MAX Cdiff Za in vitro dijagnostičku upotrebu P0215(02) Koristiti sa sistemom BD MAX Srpski NAMENA Analiza BD MAX Cdiff obavljena na sis

Транскрипт

1 MAX Cdiff Za in vitro dijagnostičku upotrebu P0215(02) Koristiti sa sistemom BD MAX Srpski NAMENA Analiza BD MAX Cdiff obavljena na sistemu BD MAX je automatizovani in vitro dijagnostički test za direktno, kvalitativno opažanje toksina B gena Clostridium difficile (tcdb) u uzorcima tečne ili mekane stolice pacijenata za koje se sumnja da imaju infekciju vrstom Clostridium difficile (CDI). Test koji je obavljen direktno na uzorku, koristi lančanu reakciju polimeraze (PCR) u realnom vremenu za pojačavanje toksina B gena DNK Clostridium difficile i fluorogenične hibridizacijske probe specifične za cilj radi otkrivanja pojačanog DNK. Analiza BD MAX Cdiff treba da pomogne u dijagnozi CDI. SAŽETAK I OBJAŠNJENJE POSTUPKA Clostridium difficile je anaerobni, gram-pozitivan bacil koji je glavni uzročnik antibiotske dijareje i pseudomembranoznog kolitisa u zdravstvenim ustanovama. 1,2 Učestalost CDI je u porastu a teški slučajevi postaju sve više uobičajeni. 3,4,5 Simptomi bolesti CDI se kreću od blage dijareje do ozbiljnog kolitisa, čak i perforacije creva i smrti. Najčešći faktor rizika je izlaganje antibioticima. 6 Dijagnoza infekcije bacilom Clostridium difficile zasniva se na kliničkim znakovima i simptomima, kao što su dijareja i laboratorijski ili patološki testovi. Laboratorijska dijagnoza toksičnog bacila Clostridium difficile obuhvata anaerobne kulture praćene otkrivanjem toksina ili otkrivanjem toksičnih gena ili enzima pronađenih u stolici. 7 Izgleda da je toksin B neophodan za razvoj CDI. 8 Analiza citotoksičnosti u testu sa kulturom tkiva koji se obavlja direktno na stolici ili na izolovanim sojevima vrste Clostridium difficile zahteva puno rada i vremena a vreme za dobijanje rezultata je između 24 i 96 sati. Enzimsko imunoispitivanje (EIA) korišćeno za otkrivanje toksina A i B i glutamat dehidrogenaze (GDH), enzima koji se nalazi u svim sojevima Clostridium difficile, trenutno se koristi u većini kliničkih laboratorija zato što su rezultati dostupni istog dana, lako se izvodi i relativno je jeftino. Međutim, osetljivost je niska, posebno za toksinske analize EIA što može da dovede do propuštenih pozitivnih rezultata. 7 Nedavno su razvijene PCR metode za otkrivanje toksina A i/ili toksina B sa visokom osetljivošću i specifičnošću u poređenju sa ispitivanjima citotoksičnosti ćelije i imunoispitivanjima. 9 Osim toga, ovi testovi se mogu obaviti za manje od tri sata. Kombinacija tih karakteristika može omogućiti ažuran ciljani tretman pacijenata sa CDI-om i time potencijalno poboljšan ishod za pacijenta, smanjeno vreme oporavka i kontrolu infektivnih oboljenja. PRINCIPI PROCEDURE Uzima se uzorak tečne ili mekane stolice i prenosi se u laboratoriju. Za testiranje se jednokratna omča za inokulaciju od 10 µl umoči u uzorak stolice i potom se nanosi u epruvetu BD MAX Cdiff Sample Buffer Tube. Epruveta sa puferom za uzorak se zatvara opnastim čepom i meša vorteks mešalicom. Pravi se radna lista, a u sistem BD MAX se umeću epruveta sa puferom za uzorak, unificirana reagens traka BD MAX Cdiff i patrona BD MAX PCR. Sistem BD MAX automatski priprema uzorke, uključujući ciljnu lizu, izdvajanje i koncentraciju DNK, rehidrataciju reagensa, kao i pojačavanje i otkrivanje ciljnih nukleinskih kiselina pomoću PCR-a u stvarnom vremenu. Sistem BD MAX automatski tumači rezultate. Test takođe uključuje kontrolu obrade uzoraka koja se nalazi u epruveti za izdvajanje. Kontrola obrade uzoraka prati korake izdvajanja DNK, korake termalnog kruženja, celovitost reagensa i prisutnost inhibitornih supstanci. Nakon enzimske lize ćelija, otpuštene nukleinske kiseline se zadržavaju na magnetnim kuglicama. Kuglice, koje vežu nukleinske kiseline, peru se pomoću pufera za ispiranje, a nukleinske kiseline se ispiru toplotom u puferu za eluciju. Isprana DNK se neutralizuje pomoću pufera za neutralizaciju i prenosi se u glavnu mešavinu kako bi rehidratizovala PCR reagense. Nakon rekonstitucije sistem BD MAX u patroni DB MAX PCR dozira fiksnu zapreminu rastvora spremnog za PCR koji sadrži izdvojene nukleinske kiseline. Sistem zapečaćuje mikroventile u patroni BD MAX PCR pre pokretanja PCR procesa koji uključuje mešavinu za amplifikaciju i tako sprečava isparavanje i kontaminaciju. 1

2 Pojačana DNK otkriva se pomoću proba (TaqMan) za hidrolizu, označenim na jednom kraju fluorescentnom bojom (fluorofor), a na drugom kraju prigušivačem. Probe označene različitim fluoroforima koriste se za otkrivanje tcdb i amplikona za kontrolu obrade uzoraka u dva različita optička kanala sistema BD MAX. Kada su probe u svom prirodnom stanju, fluorescencija fluorofora je prigušena zbog njegove blizine prigušivaču. Međutim, u prisutnosti ciljne DNK, probe hibridizuju u dodatnim redosledima i hidrolizuju se pomoću aktivnosti 5' 3' egzonukleaze polimeraze DNK dok se ona sintetizuje sa nascentnom trakom duž DNK šablona. Kao rezultat, fluorofori se odvajaju od molekula prigušivača i emituje se fluorescencija. Količina otkrivene fluorescencije u dva optička kanala koji se koriste za test BD MAX Cdiff direktno je proporcionalna količini odgovarajuće hidrolizovane probe. Sistem BD MAX prati ove signale u svakom ciklusu PCR-a i tumači podatke na kraju programa kako bi obezbedio krajnji rezultat. REAGENSI I MATERIJALI Kat. br. Sadržaj Količina BD MAX Cdiff Master Mix (Glavna mešavina BD MAX Cdiff) Glavna mešavina PCR, sušena, sadrži tcdb specifične molekularne probe i prajmere, zajedno sa molekularnim probama specifičnim za kontrolu obrade uzoraka. BD MAX Cdiff Strips (Trake BD MAX Cdiff) Unificirane reagens trake koje sadrže sve tečne reagense i vrhove pipeta za jednokratnu upotrebu potrebne za obradu uzoraka i izdvajanje DNK. BD MAX Cdiff Extraction Tube (Epruveta za izdvajanje BD MAX Cdiff) Suvo zamrznuti talog koji sadrži DNK magnetne prianjajuće kuglice, akromopeptidazu i kontrolu obrade uzorka. BD MAX Sdiff Sample Buffer Tube (Epruveta sa puferom za uzorak BD MAX Cdiff) 2 24 testa 24 testa 24 testa 24 testa Opnasti čepići 25 POTREBNI MATERIJALI KOJI NISU PRILOŽENI BD MAX PCR Cartridges (patrone za PCR BD MAX) (BD Diagnostic Systems kataloški br ) Vorteks mešalica VWR Multi-Tube Vortexer (VWR kataloški br ) Vortex Genie 2 (vorteks mešalica Genie 2) (VWR kataloški br ) ili ekvivalent Držač bočica NALGENE Cryogenic Vial Holder (VWR, kataloški br ) Disposable inoculating loops (inokulacione omče za jednokratnu upotrebu) (10 µl) Rukavice za jednokratnu upotrebu, bez pudera Suvi, čisti kontejneri za skupljanje uzoraka tečne ili mekane stolice Ako se kultivacija obavlja za spoljne kontrole: predredukovana pločica s agarom za anaerobe (npr. Brucella agar sa 5% ovčje krvi, pločica sa heminom i vitaminom K1, BBL kataloški br ) UPOZORENJA I MERE OPREZA Test BD MAX Cdiff služi za in vitro dijagnostičku upotrebu. Ovaj proizvod se može koristiti samo u sistemu BD MAX. Nemojte koristiti reagense i/ili materijale nakon isteka roka trajanja. Komplet nemojte upotrebljavati ako je sigurnosni pečat na spoljnoj kutiji slomljen prilikom dostave. Ne koristite reagense ako je njihova zaštitna kesica otvorena ili oštećena prilikom dostave. Ne koristite reagense ako u kesicama reagensa nema upijača vlage ili ako je slomljen. Ne uklanjajte upijač vlage iz kesica reagensa. Brzo zatvorite zaštitne kesice reagenasa patent zatvaračem nakon svake upotrebe. Uklonite sav višak vazduha u kesicama pre zatvaranja. Zaštitite reagense od toplote i vlage. Duža izloženost vlazi će uticati na rad proizvoda. Ne koristite reagense ako je folija pocepana ili oštećena. Nemojte mešati reagense iz različitih kesica i/ili kompleta i/ili serija. Ne zamenjujte i ne koristite ponovo kapice poklopaca jer može doći do kontaminacije koja može da kompromituje rezultate. Proverite da li su unificirane reagens trake u dodiru sa odgovarajućim tečnostima (proverite da li su tečnosti na dnu epruveta) (pogledajte sliku 1). Proverite unificirane reagens trake da biste se uverili da sadrže vrhove pipeta (pogledajte sliku 1). Pri korišćenju hemijskih rastvora postupajte oprezno jer se čitljivost bar kodova glavne mešavine i epruvete za izdvajanje može smanjiti. Dobra laboratorijska tehnika ključna je za odgovarajuće sprovođenje ovog testa. Zbog visoke analitičke osetljivosti ovog testa potrebno je biti krajnje pažljiv kako bi se očuvala čistoća svih materijala i reagenasa. U slučajevima gde se drugi PCR testovi obavljaju u istom opštem području laboratorije, potrebno je biti oprezan kako se ne bi kontaminirao test BD MAX Cdiff, ostali reagensi potrebni za testiranje, kao ni sistem BD MAX. Uvek izbegavajte kontaminaciju reagensa mikrobima i dezoksiribonukleazom (DNaza). Rukavice se moraju promeniti pre rukovanja reagensima i patronama. Kako bi se izbeglo zagađenje okoline amplikonima, ne razdvajajte patrone BD MAX PCR nakon korišćenja. Sigurnosni pečati na patronama BD MAX PCR osmišljeni su za sprečavanje zagađenja. Laboratorija mora da obavlja rutinsko praćenje okoline kako bi se smanjio rizik unakrsne kontaminacije.

3 Patrone za mikrofluide BD MAX mogu se koristiti za najviše dve analize. Obavljanje testa BD MAX Cdiff van preporučenih vremenskih okvira može dati pogrešne rezultate. Testove koji nisu završeni u okviru određenog vremena potrebno je ponoviti. Mogu se testirati dodatne kontrole u skladu sa smernicama ili zahtevima lokalnih, pokrajinskih i/ili državnih propisa ili organizacija koje donose propise. Uvek rukujte uzorcima kao da su infektivni i u skladu sa sigurnosnim postupcima u laboratoriji, kao što su oni opisani u dokumentu CLSI M29 10 i dokumentu Biološka sigurnost u mikrobiološkim i biomedicinskim laboratorijama. 11 Dok rukujete svim reagensima, nosite zaštitnu odeću i rukavice za jednokratnu upotrebu. Nakon obavljenog testa temeljno operite ruke. Ne pipetirajte ustima. Ne pušite, ne pijte, ne žvaćite i ne jedite u prostorima gde se rukuje uzorcima ili reagensima kompleta. Neiskorišćene reagense i otpad odložite u skladu sa lokalnim, državnim, regionalnim i/ili saveznim propisima. Proučite korisnički priručnik sistema BD MAX 12 za dodatna upozorenja, mere opreza i postupke. ČUVANJE I STABILNOST Prikupljeni uzorci treba da se čuvaju tokom prevoza na temperaturi između 2 C i 25 C. Zaštitite ih od zamrzavanja ili izlaganja prevelikoj toploti. Uzorci se mogu čuvati do 5 dana na 2 8 C ili do 48 sati na 2 25 C pre testiranja. Komponente sistema BD MAX Cdiff su stabilne na 2 25 C do navedenog roka trajanja. Nemojte koristiti komponente nakon isteka roka trajanja. Glavna mešavina i epruvete za izdvajanje BD MAX Cdiff dolaze u zapečaćenim kesicama. Za zaštitu proizvoda od vlage, odmah zatvoriti nakon otvaranja. Epruvete reagensa su stabilne do 7 dana na 2 25 C nakon prvog otvaranja i zatvaranja. UPUTSTVA ZA UPOTREBU Prikupljanje/transport uzoraka Da bi se dobio odgovarajući uzorak, mora se tačno pratiti postupak prikupljanja uzoraka. Koristeći suvi, čisti kontejner, uzorci tečne ili mekane stolice prikupljaju se u skladu sa sledećim postupkom: 1. Prenesite tečnu ili mekanu stolicu (ali ne urin) u kontejner. Izbegavajte mešanje toaletnog papira, vode ili sapuna sa uzorkom. 2. Označite kontejner. 3. Isporučite kontejner do laboratorije u skladu sa standardnim radnim procedurama bolnice (pogledajte poglavlje Čuvanje i stabilnost). Priprema uzoraka NAPOMENA: Jedna (1) epruveta sa puferom za uzorak, jedan (1) opnasti čep, jedna (1) glavna mešavina, jedna (1) epruveta za izdvajanje i jedna (1) unificirana reagens traka potrebni su za svaki uzorak i svaku spoljnu kontrolu koja se testira. Pripremite potrebnu količinu materijala i izvadite ih iz zaštitnih kesica ili kutija. Da biste odložili otvorene kesice glavne mešavine ili epruveta za izdvajanje, uklonite višak vazduha i zatvorite kesice patent zatvaračem. 1. Epruvetu sa puferom za uzorak sa bar kodom (providni čep) označite odgovarajućim identifikacijskim podatkom uzorka pazeći da ne zaklonite ili prepišete bar kodove ili da ne nalepite drugu oznaku preko njih. 2. Mešajte vorteks mešalicom uzorak na velikoj brzini 15 sekundi i umočite inokulacionu omču od 10 μl u materijal za testiranje stolice. Kod uzoraka mekane stolice uklonite višak stolice koji se nalazi na spoljnoj strani omče kako biste uzeli otprilike 10 µl. 3. Skinite čep sa epruvete sa puferom za uzorak, a zatim stavite omču u tečnost. Umotajte omču prstima da biste oslobodili uzorak u epruvetu. 4. Zatvorite epruvetu opnastim čepom. 5. Stavite epruvetu sa puferom za uzorak u kriogenički držač bočica NALGENE. 6. Pripremite sve dodatne uzorke za testiranje ponavljanjem koraka od 1 do 5, a zatim odmah pređite na korak Na višepozicijskoj vorteks mešalici, sve pripremljene uzorke mešajte istovremeno na najvećoj brzini jedan (1) minut. Analiza BD MAX Cdiff se mora obaviti odmah nakon koraka mešanja u vorteks mešalici. 3

4 Rad sistema BD MAX NAPOMENA: Detaljna uputstva potražite u Korisničkom priručniku sistema BD MAX 12 (odeljak Rad sistema). NAPOMENA: Testiranje analize BD MAX Cdiff se mora obaviti odmah nakon gore opisanog koraka mešanja u vorteks mešalici (Priprema uzorka, korak 7). Ako je potrebno ponoviti testiranje, ponovo promešajte uzorke u vorteks mešalici. 1. Uključite sistem BD MAX (ako već niste) i prijavite se tako da unesete <user name> (korisničko ime) i <password> (lozinku). 2. Rukavice se moraju promeniti pre rukovanja reagensima i patronama. 3. Izvadite potreban broj unificiranih reagens traka iz kompleta BD MAX Cdiff. Nežno tapkajte trakom o tvrdu površinu da biste sve tečnosti doveli na dno epruveta. 4. Izvadite potreban broj epruveta za izdvajanje i epruveta sa glavnom mešavinom iz zaštitnih kesica. Uklonite sav višak vazduha iz kesica i zatvorite ih patent zatvaračem. 5. Za testiranje svakog uzorka postavite jednu (1) unificiranu reagens traku na stalak sistema BD MAX počevši od položaja 1 na stalku A. 6. Utisnite jednu (1) epruvetu za izdvajanje (bela folija) u unificirane reagens trake u položaju 1 kako je prikazano na slici Utisnite jednu (1) epruvetu glavne mešavine (zelena folija) u unificirane reagens trake u položaju 2 kako je prikazano na slici 1. Epruvete za umetanje Rezervoar za otpad Vrhovi pipeta #1 #2 #3 Epruveta za liziranje Epruveta za izdvajanje Cdiff Master Mix Pufer za eluciju Pufer za ispiranje Pufer za neutralizaciju Slika 1: Utiskivanje epruvete za izdvajanje i epruvete za glavnu mešavinu BD MAX Cdiff u unificiranu traku reagensa. 8. Kliknite na ikonu Run (Pokreni) i unesite serijski broj kompleta za test BD MAX Cdiff (radi praćenja serije) skeniranjem bar koda skenerom ili ga unesite ručno. NAPOMENA: Ponovite 8. korak prilikom svake upotrebe nove serije kompleta. 9. Dođite do kartice Worklist (Radna lista). U padajućem meniju izaberite <BD MAX Cdiff 56>. 10. U radnu listu unesite ID epruvete sa puferom za uzorak, ID pacijenta i pristupni broj (ako se traži), što možete učiniti skeniranjem bar koda ili ručnim unosom. 11. U padajućem meniju izaberite odgovarajući broj serije kompleta (koji se nalazi na spoljnoj kutiji). 12. Ponovite korake od 9 do 11 za sve preostale epruvete sa puferom za uzorak. 13. Postavite epruvete sa puferom za uzorak na stalke sistema BD MAX u skladu sa unificiranim trakama reagensa složenim u koracima 5 do 7. NAPOMENA: Epruvete sa puferom za uzorak postavite u stalke tako da 1D nalepnice sa bar kodovima budu okrenute ka spolja (to će vam olakšati skeniranje epruveta sa puferom za uzorak prilikom prijave uzoraka). 14. Stavite potreban broj patrona BD MAX PCR u sistem BD MAX (pogledajte sliku 2). Svaka patrona omogućava 2 kruga testiranja do 12 uzoraka za ukupno 24 uzorka. Sistem BD MAX će automatski odabrati položaj i red na patroni PCR za svaki krug testiranja. Patrone BD MAX PCR mogu se koristiti više puta, dok se svi žlebovi ne iskoriste. Da biste maksimalno iskoristili patrone BD MAX PCR, u 2000 Sample Mode (načinu rada za 2000 uzoraka) odaberite Run Wizard (Čarobnjak za obradu) na kartici Worklist (Radna lista) za dodelu žleba. Više informacija potražite u Korisničkom priručniku za sistem BD MAX. 4

5 15. Umetanje stalaka u sistem BD MAX (slika 3). Slika 2: Umetanje patrona BD MAX PCR Strana A Strana B Slika 3: Umetanje stalaka u sistem BD MAX. 16. Zatvorite poklopac sistema BD MAX i kliknite na <Start> (Pokreni) da biste pokrenuli obradu. 17. Na kraju ciklusa odmah proverite rezultate ili smestite epruvete sa puferom za uzorak na 2 8 C do 5 dana ILI na 25 ± 2 C najviše do 5 sati dok se rezultati ne provere. NAPOMENA: Ako je tokom testiranja oštećen opnasti čepić, zamenite ga novim pre čuvanja uzorka. NAPOMENA: Pripremljene epruvete BD MAX Cdiff Sample Buffer Tubes možete čuvati na 2 8 C najviše 120 sati (5 dana) ILI na 25 ± 2 C najviše 5 sati nakon što je uzorak dodat u epruvete sa puferom za uzorak. Kada se dobije Indeterminate (IND) (Neodređeni), Unresolved (UNR) (Nerazrešeni) ili Incomplete (INC) (Nepotpuni) rezultat, ili kada dođe do greške spoljnih kontrola, u tom vremenskom roku treba ponoviti testiranje sa pripremljenom epruvetom sa puferom za uzorak BD MAX UVE (pogledajte odeljak Ponavljanje postupka testiranja). KONTROLA KVALITETA Postupci kontrole kvaliteta osmišljeni su za nadzor izvođenja testa. Laboratorije su u obavezi da odrede broj, vrstu i učestalost testiranja kontrolnih materijala u skladu sa smernicama ili zahtevima lokalnih, regionalnih, državnih i federalnih propisa ili akreditacijske ustanove kako bi se nadgledala efikasnost celokupnog analitičkog postupka. Za opšte smernice u vezi sa kontrolom kvaliteta korisnik može da pogleda CLSI MM03 i EP12. 13,14 1. BD ne isporučuje materijale za spoljnu kontrolu. Spoljne pozitivne i negativne kontrole se ne koriste u softveru sistema BD MAX u svrhu interpretacije rezultata testa uzoraka. Spoljne kontrole se tretiraju kao da su uzorci pacijenata. (Radi detaljnog tumačenja rezultata testiranja spoljnih kontrola, pogledajte Tabelu 1 u odeljku Interpretacija rezultata. 2. Barem jednom dnevno potrebno je da se izvodi jedna (1) pozitivna spoljna kontrola i jedna (1) negativna spoljna kontrola dok se ne postigne zadovoljavajuća potvrda procesa u sistemu BD MAX u svim laboratorijskim okruženjima. Smanjivanje učestalosti kontrolnog testiranja treba sprovoditi u skladu sa primenjivim propisima. Spoljna pozitivna kontrola je namenjena za nadzor velike greške u vezi sa reagensom. Spoljna negativna kontrola se upotrebljava za otkrivanje kontaminacije reagensa ili okoline (ili prenošenja) putem nukleinskih kiselina. 5

6 3. Preporučuje se sprovođenje različitih spoljnih kontrola kako bi se korisniku omogućilo da izabere onu koja je najprikladnija za program kontrole kvaliteta u svojoj laboratoriji. a. Negativna spoljna kontrola: Komercijalno dostupan kontrolni materijal [npr., netoksičan soj Clostridium difficile (ATCC )] ili prethodno okarakterisan uzorak za koji se zna da je netoksičan ili negativan na toksičan Clostridium difficile. BD preporučuje da se negativne spoljne kontrole pripreme pre pozitivne spoljne kontrole kako bi se smanjila mogućnost kontaminacije kao posledica pripreme kontrole. b. Pozitivna spoljna kontrola: Komercijalno dostupan kontrolni materijal [npr., soj Clostridium difficile koji nosi gen tcdb (ATCC 43255)] ili prethodno okarakterisan uzorak za koji se zna da je toksičan ili pozitivan na toksičan Clostridium difficile. Za pripremu suspenzije za spoljnu kontrolu, preporučuje se da izolate ponovo rastvorite u fiziološkom rastvoru do zamućenja od 0,5 McFarland (~1 x 10 7 CFU/ml). Serijski razredite sa fiziološkim rastvorom kako biste dobili završnu suspenziju od ~3,3 X 10 5 CFU/ml i inokulirajte odgovarajuću epruvetu sa puferom za uzorak sa 10 µl bakterijskog rastvora uzetog omčom. Obradite i testirajte kao uzorak (pogledajte poglavlja Priprema uzoraka i Rad sistema BD MAX). 4. Sve spoljne kontrole treba da daju očekivane rezultate (pozitivne za pozitivne spoljne kontrole i negativne za negativne spoljne kontrole) bez neuspelih spoljnih kontrola (sa nerazrešenim ili nepotpunim rezultatima). 5. Spoljna negativna kontrola koja da pozitivan rezultat testa ukazuje na rukovanje uzorkom i/ili na kontaminaciju. Razmotrite tehniku rukovanja uzorkom kako biste izbegli mešanje uzoraka i/ili kontaminaciju. Spoljna pozitivna kontrola koja daje negativan rezultat ukazuje na probleme pri rukovanju uzorkom / pripremi. Razmotrite tehniku rukovanja uzorkom / pripreme. 6. Spoljna kontrola koja da nerazrešeni, neodređeni ili nepotpuni rezultat ukazuje na grešku reagensa ili sistema BD MAX. Pogledajte na monitoru sistema BD MAX da li ima poruka o greškama. Pogledajte odeljak Sažetak grešaka sistema u Korisničkom priručniku sistema BD MAX 12 radi tumačenja kodova upozorenja i grešaka. Ako se problem ne ukloni, upotrebite reagense iz neotvorene kesice ili novi komplet za testiranje. 7. Svaka od epruveta za izdvajanje sadrži kontrole obrade uzorka (SPC), odnosno plazmid sa sintetičkim ciljanim DNK redosledom. Kontrola obrade uzoraka se izdvaja, ispire i uvećava zajedno sa svim DNK eventualno prisutnim u obrađenom uzorku, što osigurava predvidivost analize. Kontrola obrade uzoraka nadgleda efikasnost hvatanja DNK, pranja i ispiranja tokom obrade uzoraka, kao i efikasnost amplifikacije i otkrivanja DNK tokom PCR analize. Ako rezultat kontrole obrade uzorka ne ispunjava kriterijum prihvatljivosti, rezultati uzorka se beleže kao nerazrešeni, međutim, svi pozitivni (POS) testovi se prijavljuju i nijedan od ciljeva se ne smatra NEG. Nerazrešeni rezultat indikativan je za inhibiciju povezanu sa uzorkom ili greškom reagensa. Ponovite svaki uzorak prijavljen kao nerazrešen kako je opisano u odeljku Ponavljanje postupka testiranja. TUMAČENJE REZULTATA Rezultati su dostupni na kartici Results (Rezultati) u prozoru Results (Rezultati) na monitoru sistema BD MAX. Softver sistema BD MAX automatski tumači rezultate testa. Rezultat testiranja može biti NEG (negativan), POS (pozitivan) ili UNR (nerazrešen) na osnovu amplifikacijskog statusa cilja i kontrole obrade uzorka. IND (neodređeni) ili INC (nepotpuni) rezultati posledica su greške u sistemu BD MAX. Rezultati se zasnivaju na sledećem algoritmu odluke: Tabela 1: Interpretacija rezultata testa BD MAX CT/GC/TV Prijavljeni rezultat testa POS Cdiff NEG Cdiff Tumačenje rezultata a Otkriven DNK gena tcdb Nije otkriven DNK gena tcdb UNR Cdiff IND INC Nerešeno nema cilja ili amplifikacije kontrole obrade uzorka, inhibitorni uzorak ili greška reagensa Neodređeni rezultat kao posledica greške u sistemu BD MAX (sa kodovima upozorenja ili greške b ) Nepotpuna obrada (sa kodovima upozorenja ili greške b ) a Rezultati analize BD MAX Cdiff se mogu uzeti kao vodilja za nivo mera opreza u skladu sa programima i praksom institucije. b Pogledajte odeljak Rešavanje problema u Korisničkom priručniku sistema BD MAX System 12 radi tumačenja kodova upozorenja i grešaka. PONAVLJANJE POSTUPKA TESTIRANJA NAPOMENA: Epruveta sa puferom za uzorak sadrži dovoljnu količinu za jedno ponavljanje testiranja u sistemu BD MAX. Za epruvete sa puferom za uzorak koje se čuvaju na sobnoj temperaturi, potrebno je ponoviti testiranje u roku od 5 sati na kraju postupka. Osim toga, za epruvete sa puferom za uzorak koje se čuvaju na temperaturi 2 8 C, potrebno je ponoviti testiranje u roku od 120 sati (5 dana). Preostali uzorci stolice se mogu upotrebiti za ponovno testiranje unutar 5 dana od prikupljanja ako se čuvaju na 2 8 C ili unutar 48 sati ako se čuvaju na 2 25 C. NAPOMENA: Novi uzorci se mogu testirati u istom krugu sa ponovljenim uzorcima. NERAZREŠENI REZULTAT Do nerazrešenog rezultata može doći u slučaju kada inhibitorna svojstva uzorka ili greška reagensa spreče pravilnu amplifikaciju cilja ili kontrole obrade uzorka. Uzorci se mogu ponoviti iz odgovarajućih epruveta sa puferom za uzorak u prethodno definisanom vremenskom rasponu. Promešajte uzorke na vorteks mešalici jedan (1) minut i krenite iznova iz odeljka Rad sistema BD MAX. Preostali uzorak stolice se može koristiti i za ponovljeno testiranje unutar vremenskog raspona koji je prethodno definisan. Krenite iznova iz odeljka Priprema uzorka. 6

7 NEODREĐENI REZULTAT Neodređeni rezultat se može dobiti u slučaju kvara sistema. Uzorci se mogu ponoviti iz odgovarajućih epruveta sa puferom za uzorak u prethodno definisanom vremenskom rasponu. Promešajte uzorke na vorteks mešalici jedan (1) minut i krenite iznova iz odeljka Rad sistema BD MAX. Preostali uzorak stolice se može koristiti i za ponovljeno testiranje unutar vremenskog raspona koji je prethodno definisan. Krenite iznova iz odeljka Priprema uzorka. Tumačenje kodova upozorenja ili grešaka potražite u Korisničkom priručniku sistema BD MAX 12 (Rešavanje problema). NEPOTPUN REZULTAT Do nepotpunih rezultata može doći u slučaju da nije dovršena priprema uzorka ili PCR nije dostigao očekivana vremenska ograničenja. Uzorci se mogu ponoviti iz odgovarajućih epruveta sa puferom za uzorak u prethodno definisanom dozvoljenom vremenskom rasponu. Promešajte uzorke na vorteks mešalici jedan (1) minut i krenite iznova iz odeljka Rad sistema BD MAX. Preostali uzorak stolice se može koristiti i za ponovljeno testiranje unutar vremenskog raspona koji je prethodno definisan. Krenite iznova iz odeljka Priprema uzorka. Tumačenje kodova upozorenja ili grešaka potražite u Korisničkom priručniku sistema BD MAX 12 (Rešavanje problema). GREŠKA SPOLJNE KONTROLE Spoljne kontrole bi trebalo da daju očekivani rezultat prilikom testiranja. Ako se uzorci moraju ponoviti zbog netačnog rezultata spoljne kontrole, treba ih ponoviti iz njihovih epruveta sa puferom za uzorak zajedno sa sveže pripremljenim spoljnim kontrolama u prethodno definisanom vremenskom rasponu. Promešajte uzorke na vorteks mešalici jedan (1) minut i krenite iznova iz odeljka Rad sistema BD MAX. Preostali uzorak stolice se može koristiti i za ponovljeno testiranje unutar vremenskog raspona koji je prethodno definisan. Krenite iznova iz odeljka Priprema uzorka. UZGOJ KLINIČKIH UZORAKA Da bi se identifikacija vrsta obavila direktno iz stolice, klinički uzorci se mogu uzgojiti u skladu sa bolničkim procedurama. OGRANIČENJA PROCEDURE Ovaj proizvod treba da se koristi samo za nekonzervisanu tečnu i mekanu stolicu, nisu utvrđene karakteristike rada za druge vrste kliničkih uzoraka. Ovaj proizvod se može koristiti samo u sistemu BD MAX. Netačni rezultati testa mogu da se jave i zbog nepravilnog uzimanja uzorka, nepravilnog rukovanja ili čuvanja, prisutnosti inhibitora, tehničke greške, pomešanih uzoraka ili zbog toga što je broj organizama u uzorku manji od analitičke osetljivosti testa. Kako bi se izbegli pogrešni rezultati, potrebno je pažljivo slediti uputstva na letku u pakovanju i u Korisničkom priručniku za sistem BD MAX 12. Rezultat testa BD MAX Cdiff ne upućuje nužno na prisutnost vijabilnih organizama. On, međutim, ukazuje na prisutnost gena tcdb i omogućava verovatno opažanje toksičnih Clostridium difficile organizama. Analiza BD MAX Cdiff se ne može koristiti za identifikaciju vrsta budući da ne sadrži prajmere i probe specifične za Clostridium difficile. Kao i kod svih in vitro dijagnostičkih testova baziranih na PCR-u, moguće je detektovati izuzetno niske nivoe ciljane supstance ispod granice opažanja, ali rezultat možda neće biti moguće reprodukovati. Mesalamine, rektalni rastvor za klistiranje, i Gynol II* mogu izazvati slabu inhibiciju na testu BD MAX Cdiff (detalje potražite u odeljku Supstance koje izazivaju interferenciju). Tečnost Tums* i Maalox* mogu da inhibiraju test BD MAX Cdiff (detalje potražite u odeljku Supstance koje izazivaju interferenciju). Lažni negativni rezultati se mogu pokazati zbog gubitka nukleinske kiseline zbog neprikladnog prikupljanja, transporta ili čuvanja uzoraka ili zbog neodgovarajuće lize bakterijskih ćelija. Testu je dodata kontrola obrade uzoraka kako bi potpomogla u identifikaciji uzoraka koji sadrže inhibitore PCR amplifikacije. Kontrola obrade uzoraka ne pokazuje da li je do gubitka nukleinske kiseline došlo zbog neprikladnog prikupljanja, transporta ili čuvanja uzoraka, kao ni da li su bakterijske ćelije pravilno lizirane. Rezultati testa BD MAX Cdiff mogu ponekad da budu nerazrešeni zbog nevažeće kontrole obrade uzorka ili mogu da budu neodređeni ili nepotpuni zbog kvara instrumenta, pa je zato potrebno ponovno testiranje što može dovesti do kašnjenja u dobijanju konačnih rezultata. Mutacije ili polimorfizmi u područjima veze prajmera ili probe mogu da utiču na otkrivanje varijanti gena Clostridium difficile tcdb, što rezultira lažnim negativnim rezultatom testa BD MAX Cdiff. Varijante toksične Clostridium difficile bez gena tcdb ili sa nefunkcionalnim proteinom toksin B veoma su retke Test BD MAX Cdiff cilja na gen tcdb i nije poznato da li može opaziti varijante vrste toksin A+/ toksin B-. Višak stolice može da inhibira test BD MAX Cdiff. Kao kod svih in vitro dijagnostičkih testova, pozitivne i negativne prediktivne vrednosti veoma zavise od učestalosti. Uspešnost testa BD MAX Cdiff se može razlikovati u zavisnosti od testirane učestalosti i populacije. 7

8 FUNKCIONALNE KARAKTERISTIKE Kliničke karakteristike svojstava testa BD MAX Cdiff utvrđene su prospektivnom istraživačkom studijom na više mesta. U istraživanju je učestvovalo šest (6) istraživačkih centara. Da bi učestvovali u ispitivanju, uzorci su morali da budu uzeti od pacijenata za koje se sumnja da imaju infekciju bacilom Clostridium difficile za koji su namenjena i naručena dijagnostička ispitivanja. Obuhvaćena je samo mekana ili tečna stolica i samo jedan uzorak po pacijentu. Komparativna referentna metoda sastojala se od toksične kulture koja se definiše kao anaerobna kultura za izolovanje soja Clostridium difficile, a zatim, ukoliko je taj soj prisutan, i od analize toksičnosti izolata analizom citotoksičnosti u testu sa kulturom tkiva. Anaerobna kultura je obavljena na izmenjenim pločama sa agarom ciklozerin cefoksitin fruktoze. Procenjena je toksičnost kolonija koje po morfologiji podsećaju na Clostridium difficile i koje je potvrdilo bojenje po Gramu, karakterističan miris na fekalije, pozitivan Pro-disk (L-prolin) test i neotpornost na vazduh na pločici sa čokoladnim agarom. Ovo je utvrđeno testom na toksin/ antitoksin koji je obavljen na filtratima bujona sa glukozom iz kuvanog mesa (CMG), po preporuci proizvođača. Ukupno uzoraka mekane ili tečne stolice testirano je pomoću toksične kulture i analize BD MAX Cdiff. Bilo je usklađenih uzoraka i rezultata za prijavljivanje (tabela 2). U poređenju sa toksičnom kulturom, test BD MAX Cdiff je identifikovao 96,3% toksičnih pozitivnih uzoraka Clostridium difficile i 92,4% toksičnih negativnih uzoraka Clostridium difficile (tabela 3). Tabela 2: Rezultati dobijeni testom BD MAX Cdiff u poređenju sa toksičnom kulturom Sve lokacije Test BD MAX Cdiff Toksična kultura + - Ukupno Ukupno Tabela 3: Performanse dobijene testom BD MAX Cdiff u poređenju sa toksičnom kulturom Klinički centri Učestalost Lokacija 1 4,3% (9/210) Lokacija 2 10,0% (26/261) Lokacija 3 8,0% (28/352) Lokacija 4 3,5% (17/487) Lokacija 5 14,4% (21/146) Lokacija 6 18,3% (73/399) Sveukupno 9,4% (174/1.855) a CI: Intervali pouzdanosti Osetljivost sa 95% Intervala pouzdanosti a 87,5% (7/8) (52,9%, 97,8%) 100% (26/26) (87,1%, 100%) 96% (24/25) (80,5%, 99,3%) 90,9% (10/11) (62,3%, 98,4%) 95,2% (20/21) (77,3%, 99,2%) 97,3% (71/73) (90,5%, 99,2%) 96,3% (158/164) (92,2%, 98,3%) Specifičnost sa 95% Intervala pouzdanosti a 94,4% (152/161) (89,7%, 97%) 90,6% (213/235) (86,2%, 93,7%) 93,9% (276/294) (90,5%, 96,1%) 90,9% (279/307) (87,1%, 93,6%) 94,3% (115/122) (88,6%, 97,2%) 92% (298/324) (88,5%, 94,5%) 92,4% (1.333/1.443) (90,9%, 93,6%) Od uzoraka mekane ili tečne stolice testiranih pomoću analize BD MAX Cdiff, 47 (2,9%) njih je inicijalno prijavljeno kao nerazrešeno. Njih trideset četiri (34) njih je ponovljeno a 26 je rešeno nakon ponavljanja testa. Sveukupno, 0,5% je ostalo nerazrešeno nakon ponavljanja. Analitička osetljivost Analitička osetljivost (granice opažanja ili LoD) za test BD MAX Cdiff utvrđena je na sledeći način: Za pripremu simuliranih pozitivnih uzoraka, omče za inokulaciju se umaču u širok raspon Clostridium difficile bakterijskih rastvora u različitim koncentracijama, koji su pripremljeni i kvantifikovani iz 4 soja bacila Clostridium difficile koji predstavljaju 3 tipa toksina (0, III, VIII). Svaka omča je, zatim, preneta u epruvetu sa puferom za uzorak koja već sadrži fekalnu matricu, negativnu na toksičan Clostridium difficile. Svaki soj Clostridium difficile su ispitala 2 različita operatera u 24 replika po koncentraciji pomoću 3 različite proizvodne serije testa BD MAX Cdiff. Analitička osetljivost (LoD), definisana kao najniža koncentracija pri kojoj 95% kopija daje pozitivan rezultat testa, bila je u rasponu od 125 do 265 CFU po omči (tabela 4). 8

9 Clostridium difficile soj Tabela 4: Granica detekcije za test BD MAX Cdiff Tip toksina 9 LoD (CFU/omči [95% CI a ]) ATCC [140, 502] ATCC [82, 298] ATCC BAA-1805 III 205 [102, 412] a CI: Interval pouzdanosti ATCC VIII 125 [66, 235] Analitička uključivost U ovu studiju uključene su različite vrste sojeva Clostridium difficile uzimajući u obzir geografsko poreklo, tipove toksina, prenošenje NAP1/027/BI i privremene različitosti. Ispitano je šezdeset četiri (64) sojeva, uključujući 23 tipa toksina i ispitana je 21 reprezentativna zemlja, uključujući sojeve iz javnih zbirki i dobro okarakterizovane kliničke izolate. Test je ispravno identifikovao sve testirane toksične sojeve Clostridium difficile. Analitička specifičnost Test BD MAX Cdiff izveden je na uzorcima koji su sadržali filogenetski povezane vrste (Clostridium koji nije toksičan Clostridium difficile) ili druge organizme (bakterije, viruse) za koje postoji velika verovatnoća da se pronađu u uzorcima stolice. Šest (6) od 6 sojeva Clostridium difficile koji nose gen tcdb, testiranih na koncentraciji 1 X 10 8 CFU/ml, dalo je negativne rezultate sa testom BD MAX Cdiff. Trideset (30) od 30 sojeva Clostridium koji nisu Clostridium difficile (uključujući 4 soja Clostridium sordellii), testiranih na koncentraciji 1 X 10 8 CFU/ml, dalo je negativne rezultate sa testom BD MAX Cdiff. Devedeset osam (98) od 98 ostalih bakterijskih sojeva (uključujući 93 vrste i podvrste), testiranih na koncentraciji 1 X 10 8 CFU/ml (ili ~ 1 X 10 8 genomskih DNK cp/ml ili 1 X 10 8 elementarnih tela/ml), dalo je negativne rezultatate sa testom BD MAX Cdiff. Sedam (7) od 7 virusa, testiranih na koncentraciji 1 X 10 5 PFU/ml, dalo je negativne rezultate sa testom BD MAX Cdiff. Supstance koje izazivaju interferenciju Dvadeset pet (25) bioloških i hemijskih supstanci koje se povremeno koriste ili nalaze u perianalnim, rektalnim i/ili uzorcima stolice procenjene su zbog moguće interferencije sa testom BD MAX Cdiff. Testirana su i dva (2) organizma (Escherichia coli ATCC i netoksičan Clostridium difficile ATCC ) pri visokom opterećenju kako bi se procenila bakterijska interferencija. Uzorci negativni na toksični bacil Clostridium difficile i uzorci pozitivni na toksični bacil Clostridium difficile pri 2 3X LoD testirani su sa najvećom količinom od svakog jedinjenja za koje postoji verovatnoća da se pronađe u uzorcima ili sa ometajućim organizmima (1 X 10 8 CFU/ml svakog soja). Potencijalno ometajuće supstance obuhvataju kalcijum karbonat (Tums*), kao i magnezijum i aluminijum hidroksid (tečnost Maalox*). Rezultati su pokazali da nije primećena interferencija nijedne druge testirane supstance, osim za Mesalamine rektalni rastvor za klistiranje i Gynol II* koji su pokazali slabu inhibiciju (kašnjenje Druge derivacije gornje apscise) u testu BD MAX Cdiff, međutim dobijeni su očekivani rezultati testiranja (tabela 5). Tabela 5: Endogene i komercijalne egzogene supstance testirane testom BD MAX Cdiff Naziv robne marke ili opis Rezultat Naziv robne marke ili opis Rezultat Nistatin NI Pepto Bismol* NI Hyderm* hidrokortizon (mast) NI Ex-Lax* NI Glicerinski čepić NI Metronidazol NI Krema od puževe sluzi NI Vankomicin NI Anusol* plus NI Polysporin* NI Preparat H* sa Bio-Dyne* kremom NI Naproksen NI Glavni preparat* sa fenilefrinom NI Tucks* personalni jastučići za čišćenje NI Tums* I Mešavina triglicerida (C2 C10) NI Maalox* tečnost I Palmitinska kiselina NI Mesalamine rektalni rastvor za klistiranje a Stearinska kiselina NI Fleet* klistir na bazi mineralnog ulja NI Krv NI Gynol II* vaginalno kontraceptivno sredstvo (sa nonoksinolom-9) a Sluz NI Imodijum AD* NI Escherichia coli + netoksičan Clostridium difficile NI I: Interferencija sa testom BD MAX Cdiff. NI: nije zabeležena interferencija sa testom BD Cdiff. a Mesalamine rektalni rastvor za klistiranje i Gynol II* (sa nonoksinolom-9) pokazao je slabu inhibiciju (kašnjenje Druge derivacije gornje apscise) u testu BD MAX Cdiff, međutim dobijeni su očekivani rezultati testiranja.

10 Ponovljivost Panel reproduktivnosti sastojao se od 5 kategorija uzoraka na sledeći način: Umereno pozitivna (UP): 2 5X LoD Nisko pozitivna (NP): 1 2X LoD Visoko negativna 1:10 (VN1:10): desetostruki rastvor 1X LoD Visoko negativna 1:100 (VN1:100): stostruki rastvor 1X LoD Stvarno negativna Uzorci u svakoj kategoriji su testirani u triplikatu tokom pet različitih dana, pri čemu su svakoga dana dva tehnologa testirala dva skupa testova na tri kliničke lokacije sa jednom serijom reagensa (testiranje između lokacija). Ukupan procenat podudaranja ponovljivosti među serijama bio je 100% za kategorije UP, NP i Neg, odnosno 92,2% i 50,0% negativnog podudaranja za kategorije VN1:100 i VN1:10 (tabela 6). Druga derivacija gornje apscise (SDPA), interni kriterijumi korišćeni za utvrđivanje rezultata završnog testa, izabrani su kao dodatno sredstvo procene ponovljivosti testa. Ukupne srednje vrednosti SDPA sa komponentama varijanse (SD i %KV) prikazane su u tabeli 6. Kategorija Tabela 6: Rezultati ispitivanja ponovljivosti između lokacija upotrebom jedne serije LOKACIJA Lokacija 1 Lokacija 2 Lokacija 3 Slaganje rezultata u procentima Slaganje rezultata u procentima Slaganje rezultata u procentima Slaganje svih rezultata u procentima SDPA vrednosti a Sveukupna srednja vrednost Neg. a 30/30 100,0% 30/30 100,0% 30/30 100,0% 100,0% (95,9%, 100,0%) 28,7 0,30 1,1 VN1:100 a,b 28/30 93,3% 25/30 83,3% 30/30 100,0% 92,2% (84,8%, 96,2%) 28,8 0,39 1,4 VN1:10 a,b 17/30 56,7% 8/30 26,7% 20/30 66,7% 50,0% (39,9%, 60,1%) 28,8 0,36 1,2 NP 30/30 100,0% 30/30 100,0% 30/30 100,0% 100,0% (95,9%, 100,0%) 32,5 0,77 2,4 UP 30/30 100,0% 30/30 100,0% 30/30 100,0% 100,0% (95,9%, 100,0%) 31,6 0,82 2,6 a Za Negativne i Visoko negativne kategorije, zabeležene SDPA vrednosti se odnose na kontrolu obrade uzoraka. Za druge kategorije, zabeležene SDPA vrednosti se odnose na ciljani toksičan Clostridium difficile. b Za Visoko negativne kategorije, pretpostavljalo se da će očekivani rezultat testa biti negativan. Zato je izračunato slaganje rezultata u procentima za negativne rezultate. SD % KV Prenosna/prelazna kontaminacija Sprovedeno je ispitivanje radi utvrđivanja prenosivosti unutar ciklusa i između ciklusa testiranja tokom obrade uzoraka visoke koncentracije bakterija u toksičnom Clostridium difficile u testu BD MAX Cdiff. Za pripremu brojnih uzoraka korišćen je skup testova od jednog visoko pozitivnog uzorka i od jednog negativnog uzorka. Soj Clostridium difficile (Tox 0, ATCC 9689) korišćen je za visoko pozitivan član panela Clostridium difficile panel member (~3 x 10 8 CFU/ml). Negativni član nije sadržao nijedan od ciljnih analita. Testirano je dvanaest (12) replika visoko pozitivnog člana uzorka i 12 replika negativnog člana uzorka u svakom testu uz izmenu negativnih i pozitivnih uzoraka. Tri (3) operatera izvela su 3 uzastopna testa za ukupno 9 testova sa 24 uzorka. Nije bilo lažno pozitivnih rezultata zbog prenosa kontaminacije. REFERENCE 1. Dubberke ER, Wertheimer AI. Review of current literature on the economic burden of Clostridium difficile infection. Infect Control Hosp Epidemiol 2009; 30: Poutanen SM, Simor AE. Clostridium difficile-associated diarrhea in adults. Can Med Assoc J 2004;171: Redelings MD, Sorvillo F, Mascola L. Increase in Clostridium difficile-related mortality rates, United States, Emerg Infect Dis 2007;13: McDonald LC, Owing M, Jernigan DB. Clostridium difficile Infection in Patients Discharged from US Short-Stay hospitals, Emerging Infectious Diseases, 2006, 12 (3): Pepin J, Valiquettte L, Alary ME. Clostridium difficile associated diarrhea in a region of Quebec from 1991 to 2003: a changing pattern of disease severity. CMAJ. 2004;171: Bignardi GE. Risk factors for Clostridium difficile infection. J Hosp Infect 1998; 40: Peterson LR, Robicsek A. Does my patient have Clostridium difficile infection? Ann Intern Med 2009;151: Lyras D, O Connor JR, Howarth PM, et al. Toxin B is essential for virulence of Clostridium difficile. Nature 2009;458: Delmee M. Laboratory diagnosis of Clostridium difficile disease. Clin Microbiol Infect Aug;7(8): Clinical and Laboratory Standards Institute. Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections; Approved Guideline. Document M29 (Refer to the latest edition). 11. Centers for Disease Control and Prevention, and National Institutes of Health. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. Chosewood L.C. and Wilson D.E. (eds) (2009). HHS Publication number (CDC) BD MAX System User s Manual (Refer to the latest version) BD Life Sciences, Sparks, MD, USA. 10

11 13. Clinical and Laboratory Standards Institute. Molecular Diagnostic Methods for Infectious Diseases; Approved Guideline, document MM03 (Refer to the latest edition). 14. Clinical and Laboratory Standards Institute. User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance; Approved Guideline. Document EP12 (Refer to the latest edition). 15. Cohen SH et al. (1998) Isolation of a Toxin B-deficient mutant strain of Clostridium difficile in a case of recurrent Clostridium difficile Associated Diarrhea, Clin. Infect. Dis. 26: Cohen SH et al. (2000) Analysis of the pathogenicity locus in Clostridium difficile strains, J. Infect. Dis. 181: MacCannell D. et al. (2006) Characterization of a novel, tcdb-deficient, NPA1 variant strain of Clostridium difficile, 46th Annual ICAAC, San Francisco, Sept McFarland, L.V., et al., Implications of the changing face of Clostridium difficile disease for health care practitioners. Am J Infect Control, (4): p Rupnik M. et al. A novel toxinotyping scheme and correlation of toxinotypes with serogroups of Clostridium difficile isolates, J Clin Microbiol, 1998, 36 (8): Rupnik M. et al. Comparison of toxinotyping and PCR ribotyping of Clostridium difficile strains and description of novel toxinotypes, Microbiology 2001, 147, Rupnik M. et al. New types of Toxin A-Negative, Toxin B-Positive strains among Clostridium difficile isolates from Asia, J Clin Microbiol, 2003, 41(3):

12 Manufacturer / Производител / Výrobce / Fabrikant / Hersteller / Κατασκευαστής / Fabricante / Tootja / Fabricant / Proizvođać / Gyártó / Fabbricante / Атқарушы / 제조업체 / Gamintojas / Ražotājs / Tilvirker / Producent / Producător / Производитель / Výrobca / Proizvođač / Tillverkare / Üretici / Виробник / 生产厂商 Use by / Използвайте до / Spotřebujte do / Brug før / Verwendbar bis / Χρήση έως / Usar antes de / Kasutada enne / Date de péremption / 사용기한 / Upotrijebiti do / Felhasználhatóság dátuma / Usare entro / Дейін пайдалануға / Naudokite iki / Izlietot līdz / Houdbaar tot / Brukes for / Stosować do / Prazo de validade / A se utiliza până la / Использовать до / Použite do / Upotrebiti do / Använd före / Son kullanma tarihi / Використати до\line / 使用截止日期 YYYY-MM-DD / YYYY-MM (MM = end of month) ГГГГ-ММ-ДД / ГГГГ-ММ (ММ = края на месеца) RRRR-MM-DD / RRRR-MM (MM = konec měsíce) ÅÅÅÅ-MM-DD / ÅÅÅÅ-MM (MM = slutning af måned) JJJJ-MM-TT / JJJJ-MM (MM = Monatsende) ΕΕΕΕ-MM-HH / ΕΕΕΕ-MM (MM = τέλος του μήνα) AAAA-MM-DD / AAAA-MM (MM = fin del mes) AAAA-KK-PP / AAAA-KK (KK = kuu lõpp) AAAA-MM-JJ / AAAA-MM (MM = fin du mois) GGGG-MM-DD / GGGG-MM (MM = kraj mjeseca) ÉÉÉÉ-HH-NN / ÉÉÉÉ-HH (HH = hónap utolsó napja) AAAA-MM-GG / AAAA-MM (MM = fine mese) ЖЖЖЖ-АА-КК / ЖЖЖЖ-АА / (АА = айдың соңы) YYYY-MM-DD/YYYY-MM(MM = 월말 ) MMMM-MM-DD / MMMM-MM (MM = mėnesio pabaiga) GGGG-MM-DD/GGGG-MM (MM = mēneša beigas) JJJJ-MM-DD / JJJJ-MM (MM = einde maand) ÅÅÅÅ-MM-DD / ÅÅÅÅ-MM (MM = slutten av måneden) RRRR-MM-DD / RRRR-MM (MM = koniec miesiąca) AAAA-MM-DD / AAAA-MM (MM = fim do mês) AAAA-LL-ZZ / AAAA-LL (LL = sfârşitul lunii) ГГГГ-ММ-ДД / ГГГГ-ММ (ММ = конец месяца) RRRR-MM-DD / RRRR-MM (MM = koniec mesiaca) GGGG-MM-DD / GGGG-MM (MM = kraj meseca) ÅÅÅÅ-MM-DD / ÅÅÅÅ-MM (MM = slutet av månaden) YYYY-AA-GG / YYYY-AA (AA = ayın sonu) РРРР-MM-ДД / РРРР-MM (MM = кінець місяця) YYYY-MM-DD / YYYY-MM (MM = 月末 ) Catalog number / Каталожен номер / Katalogové číslo / Katalognummer / Αριθμός καταλόγου / Número de catálogo / Katalooginumber / Numéro catalogue / Kataloški broj / Katalógusszám / Numero di catalogo / Каталог нөмірі / 카탈로그번호 / Katalogo / numeris / Kataloga numurs / Catalogus nummer / Numer katalogowy / Număr de catalog / Номер по каталогу / Katalógové číslo / Kataloški broj / Katalog numarası / Номер за каталогом / 目录号 Authorized Representative in the European Community / Оторизиран представител в Европейската общност / Autorizovaný zástupce pro Evropském společenství / Autoriseret repræsentant i De Europæiske Fællesskaber / Autorisierter Vertreter in der Europäischen Gemeinschaft / Εξουσιοδοτημένος αντιπρόσωπος στην Ευρωπαϊκή Κοινότητα / Representante autorizado en la Comunidad Europea / Volitatud esindaja Euroopa Nõukogus / Représentant autorisé pour la Communauté européenne / Autorizuirani predstavnik u Europskoj uniji / Meghatalmazott képviselő az Európai Közösségben / Rappresentante autorizzato nella Comunità Europea / Европа қауымдастығындағы уәкілетті өкіл / 유럽공동체의위임대표 / Įgaliotasis atstovas Europos Bendrijoje / Pilnvarotais pārstāvis Eiropas Kopienā / Bevoegde vertegenwoordiger in de Europese Gemeenschap / Autorisert representant i EU / Autoryzowane przedstawicielstwo we Wspólnocie Europejskiej / Representante autorizado na Comunidade Europeia / Reprezentantul autorizat pentru Comunitatea Europeană / Уполномоченный представитель в Европейском сообществе / Autorizovaný zástupca v Európskom spoločenstve / Autorizovano predstavništvo u Evropskoj uniji / Auktoriserad representant i Europeiska gemenskapen / Avrupa Topluluğu Yetkili Temsilcisi / Уповноважений представник у країнах ЄС / 欧洲共同体授权代表 In Vitro Diagnostic Medical Device / Медицински уред за диагностика ин витро / Lékařské zařízení určené pro diagnostiku in vitro / In vitro diagnostisk medicinsk anordning / Medizinisches In-vitro-Diagnostikum / In vitro διαγνωστική ιατρική συσκευή / Dispositivo médico para diagnóstico in vitro / In vitro diagnostika meditsiiniaparatuur / Dispositif médical de diagnostic in vitro / Medicinska pomagala za In Vitro Dijagnostiku / In vitro diagnosztikai orvosi eszköz / Dispositivo medicale per diagnostica in vitro / Жасанды жағдайда жүргізетін медициналық диагностика аспабы / In Vitro Diagnostic 의료기기 / In vitro diagnostikos prietaisas / Medicīnas ierīces, ko lieto in vitro diagnostikā / Medisch hulpmiddel voor in-vitro diagnostiek / In vitro diagnostisk medisinsk utstyr / Urządzenie medyczne do diagnostyki in vitro / Dispositivo médico para diagnóstico in vitro / Dispozitiv medical pentru diagnostic in vitro / Медицинский прибор для диагностики in vitro / Medicínska pomôcka na diagnostiku in vitro / Medicinski uređaj za in vitro dijagnostiku / Medicinteknisk produkt för in vitro-diagnostik / İn Vitro Diyagnostik Tıbbi Cihaz / Медичний пристрій для діагностики in vitro / 体外诊断医疗设备 Temperature limitation / Температурни ограничения / Teplotní omezení / Temperaturbegrænsning / Temperaturbegrenzung / Περιορισμοί θερμοκρασίας / Limitación de temperatura / Temperatuuri piirang / Limites de température / Dozvoljena temperatura / Hőmérsékleti határ / Limiti di temperatura / Температураны шектеу / 온도제한 / Laikymo temperatūra / Temperatūras ierobežojumi / Temperatuurlimiet / Temperaturbegrensning / Ograniczenie temperatury / Limites de temperatura / Limite de temperatură / Ограничение температуры / Ohraničenie teploty / Ograničenje temperature / Temperaturgräns / Sıcaklık sınırlaması / Обмеження температури / 温度限制 Batch Code (Lot) / Код на партидата / Kód (číslo) šarže / Batch-kode (lot) / Batch-Code (Charge) / Κωδικός παρτίδας (παρτίδα) / Código de lote (lote) / Partii kood / Numéro de lot / Lot (kod) / Tétel száma (Lot) / Codice batch (lotto) / Топтама коды / 배치코드 ( 로트 ) / Partijos numeris (LOT) / Partijas kods (laidiens) / Lot nummer / Batch-kode (parti) / Kod partii (seria) / Código do lote / Cod de serie (Lot) / Код партии (лот) / Kód série (šarža) / Kod serije / Partinummer (Lot) / Parti Kodu (Lot) / Код партії / 批号 ( 亚批 ) Contains sufficient for <n> tests / Съдържанието е достатъчно за <n> теста / Dostatečné množství pro <n> testů / Indeholder tilstrækkeligt til <n> tests / Ausreichend für <n> Tests / Περιέχει επαρκή ποσότητα για <n> εξετάσεις / Contenido suficiente para <n> pruebas / Küllaldane <n> testide jaoks / Contenu suffisant pour <n> tests / Sadržaj za <n> testova / <n> teszthez elegendő / Contenuto sufficiente per <n> test / <п> тесттері үшін жеткілікті / <n> 테스트가충분히포함됨 / Pakankamas kiekis atlikti <n> testų / Satur pietiekami <n> pārbaudēm / Inhoud voldoende voor n testen / Innholder tilstrekkelig til <n> tester / Zawiera ilość wystarczającą do <n> testów / Conteúdo suficiente para <n> testes / Conţinut suficient pentru <n> teste / Достаточно для <n> тестов(а) / Obsah vystačí na <n> testov / Sadržaj dovoljan za <n> testova / Innehåller tillräckligt för <n> analyser / <n> test için yeterli malzeme içerir / Вистачить для аналізів: <n> / 足够进行 <n> 次检测 Consult Instructions for Use / Направете справка в инструкциите за употреба / Prostudujte pokyny k použití / Se brugsanvisningen / Gebrauchsanweisung beachten / Συμβουλευτείτε τις οδηγίες χρήσης / Consultar las instrucciones de uso / Lugeda kasutusjuhendit / Consulter la notice d emploi / Koristi upute za upotrebu / Olvassa el a használati utasítást / Consultare le istruzioni per l uso / Пайдалану нұсқаулығымен танысып алыңыз / 사용지침참조 / Skaitykite naudojimo instrukcijas / Skatīt lietošanas pamācību / Raadpleeg de gebruiksaanwijzing / Se i bruksanvisningen / Zobacz instrukcja użytkowania / Consultar as instruções de utilização / Consultaţi instrucţiunile de utilizare / См. руководство по эксплуатации / Pozri Pokyny na používanie / Pogledajte uputstvo za upotrebu / Se bruksanvisningen / Kullanım Talimatları na başvurun / Див. інструкції з використання / 请参阅使用说明 Do not reuse / Не използвайте отново / Nepoužívejte opakovaně / Ikke til genbrug / Nicht wiederverwenden / Μην επαναχρησιμοποιείτε / No reutilizar / Mitte kasutada korduvalt / Ne pas réutiliser / Ne koristiti ponovo / Egyszer használatos / Non riutilizzare / Пайдаланбаңыз / 재사용금지 / Tik vienkartiniam naudojimui / Nelietot atkārtoti / Niet opnieuw gebruiken / Kun til engangsbruk / Nie stosować powtórnie / Não reutilize / Nu refolosiţi / Не использовать повторно / Nepoužívajte opakovane / Ne upotrebljavajte ponovo / Får ej återanvändas / Tekrar kullanmayın / Не використовувати повторно / 请勿重复使用 Serial number / Сериен номер / Sériové číslo / Serienummer / Seriennummer / Σειριακός αριθμός / Nº de serie / Seerianumber / Numéro de série / Serijski broj / Sorozatszám / Numero di serie / Топтамалық нөмірі / 일련번호 / Serijos numeris / Sērijas numurs / Serie nummer / Numer seryjny /Número de série / Număr de serie / Серийный номер / Seri numarası / Номер серії / 序列号 12