faza (organski ekstrakti jabuke) je odvojena od čvrste centrifugiranjem, 10 minuta na 3500 obrtaja u minuti. Organski ekstrakti na bazi dihlormetana i metil-tercbutil etra su sušeni anhidrovanim magnezijum-sulfatom. Magnezijum-sulfat je odvojen centrifugiranjem, 5 minuta na 3000 obrtaja u minuti. 3.5.3. Postupak evaluacije matriks efekta Kalibracione krive su konstruisane pravljenjem standardnih serija pesticida u sledećim koncentracjama: 0,01; 0,025; 0,05; 0,1; 0,25; 0,5; 1; 2,5 i 5 g/ml, odmeravanjem: 1. 100 l odgovarajućeg rastvora pesticida, 100 L radnog rastvora internog standarda i 800 l čistog rastvarača (kalibracione na bazi čistih rastvarača); 2. 100 l odgovarajućeg rastvora pesticida, 100 L radnog rastvora internog standarda i 800 l organskog ekstrakta jabuke (kalibracione na bazi matriksa). Matriks efekat je izračunat pomoću odnosa nagiba kalibracione krive dobijene razblaživanjem standarda u organskim ekstraktima (S1) i nagiba krive dobijene u čistom rastvaraču (S2), koristeći sledeću jednačinu (1): Ako je dobijeni procenat pozitivan, to označava poboljšanje signala, a ako je negativan to označava supresiju signala. U zavisnosti od vrednosti ovog procenta, matriks efekti se mogu klasifikovati u različite kategorije. Procenti između -20% i 20% ne ukazuje na matriks efekat, jer 22
Eksperimentalni deo ulaze u opseg vrednosti relativne standardne devijacije. Vrednosti između -50% i -20% ili između 20% i 50% ukazuju na srednji matriks efekat, a ispod -50% ili iznad +50% na jak matriks efekat. 3.5.4. Evaluacija prinosa ekstrakcije Procena prinosa ekstrakcije je vršena za ekstrakciju pesticida sa tri rastvarača, u oblasti maksimalno dozvoljenih koncentracija (MDK) ostataka pesticida u prehrambenim proizvodima. Prema pravilniku Ministarstva poljoprivrede, šumarstva i vodoprivrede Republike Srbije (Pravilnik o maksimalno dozvoljenim količinama ostataka sredstava za zaštitu bilja u hrani i hrani za životinje i o hrani za životinje za koju se utvrđujz maksimalno dozvoljene količine ostataka sredstava za zaštitu bilja) MDK za bifentrin je 0,3 g/g, za trifloksistrobin 0,5 g/g, za ciprodinil 1 g/g, za boskalid 2 g/g i za pirimetanil 5 g/g. Radni rastvor za ovaj deo eksperimenta je rastvor smeše pesticida u etanolu sa sledećim koncentracijama pojedinjačnih pesticida: pirimetanil - 20 g/ml, boskalid - 8 g/ml, ciprodinil - 4 g/ml, trifloksistrobin - 2 g/ml, bifentrin - 1,2 g/ml. 200 g uzorka, dobijenog od nekoliko plodova jabuke je usitnjeno u blenderu. Odmereno je po 10 g dobijene kaše u erlenmajer, pipetom je odmereno 2,5 ml radnog rastvora pesticida tako da uneta masa pesticida ili fortification level odgovara MDK. Nakon homogenizacije i stabilizacije uzoraka od 20 minuta, vršena je ekstrakcija rastvaračima, odmeravanjem 10 ml heksana/dihlormetana/metiltercbutiletra i mućkanjem 15 minuta. Procena prinosa ekstrakcije na bazi svakog od rastvarača je rađena u tri replikata. Nakon ekstrakcije, organski ekstrakti su odvojeni centrifugiranjem, 10 minuta na 3500 obrtaja u minuti. Organski ekstrakti na bazi dihlormetana i metil-tercbutil etra su sušeni anhidrovanim magnezijum-sulfatom. Magnezijumsulfat je odvojen centrifugiranjem, 5 minuta na 3000 obrtaja u minuti. Kvantifikacija rezultata je vršena tzv. single-level kalibracijom. Paralelno za uzorcima je snimljen i standardni rastvor pesticida (kvantifikacioni standard), sa sledećim koncentracijama pojedinačnih pesticida: pirimetanil - 5 g/ml, boskalid - 2 g/ml, ciprodinil - 1 g/ml, trifloksistrobin - 0,5 g/ml, bifentrin 0,3 - g/ml. Ove koncentracije su korespodentne sa masom pesticida unetom u uzorak - fortification level. Kvantifikacioni standard je pripremljen u organskom ekstraktu jabuke na bazi odgovarajućeg rastvarača, u cilju anuliranja matriks efekta. 23
Eksperimentalni deo 3.5.5. GC/MS analiza Kvalitativna i kvantitativna analiza uzoraka je vršena tehnikom gasne hromatografije spregnute sa masenom spektrometrijom (GC/MS). Uzorci su snimani na HP 6890 gasnom hromatografu opremljenim Agilent 5973 masenim selektivnim detektorom. Parametri rada na instrumentu su dati u tabeli 3. Maseni fragmenti pesticida korišćeni u SIM metodi su dati kao boldirani u tabeli 1; za hinolin karakterističan maseni fragment je jon m/z 129. Tabela 3. Parametri rada na GC/MS Metoda snimanja Full Scan (01) 28 min/ Sinlge-ion monitoring (SIM) Mode snimanja Injektovana zapremina uzorka (µl) Energija jonizacije uzorka (ev) Tip kolone Splitless 1 69.9 Agilent 122-5532 DB-5MS (30m 250µm x 0,25 µm) Temperaturni režim pećnice Početna temperatura: 60 C Rampe: 20º/min (220º) 5ºC/min (280ºC) Slika 12. Hromatogram u SIM modu za rastvor smeše pesticida u heksanu u koncentraciji 0,25 µg/ml 24
Rezultati i diskusija 4. Rezultati i diskusija 25
Rezultati i diskusija 4.1. Profil organskih ekstrakata jabuke U tabeli 4 su prikazane osobine korišćenih rastvarača. Rastvorljivost u vodi je nešto veća za dihlormetan (DCM) i metiltercbutil etar (MTBE), u odnosu na heksan. Pri intenzivnom mućkanju izvesna je delimična mešljivost ovih rastvarača sa vodenim ekstraktom jabuke. Za otklanjanje eventualnih tragova vode iz organskih ekstrakta jabuke na bazi DCM i MTBE, pre GC/MS analize je primenjen anhidrovani magnezijum-sulfat. Tabela 4. Osobine korišćenih rastvarača Naziv rastvarača Molarna masa (g/mol) Agregatno stanje Gustina (g/cm 3 ) Tačka topljenja ( C) Tačka ključanja ( C) Rastvorljivost u vodi (g/l) Indeks polarnosti Heksan 86,17 tečno 0,659-95 68,7 0,05 Dihlormetan (DCM) Metiltercbutil etar (MTBE) 84,3 tečno 1,3255-96,7 39 13 88,15 tečno 0,7404-109 55,2 42 0,1 (nepolaran) 3,1 (polaran) 2,4 (Nepolarni) Svi primenjeni rastvarači su relativno nepolarni - dihlormetan se ističe kao najpolarniji među korišćenim rastvaračima, pa se može očekivati da se njima ekstraktuju relativno nepolarna jedinjenja, od kojih su u jabuci najzastupljenije voskaste materije. Maseni spektri jedinjenja koja se eluiraju na 20,3 min i 23,1 min, se sastoje od masenih fragmenata koji se razlikuju za m/z vrednost 14, što ukazuje na duge alifatične nizove, tj. na klasu voskova. 26
Rezultati i diskusija Slika 13. Hromatogrami organskih ekstrakata jabuke na bazi heksana, DCM i MTBE u full scan mode-u Sa slike 13 se vidi da je profil organskih ekstrakata na bazi tri rastvarača uglavnom isti, ali se razlikuje zastupljenost ekstraktovanih jedinjenja, najmanje heksanom, a i do 2 puta više u dihlormetanu i metiltercbutil etru. 27
Rezultati i diskusija 4.2. Matriks efekat Na slici 14, na primeru šireg opsega koncentracija bifentrina se može uočiti pozitivan matriks efekat u svim standardima na bazi ekstrakata jabuke u odnosu na čiste rastvarače. Najmanje odstupanje u nagibima pravih postoji između standarda na bazi dihlormetana i dihlormetanskog ekstrakta jabuke, što pokazuju i podaci iz tabele 5. gde se značajniji matriks efekat za bifentrin (preko 20 %) uočava u MTBE ekstraktu. Slika 14. Serije standarda bifentrina, napravljene u organskim ekstraktima jabuke i u čistim rastvaračima 28
Rezultati i diskusija U tabeli 5 su dati parametri za serije standarda na bazi čistih rastvarača i na bazi organskih ekstrakta jabuke. Kao što se vidi iz tabele, faktor korelacije R 2 se kreće od 0,92 do 0,99, postoji dobar odnos između podataka na bazi čistih rastvarača i organskih ekstrakta jabuke. Vrednosti za matriks efekat se kreću od 57 do 190 %. Tabela 5. Podaci za seriju standarda pravljenih na bazi čistih rastvarača i organskih ekstrakata jabuke, sa pratećim vrednostima za matriks efekat. Pesticidi Pirimetanil Ciprodinil Trifloksistrobin Bifentrin Boskalid Heksan Nagib 3,163 0,461 0,225 0,774 0,075 R 2 0,997 0,998 0,932 0,987 0,966 Heksanski ekstrakt jabuke Nagib 3,640 0,561 0,102 0,920 0032 R 2 0,997 0,995 0,941 0,947 0,924 Matriks efekat (%) 15,10 28,20-54,67 18,86-57,33 Dihlormetan Nagib 3,163 0,461 0,219 0,774 0,073 R 2 0,997 0,998 0,939 0,987 0,974 Dihlormetanski ekstrakt jabuke Nagib 3,689 0,622 0,186 0,804 0,167 R 2 0,999 0,999 0,989 0,996 0,994 Matriks efekat (%) 16,64 35,10-14,99 3,94 128,76 Metiltercbutil etar Nagib 3,163 0,461 0,219 0,774 0,073 R 2 0,997 0,998 0,939 0,987 0,974 MTBE ekstrakt jabuke Nagib 3,558 0,613 0,290 1,145 0,212 R 2 0,996 0,998 0,930 0,984 0,985 Matriks efekat (%) 12,49 32,97 32,42 47,93 190,41 Na slici 15 dat je šematski prikaz vrednosti matriks efekta. Jak matriks efekat se uočava za boskalid, prilikom upotrebe MTBE kao ekstrakcionog sredstva, ali i prilikom upotrebe DCM. Trifloksistrobin se slično ponaša kao i boskalid prilikom upotrebe heksana, dok se prilikom upotrebe DCM i MTBE javlja srednji matriks efekar. Kod bifentina je manje izražen matriks efekat, u MTBE se uočava srednji matriks efekat.. Pirimetanil i ciprodinil pripadaju istoj klasi jedinjenja, anilin-pirimidinima. Kod njih se uočava slično ponašanje, pirimetanil ima slabiji matriks efekat od ciprodinila. 29
Rezultati i diskusija Slika15. Šematski prikaz vrednosti matriks efekta 4.3. Prinos ekstrakcije U tabeli 6 su dati prinosi ekstrakcije i preciznost izražena u RSD (%). Reproduktivnost rezultata, data kao RSD (%) je dobra, jer se sve do +20% smatra prihvatljivim. Za bifentrin prinos ekstrakcije je dosta nizak za sva tri ekstrakciona sredstva (prihvatljive vrednosti su od 70 do 120%). Za trifloksistrobin dobar prinos ekstrakcije se dobija za heksan i MTBE kao ekstrakciono sredstvo, dok je u DCM svega 27%. Prinos ekstrakcije za ciprodinil je zadovoljavajući za sva tri ekstrakciona sredstva, kao i za pirimetanil. Za boskalid slično kao i za trifloksistrobin, prinosi esktrakcije su relativno niski. 30
Rezultati i diskusija (%). Tabela 6. Prinos ekstrakcije pesticida iz jabuke sa tri rastvarača; preciznost je izražena u RSD Prinos ekstrakcije (%) Naziv pesticida Fortification level ( g/g) RSD (%) Hexan DCM MTBE Hexan DCM MTBE Bifentrin 0.3 17.91 34.4 42.41 8.88 6.54 1.27 Trifloksistrobin 0.5 108.73 27 68.21 9.39 11.15 0.84 Ciprodinil 1 118.92 89.13 84.53 10.12 11.39 1.56 Boskalid 2 55.68 13.38 27.36 7.99 14.28 0.44 Pirimetanil 5 90.88 45.43 83.89 15.70 8.54 1.67 31
Zaključak 5. Zaključak 32
Zaključak Profil organskih ekstrakata na bazi tri rastvarača je uglavnom isti, ali se razlikuje zastupljenost ekstraktovanih jedinjenja. Najmanje je heksanom, a i do 2 puta više u dihlormetanu i metiltercbutil etru. Vrednosti za matriks efekat se kreću od 57 do 190 %. Jak matriks efekat se uočava za boskalid u DCM i MTBE, kao i za trifloksistrobin u heksanu, srednji matriks efekat je uočen za trifloksistrobin u DCM i MTBE i za bifentrin u MTBE, dok je u heksanu i DCM slab, kao i za pesticide ciprodinil i pirimetanil matriks efekat praktično ne postoji. Zbog razlike u interakcijama između analita, komponenata matriksa i hromatografskog sistema teško je utvrditi tendenciju matriks efekta za svaki analit u svakoj matrici. Prema tome, u postupcima kvantifikacije pesticida treba primeniti kalibraciju matriks efekta sa standardima pripremljenim sa istom koncentracijom matriksa. 33
Literatura 6. Literatura 34
Literatura [1] National pesticide information center (NPIC). http://npic.orst.edu/ [2] US Environmental.(2007).What is pesticide? https://www.epa.gov/ingredients-usedpesticide-products/basic-information-about-pesticide-ingredients [3] Janjic V. (2009). Mehanizam delovanja pesticida.(17-380) [4] Environmental effects of pesticides. https://en.wikipedia.org/wiki/environmental_impact_of_pesticides [5] About pesticides. www.wikipedia.com [6] Pesticide action network UK. Health effects of pesticides and pesticide poisoning. Impacts of pesticides on health. http://www.pan-uk.org/health-effects-of-pesticides/ [7] Bolesti voća. http://www.zastitavoca.rs/bolesti-jabuke/ [8] About specific pesticedes. http://www.hemoslavija.co.rs/zastita-bilja/insekticidi/656- talstar.html [9] (2009). Fungicidi i mehanizam delovanja fungicida. https://www.scribd.com/doc/17676710/fungicidi-skripta [10] Instrumenti (GC/MS). http://www.mol.rs/instrumenti.html [11] Ivanov D. (2008).Gasna hromatografija- masena spektrometrija (GC/MS). https://www.tehnologijahrane.com/enciklopedija/gasna-hromatografija-masenaspektrometrija-gc-ms [12] Rizea Savu S., Tarcomnicu I, and Silvestro L. Matrix Effects in Mass Spectrometry Combined with Separation Methods Comparison HPLC, GC and Discussion on Methods to Control these Effects. (6) [13] Ferrerira de Nascimento R., Milhome M., Gomes Lima C., Silva R., Guedes J. (2016). Matrix effect in guava multiresidue analysis by QuEChERS method and gas chromatography coupled to quadrupole mass spectrometry. Food Chemistry. (199). (380-386) [14] Sparkman D., Penton Z. and Kitson F. (17 May 2011)- Gas Chromatography and Mass Spectrometry: A Practical Guide [15] J. Hajslová, J. Zrostlíková, J. Chromatogr. A 1000 (2003) 181. Matrix effects in (ultra)trace analysis of pesticide residues in food and biotic matrices 35
Literatura [16] F. A. De Sousa, A. I. Guido Costa, M. E. L. R. De Queiroz, R. F. Teófilo, A. A. Neves, G. P. De Pinho, Food Chem. 135 (2012).179. Evaluation of matrix effect on the GC response of eleven pesticides by PCA [17] L. Silvestro, I. Tarcomnicu, S. R. Savu, Matrix Effects in Mass Spectrometry Combined with Separation Methods Comparison HPLC, GC and Discussion on Methods to Control these Effects, in Tandem Mass Spectrometry Molecular Characterization, A.V. Coelho, Ed., IntechOpen, London, United Kingdom [18] Tabele contents. Analytical standards and certified reference standards. www.chemservice.com. [19] Tabele contents. www.pubmed.gov [20] Tabele contents. www.pubchem.gov [21] Tabele contents. https://www.sciencedirect.com/ [22] Ministarstvo poljoprivrede, šumarstva i vodoprivrede. Pravilnik o maksimalno dozvoljenim količinama ostataka sredstva za zaštitu bilja u hrani i hrani za životinje i o hrani za životinje za koju se utvrđuju maksimalno dozvoljene količine ostataka sredstva za zaštitu bilja 36