3D profiliranje lakih elemenata u tankim filmovima

Транскрипт

1 Nuklearne metode za analizu bioloških materijala dr. sc. Ivančica Bogdanović Radović, viša znanstvena suradnica Laboratorij za interakcije ionskih snopova Zavod za eksperimentalnu fiziku Institut Ruđer Bošković Zagreb, Croatia Ruđer Bošković Institute, Zagreb, Croatia

2 Uvod O vrstama ionizirajućeg zračenja Izvori zračenja u prirodi Malo o povijesti otkrića ionizirajućeg zračenja Korištenje radioaktivnosti u svakodnevnom životu Utjecaji zračenja na živi organizam Međudjelovanje zračenja i materije, Nuklearne analitičke metode Korištenje nuklearnih analitičkih metoda za karakterizaciju bioloških uzoraka

3 O vrstama ionizirajućeg zračenja

4 Vrste zračenja Ionizirajuće ionizira [izbacuje elektrone iz atoma]; Neionizirajuće uključuje: čestice -alpha -beta -neutron -itd. Elektromagnetsko zračenje

5 Neionizirajuće zračenje - nema dovoljno energije za ionizaciju atoma (micanje elektrona iz atomskih ljusaka) - elektromagnetsko zračenje s nedovoljno energije za kidanje kemijskih veza preko netermičkih procesa - primjeri: radio, TV, mikrovalovi, radar; infracrveno, vidljivo i ultraljubičasto svjetlo;

6 Radioaktivan vs. Radijacija Radioaktivni izvor [radioaktivni materijal] Ozračeni materijal Radijacija (zračenje)

7 Nestabilni atomi emitiraju zračenje

8 Zašto se neki atomi raspadaju: nuklearne sile i stabilnost Jezgra se sastoji od protona i neutrona- nukleona. Jezgru karakteriziraju dva broja: A A maseni broj (ukupni broj nukleona) X Z Z - atomski broj (broj protona) Ovako to označavamo: 6 3 Be Be - berilij 6 ukupan broj protona i neutrona 3 broj protona jezgra elektroni

9 Zašto se neki atomi raspadaju: nuklearne sile i stabilnost Što drži jezgu na okupu? Između protona djeluje odbojna elektrostatska sila (isti se naboji odbijaju), protoni su u jezgri jako blizu, jezgra je vrlo malih dimenzija (femtometri!). Na nukleone u jezgri djeluje jaka nuklearna sila koja je kratkog dosega. Jaka nuklearna sila je vrlo jaka privlačna sila za protone i neutrone odvojene nekoliko femtometara ali je zanemariva na većim udaljenostima. Sile koje djeluju u 6 Be jezgri p n n p p n Nuklearna sila proton neutron Elektrostatsko odbijanje

10 Krivulja stabilnosti jezgri - Što smo dalje od ravnotežnog stanja jezgre se brže raspadaju Z (broj protona) nestabilne previše protona N (broj neutrona) N = Z Nestabilne previše neutrona N 1.5 Z

11 Alfa čestice Alfa čestica se sastoji od 2 protona i 2 neutrona. To je u stvari atom helija kojem su maknuti elektroni pa je ostala samo jezgra. α 4 2 He

12 Opasnosti od α čestica -koža će zaustaviti α čestice - opasno ako izvor unesemo u sebe, udisanjem ili preko hrane - kao zaštita od njih dovoljan je list papira, a zaustavit će se i u zraku - mnogi radionuklidi koji se nalaze u zemlji, radon i drugi radioaktivni materijali raspadaju se emisijom α čestica

13 Beta čestice Beta čestice su elektroni visokih energija. Električki su negativni. Emitiraju se u beta raspadu. β β raspad, neutron (n 0 ) se pretvara u (p + ) uz emisiju elektrona (e ) i anti-neutrina (ν e ): K Ca+ e + ν

14 Opasnosti od beta čestica - opasnost za kožu, oči ili ako se unesu u tijelo - zaustavlja ih malo deblji materijal (recimo plastika) - dolaze iz hrane, vode i zraka

15 γ ili x-zračenje - fotoni (elektromagnetsko zračenje) γ or X-ray γ -zračenje kad nakon radioaktivnog raspada jezgra prelazi u osnovno stanje, vezano uz jezgru x zračenje vezano uz atomsku ljusku, kod ionizacije elektrona iz unutarnjih ljuski atoma atom prelazi u osnovno stanje tako da neki elektron iz vanjske ljuske popuni nastalu šupljinu a zbog zakona o sačuvanju energije emitira se x-zračenje

16 Spektar elektromagnetskog zračenja

17 valna duljina, metri frekvencija, Hz energija fotona, ev

18 Izvori X - zračenja Zakočno zračenje Karakteristično x-zračenje

19 Izvori γ-zračenja U nuklearnim reakcijama kad jezgra preko raspada prelazi u niže pobuđeno stanje Centar naše galaksije kao i druge udaljene galaksije su također izvori γ-zračenja. Naša atmosfera štiti nas od većine γ-zračenja proizvedenog u svemiru.

20 Valna duljina, metri X-zračenje vs. γ -zračenje: - nema jasne granice što se tiče energije fotona Definirane su preko izvora: γ-zračenje iz jezgri, x- zračenje iz atoma i drugih izvora. frekvencija, Hz Energija fotona, ev

21 X i γ zračenje su prodorna zračenja zaustavlja ih olovo medicinska primjena prirodno prisutni u tlu i kao kozmičko zračenje

22 Neutroni - nemaju naboj i ne djeluju elektromagnetskom silom s okolinom no mogu direktno izbiti iz atoma česticu i na taj način ioniziraju atom Izbijeni proton n Ulazni neutron H O H Molekula vode Izbijena čestica dalje ionizira atome oko sebe. Pošto je čovjek građen uglavnom iz vode ova reakcija je česta. Iako gubitak molekule vode ne predstavlja problem sam po sebi, taj će proces kreirati kemijski reaktivne slobodne radikale kao što su H + ioh - koji difundiraju kroz stanicu i izazivaju oštećenja. Neutroni su izuzetno opasni jer su zbog neutralnosti najprodorniji i najviše međudjeluju s lakim atomima.

23 Različite vrste zračenja imaju različitu prodornost u materijalima

24 Vrijeme poluraspada radioaktivnih tvari Vrijeme potrebno da bi se broj radioaktivnih atoma u nekom uzorku raspao na pola Vrijeme poluraspada je fiksirano nema veze koliko je velik uzorak, kolika je temperatura ili tlak, uvijek je to jednako vrijeme Najteži prirodni radioizotop je uran a vrijeme poluraspada mu je 4.5 x 10 9 godina Što je radioaktivni izotop nestabilniji kraće mu je vrijeme poluraspada

25 Jedinice za radioaktivnost Aktivnost količina radioaktivnog materijala curie (Ci): 3.7x10 10 raspada/sekundi 1 Ci = velika aktivnost [bazirana na 1 g radija] odrastao čovjek ima u sebi ~0.1 mikrocuria (µci) 14 C becquerel (Bq): 1 raspad/sekundi Bq = mala aktivnost [SI jedinicat] odrastao čovjek ima ~3,700 Bq 14 C 1 µci = 37 kbq = 2.22x10 6 dpm [disintegration/minute]

26 Izvori zračenja u prirodi

27 Zračenje je svuda oko nas prirodni izvori zračenja Zemlja i živi organizmi na njoj stalno su izloženi zračenju koje dolazi iz svemira. To zračenje međudjeluje s atomima u atmosferi i kreira sekundarno zračenje (x-zračenje, p, n,e, itd.) Radioaktivni materijal nalazi se svuda oko nas u prirodi (u zemlji, stijenama, vodi, zraku, biljkama pa i u nama samima). Prirodna radioaktivnost posljedica raspadanja prirodno nestabilnih nuklida. Glavni radionuklidi u prirodi su 40 K, 238 U i 232 Th. Od rođenja Zemlje svi se oni raspadaju (imaju dug poluživot). Tako je 40 K sad prisutan u dozi koja je otprilike za ½ manja od one koja je bila na početku rađanja Zemlje.

28 Izvori umjetnog zračenja Medicinski terapije, dijagnostika Profesionalni Ciklus nuklearnog goriva Otpad Industrija Drugi

29 Prirodna radioaktivnost - građevinski materijali (pci/g) Potassium (pci/g) Thorium (pci/g) Uranium Material 32 0, Granite Sandstone Cement concrete Limestone concrete Sandstone Dry wallboard gypsum By-product Gypsum Natural Wood Clay Brick

30 Zračenje je svuda oko nas Radon je plin koji nastaje kao produkt u raspadu 238 U (koji se nalazi u zemlji i ima ga posvuda). Koncentracija radona najveća je blizu tla, posebno u podrumima pa je provjetravanje prostorija vrlo važno. Radon udišemo u pluća a kako se on dalje raspada na taj smo način unijeli izvor zračenja u sebe. Radon je najveći pojedinačni doprinos dozi koju čovjek dobije iz prirodnih izvora zračenja.

31 Malo o povijesti otkrića ionizirajućeg zračenja

32 Malo o povijesti otkrića ionizirajućeg zračenja Wilhelm Conrad Röntgen( ) 8. studenog1895. Röntgen otkriva X- zrake, i to otkriće je gotovo trenutno dovelo do promjena u fizici i medicini. U 1. godini nakon otkrića objavljeno na tu temu više od 1000 stručnih i znanstvenih članaka. Za svoje otkriće, Röntgen dobiva Nobelovu nagradu za fiziku godine.

33 - Istraživanje luminiscencije uranovih soli

34 Antoine Henri Becquerel ( ) Prvo je vjerovao da je energija sunca apsorbirana u uranu odgovorna za emisiju x- zračenja iz njega Kasnije je shvatio da uran emitira zračenje bez nekog vanjskog izvora energije (kao što je npr. Sunce) Becquerel je otkrio radioaktivnost, spontanu emisiju zračenja iz materijala. Za to je otkriće godine dobio Nobelovu nagradu iz fizike. Slika Becquerelove fotografske ploče na kojoj se jasno vide zatamnjenja nastala kao posljedica izloženosti zračenja uranovim solima. Jasno se može vidjeti sjena metalnog Malteškog križa koji je bio postavljen između materijala i fotografske ploče.

35 Pierre Curie( ) Marie Curie( ) Naziv radioaktivnost prvi put spominje M. Curie g. Curievi su radili eksperiment kemijske ekstrakcije urana iz rude. Zaključili su da u rudi, uz uran, postoje još neki radioaktivni elementi. Novim elementima koje su otkrili dali su imena polonij i radij. Za svoj su rad dobili Nobelovu nagradu iz fizike a nekoliko godina kasnije Marie Curie je dobila i Nobelovu nagradu iz kemije. Bila je prva osoba koja je osvojila, ili podijelila dvije Nobelove nagrade. Jedna je od dvije osobe koja je dobila Nobelovu nagradu u dva različita područja (drugi je Linus Pauling), i do listopada ostaje jedina žena koja je dobila dvije Nobelove nagrade. Umrla je od leukemije najvjerojatnije zbog prevelikog izlaganja radijaciji tijekom višegodišnja istraživanja.

36 Ernst Rutherford je godine ustanovio da se zračenje iz urana sastoji od dviju komponenti. Jedne koja se lako absorbira u tvarima (nazvao ju je α-zračenje) i druge koja je prodornija (β-zračenje) "All science is either physics or stamp collecting" Otkrio je postojanje atomske jezgre (poznati pokus raspršenja α-čestica na tankoj foliji zlata) I razvio model atoma sličan solarnom sistemu. Jednako kao što planeti kruže oko Sunca, tako i elektroni kruže oko atomske jezgre. Rutherford je prvi alkemičar tj.čovjek koji je izveo nuklearnu reakciju (1919), on je pretvorio dušik u kisik. N + He = O + H

37 Korištenje radioaktivnosti u svakodnevnom životu

38 Korištenje radioaktivnosti za određivanje starosti Datiranje pomoću 14 C: Svi živi organizmi sadrže određeni udio radioizotopa ugljika 14 ( 14 C) U trenutku kad biljke i životinje umru udio 14 C počinje opadati, zato što raspadajući 14 C više nije zamjenjen s 14 C koji unose u sebe preko npr. hrane Vrijeme poluraspada 14 Cje 5700 godina Znanstvenici mogu odrediti starost organskih ostataka (npr. kosti) usporedbom iznosa 14 C koji je preostao u uzorku prema onom koji bi bio u živom organizmu i koriste pri tome krivulju za poluraspad.

39 Korištenje radioaktivnosti γ zračenje Terapija zračenjem: Gama zračenje ubija stanice raka Određivanje potrebne doze je od velikog značaja prevelika doza će ubiti i zdrave stanice, premala neće spriječiti širenje raka Sterilizacija hrane i medicinske opreme 60 Co: Produljuje vijek trajanja hrane, čajeva,lijekova,... Sterilizira se oprema koja bi inače bila uništena visokom temperaturom Provjera kvalitete varova Za visokotlačne posude, cjevovode, plinovode, i sl. Tracers: Za praćenje puta tvari kroz tijelo npr. da se detektira blokirani bubreg

40 Korištenje radioaktivnosti α i β zračenje Detektori dima: Sadrže malu količinu 241 Am koji emitira α zračenje. One ioniziraju zrak i tako teče struja. U trenutku kad dim uđe u detektor on absorbira α zračenje i to prekida strujni krug. Prekidanje strujnog kruga pokreće alarm. Testiranje debljine: S jedne strane postavimo izvor βčestica a s druge Geiger brojač, između njih nalazi se papir čiju debljinu ispitujemo. Mjeri se količina β zračenja koja dođe u brojač kroz papir Ako se premalo (previše) zračenja detektira u brojaču to znači da je debljina papira prevelika (premala) i stroj se automatski podešava da napravi papir deblji (tanji).

41 Utjecaji zračenja na živi organizam

42 Doza zračenja Oštećenje organizma povezano je s količinom zračenja. Dozu možemo promatrati u kontekstu broja ionizacija proizvedenih po jedinici mase u ozračenom tkivu. Energija potrebna za stvaranje ionskog para neovisna je o vrsti upadnog zračenja, mnogo je bolje izraziti dozu zračenja kao energiju absorbiranu u tkivu po jedinici mase. 1 Gray = absorbirana energija od 1 J/kg [ Starija jedinica je rad : 1 Gray = 100 rad. ] Ipak, broj ionizacija (ili absorbirana energija) nije jedini faktor. Ako je gustoća ionizacije velika biološko oštećenje bit će veće. Svakoj vrsti zračenja može se pridružiti tzv. Quality Factor, koji uzima u obzir taj efekt (veći quality factor veće oštećenje biološkog materijala).

43 Vrsta zračenja Quality Factor X- i γ-zračenje 1 β zračenje 1 α zračenje 20 neutroni 20 Ovisi o energiji neutrona α i n rade 20 puta više oštećenja od β, X- i γ-zračenja! Da bi se izmjerili efekti oštećenja izazvani radijacijom u ljudskom tijelu koristimo: Ekvivalentna doza = Absorbirana doza (u Gray-ima) x Quality factor To se mjeri u Sivertima (Sv) [ stara jedinica rem, 1 Sv = 100 rem ]

44 Utjecaj na zdravlje deterministički efekti Utjecaj na zdravlje ne ovisi samo o primljenoj dozi nego i o vremenu u kojem smo tu dozu primili. Primanje iste doze ali kroz duže vremensko razdoblje je manje štetno zato jer tijelo ima više vremena za popravak štete. Izloženost velikoj dozi zračenja u kratkom vremenu zovemo akutna ekspozicija. Doza zračenja (Sv) Utjecaj na zdravlje > 0.1 promjene u krvnoj slici 0.5 mučnina 0.75 povraćanje, gubitak kose 4 Smrt unutar 2 mjeseca ( za 50% ozračenih) >6 Sigurna smrt

45 Godišnja doza zračenja koju primi čovjek Ukupna doza Izvori za koje je zaslužan čovjek Radon 55.0% Medical X-Rays 11 Other 1% Internal 11% Cosmic 8% Terrestrial 6% Man-Made 18% Nuclear Medicine 4% Consumer Products 3% Natural (msv) Radon 2 Cosmic 0.27 Terrestrial: -external internal 0.39 Artificial (msv) -Diag. X-rays Nuc. Med Consumer Pro Other ~0.01 TOTAL ~ 3.6 msv

46 Utjecaj na zdravlje stohastički efekti Dugotrajni efekti na zdravlje izazvani malim dozama zračenja kroz dulje vrijeme zovu se stohastički. To znači da se neposredno nakon izloženosti ne moraju pokazati trenutačni klinički efekti ali postoji određena vjerojatnost razvoja malignih bolesti kao što su leukemija ili rak kostiju. Analiza ljudi koji su primili velike doze zračenja, kao što su preživjeli iz Hiroshime i Nagasakija, ljudi koji su živjeli blizu Chernobyla i pacijenti izloženi zračenju u okviru terapije, omogućuju nam da procijenimo vjerojatnost razvoja malignih bolesti u ovisnosti o primljenoj dozi: Doza od 1 Sv! Rizik od 1 na 50 (tj. 2%) od umiranja od raka. Izloženost zračenju može također utjecati na nerođenu generaciju. Ako je npr. jedan roditelj bio izložen dozi od 1 Sv prije začeća, rizik ozbiljnog defekta pri porodu djece ili unuka je 4 na 1000 (0.4%).

47 Utjecaj zračenja: glavni kemijski efekti u tkivu stvaranje slobodnih radikala Primarne reakcije [unutar ~10-10 sekunde nakon prolaska ionizirajućeg zračenja] Molekula vode se disocira na slobodne radikale H 2 O H + OH Sekundarne reakcije [10-5 sekunde] H + H H 2 (plin) H + OH H 2 O (voda) OH + OH H 2 O 2 (vodikov peroksid)

48 Efekti oštećenja DNA Gene Expression A gene may respond to the radiation by changing its signal to produce protein. This may be protective or damaging. Gene Mutation Sometimes a specific gene is changed so that it is unable to make its corresponding protein properly Chromosome Aberrations Sometimes the damage effects the entire chromosome, causing it to break or recombine in an abnormal way. Sometimes parts of two different chromosomes may be combined Genomic Instability Sometimes DNA damage produces later changes which may contribute to cancer. Cell Killing Damaged DNA may trigger apoptosis, or programmed cell death. If only a few cells are affected, this prevents reproduction of damaged DNA and protects the tissue. Studije su pokazale da najveći dio zračenjem izazvanog DNK oštećenja tijelo može samo popraviti.

49 Međudjelovanje zračenja i materije: Nuklearne analitičke metode

50 Međudjelovanje zračenja s materijom Ionizacija: izbijanje elektrona iz atoma Pobuđivanje: podizanje elektrona u orbitalama na više energijske nivoe dizanje u više orbitale tog istog atoma Raspršenja: ulazni ioni rasprše se elastično ili neelastično na jezgrama atoma mete Aktivacija: proces u kojem materijal postaje radioaktivan nakon što je izložen djelovanju neutrona, protona, ili neke druge vrste zračenja Za nuklearne analitičke metode najčešće ne koristimo prirodne izvore zračenja već ubrzavamo različite ione (ionizirane atome različitih elemenata) da bi njima potaknuli reakcije u različitim uzorcima. Ione dobivamo iz ionskih izvora a ubrzavamo ih na visoke energije pomoću akceleratora ili ubrzivača.

51 Nuklearne analitičke metode (Ion Beam Analysis) NRA Nuclear reaction products PIGE γ rays Ion beam PIXE X-rays RBS Backscattered particles SEI Secondary electrons ANALIZA (elementi, izotopi) koristeći ione MeV-skih energija - (na, pa): -elementi Z > 12(PIXE) - C,N,O (RBS) -H(ERDA) -isotopi nuklearne reakcije γ -zrake(pige) čestice (NRA) Light IL TARGET Charge pulse IBIC Recoil nuclei ERDA Transmitted particles Forward scattered particles STIM KARAKTERIZACIJA s MeV pojedinačnim ionima -(fa): - gustoća - (STIM) - prijenos naboja - (IBIC) - kristalna struktura - channelling (RBS, STIM, PIXE) - morfologija sekundarni elektroni (SEI) - Kemijske veze - svjetlost, x-zrake (IL, PIXE)

52 Akceleratori ili ubrzivači tvornice brzih iona Direct extraction duoplasmatron S3 ts1 S4 Sputtering ion source tm1 te1 F 1 ts1 tl1 1.0 MV HVE Tandetron tq1 ts2 tm2 sw1 F 3 M2 tq2 F 3 D2 F 2 Q1 6.0 MV EN Tandem Van de Graaff D1 F 1 Sputtering ion source S1 E1 E2 M1 S2 Alphatross ion source sw2 external beam PIXE Q3 PIXE/RBS TOF ERDA Nuclear reactions DM implantation & HR PIXE Nuclear microprobe Nuclear microprobe Ruđer Bošković Institute, Zagreb, Croatia

53 Zaustavljanje iona u materijalu Mijenjanjem energije i vrste iona, IBA metode mogu se koristiti za ispitivanje različitih debljina uzorka. Doseg raznih iona u siliciju dan je kao primjer: MeV p - 30 mm, MeV p - 90 mm -6.0 MeV p -290 mm MeV Li mm MeV O mm 4.5 MeV Li 7 ions de/dx 20 3 MeV protons x Range (µm) 3 MeV protoni u zraku

54 Protonima inducirana emisija x-zračenja (PIXE) Osnovni fizikalni principi: - ion prolaskom kroz materijal gubi energiju pobuđujući e - uatomu -ako je izbačen e - (K, L...) iz unutarnje ljuske atom ostaje nestabilan - unutarnju ljusku popunjava vanjski e - u kratkom vremenu (t < s) - zbog zakona sačuvanja energije jedan način je emisija karakteristične x-zrake - Svi elementi (osim H) ima svoj zapis preko karakterističnih x-zrake pa ih mi koristimo da bi odredili elementni sastav uzorka. - Mjerenjem intenziteta karakterističnih x-zraka mogu se odrediti koncentracije elemenata u uzorku s granicom detekcije ~ 1 ppm (part per million).

55 PIXE - Za mjerenja se tipično koriste protoni energije 2-3 MeV dobiveni iz akceleratora - za detekciju X-zračenja koriste se poluvodički Si(Li) detektori - standardno se mogu odrediti elementi od Na do U (K i L x-zračenje) - metoda je multielementna i nedestruktivna! Cu intenzitet Cu Pb Sn Cl Si Fe Pb Sn energija (kev) PIXE spektar arheološkog uzorka (Apoxiomenos).

56 PIXE setup u vakuumu Si(Li) detector beam sample Analiza u vakuumu: - manja absorbcija (važno za x-zračenje niskih energija) - širenje snopa zbog raspršenja problemi: veličina uzorka i integritet PIXE setup s vanjskim snopom: beam thin exit foil Si(Li) detector sample He or H gas flow Analiza u zraku: - Korisno za umjetnost i arheologiju - veliki objekti -manje ostećenje uzorka zbog snopa - glavni problemi: smanjena je kvaliteta snopa (gubitak energije, širenje snopa u izlaznom prozoru i okolnom zraku).

57

58 Komora za raspršenje s pripadnim detektorima Čestični detektor Detektor x-zračenja Si čestični detektori Detektor za vodik

59 RBS - Rutherford Backscattering spektroskopija - Počiva na činjenici da energija iona koji su elastično raspršeni unatrag na atomima mete ovisi o masi atoma mete (kinematički faktor) i o dubini na kojoj se je desilo raspršenje (gubitak energije ne putu u uzorak i natrag na putu iz uzorka prema detektoru). Uzorak M 2 Ulazni ion E 0, M 1 θ kinematički faktor: E 1 Čestični detektor

60 RBS - Rutherford Backscattering mass scale! ~ laki ioni (p, α ili Li) energije nekoliko MeV

61 RBS - Rutherford Backscattering SAMPLE pogodno za: - tanke filmove - teške elemente u lakim matricama ION BEAM problem: - laki elementi u teškim matricama DETECTOR M1 M2 Backscattered particle spectrum M3 Energy

62 ERDA Elastic Recoil Detection Analysis - detekcija elastično izbijenih jezgri ERDA - teži upadni ion izbije lakši atom iz mete -Z ion > Z atom -Ako postavimo čestični detektor u prednje kuteve možemo detektirati lakše izbijene atome -koristi se najčešće za detekciju H 4 He, 7 Li, 12 C Ili neki drugi teži ion ERDA Primarni ioni H

63 NRA Nuclear Reaction Analysis - analiza detekcijom nuklearnih reakcija Ioni MeV-skih energija mogu izazvati nuklearne reakcije u jezgrama atoma koji se nalaze u uzorku. NRA se najviše koristi za analizu H, Li, Be, B, C, N, O,F, Na, Al, P. Prinos produkata reakcije (g, p, n, d, 3 He, 4 He, etc.) je proporcionalan koncentraciji određenog elementa u uzorku.

64 NRA Nuklearne reakcije O (RBS) Si (RBS) Ge (RBS) 11 B (p,α) 8 Be Q = MeV B (NRA) - Isti čestični detektor kao i za RBS - RBS dio spektra dobro je odvojen od dijela koji pripada produktima reakcije (for Q > 0)

65 PIGE - Protonima Inducirana Emisija γ-zračenja D.D. Cohen et al. / Nucl. Instr. and Meth. in Phys. Res. B (2004)

66 STIM Scanning Transmission Ion Microscopy proton Uzorak STIM Sekcija tkiva (nekoliko µm) izolirane stanice 120 Princip STIM metode - čestica prolaskom kroz uzorak gubi energiju u sudaru s elektronima. Mjerenjem gubitka energije individualnih čestica u transmitiranom snopu dobijemo informaciju o gustoći ili debljini uzorka X (µm)

67 Korištenje nuklearnih analitičkih metoda za karakterizaciju bioloških uzoraka

68 Primjeri iz biologije: Mikroproba konferencija ICNMTA znanstvenih publikacija objavljeno u Zborniku radova s konferencije od toga njih 31 je povezan s biomedicinskim aplikacijama - Distribucija elemenata u stanicama -Istraživanje neurodegenerativnih bolesti (Alzheimer, Parkinson) određivanjem distribucije elemenata u tkivu mozga - Prostorna distribucija elemenata u tragovima s morfološkim osobinama arterosklerotičnih nakupina - Distribucija metala u tkivima i organima nakon akutne izloženosti tim metalima - Studije apsorbcije pojedinih spojeva iz kozmetičkih preparata u kožu (metalni oksidi npr. TiO 2 koji služi kao zaštitni faktor u kremama za sunčanje) - Analiza metala u proteinima -Proučavanje uloge Ca i ostalih bioloških elemenata u tragovima tijekom fotodinamičke terapije tumora -Proučavanje distribucije elemenata u bioindikatorima i bioakumulatorima kod mjerenja zagađenja zraka

69 Protonska mikroproba što je to? proton beam object slits quadrupole doublet focusing lens sample Y scan generator X x-ray detector amplifier Y X X-ray energy spectrum Fe Ca S Pb elemental maps

70 Komora za protonsku mikroprobu 2 mikroskopa 9 ulaza za detektore load-lock komora nosač uzoraka: -grijanje/hlađenje - višepinski el. kontakt xyz manipulator goniometar 2x2 µm 2 u modu velikih struja 500x500 nm 2 u modu malih struja Ruđer Bošković Institute, Zagreb, Croatia

71 2D distribucija elemenata Si Micro-PIXE, RBS, ERDA koncentracija i distribucija elemenata u raznim uzorcima. Ca Kod bioloških uzoraka vrlo važna je priprema uzoraka a nepravilna priprema može dovesti do kontaminacije uzorka, gubitka ili redistribucije elemenata. Cl

72 Priprema uzoraka Cilj je tako pripremiti uzorak da se sačuva distribucija elemenata koliko god je moguće sličnija onoj kakva je bila kod živog organizma. Pravilna priprema uzoraka je od velike važnosti za mikropixe i nemar kod pripreme uzoraka može uzrokovati, kontaminaciju uzorka, gubitak elemenata iz uzorka ili redistribuciju elemenata. MikroPIXE analiza se izvodi u vakuumu zato uzorak mora biti isušen i imobiliziran u svom funkcionalnom stanju kakvo je bilo prije analize. - Također je važno i kolika je debljina uzorka prema debljini podloge na koju smo uzorak stavili jer je za šum ali i za RBS metodu jako važna ukupna količina materijala (masa uzorka + podloge). Nije dobro ako je masa podloge puno veća od mase uzorka. Debela podloga kvarit će granicu detekcije metode zbog šuma koji dolazi od zakočnog zračenja.

73 Preporučena metoda je niskotemperaturna obrada uzoraka smrzavanjem (cryofixation) nakon kojeg slijedi rezanje smrznutih uzoraka na tanke slojeve (cryosectioning) i liofilizacija (freez-drying). Priprema uzoraka tehnike na niskoj temperaturi Što kraće vrijeme između uzimanja uzoraka i smrzavanja jako bitno.

74 Priprema uzoraka - podloga na koju se stavljaju uzorci Najčešći materijal na koji se stavljaju biološki uzorci za PIXE su tanki plastični filmovi. Za kvantitativnu elementnu analizu važno je da su ti filmovi spektroskopski čisti tj. da su sastavljeni od elemenata (C,H,N,O) koji se ne vide u spektru karakterističnog x-zračenja te da u sebi nemaju kontaminacije težim elementima (koji su vidljivi u spektru x-zračenja). To je posebno važno za točno određivanje koncentracije elementa, kao što je npr. određivanje metala u proteinima u obliku isušenih kapljica na tankom filmu. Koncentracija metala je određena relativno prema koncentraciji sumpora(zaproteine) ilifosfora (zadna) u uzorku, tako da prisustvo tih elementa u filmu na koji se uzorci montiraju može značajno utjecati na rezultat. film debljina (µm) Mylar 1-3 pioloform

75 Analiza proteina pomoću mikroprobe Mnoge molekule proteina sadrže mali broj metalnih atoma koji su bitni za biokemijsku funkciju pproteina. Poznavanje količine i vrste tih atoma može biti od presudnog značenja kako za razumijevanje funkcije tako i za interpretaciju strukturnih podataka koje dobivamo iz x-ray kristalografije. Kako je koncentracija metala mala a i količina uzorka mala (mikrolitri otopine), micropixe je jedna od rijetkih tehnika pogodnih za dobivanje pouzdanih rezultata. Kvantifikacija mjerenja se bazira na činjenici da većina proteina sadrži poznati iznos sumpora pa je dovoljno mjeriti omjer metala prema sumporu da bi odredili broj metalnih atoma po molekuli. Sample TM ~1 µl Mylar foil Aluminium frame Osušene kapljice proteinske otopine Mylar TM folija Aluminijski okvirić

76 Istovremena detekcija nekoliko metala u nepoznatim proteinima; Vrlo dobre granice detekcije; Mali volumen uzorka je potreban; Mala koncentracija proteina; Ne trebaju dodatne kemikalije kod pripreme uzoraka Metallo-β-lactamase (double metal center) [C 1278 H 2005 N 347 O 388 S 11 ] = 0,8 mg/ml (~60 µm) H. Natal da Luz et al., NIMB 231 (2005)308

77 Interakcija između karboplatine (analogije Pt t za terapiju tomora ) i Cu pod djelovanjem male doze zračenja Karboplatina se veže za DNK i stvara s njom ireverzibilne kovalentne veze i deformira strukturu DNK. Neke deformacije DNK se poprave a neke ne. Karboplatina uzrokuje zastoj staničnog ciklusa, te time dovodi do programirane stanične smrti. Vjeruje se da mala doza zračenja može povećati međustaničnu koncentraciju karboplatine a s time i antitumorni efekt. Određivanje Pt pomoću mikropixe metode je napravljeno na dvije grupe leukemijskih stanica koje su prošle tretman s carboplatinom: 1. samo tretman s carboplatinom 2. kombinirani tretman s carboplatinom i dozom zračenja od 0.5 Gy.

78 Pt Cu P Pt Cu P 9hr Mali unos karboplatine e i Cu u slučaju kad nije bilo dodatnog zračenja (gore). Povećani unos karboplatine uz dodatno zračenje (dolje). S. Harada et al., predstavljeno na ICNMTA 2004 Konferenciji

79 Analiza elemenata u tragovima u serumu korištenjem PIXE metode Yoshinori Miura et al., PIXE Analiza elemenata u tragovima u serumu pacijenata koji boluju od srčanih i bubrežnih bolesti. Priprema uzoraka: Ag je korišten kao interni standard za kvantitativnu analizu. 100 µg otopine srebro nitrata kapne se u 1 ml seruma. 10 ml tog miješanog uozrka deponira se na podlogu i suši na sobnoj temperaturi. Distribucija koncentracija elemenata u serumu sakupljenih od pacijenata na hemodijalizi (HD) i pacijenata koji nisu na hemodijalizi ali s bubrežnim bolestima (RD). (a): HD/28 muškarci, (b): RD/6 muškarci, (c): (a) preklopljen preko (b)

80 Istraživanje neurodegenerativnih bolesti (Alzheimer, Parkinson) lokalizacija oboljelog tkiva i određivanje elemenata : Elementni sastav lezija u mozgu koje su karakteristične za Alzheimerovu bolest - predmet istraživanja otkad je pretpostavljeno da elementi u tragovima (Al) bi mogli biti povezani s razvojem bolesti. Pronalaženje oboljelog tkiva bez bojanja -nema kontaminacije, oboljelo tkivo je gušće od zdravog i protoni gube prolaskom kroz njega više energije. STIM slika neurona identificiranog u 5 µm debelom tkivu mozga zahvaćenog AD 30x30 µm 2 Shematski diagram NFT (neurofibrillary tangles) neurona i zdravog neurona Energija protona 2 MeV: Transmitirani protoni energijski prozor MeV Preuzeto iz J. Makjanić, F. Watt, Nucl. Instr. and Meth. B 150 (1999) 167

81 Prostorna distribucija elemenata u tragovima s morfološkim osobinama arterosklerotičnih nakupina : F. Watt et al., Nucl. Instr. And Meth. B 249 (2006) 646 STIM i elementne mape ranih lezija (bijeli zečevi hranjeni 8 tjedana masnom hranom (1% kolesterol)). Na STIM slici lezija se prepoznaje preko veće gustoće i povećane koncentracije fosfora. Veličina mape je µm 2

82 Studije apsorbcije pojedinih spojeva iz kozmetičkih preparata u kožu TiO2 se često koristi u kozmetičkim preparatima. Ipak, malo je eksperimenata napravljeno da bi se proučilo koliko duboko prodire kroz kožu i kakvi su njegovi efekti na organizam. Mikro-PIXE,RBS i STIM koriste se u kombinaciji za mapiranje elementnog sastava i idetifikaciju slojeva kože. STIM + Ti Cl P S Ti Zs. Kertesz et al., Nucl. Instr. and Meth. in Phys. Res. B 231 (2005) 106

83 Ozračavanje pojedinačnih stanica - Mikroproba je posebno zanimljiva jer je u stanju predati stanici preciznu dozu zračenja - Za istu dozu zračenja teže čestice su mnogo efektnije od lakših ili od x-zraka zbog veće gustoće ionizacije proizvode štetu koju je teže popraviti -Proučavaju se efekti koje na stanicu i njezinu okolinu izazivaju pojedinačni teži ioni -Proučavanje bystander efekta 1. put opazili Nagasawa i Little, Cancer Res. 52 (1992) 6392 Iako je samo 1% stanica bio izložen snopu α čestica oštećenja kromosoma primjećena su u oko 30% stanica

84 Zaključak - Protonska mikroproba s prostornim rezolucijom snopa od 2x2 µm 2 i nuklearne analitičke tehnike PIXE, RBS, ERDA, STIM omogućuje 2D mapiranje gotovo svih elemenata u uzorcima s velikom osjetljivošću (u području ppm) - Veliki je interes u svijetu za analizu različitih vrsta bioloških materijala na mikroprobi (otprilike 1/3 objavljenih radova vezanih za mikroprobu odnosi se na takve uzorke) - Definicija problema + priprema uzorka (od izuzetne važnosti za uspjeh) - biolozi, medicinari, botaničari - Posljednjih godina raste broj uređaja posvećenih ozračivanju pojedinačnih stanica