MAX Cdiff Za in vitro dijagnostiku P0215(02) Za upotrebu sa sustavom BD MAX Hrvatski NAMJENA BD MAX Cdiff assay, koji se izvodi na sus

Транскрипт

1 MAX Cdiff Za in vitro dijagnostiku P0215(02) Za upotrebu sa sustavom BD MAX Hrvatski NAMJENA BD MAX Cdiff assay, koji se izvodi na sustavu BD MAX, automatizirani je in vitro dijagnostički test za izravno, kvalitativno otkrivanje gena za B toksin bakterije Clostridium difficile (tcdb) u uzorcima tekuće i meke ljudske stolice pacijenata za koje se sumnja da imaju infekciju bakterijom Clostridium difficile (CDI). Test se vrši izravno na uzorku, koristi lančanu reakciju polimerazom (PCR) u stvarnom vremenu za umnožavanje DNK gena za B toksin bakterije Clostridium difficile i fluorogenske hibridizacijske probe specifične za cilj radi otkrivanja umnoženog DNK. BD MAX Cdiff assay namijenjen je dijagnostici CDI-ja. SAŽETAK I OBJAŠNJENJE POSTUPKA Clostridium difficile je anaerobni, gram-pozitivni bacillus koji je glavni uzročnik proljeva povezanog s korištenjem antibiotika i pseudomembranoznog kolitisa u ustanovama zdravstvene skrbi. 1,2 Učestalost CDI-ja se povećava, a teški slučajevi postaju sve češći. 3,4,5 Simptomi bolesti CDI-ja variraju od blagog proljeva do teškog kolitisa te čak perforacije crijeva i smrti. Najčešći faktor rizika je izloženost antibioticima. 6 Dijagnoza infekcije bakterijom Clostridium difficile temelji se na kliničkim znakovima i simptomima kao što je proljev te na laboratorijskim i patološkim ispitivanjima. Laboratorijska dijagnoza toksigene bakterije Clostridium difficile uključuje anaerobnu kulturu nakon koje slijedi otkrivanje toksina ili otkrivanje gena ili enzima toksina u stolici. 7 Čini se da je toksin B nužan za razvoj CDI-ja. 8 Ispitivanje citotoksičnosti kulture tkiva koje se izvodi izravno na stolici ili na izoliranom soju Clostridium difficile iziskuje puno truda i vremena, a rezultate nije moguće dobiti za manje od 24 do 96 sati. Enzimski imunotest (EIA) koji se koristi za otkrivanje toksina A i B te otkrivanje glutamat dehidrogenaze (GDH), enzima koji se nalazi u svim sojevima bakterije Clostridium difficile, trenutno se koristi u većini kliničkih laboratorija zato što su rezultati dostupni isti dan, jednostavno se izvodi i relativno je jeftin. Međutim, osjetljivost je niska, posebno za EIA-ove toksina, zbog čega može doći do propuštanja pozitivnih rezultata. 7 Nedavno su razvijene PCR metode otkrivanja toksina A i B visoke osjetljivosti i specifičnosti u usporedbi s testovima citotoksičnosti stanica i imunotestovima. 9 Nadalje, ti se testovi mogu izvršiti za manje od 3 sata. Kombinacija tih značajki može omogućiti ažuran ciljani tretman pacijenata s CDI-jem i time potencijalno poboljšati ishod za pacijenta, smanjiti vrijeme oporavka i prakse kontrole infekcije. NAČELA POSTUPKA Prikuplja se uzorak tekuće ili mekane stolice i prenese u laboratorij. Za provođenje ispitivanja, jednokratna ušica za inokulaciju od 10 µl umače se u uzorak stolice i tada umače u BD MAX Cdiff Sample Buffer Tube (epruvetu s puferom za uzorak). Epruveta s puferom za uzorak se zatvara opnastim čepom i promiješa u orbitalnoj miješalici. Stvara se radni popis, a epruveta s puferom za uzorak, BD MAX Cdiff Unitized Reagent Strip (unificirana traka reagensa) i BD MAX PCR Cartridge (patrona za PCR) umeću se u sustav BD MAX. Sustav BD MAX automatizira pripremu uzoraka, uključujući liziranje cilja, ekstrakciju i koncentriranje DNK, rehidraciju reagensa, umnožavanje ciljne nukleinske kiseline i njezino otkrivanje korištenjem PCR-a u stvarnom vremenu. Sustav BD MAX automatski tumači rezultate. Analiza uključuje i kontrolu obrade uzoraka koja se nalazi u epruveti za ekstrakciju. Kontrola obrade uzoraka prati korake ekstrakcije DNK, korake toplinskog kruženja, cjelovitost reagensa i prisutnost inhibitornih tvari. Nakon enzimskog liziranja, otpuštene nukleinske kiseline zadržavaju se na magnetskim kuglicama. Kuglice na koje su vezane nukleinske kiseline ispiru se, a nukleinske kiseline se eluiraju toplinom u puferu za eluiranje. Isprani DNK neutralizira se pomoću pufera za neutralizaciju i prenosi u epruvetu za glavnu mješavinu radi rehidracije reagensa za PCR. Nakon rekonstitucije sustav BD MAX ulijeva fiksnu količinu uzorka spremnog za PCR koji sadrži izdvojene nukleinske kiseline u BD MAX PCR Cartridge. Sustav pečati mikro-ventile patrone BD MAX PCR Cartridge prije pokretanja PCR postupka da bi se mješavina za umnožavanje zadržala unutra i time spriječilo isparavanje i kontaminacija. 1

2 Umnoženi ciljevi DNK otkrivaju se pomoću proba (TaqMan) za hidrolizu koje su označene fluorescentnom bojom (fluorofor) na jednom kraju i prigušujućom skupinom na drugom kraju. Probe označene različitim fluoroforima koriste se za otkrivanje amplikona tcdb-a i kontrole obrade uzoraka u dva različita optička kanala sustava BD MAX. Kada su probe u svom prirodnom stanju, fluorescencija fluorofora prigušena je zbog njegove blizine prigušujućoj skupini. No, u prisutnosti ciljnog DNK, probe hibridiziraju u komplementarne sljedove i hidroliziraju se pomoću aktivnosti 5'-3' egzonukleaze polimeraze DNK dok ona sintetizira nascentni lanac uzduž DNK predloška. Zahvaljujući tome fluorofori se odvajaju od prigušujućih molekula i emitira se fluorescencija. Količina fluorescencije otkrivena u dva optička kanala koji se koriste u testu BD MAX Cdiff assay izravno je proporcionalna količini odgovarajuće probe koja se hidrolizira. Sustav BD MAX prati ove signale u svakom ciklusu PCR-a i tumači podatke na kraju programa da bi pružio konačni rezultat. REAGENSI I MATERIJALI KAT. BR. Sadržaj Količina BD MAX Cdiff Master Mix (glavna mješavina) Sušena glavna mješavina za PCR koja sadrži molekularne probe i primere specifične za 24 testa tcdb i molekularnu probu specifičnu za kontrolu obrade uzoraka. BD MAX Cdiff Strips (trake) Unificirane trake reagensa koje sadrže sve tekuće reagense i vrške pipeta za 24 testa jednokratnu upotrebu koji su potrebni za obradu uzoraka i ekstrakciju DNK. BD MAX Cdiff Extraction Tube (epruveta za ekstrakciju) Tableta sušena u smrznutom stanju koja sadrži magnetske prianjajuće kuglice za DNK, 24 testa akromopeptidazu i kontrolu obrade uzoraka. BD MAX Cdiff Sample Buffer Tube (epruveta s puferom za uzorak) 24 testa Opnasti čepovi 25 POTREBNA OPREMA I MATERIJALI KOJI SE NABAVLJAJU ZASEBNO BD MAX PCR Cartridges (patrone za PCR) (BD Diagnostic Systems kataloški br ) VWR Multi-Tube Vortexer (višepozicijska orbitalna miješalica) (VWR kataloški br ) Vortex Genie 2 (orbitalna miješalica) (VWR kataloški br ) ili ekvivalent NALGENE Cryogenic Vial Holder (držač kriogenih bočica) (VWR, kataloški br ) inokulacijske ušice za jednokratnu uporabu (10 µl) rukavice za jednokratnu uporabu, bez pudera suhi, čisti spremnici za prikupljanje uzoraka tekuće ili mekane stolice. Ako se kultura izvodi za vanjske kontrole: unaprijed reducirana posuda za anaerobe (npr. posuda Brucella Agar s 5 % ovčje krvi, heminom i vitaminom K1, BBL kataloški br ). UPOZORENJA I MJERE OPREZA BD MAX Cdiff služi za in vitro dijagnostiku. Ovaj proizvod može se koristiti samo u sustavu BD MAX. Ne upotrebljavajte reagense i/ili materijale kojima je istekao rok trajanja. Komplet nemojte upotrebljavati ako je naljepnica za zatvaranje vanjske kutije slomljena prilikom dostave. Reagense nemojte upotrebljavati ako su zaštitne vrećice otvorene ili oštećene prilikom dostave. Ne koristite reagense ako u vrećicama reagensa nema upijača vlage ili ako je slomljen. Ne uklanjajte upijač vlage iz vrećica reagensa. Brzo zatvorite zaštitne vrećice s reagensima patentnim zatvaračem nakon svake upotrebe. Uklonite sav višak zraka iz vrećica prije zatvaranja. Zaštitite reagense od topline i vlage. Duža izloženost vlazi utjecat će na učinak proizvoda. Ne koristite reagense ako je folija potrgana ili oštećena. Nemojte miješati reagense iz različitih vrećica i/ili kompleta i/ili serija. Čepove nemojte zamjenjivati ni ponovno koristiti jer može doći do kontaminacije koja može ugroziti rezultate testa. Provjerite jesu li unificirane trake reagensa ispravno napunjene tekućinom (provjerite nalaze li se tekućine na dnu epruveta) (pogledajte sliku 1). Provjerite sadrže li unificirane trake reagensa sve vrške pipeta (pogledajte sliku 1). Pri korištenju kemijskih otopina postupajte oprezno jer se čitljivost crtičnih kodova glavne mješavine i epruvete za ekstrakciju može smanjiti. Dobra laboratorijska tehnika ključna je za odgovarajuću izvedbu ovog testa. Zbog visoke analitičke osjetljivosti ovog testa potrebno je biti krajnje pažljiv kako bi se očuvala čistoća svih materijala i reagensa. U slučajevima gdje se drugi PCR testovi obavljaju u istom prostoru unutar laboratorija, potreban je oprez kako se BD MAX Cdiff assay, ostali reagensi potrebni za testiranje i sustav BD MAX ne bi kontaminirali. Uvijek izbjegavajte kontaminaciju reagensa mikrobima i deoksiribonukleazom (DNaza). Obavezno promijenite rukavice prije rukovanja reagensima i patronama. Da bi se izbjegla kontaminacija okoliša amplikonima, ne otvarajte patrone BD MAX PCR Cartridge nakon korištenja. Sigurnosni pečati na patronama BD MAX PCR Cartridge osmišljeni su za sprječavanje kontaminacije. 2

3 Laboratorij mora obavljati rutinsko praćenje okoliša kako bi se smanjila opasnost od križne kontaminacije. BD MAX Microfluidic Cartridge može se koristiti do dva puta. Provedba testa BD MAX Cdiff assay izvan preporučenih vremenskih okvira može dati rezultate koji nisu valjani. Analize koje se ne provedu u određenom vremenskom roku potrebno je ponoviti. Mogu se testirati dodatne kontrole u skladu sa smjernicama ili zahtjevima lokalnih, državnih, pokrajinskih i/ili saveznih propisa ili akreditirajućih ustanova. Uvijek rukujte uzorcima kao da su infektivni i u skladu sa sigurnim laboratorijskim postupcima, kao što su oni opisani u dokumentima CLSI Document M29 10 i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 11 Za vrijeme rukovanja reagensima nosite zaštitnu odjeću i rukavice za jednokratnu upotrebu. Nakon obavljanja testa temeljito operite ruke. Ne pipetirajte ustima. Nemojte pušiti, piti, žvakati niti jesti u područjima u kojima se rukuje uzorcima ili reagensima kompleta. Neiskorištene reagense i otpad odložite u skladu s lokalnim, državnim, pokrajinskim i/ili saveznim propisima. Dodatna upozorenja, mjere opreza i postupke potražite u Korisničkom priručniku sustava BD MAX. 12 POHRANA I STABILNOST Prikupljene uzorke tijekom transporta treba držati pri temperaturi između 2 C i 25 C. Zaštitite ih od smrzavanja ili izlaganja prevelikoj toplini. Uzorci se mogu pohraniti do 5 dana pri temperaturi 2 8 C ili do 48 sati pri temperaturi 2 25 C prije testiranja. Komponente za BD MAX Cdiff assay stabilne su pri temperaturi 2 25 C do isteka navedenog roka trajanja. Ne koristite komponente kojima je istekao rok trajanja. Glavna mješavina i epruvete za ekstrakciju kompleta BD MAX Cdiff isporučuju se u zapečaćenim vrećicama. Radi zaštite proizvoda od vlage, zatvorite vrećicu odmah nakon otvaranja. Epruvete reagensa stabilne su do 7 dana pri temperaturi 2 25 C nakon prvog otvaranja i ponovnog zatvaranja. UPUTE ZA UPORABU Prikupljanje/transport uzoraka Da bi se dobio odgovarajući uzorak, potrebno je točno slijediti postupak prikupljanja uzoraka. Rabeći suhi, čisti spremnik, uzorci tekuće ili mekane stolice prikupljaju se sukladno sljedećem postupku: 1. Prenesite tekuću ili mekanu stolicu (ali ne i urin) u spremnik. Izbjegavajte miješanje toaletnog papira, vode i sapuna s uzorkom. 2. Označite spremnik. 3. Pošaljite spremnik u laboratorij u skladu sa standardnim postupcima zdravstvene ustanove (pogledajte odjeljak Pohrana i stabilnost). Priprema uzoraka NAPOMENA: za svaki uzorak i svaku vanjsku kontrolu koje treba testirati potrebna je jedna (1) epruveta s puferom za uzorak, jedan (1) opnasti čep, jedna (1) glavna mješavina, jedna (1) epruveta za ekstrakciju i jedna (1) unificirana traka reagensa. Izvadite potrebnu količinu materijala iz zaštitnih vrećica ili kutija i pripremite ih. Da biste pohranili otvorene vrećice glavne mješavine ili epruveta za ekstrakciju, uklonite višak zraka iz vrećica ii zatvorite ih patentnim zatvaračem. 1. Označite epruvetu s puferom za uzorak (prozirni čep) koja ima crtični kod odgovarajućom identifikacijom uzorka, a da pri tome ne zaklonite ili pišete preko crtičnih kodova. 2. Promiješajte uzorak u orbitalnoj miješalici 15 sekundi i umočite ušicu od 10 µl za inokulaciju u stolicu za testiranje. Za uzorke meke stolice, uklonite višak stolice s vanjske strane ušice da biste uzeli uzorak od otprilike 10 µl. 3. Skinite čep s epruvete s puferom za uzorak, a zatim stavite ušicu u tekućinu. Zavrtite ušicu među prstima da biste oslobodili uzorak u epruvetu. 4. Zatvorite epruvetu opnastim čepom. 5. Stavite epruvetu s puferom za uzorak u NALGENE Cryogenic Vial holder. 6. Sve dodatne uzorke za ispitivanje pripremite ponavljanjem koraka od 1. do 5., a zatim odmah prijeđite na 7. korak. 7. Istovremeno promiješajte sve uzorke na maksimalnoj brzini jednu (1) minutu koristeći orbitalnu miješalicu. BD MAX Cdiff assay mora se izvršiti odmah nakon koraka miješanja. 3

4 Rad sustava BD MAX NAPOMENA: detaljne upute potražite u Korisničkom priručniku sustava BD MAX 12 (odjeljak Rad sustava). NAPOMENA: testiranje za BD MAX Cdiff assay mora se provesti odmah nakon prethodno opisanog koraka miješanja (Priprema uzoraka, 7. korak). Ako je potrebno ponoviti testiranje, ponovno promiješajte uzorke u miješalici. 1. Uključite sustav BD MAX (ako već niste) i prijavite se tako da unesete <user name> (korisničko ime) i <password> (lozinku). 2. Obavezno promijenite rukavice prije rukovanja reagensima i patronama. 3. Izvadite potreban broj unificiranih traka reagensa iz kompleta BD MAX Cdiff. Nježno tapkajte svakom trakom o tvrdu površinu da biste sve tekućine doveli na dno epruveta. 4. Izvadite potreban broj epruveta za ekstrakciju i epruveta s glavnom mješavinom iz zaštitnih vrećica. Uklonite sav višak zraka iz vrećica i zatvorite ih patentnim zatvaračem. 5. Za svaki od uzoraka koje je potrebno testirati postavite jednu (1) unificiranu traku reagensa na stalak sustava BD MAX počevši od položaja 1 na stalku A. 6. Utisnite jednu (1) epruvetu za ekstrakciju (bijela folija) u svaku od unificiranih traka reagensa u položaj 1, kao što je prikazano na slici Utisnite jednu (1) epruvetu glavne mješavine (zelena folija) u svaku od unificiranih traka reagensa u položaj 2, kao što je prikazano na slici 1. Epruvete za umetanje spremnik za otpad vrhovi pipeta #1 #2 #3 Epruveta za liziranje epruveta za ekstrakciju Cdiff glavna mješavina pufer za eluciju pufer za ispiranje pufer za neutralizaciju Slika 1: utiskivanje epruveta BD MAX Cdiff Extraction Tube i Master Mix Tube u unificirane trake reagensa. 8. Kliknite ikonu Run (pokreni) i unesite broj serije kompleta za BD MAX Cdiff assay (radi praćenja serije) skeniranjem crtičnog koda skenerom ili ručnim unosom. NAPOMENA: ponovite 8. korak svaki puta kada počnete koristiti novu seriju kompleta. 9. Idite na karticu Worklist (Radni popis). Na padajućem izborniku odaberite <BD MAX Cdiff 56>. 10. Unesite ID epruvete s puferom za uzorak, ID pacijenta i pristupni broj (ako je primjenjiv) na radni popis skeniranjem crtičnog koda skenerom ili ručnim unosom. 11. Na padajućem izborniku odaberite odgovarajući broj serije kompleta (nalazi se na vanjskoj kutiji). 12. Ponovite korake od 9. do 11. za sve preostale epruvete s puferom za uzorak. 13. Postavite epruvete s puferom za uzorak na stalke sustava BD MAX u skladu s unificiranim trakama reagensa koje ste složili između 5. i 7. koraka. NAPOMENA: epruvete s puferom za uzorak postavite u stalke tako da naljepnice s 1D crtičnim kodovima budu okrenute prema van (to olakšava skeniranje epruveta s puferom za uzorak tijekom prijave uzoraka). 14. Stavite potreban broj patrona BD MAX PCR Cartridge u sustav BD MAX (pogledajte sliku 2). Svaka patrona omogućuje 2 obrade, do 12 uzoraka po obradi, za ukupno 24 uzorka. Sustav BD MAX automatski će odabrati položaj i red na patroni BD MAX PCR Cartridge za svaku obradu. BD MAX PCR Cartridge može se koristiti više puta, sve dok se ne iskoriste svi utori. Da biste maksimalno iskoristili patrone BD MAX PCR Cartridge, koristeći 2000 Sample Mode (način rada za 2000 uzoraka), odaberite Run Wizard (Čarobnjak za obradu) za dodjelu utora na kartici Worklist (Radni popis). Više informacija potražite u Korisničkom priručniku sustava BD MAX. 4

5 15. Umetnite stalke u sustav BD MAX (slika 3). Slika 2: umetanje patrona BD MAX PCR Cartridge strana A strana B Slika 3: umetanje stalaka u sustav BD MAX. 16. Zatvorite poklopac sustava BD MAX i kliknite <Start> (Pokreni) da biste pokrenuli obradu. 17. Na kraju obrade odmah provjerite rezultate ili pohranite epruvete s puferom za uzorak pri temperaturi 2 8 C do 5 dana ILI pri temperaturi od 25 ± 2 C najviše do 5 sati dok se rezultati ne provjere. NAPOMENA: ako je tijekom testiranja oštećen opnasti čep, zamijenite ga novim prije odlaganja uzorka. NAPOMENA: pripremljene epruvete BD MAX Cdiff Sample Buffer Tube mogu se čuvati pri temperaturi 2 8 C najviše 120 sati (5 dana) ILI pri 25 ± 2 C najviše 5 sati nakon što je uzorak dodan u epruvete s puferom. Kada dobijete rezultat koji je neodređen (IND), neriješen (UNR) ili nepotpun (INC) ili ako dođe do pogreške vanjskih kontrola, potrebno je izvršiti ponovno testiranje iz pripremljenih epruveta s puferom za uzorak u ovom vremenskom okviru (pogledajte odjeljak Ponavljanje postupka testiranja). KONTROLA KVALITETE Postupci kontrole kvalitete nadziru izvedbu analize. Laboratoriji su dužni odrediti broj, vrstu i učestalost testiranja kontrolnih materijala u skladu sa smjernicama ili zahtjevima lokalnih, pokrajinskih, državnih, saveznih i/ili nacionalnih propisa ili akreditirajućih ustanova u svrhu nadzora učinkovitosti cijelog analitičkog postupka. Za općenite smjernice u vezi s kontrolom kvalitete korisnik može pogledati dokumente CLSI MM03 i EP12. 13,14 1. BD ne isporučuje vanjske kontrolne materijale. Vanjske pozitivne i negativne kontrole ne koriste se u softveru sustava BD MAX u svrhu tumačenja rezultata testiranja uzoraka. Vanjske kontrole tretiraju se kao da su uzorci pacijenata. (Za interpretaciju rezultata analize vanjskih kontrola pogledajte tablicu 1 u odjeljku Interpretacija rezultata.) 2. Barem jednom dnevno potrebno je provesti jednu (1) vanjsku pozitivnu kontrolu i jednu (1) vanjsku negativnu kontrolu dok se ne postigne zadovoljavajuća potvrda procesa u sustavu BD MAX u svakom od laboratorijskih okruženja. Smanjivanje učestalosti kontrolnog testiranja treba se provesti u skladu s primjenjivim propisima. Vanjska pozitivna kontrola namijenjena je nadzoru velikih pogrešaka reagensa. Vanjska negativna kontrola namijenjena je otkrivanju kontaminacije (ili prijenosa) reagensa ili okoliša ciljnim nukleinskim kiselinama. 5

6 3. Preporučuje se provođenje različitih vanjskih kontrola da bi se korisniku omogućio odabir one koja je najprikladnija za program kontrole kvalitete u njihovom laboratoriju. a. Vanjska negativna kontrola: komercijalno dostupni kontrolni materijali [npr. soj bakterije Clostridium difficile koji nije toksigen (ATCC )] ili prethodno okarakterizirani uzorak za koji se zna da nije toksigen ili je negativan za toksigenu bakteriju Clostridium difficile. BD preporučuje da se vanjska negativna kontrola pripremi prije vanjske pozitivne kontrole kako bi se smanjila mogućnost kontaminacije kao posljedica pripreme kontrole. b. Vanjska pozitivna kontrola: komercijalno dostupni kontrolni materijali [npr. soj Clostridium difficile koji je nositelj gena tcdb (ATCC 43255)] ili prethodno okarakterizirani uzorak za koji se zna da je toksigen ili pozitivan na toksigeni Clostridium difficile. Za pripremu suspenzija vanjskih kontrola, preporučuje se da ponovno suspendirate izolate u fiziološkoj otopini do zamućenosti od 0,5 McFarlanda (~1 X 10 7 CFU/mL). Serijski razrijedite kontrolu fiziološkom otopinom do konačne suspenzije ~3,3 X 10 5 CFU/mL te inokulirajte odgovarajuću epruvetu s puferom za uzorak koristeći ušicu od 10 µl bakterijske suspenzije. Obradite i testirajte kao uzorak (pogledajte odjeljke Priprema uzoraka i Rad sustava BD MAX). 4. Sve vanjske kontrole trebaju dati očekivane rezultate (pozitivne za vanjske pozitivne kontrole, odnosno negativne za vanjske negativne kontrole) bez neuspjelih vanjskih kontrola (neriješeni ili neodređeni rezultati). 5. Vanjska negativna kontrola koja daje pozitivan rezultat testa ukazuje na neodgovarajuće rukovanje uzorkom i/ili kontaminaciju. Razmotrite tehniku rukovanja uzorkom radi izbjegavanja miješanja i/ili kontaminacije uzoraka. Vanjska pozitivna kontrola koja daje negativan rezultat ukazuje na problem s rukovanjem/pripremom uzorka. Razmotrite tehniku rukovanja/pripreme uzorka. 6. Vanjska kontrola koja daje neriješen, neodređen ili nepotpun rezultat testa ukazuje na pogrešku reagensa ili sustava BD MAX. Provjerite pojavljuju li se poruke o pogreškama na zaslonu sustava BD MAX. Kako interpretirati kodove upozorenja i pogrešaka potražite u odjeljku Sažetak pogrešaka sustava u Korisničkom priručniku sustava BD MAX. 12 Ako se problem nastavi, upotrijebite reagense iz neotvorene vrećice ili novi komplet za analizu. 7. Svaka od epruveta za ekstrakciju sadrži kontrolu obrade uzoraka, odnosno plazmid sa sintetičkim ciljanim slijedom DNK. Kontrola obrade uzoraka se izdvaja, eluira i umnožava zajedno s DNK-om prisutnim u obrađenom uzorku, čime se osigurava predvidivost analize. Kontrola obrade uzoraka nadgleda učinkovitost hvatanja, pranja i eluiranja DNK tijekom koraka obrade uzoraka, kao i učinkovitost umnožavanja i otkrivanja DNK tijekom PCR analize. Ako rezultat kontrole obrade uzoraka ne ispunjava kriterije prihvatljivosti, rezultati uzorka bilježe se kao neriješeni, međutim, svi pozitivni (POS) rezultati analize će se prijaviti, a niti jedan od ciljeva neće biti obilježen kao NEG (negativno). Neriješen rezultat ukazuje na inhibiciju povezanu s uzorkom ili pogrešku reagensa. Ponovite analizu za svaki uzorak koji je prijavljen kao neriješen kako je opisano u odjeljku Ponavljanje postupka testiranja. INTERPRETACIJA REZULTATA Rezultati su dostupni na kartici Results (Rezultati), u prozoru Results (Rezultati) na zaslonu sustava BD MAX. Softver sustava BD MAX automatski tumači rezultate testa. Rezultat testa može biti NEG (negativan), POS (pozitivan) ili UNR (neriješen), ovisno o statusu umnožavanja cilja i kontrole obrade uzoraka. IND (neodređeni) ili INC (nepotpuni) rezultati posljedica su pogreške u sustavu BD MAX. Rezultati se temelje na sljedećem algoritmu odlučivanja. Tablica 1: interpretacija rezultata testa BD MAX Cdiff assay Prijavljeni rezultat analize Cdiff POS Cdiff NEG Interpretacija rezultata a Otkriven je DNK tcdb gena Nije otkriven DNK tcdb gena Neriješeno nema umnožavanja cilja ili kontrole obrade uzoraka, Cdiff UNR inhibitorni uzorak ili pogreška reagensa Neodređeni rezultat kao posljedica pogreške u sustavu BD MAX IND (s kodovima upozorenja ili pogrešaka b ) Nepotpuna obrada INC (s kodovima upozorenja ili pogrešaka b ) a Rezultati analize BD MAX Cdiff mogu se koristiti kao smjernica za razinu mjera opreza u skladu s programima i praksama institucije. b Kako interpretirati kodove upozorenja i pogrešaka potražite u odjeljku Rješavanje problema u Korisničkom priručniku sustava BD MAX. 12 PONAVLJANJE POSTUPKA TESTIRANJA NAPOMENA: epruveta s puferom za uzorak sadrži dovoljnu količinu za jedno ponavljanje testa na sustavu BD MAX. Za epruvete s puferom za uzorak koje su na sobnoj temperaturi, ponovno testiranje mora se izvršiti u roku od 5 sati nakon kraja ciklusa. Umjesto toga, za epruvete s puferom za uzorak pohranjene pri temperaturi 2 8 C testiranje je potrebno ponoviti u roku od 120 sati (5 dana). Preostali uzorci stolice mogu se upotrijebiti za ponovno testiranje unutar 5 dana od prikupljanja ako su pohranjeni na 2 8 C ili unutar 48 sati ako su pohranjeni na 2 25 C. NAPOMENA: novi se uzorci mogu testirati u istom ciklusu s ponovljenim uzorcima. 6

7 NERIJEŠEN REZULTAT Neriješeni rezultati mogu se dobiti u slučaju da inhibicija vezana uz uzorak ili pogreška reagensa spriječe točno umnožavanje cilja ili kontrole obrade uzoraka. Uzorci se mogu ponoviti iz odgovarajućih epruveta s puferom za uzorak u ranije definiranom vremenskom okviru. Promiješajte uzorke na orbitalnoj miješalici jednu (1) minutu i ponovno krenite od odjeljka Rad sustava BD MAX. Preostali uzorci stolice također se mogu upotrijebiti za ponovno testiranje unutar ranije definiranog vremenskog okvira. Ponovno krenite od odjeljka Priprema uzoraka. NEODREĐENI REZULTAT Neodređeni rezultati mogu se dobiti u slučaju pogreške sustava. Uzorci se mogu ponoviti iz odgovarajućih epruveta s puferom za uzorak u ranije definiranom vremenskom okviru. Promiješajte uzorke na orbitalnoj miješalici jednu (1) minutu i ponovno krenite od odjeljka Rad sustava BD MAX. Preostali uzorci stolice također se mogu upotrijebiti za ponovno testiranje unutar ranije definiranog vremenskog okvira. Ponovno krenite od odjeljka Priprema uzoraka. Interpretaciju kodova upozorenja ili pogrešaka potražite u Korisničkom priručniku sustava BD MAX 12 (odjeljak Rješavanje problema). NEPOTPUNI REZULTAT Nepotpuni rezultati mogu se dobiti u slučaju da se priprema uzorka ili PCR nisu dosegli očekivane vremenske točke. Uzorci se mogu ponoviti iz odgovarajućih epruveta s puferom za uzorak u ranije definiranim dozvoljenim vremenskim okvirima. Promiješajte uzorke na orbitalnoj miješalici jednu (1) minutu i ponovno krenite od odjeljka Rad sustava BD MAX. Preostali uzorci stolice također se mogu upotrijebiti za ponovno testiranje unutar ranije definiranog vremenskog okvira. Ponovno krenite od odjeljka Priprema uzoraka. Interpretaciju kodova upozorenja ili pogrešaka potražite u Korisničkom priručniku sustava BD MAX 12 (odjeljak Rješavanje problema). POGREŠKA VANJSKE KONTROLE Vanjske kontrole trebale bi prilikom testiranja dati očekivane rezultate. Ako se uzorci moraju ponoviti zbog netočnog rezultata vanjske kontrole, treba ih ponoviti iz njihovih epruveta s puferom za uzorak zajedno sa svježe pripremljenim vanjskim kontrolama u ranije definiranom vremenskom okviru. Promiješajte uzorke na orbitalnoj miješalici jednu (1) minutu i ponovno krenite od odjeljka Rad sustava BD MAX. Preostali uzorci stolice također se mogu upotrijebiti za ponovno testiranje unutar ranije definiranog vremenskog okvira. Ponovno krenite od odjeljka Priprema uzoraka. UZGOJ KLINIČKIH UZORAKA Za provođenje identifikacije vrste izravno iz stolice, može se uzgojiti kultura kliničkih uzoraka koristeći bolničke postupke. OGRANIČENJA POSTUPKA Ovaj proizvod namijenjen je upotrebi samo s tekućom ili mekom stolicom bez konzervansa. Karakteristike svojstava drugih vrsta kliničkih uzoraka nisu utvrđene. Ovaj proizvod može se koristiti samo u sustavu BD MAX. Netočni rezultati testa mogu se javiti i zbog nepravilnog prikupljanja uzoraka, nepravilnog rukovanja ili pohranjivanja, tehničke pogreške, pomiješanih uzoraka ili zbog toga što je broj organizama u uzorku manji od analitičke osjetljivosti testa. Potrebno je pažljivo slijediti upute na letku u pakiranju i u Korisničkom priručniku sustava BD MAX 12 da bi se izbjegli pogrešni rezultati. Pozitivan rezultat testa BD MAX Cdiff ne ukazuje nužno na prisutnost vijabilnih organizama. Međutim, ukazuje na prisutnost gena tcdb i upućuje na vjerojatno otkrivanje toksigenog organizma Clostridium difficile. BD MAX Cdiff assay ne može se koristiti za identifikaciju vrste jer ne sadrži primere i probe specifične za Clostridium difficile. Kao i kod svih in vitro dijagnostičkih testova baziranih na PCR-u, moguće je detektirati iznimno niske razine ciljane tvari ispod granice otkrivanja, ali rezultat možda neće biti moguće ponoviti. Klistir sa suspenzijom mesalazina za rektalnu primjenu i Gynol II* mogu uzrokovati blagu inhibiciju analize BD MAX Cdiff (više detalja potražite u odjeljku Tvari koje interferiraju). Tums* i Maalox* tekućina mogu inhibirati BD MAX Cdiff assay (više detalja potražite u odjeljku Tvari koje interferiraju). Lažni negativni rezultati mogu se pojaviti zbog gubitka nukleinske kiseline uslijed neprikladnog prikupljanja, transporta ili pohrane uzoraka ili zbog neodgovarajućeg liziranja bakterijskih stanica. Kontrola obrade uzoraka dodana je testu da bi pomogla u identifikaciji uzoraka koji sadrže inhibitore umnožavanja PCR-a. Kontrola obrade uzoraka ne pokazuje je li do gubitka nukleinske kiseline došlo zbog neprikladnog prikupljanja, transporta ili pohrane uzoraka, te jesu li bakterijske stanice ispravno lizirane. Rezultati za BD MAX Cdiff assay mogu povremeno biti neriješeni zbog nevaljane kontrole obrade uzoraka ili neodređeni ili nepotpuni zbog pogreške sustava, te tada zahtijevaju ponovno testiranje koje može dovesti do kašnjenja u dobivanju konačnih rezultata Mutacije ili polimorfizmi u područjima vezanja primera ili probe mogu utjecati na otkrivanje varijanti Clostridium difficile tcdb gena, zbog čega BD MAX Cdiff assay može dati lažne negativne rezultate. Varijante toksigene bakterije Clostridium difficile bez gena tcdb ili s proteinom toksina B koji nije funkcionalan su vrlo rijetke BD MAX Cdiff assay cilja gen tcdb i nije poznato može li otkriti sojeve varijante toksin A+ / toksin B-. Prevelika količina stolice može inhibirati BD MAX Cdiff assay. Kao kod svih in vitro dijagnostičkih testova, pozitivne i negativne prediktivne vrijednosti uvelike ovise o prevalenciji. Učinak testa BD MAX Cdiff može varirati ovisno o prevalenciji i testiranoj populaciji. 7

8 KARAKTERISTIKE SVOJSTAVA Karakteristike kliničkih svojstava testa BD MAX Cdiff assay određene su u prospektivnoj istraživačkoj studiji na više lokacija. U istraživanju je sudjelovalo šest (6) istraživačkih centara. Da bi sudjelovali u studiji, uzorci su morali potjecati od pacijenata za koje se sumnjalo da imaju infekciju bakterijom Clostridium difficile za koju su navedeni i naručeni dijagnostički testovi. Uključeni su samo uzorci tekuće i meke stolice i samo jedan uzorak po pacijentu. Komparativna referentna metoda sastojala se od toksigene kulture, koja ja definirana kao anaerobna kultura za izolaciju soja Clostridium difficile te, u slučaju prisutnosti tog soja, procjene toksigenosti izolata ispitivanjem citotoksičnosti kulture tkiva. Anaerobna kultura je uzgojena u modificiranim posudama s agarom cikloserin-cefoksitin-fruktoze. Kolonijama koje morfološki sliče bakteriji Clostridium difficile, a koje se potvrde bojanjem po Gramu, karakterističnim stajskim mirisom, pozitivnim testom Pro-disk (L-proline) te netolerancijom aerobnih uvjeta na posudi s čokoladnim agarom, ispitana je toksigenost. To je određeno testom toksina/ antitoksina koji je izvršen na filtratima bujona s glukozom kuhanog mesa (CMG) prema preporuci proizvođača. Testovima toksigene kulture i BD MAX Cdiff assay ispitan je ukupno 1881 uzorak tekuće i tvrde stolice. Dobiveno je 1628 sukladnih uzoraka te 1607 prijavljivih rezultata (tablica 2). U usporedbi s toksigenom kulturom, BD MAX Cdiff assay identificirao je 96,3 % uzoraka pozitivnih na toksigenu bakteriju Clostridium difficile i 92,4 % uzoraka negativnih na toksigenu bakteriju Clostridium difficile (tablica 3). Tablica 2: rezultati dobiveni za BD MAX Cdiff Assay u usporedbi s toksigenom kulturom Sve lokacije BD MAX Cdiff assay Toksigena kultura + - Ukupno Ukupno Tablica 3: svojstva dobivena za BD MAX Cdiff Assay u usporedbi s toksigenom kulturom Lokacije klinika Prevalencija Osjetljivost s 95 % IP a Osjetljivost s 95 % IP a 1. lokacija 4,3 % (9/210) 2. lokacija 10,0 % (26/261) 3. lokacija 8,0 % (28/352) 4. lokacija 3,5 % (17/487) 5. lokacija 14,4 % (21/146) 6. lokacija 18,3 % (73/399) Ukupno 9,4 % (174/1855) a IP: intervali pouzdanosti 87,5 % (7/8) (52,9 %, 97,8 %) 100 % (26/26) (87,1 %, 100 %) 96 % (24/25) (80,5 %, 99,3 %) 90,9 % (10/11) (62,3 %, 98,4 %) 95,2 % (20/21) (77,3 %, 99,2 %) 97,3 % (71/73) (90,5 %, 99,2 %) 96,3 % (158/164) (92,2 %, 98,3 %) 94,4 % (152/161) (89,7 %, 97 %) 90,6 % (213/235) (86,2 %, 93,7 %) 93,9 % (276/294) (90,5 %, 96,1 %) 90,9 % (279/307) (87,1 %, 93,6 %) 94,3 % (115/122) (88,6 %, 97,2 %) 92 % (298/324) (88,5 %, 94,5 %) 92,4 % (1333/1443) (90,9 %, 93,6 %) Od 1635 uzoraka meke ili tekuće stolice ispitanih testom BD MAX Cdiff assay, 47 (2,9 %) je prijavljeno kao neriješeni nakon prvotnog ispitivanja. Trideset i četiri (34) od tih uzoraka je ponovljeno, a 26 je riješeno ponovnim testiranjem. Ukupno je 0,5 % ostalo neriješeno nakon ponovnog testiranja. Analitička osjetljivost Analitička osjetljivost (granica otkrivanja ili LoD) za BD MAX Cdiff assay utvrđena je na sljedeći način: Za pripremu simuliranih pozitivnih uzoraka, ušice za inokulaciju su umočene u široki spektar suspenzija bakterije Clostridium difficile pri različitim koncentracijama koje su pripremljene i kvantificirane iz kultura 4 soja Clostridium difficile koji predstavljaju 3 vrste toksigenosti (0, III, VIII). Svaka ušica prenijeta je u epruvetu s puferom za uzorak koja je već sadržavala fekalnu matricu negativnu na toksigenu bakteriju Clostridium difficile. Svaki soj bakterije Clostridium difficile testirala su 2 rukovatelja u 24 replikata za svaku koncentraciju i to koristeći 3 različite proizvodne serije kompleta BD MAX Cdiff assay. Analitička osjetljivost (LoD), definirana kao najniža koncentracija pri kojoj barem 95 % svih replikata daje pozitivan rezultat testa, bila je u rasponu od 125 do 265 CFU-a po ušici (tablica 4). 8

9 Soj Clostridium difficile Tablica 4: analitička osjetljivost testa BD MAX Cdiff Assay Vrsta toksigenosti 9 LoD (CFU/ušica [95 % IP a ]) ATCC [140, 502] ATCC [82, 298] ATCC BAA-1805 III 205 [102, 412] a IP: interval pouzdanosti ATCC VIII 125 [66, 235] Analitička uključivost U ovu studiju uključen je niz toksigenih sojeva bakterije Clostridium difficile, uzimajući u obzir geografsko podrijetlo, vrste toksigenosti, epidemije NAP1/027/BI i vremenske razlike. Ispitana su šezdeset i četiri (64) soja, uključujući 23 vrste toksigenosti 19-21, koji predstavljaju 21 državu, uključujući sojeve iz javnih zbirki i iz dobro okarakteriziranih kliničkih izolata. Analiza je točno identificirala sve ispitane toksigene sojeve Clostridium difficile. Analitička specifičnost BD MAX Cdiff assay je izvršen na uzorcima koji su sadržavali filogenetski povezane vrste (Clostridium koji nije toksigeni Clostridium difficile) ili druge organizme (bakterije i viruse) koji se često nalaze u uzorcima stolice. Šest (6) od 6 sojeva bakterije Clostridium difficile koji ne nose gen tcdb, testiranih pri koncentraciji od 1 X 10 8 CFU/mL, dali su negativne rezultate na testu BD MAX Cdiff assay. Trideset (30) od 30 sojeva bakterije Clostridium koji nisu Clostridium difficile (uključujući 4 soja Clostridium sordellii), ispitanih pri koncentraciji od 1 X 10 8 CFU/mL, dali su negativne rezultate na testu BD MAX Cdiff assay. Devedeset i osam (98) od 98 drugih bakterijskih sojeva (uključujući 93 vrste i podvrste), ispitanih pri koncentraciji od 1 X 10 8 CFU/mL (ili ~ 1 X 10 8 cp-a genomskog DNK / ml ili 1 X 10 8 elementarnih tijela / ml), dalo je negativne rezultate na testu BD MAX Cdiff assay. Sedam (7) od 7 virusa, ispitanih pri koncentraciji od 1 X 10 5 PFU/mL, dalo je negativne rezultate na testu BD MAX Cdiff assay. Tvari koje interferiraju Procijenjena je potencijalna interferencija dvadeset i pet (25) bioloških i kemijskih tvari koje se povremeno rabe ili nalaze u perianalnim uzorcima i/ili uzorcima stolice s testom BD MAX Cdiff assay. Ispitana su i dva (2) organizma (Escherichia coli ATCC i Clostridium difficile koji nije toksigen ATCC ) pri visokim koncentracijama da bi se procijenila bakterijska interferencija. Uzorci negativni na toksigeni Clostridium difficile i uzorci pozitivni na toksigeni Clostridium difficile pri 2 3 x LoD ispitani su s najvećim količinama svake od tvari za koje je vjerojatno da će se naći u uzorcima ili s interferirajućim organizmima (1 X 10 8 CFU/mL za svaki soj). Potencijalno interferirajuće tvari uključuju kalcijev karbonat (Tums*) te magnezijev i aluminijev hidroksid (Maalox* tekućina). Rezultati su pokazali da za ostale ispitane tvari nema zabilježene interferencije, osim za klistir sa suspenzijom mesalazina za rektalnu primjenu i Gynol II* koji pokazuju blagu inhibiciju (odgađanje apscise vrha druge derivacije) testa BD MAX Cdiff assay. Unatoč tome, dobiveni su očekivani rezultati analize (tablica 5). Tablica 5: endogene i komercijalne egzogene tvari testirane analizom BD MAX Cdiff Assay Naziv robne marke ili opis Rezultat Naziv robne marke ili opis Rezultat Nistatin NI Pepto Bismol* NI Hyderm* hidrokortizon (mast) NI Ex-Lax* NI Glicerinski čepići NI Metronidazol NI Ihle s Paste (pasta) NI Vankomicin NI Anusol* Plus NI Polysporin* NI Preparation H* s Bio-Dyne* mast NI Naproksen NI Major Prep* s fenilefrinom NI Tucks* blazinice za osobno čišćenje NI Tums* I Mješavina triglicerida (C2-C10) NI Maalox* tekućina I Palmitinska kiselina NI Klistir sa suspenzijom mesalazina za rektalnu primjenu a Stearična kiselina NI Fleet* klistir s mineralnim uljem NI Krv NI Gynol II* vaginalni kontraceptiv (sadrži nonoksinol-9) a Sluz NI Imodium AD* NI Escherichia coli + Clostridium difficile koji nije toksigen NI I: interferencija s testom BD MAX Cdiff assay. NI: nije zabilježena interferencija s testom BD Cdiff assay. a Klistir sa suspenzijom mesalazina za rektalnu primjenu i Gynol II* (koji sadrži nonoksinol-9) pokazali su blagu inhibiciju (odgađanje apscise vrha druge derivacije) u testu BD MAX Cdiff assay, ali su svejedno dobiveni očekivani rezultati analize.

10 Ponovljivost Skup testova ponovljivosti sastojao se od sljedećih 5 kategorija uzoraka: umjereno pozitivna (UP): 2 5 X LoD nisko pozitivna (NP): 1 2 X LoD visoko negativna 1: 10 (VN1:10): razrjeđivanje 1 X LoD 10 puta visoko negativna 1: 100 (VN1:100): razrjeđivanje 1X LoD 100 puta stvarno negativna. Uzorci u svakoj od kategorija trostruko su ispitani na 5 različitih dana, a svaki dan su 2 različita tehnologa testirala 2 skupa testova u 3 klinike koristeći 1 seriju reagensa (ponovljivost između lokacija). Ukupan postotak slaganja bio je 100 % za kategorije MP, LP i Neg, a 92,2 % i 50,0 % negativnog slaganja za kategorije HN1:100 i HN1:10 (tablica 6). Apscisa vrha druge derivacije (SDPA), temeljna brojčana vrijednost koja se koristi za određivanje konačnih rezultata analize, odabrana je kao dodatno sredstvo procjene ponovljivosti analize. Ukupne srednje vrijednosti SDPA-ova s komponentama varijance (SD i %KV) prikazane su u tablici 6. Kategorija Tablica 6: rezultati ispitivanja ponovljivosti između lokacija koristeći jednu seriju LOKACIJA 1. lokacija 2. lokacija 3. lokacija Postotak slaganja Postotak slaganja Postotak slaganja Ukupni postotak slaganja Vrijednosti SDPA-ova a Ukupna srednja vrijednost Neg a 30/30 100,0 % 30/30 100,0 % 30/30 100,0 % 100,0 % (95,9 %, 100,0 %) 28,7 0,30 1,1 HN1:100 a, b 28/30 93,3 % 25/30 83,3 % 30/30 100,0 % 92,2 % (84,8 %, 96,2 %) 28,8 0,39 1,4 HN1:10 a, b 17/30 56,7 % 8/30 26,7 % 20/30 66,7 % 50,0 % (39,9 %, 60,1 %) 28,8 0,36 1,2 NP 30/30 100,0 % 30/30 100,0 % 30/30 100,0 % 100,0 % (95,9 %, 100,0 %) 32,5 0,77 2,4 UP 30/30 100,0 % 30/30 100,0 % 30/30 100,0 % 100,0 % (95,9 %, 100,0 %) 31,6 0,82 2,6 a Za negativne i visoko negativne kategorije, prijavljene su vrijednosti SDPA-ova za kontrolu obrade uzoraka. Za ostale kategorije, prijavljene su vrijednosti SDPA-ova za bakteriju Clostridium difficile koja je toksigena. b Za visoko negativne kategorije, očekivani rezultati analize smatraju se negativnima. Stoga je postotak podudaranja izračunat za negativne rezultate. SD %KV Prijenosna/križna kontaminacija Provedeno je istraživanje prijenosa unutar jedne obrade i prijenosa između obrada tijekom obrade uzoraka s velikom količinom bakterije Clostridium difficile koja je toksigena u testu BD MAX Cdiff assay. Za pripremu brojnih uzoraka korišten je skup testova koji se sastojao od jednog visoko pozitivnog i jednog negativnog člana. Soj bakterije Clostridium difficile (Tox 0, ATCC 9689) upotrijebljen je za visoko pozitivni član skupa testova Clostridium difficile (~3 x 10 8 CFU/mL). Negativni član nije sadržavao nijedan od ciljnih analita. Testirano je dvanaest (12) replikata visoko pozitivnog člana skupa testova i 12 replikata negativnog člana skupa testova u svakoj obradi uz izmjenu negativnih i pozitivnih uzoraka. Tri (3) rukovatelja izvela su 3 uzastopne obrade, odnosno ukupno 9 testova s 24 uzorka. Nije bilo lažnih pozitivnih rezultata zbog kontaminacije prijenosom. REFERENCE 1. Dubberke ER, Wertheimer AI. Review of current literature on the economic burden of Clostridium difficile infection. Infect Control Hosp Epidemiol 2009; 30: Poutanen SM, Simor AE. Clostridium difficile-associated diarrhea in adults. Can Med Assoc J 2004;171: Redelings MD, Sorvillo F, Mascola L. Increase in Clostridium difficile-related mortality rates, United States, Emerg Infect Dis 2007;13: McDonald LC, Owing M, Jernigan DB. Clostridium difficile Infection in Patients Discharged from US Short-Stay hospitals, Emerging Infectious Diseases, 2006, 12 (3): Pepin J, Valiquettte L, Alary ME. Clostridium difficile associated diarrhea in a region of Quebec from 1991 to 2003: a changing pattern of disease severity. CMAJ. 2004;171: Bignardi GE. Risk factors for Clostridium difficile infection. J Hosp Infect 1998; 40: Peterson LR, Robicsek A. Does my patient have Clostridium difficile infection? Ann Intern Med 2009;151: Lyras D, O Connor JR, Howarth PM, et al. Toxin B is essential for virulence of Clostridium difficile. Nature 2009;458: Delmee M. Laboratory diagnosis of Clostridium difficile disease. Clin Microbiol Infect Aug;7(8): Clinical and Laboratory Standards Institute. Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections; Approved Guideline. Document M29 (Refer to the latest edition). 11. Centers for Disease Control and Prevention, and National Institutes of Health. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. Chosewood L.C. and Wilson D.E. (eds) (2009). HHS Publication number (CDC) BD MAX System User s Manual (Refer to the latest version) BD Life Sciences, Sparks, MD, USA. 13. Clinical and Laboratory Standards Institute. Molecular Diagnostic Methods for Infectious Diseases; Approved Guideline, document MM03 (Refer to the latest edition). 10

11 14. Clinical and Laboratory Standards Institute. User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance; Approved Guideline. Document EP12 (Refer to the latest edition). 15. Cohen SH et al. (1998) Isolation of a Toxin B-deficient mutant strain of Clostridium difficile in a case of recurrent Clostridium difficile Associated Diarrhea, Clin. Infect. Dis. 26: Cohen SH et al. (2000) Analysis of the pathogenicity locus in Clostridium difficile strains, J. Infect. Dis. 181: MacCannell D. et al. (2006) Characterization of a novel, tcdb-deficient, NPA1 variant strain of Clostridium difficile, 46th Annual ICAAC, San Francisco, Sept McFarland, L.V., et al., Implications of the changing face of Clostridium difficile disease for health care practitioners. Am J Infect Control, (4): p Rupnik M. et al. A novel toxinotyping scheme and correlation of toxinotypes with serogroups of Clostridium difficile isolates, J Clin Microbiol, 1998, 36 (8): Rupnik M. et al. Comparison of toxinotyping and PCR ribotyping of Clostridium difficile strains and description of novel toxinotypes, Microbiology 2001, 147, Rupnik M. et al. New types of Toxin A-Negative, Toxin B-Positive strains among Clostridium difficile isolates from Asia, J Clin Microbiol, 2003, 41(3):

12 Manufacturer / Производител / Výrobce / Fabrikant / Hersteller / Κατασκευαστής / Fabricante / Tootja / Fabricant / Proizvođać / Gyártó / Fabbricante / Атқарушы / 제조업체 / Gamintojas / Ražotājs / Tilvirker / Producent / Producător / Производитель / Výrobca / Proizvođač / Tillverkare / Üretici / Виробник / 生产厂商 Use by / Използвайте до / Spotřebujte do / Brug før / Verwendbar bis / Χρήση έως / Usar antes de / Kasutada enne / Date de péremption / 사용기한 / Upotrijebiti do / Felhasználhatóság dátuma / Usare entro / Дейін пайдалануға / Naudokite iki / Izlietot līdz / Houdbaar tot / Brukes for / Stosować do / Prazo de validade / A se utiliza până la / Использовать до / Použite do / Upotrebiti do / Använd före / Son kullanma tarihi / Використати до\line / 使用截止日期 YYYY-MM-DD / YYYY-MM (MM = end of month) ГГГГ-ММ-ДД / ГГГГ-ММ (ММ = края на месеца) RRRR-MM-DD / RRRR-MM (MM = konec měsíce) ÅÅÅÅ-MM-DD / ÅÅÅÅ-MM (MM = slutning af måned) JJJJ-MM-TT / JJJJ-MM (MM = Monatsende) ΕΕΕΕ-MM-HH / ΕΕΕΕ-MM (MM = τέλος του μήνα) AAAA-MM-DD / AAAA-MM (MM = fin del mes) AAAA-KK-PP / AAAA-KK (KK = kuu lõpp) AAAA-MM-JJ / AAAA-MM (MM = fin du mois) GGGG-MM-DD / GGGG-MM (MM = kraj mjeseca) ÉÉÉÉ-HH-NN / ÉÉÉÉ-HH (HH = hónap utolsó napja) AAAA-MM-GG / AAAA-MM (MM = fine mese) ЖЖЖЖ-АА-КК / ЖЖЖЖ-АА / (АА = айдың соңы) YYYY-MM-DD/YYYY-MM(MM = 월말 ) MMMM-MM-DD / MMMM-MM (MM = mėnesio pabaiga) GGGG-MM-DD/GGGG-MM (MM = mēneša beigas) JJJJ-MM-DD / JJJJ-MM (MM = einde maand) ÅÅÅÅ-MM-DD / ÅÅÅÅ-MM (MM = slutten av måneden) RRRR-MM-DD / RRRR-MM (MM = koniec miesiąca) AAAA-MM-DD / AAAA-MM (MM = fim do mês) AAAA-LL-ZZ / AAAA-LL (LL = sfârşitul lunii) ГГГГ-ММ-ДД / ГГГГ-ММ (ММ = конец месяца) RRRR-MM-DD / RRRR-MM (MM = koniec mesiaca) GGGG-MM-DD / GGGG-MM (MM = kraj meseca) ÅÅÅÅ-MM-DD / ÅÅÅÅ-MM (MM = slutet av månaden) YYYY-AA-GG / YYYY-AA (AA = ayın sonu) РРРР-MM-ДД / РРРР-MM (MM = кінець місяця) YYYY-MM-DD / YYYY-MM (MM = 月末 ) Catalog number / Каталожен номер / Katalogové číslo / Katalognummer / Αριθμός καταλόγου / Número de catálogo / Katalooginumber / Numéro catalogue / Kataloški broj / Katalógusszám / Numero di catalogo / Каталог нөмірі / 카탈로그번호 / Katalogo / numeris / Kataloga numurs / Catalogus nummer / Numer katalogowy / Număr de catalog / Номер по каталогу / Katalógové číslo / Kataloški broj / Katalog numarası / Номер за каталогом / 目录号 Authorized Representative in the European Community / Оторизиран представител в Европейската общност / Autorizovaný zástupce pro Evropském společenství / Autoriseret repræsentant i De Europæiske Fællesskaber / Autorisierter Vertreter in der Europäischen Gemeinschaft / Εξουσιοδοτημένος αντιπρόσωπος στην Ευρωπαϊκή Κοινότητα / Representante autorizado en la Comunidad Europea / Volitatud esindaja Euroopa Nõukogus / Représentant autorisé pour la Communauté européenne / Autorizuirani predstavnik u Europskoj uniji / Meghatalmazott képviselő az Európai Közösségben / Rappresentante autorizzato nella Comunità Europea / Европа қауымдастығындағы уәкілетті өкіл / 유럽공동체의위임대표 / Įgaliotasis atstovas Europos Bendrijoje / Pilnvarotais pārstāvis Eiropas Kopienā / Bevoegde vertegenwoordiger in de Europese Gemeenschap / Autorisert representant i EU / Autoryzowane przedstawicielstwo we Wspólnocie Europejskiej / Representante autorizado na Comunidade Europeia / Reprezentantul autorizat pentru Comunitatea Europeană / Уполномоченный представитель в Европейском сообществе / Autorizovaný zástupca v Európskom spoločenstve / Autorizovano predstavništvo u Evropskoj uniji / Auktoriserad representant i Europeiska gemenskapen / Avrupa Topluluğu Yetkili Temsilcisi / Уповноважений представник у країнах ЄС / 欧洲共同体授权代表 In Vitro Diagnostic Medical Device / Медицински уред за диагностика ин витро / Lékařské zařízení určené pro diagnostiku in vitro / In vitro diagnostisk medicinsk anordning / Medizinisches In-vitro-Diagnostikum / In vitro διαγνωστική ιατρική συσκευή / Dispositivo médico para diagnóstico in vitro / In vitro diagnostika meditsiiniaparatuur / Dispositif médical de diagnostic in vitro / Medicinska pomagala za In Vitro Dijagnostiku / In vitro diagnosztikai orvosi eszköz / Dispositivo medicale per diagnostica in vitro / Жасанды жағдайда жүргізетін медициналық диагностика аспабы / In Vitro Diagnostic 의료기기 / In vitro diagnostikos prietaisas / Medicīnas ierīces, ko lieto in vitro diagnostikā / Medisch hulpmiddel voor in-vitro diagnostiek / In vitro diagnostisk medisinsk utstyr / Urządzenie medyczne do diagnostyki in vitro / Dispositivo médico para diagnóstico in vitro / Dispozitiv medical pentru diagnostic in vitro / Медицинский прибор для диагностики in vitro / Medicínska pomôcka na diagnostiku in vitro / Medicinski uređaj za in vitro dijagnostiku / Medicinteknisk produkt för in vitro-diagnostik / İn Vitro Diyagnostik Tıbbi Cihaz / Медичний пристрій для діагностики in vitro / 体外诊断医疗设备 Temperature limitation / Температурни ограничения / Teplotní omezení / Temperaturbegrænsning / Temperaturbegrenzung / Περιορισμοί θερμοκρασίας / Limitación de temperatura / Temperatuuri piirang / Limites de température / Dozvoljena temperatura / Hőmérsékleti határ / Limiti di temperatura / Температураны шектеу / 온도제한 / Laikymo temperatūra / Temperatūras ierobežojumi / Temperatuurlimiet / Temperaturbegrensning / Ograniczenie temperatury / Limites de temperatura / Limite de temperatură / Ограничение температуры / Ohraničenie teploty / Ograničenje temperature / Temperaturgräns / Sıcaklık sınırlaması / Обмеження температури / 温度限制 Batch Code (Lot) / Код на партидата / Kód (číslo) šarže / Batch-kode (lot) / Batch-Code (Charge) / Κωδικός παρτίδας (παρτίδα) / Código de lote (lote) / Partii kood / Numéro de lot / Lot (kod) / Tétel száma (Lot) / Codice batch (lotto) / Топтама коды / 배치코드 ( 로트 ) / Partijos numeris (LOT) / Partijas kods (laidiens) / Lot nummer / Batch-kode (parti) / Kod partii (seria) / Código do lote / Cod de serie (Lot) / Код партии (лот) / Kód série (šarža) / Kod serije / Partinummer (Lot) / Parti Kodu (Lot) / Код партії / 批号 ( 亚批 ) Contains sufficient for <n> tests / Съдържанието е достатъчно за <n> теста / Dostatečné množství pro <n> testů / Indeholder tilstrækkeligt til <n> tests / Ausreichend für <n> Tests / Περιέχει επαρκή ποσότητα για <n> εξετάσεις / Contenido suficiente para <n> pruebas / Küllaldane <n> testide jaoks / Contenu suffisant pour <n> tests / Sadržaj za <n> testova / <n> teszthez elegendő / Contenuto sufficiente per <n> test / <п> тесттері үшін жеткілікті / <n> 테스트가충분히포함됨 / Pakankamas kiekis atlikti <n> testų / Satur pietiekami <n> pārbaudēm / Inhoud voldoende voor n testen / Innholder tilstrekkelig til <n> tester / Zawiera ilość wystarczającą do <n> testów / Conteúdo suficiente para <n> testes / Conţinut suficient pentru <n> teste / Достаточно для <n> тестов(а) / Obsah vystačí na <n> testov / Sadržaj dovoljan za <n> testova / Innehåller tillräckligt för <n> analyser / <n> test için yeterli malzeme içerir / Вистачить для аналізів: <n> / 足够进行 <n> 次检测 Consult Instructions for Use / Направете справка в инструкциите за употреба / Prostudujte pokyny k použití / Se brugsanvisningen / Gebrauchsanweisung beachten / Συμβουλευτείτε τις οδηγίες χρήσης / Consultar las instrucciones de uso / Lugeda kasutusjuhendit / Consulter la notice d emploi / Koristi upute za upotrebu / Olvassa el a használati utasítást / Consultare le istruzioni per l uso / Пайдалану нұсқаулығымен танысып алыңыз / 사용지침참조 / Skaitykite naudojimo instrukcijas / Skatīt lietošanas pamācību / Raadpleeg de gebruiksaanwijzing / Se i bruksanvisningen / Zobacz instrukcja użytkowania / Consultar as instruções de utilização / Consultaţi instrucţiunile de utilizare / См. руководство по эксплуатации / Pozri Pokyny na používanie / Pogledajte uputstvo za upotrebu / Se bruksanvisningen / Kullanım Talimatları na başvurun / Див. інструкції з використання / 请参阅使用说明 Do not reuse / Не използвайте отново / Nepoužívejte opakovaně / Ikke til genbrug / Nicht wiederverwenden / Μην επαναχρησιμοποιείτε / No reutilizar / Mitte kasutada korduvalt / Ne pas réutiliser / Ne koristiti ponovo / Egyszer használatos / Non riutilizzare / Пайдаланбаңыз / 재사용금지 / Tik vienkartiniam naudojimui / Nelietot atkārtoti / Niet opnieuw gebruiken / Kun til engangsbruk / Nie stosować powtórnie / Não reutilize / Nu refolosiţi / Не использовать повторно / Nepoužívajte opakovane / Ne upotrebljavajte ponovo / Får ej återanvändas / Tekrar kullanmayın / Не використовувати повторно / 请勿重复使用 Serial number / Сериен номер / Sériové číslo / Serienummer / Seriennummer / Σειριακός αριθμός / Nº de serie / Seerianumber / Numéro de série / Serijski broj / Sorozatszám / Numero di serie / Топтамалық нөмірі / 일련번호 / Serijos numeris / Sērijas numurs / Serie nummer / Numer seryjny /Número de série / Număr de serie / Серийный номер / Seri numarası / Номер серії / 序列号 For IVD Performance evaluation only / Само за оценка качеството на работа на IVD / Pouze pro vyhodnocení výkonu IVD / Kun til evaluering af IVD ydelse / Nur für IVD- Leistungsbewertungszwecke / Mόνο για αξιολόγηση απόδοσης IVD / Sólo para la evaluación del rendimiento en diagnóstico in vitro / Ainult IVD seadme hindamiseks / Réservé à l évaluation des performances IVD / Samo u znanstvene svrhe za In Vitro Dijagnostiku / Kizárólag in vitro diagnosztikához / Solo per valutazione delle prestazioni IVD / Жасанды жағдайда «пробирка ішінде»,диагностикада тек жұмысты бағалау үшін / IVD 성능평가에대해서만사용 / Tik IVD prietaisų veikimo charakteristikoms tikrinti / Vienīgi IVD darbības novērtēšanai /Uitsluitend voor doeltreffendheidsonderzoek / Kun for evaluering av IVD-ytelse / Tylko do oceny wydajności IVD / Uso exclusivo para avaliação de IVD / Numai pentru evaluarea performanţei IVD / Только для оценки качества диагностики in vitro / Určené iba na diagnostiku in vitro / Samo za procenu učinka u in vitro dijagnostici / Endast för utvärdering av diagnostisk användning in vitro / Yalnızca IVD Performans değerlendirmesi için / Тільки для оцінювання якості діагностики in vitro / 仅限 IVD 性能评估 For US: For Investigational Use Only Lower limit of temperature / Долен лимит на температурата / Dolní hranice teploty / Nedre temperaturgrænse / Temperaturuntergrenze / Κατώτερο όριο θερμοκρασίας / Límite inferior de temperatura / Alumine temperatuuripiir / Limite inférieure de température / Najniža dozvoljena temperatura / Alsó hőmérsékleti határ / Limite inferiore di temperatura / Температураның төменгі руқсат шегі / 하한온도 / Žemiausia laikymo temperatūra / Temperatūras zemākā robeža /Laagste temperatuurlimiet / Nedre temperaturgrense / Dolna granica temperatury / Limite minimo de temperatura / Limită minimă de temperatură / Нижний предел температуры / Spodná hranica teploty / Donja granica temperature / Nedre temperaturgräns / Sıcaklık alt sınırı / Мінімальна температура / 温度下限 Control / Контролно / Kontrola / Kontrol / Kontrolle / Μάρτυρας / Kontroll / Contrôle / Controllo / Бақылау / 컨트롤 / Kontrolė / Kontrole / Controle / Controlo / Контроль / kontroll / Контроль / 对照 12