UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU Saša A. Cvetković Uticaj saharoze na indukciju aksilarnih pupoljak

UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU Saša A. Cvetković Uticaj saharoze na indukciju aksilarnih pupoljaka Micromeria pulegium L. (Benth.) in vitro MASTER RAD Niš, 2019.

UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU Uticaj saharoze na indukciju aksilarnih pupoljaka Micromeria pulegium L. (Benth.) in vitro MASTER RAD Kandidat: Saša A. Cvetković Br. indeksa: 251 Mentor: Dr Dragana D. Stojičić redovni profesor Niš, 2019.

UNIVERSITY OF NIŠ FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY Influence of sucrose on axillary bud induction of Micromeria pulegium L. (Benth.) in vitro MASTER THESIS Candidate: Saša A. Cvetković No. of index 251 Menthor: Dr Dragana D. Stojičić Professor Niš, 2019.

ZAHVALNICA Najsrdačnije se zahvaljujem svom mentoru prof. dr Dragani Stojičić na ukazanoj pomoći, strpljenju i razumevanju prilikom izrade ovog master rada. Takođe, veliku zahvalnost dugujem dr Svetlani Tošić, na ukazanoj pomoći pri realizaciji eksperimentalnog dela ovog master rada. Veliko hvala mojim roditeljima, sestri i supruzi na podršci. Hvala vam.

Sažetak Micromeria pulegium (Rochel) Benth. je endemična vrsta južnih Karpata iz porodice Lamiaceae. Ova familija obuhvata često korišćene biljke u kulinarstvu i narodnoj medicini. M. pulegium naseljava kamenjare, uglavnom klisure, na nadmorskoj visini od 1000 do 1200 m. Prirodne populacije ove vrste imaju mali broj jedinki, pa se nameće potreba za pronalaženjem načina njihove zaštite, gajenja i umnožavanja. U ovom istraživanju ispitivan je uticaj koncentracije saharoze (izvora ugljenika) na indukciju aksilarnih pupoljaka M. pulegium. Eksperiment je pokazao da je najveći prosečan broj pupoljaka po eksplantatu razvijen na podlozi sa 5% saharoze. Najveća prosečna dužina pupoljaka dobijena je gajenjem eksplantata na podlozi sa 1% saharoze, dok je najveća sveža i suva masa dobijena kada su eksplantati gajeni na podlozi sa 5% saharoze. Ključne reči: Micromeria pulegium, mikropropagacija, saharoza, aksilarni pupoljci.

Abstract Micromeria pulegium (Rochel) Benth. is an endemic species of Southern Carpathians from the Lamiaceae family. These families include frequently used plants in culinary and folk medicine. M. pulegium settles rocks, mostly gorges, at an altitude of 1000 to 1200 m. Natural populations of this species have a small number of individuals, so the need for finding ways of their protection, cultivation and reproduction is imposed. In this study, the influence of sucrose (carbon source) concentration on the induction of axillary buds M. pulegium was investigated. The experiment showed that the largest average number of buds per explant developed on medium with 5% sucrose. The highest average length of buds was obtained by cultivating explants on the surface with 1% sucrose, while the largest fresh and dry weight was obtained when the explants were grown on a 5% sucrose substrate. Keywords: Micromeria pulegium, micropropagation, sucrose, axillary buds.

Sadržaj 1.UVOD...1 1.1. Mikropropagacija vegetativno razmnožavanje in vitro...3 1.2. Faktori koji utiču na rastenje biljnih kultura in vitro...4 2.CILJ RADA...6 3. MATERIJAL I METODE...7 3.1. Biljni materijal...7 3.2. Sastav hranljive podloge...7 3.3. Hranljiva podloga za indukciju aksilarnih pupoljaka Micromeria pulegium...8 3.4. Sterilizacija...8 3.5. Statistička analiza...9 4. REZULTATI... 10 5. DISKUSIJA... 17 6. ZAKLJUČAK... 19 7. LITERATURA... 20

1.UVOD Familija Lamiaceae (usnatice) predstavlja jednu od najvećih familija dikotila, koju čini više od 240 rodova. Veliki broj vrsta, koje pripadaju ovoj familiji su veoma aromatične, zbog prisustva žlezdanih struktura koje proizvode isparljiva ulja (Giuliani & Maleci, 2008). Mnoge vrste pripadaju grupi jestivih, lekovitih ili aromatičnih biljaka koje se koriste u prehrambenoj i kozmetičkoj industriji, tradicionalnoj medicini i hortikulturi. Retke, endemične i ugrožene vrste familije Lamiaceae predstavljaju poseban izazov za proučavanje u cilju očuvanja specijskog diverziteta i njihovih populacija u prirodi (Tošić, 2015). U taksonomskom sistemu rod Micromeria Benth. zauzima sledeći položaj: klasa Magnoliopsida, red Lamiales, familija Lamiaceae, podfamilija Nepetoideae, tribus Mentheae i subtribus Menthinae (Takhtajan, 2009). Rod Micromeria prvi je definisao Bentham (1829). Prema Bräuchler et al. (2008) rod sadrži 54 vrste, 32 podvrste i 13 varijeteta. Rod se prostire od Makaronezijsko-Mediteranskog regiona do južne Afrike, Indije i Kine (Slika 1). U flori Srbije i Crne Gore rod Micromeria obuhvata 10 vrsta, od kojih su 7 endemične (Šilić, 1979). Vrste roda Micromeria su poznate kao aromatične vrste, jer sadrže značajne količine esencijalnih ulja. Količina esencijalnih ulja od ± 0.5% je jedna od karakteristika na osnovu koje su vrste ovog roda klasifikovane u podfamiliju Nepetoideae (El-Gazzar & Watson, 1970). Slika 1. Rasprostranjenje roda Micromeria Benth. (Bräuchler et al., 2008) 1

Rod Micromeria Benth. je podeljen na 4 sekcije: Pseudomelissa, Micromeria, Cymularia i Pineolentia (Harley et al., 2004). Micromeria pulegium (Slika 2) pripada sekciji Pseudomelissa. Prema molekularnim dokazima, naglašavajući sličnost izabranih morfoloških osobina Bräuchler et al. (2006) uključuju vrste roda Micromeria iz sekcije Pseudomelissa u rod Clinopodium L. Slika 2. Micromeria pulegium na prirodnom staništu (Tošić, 2015) Micromeria pulegium je višegodišnja biljka sa uspravnom stabljikom. Na stabljikama se razlikuju jajasti, eliptični do lancetasti listovi, čije ivice mogu biti tupo do oštro nazubljene. Na naličju listova se nalaze brojne žlezdane dlake. Brakteje su linearne. Cvast je dihazijum, koji čine 10 do 40 cvetova. Čašica je uspravna, retko dlakava u grlu, sa 13 nerava. Krunica je bele ili lila boje. M. pulegium predstavlja endemičnu vrstu južnih Karpata rasprostranjenu u jugozapadnoj Rumuniji i istočnoj Srbiji. Biljka nastanjuje stenovita područja, najčešće klisure, na 1000 do 1200 metara nadmorske visine (Chater & Guinea 1972). Na području Srbije po Bogosavljević et al. (2007) zabeležena su staništa na području planine Tare (Zaovine), kao i u istočnoj Srbiji u klisuri Svrljiškog Timoka (selo Orešac), kod Knjaževca (Slika 3). 2

Slika 3. Distribucija vrste Micromeria pulegium u Srbiji (Bogosavljević et al., 2007) 1.1. Mikropropagacija vegetativno razmnožavanje in vitro Mikropropagacija biljaka je proces u kome se ćelije, tkiva ili organi željene biljke izoluju, površinski sterilišu i gaje u aseptičnim uslovima na podlogama koje sadrže faktore koji pospešuju rastenje kako bi se dobio veliki broj klonova te biljke (Altman, 2000). U ovom procesu se koriste isključivo izdanci stabla osovinskog porekla, odnosno vršni i pazušni pupoljci. Potencijal ćelije da raste i da se razvija u višećelijski organizam predstavlja ćelijsku totipotenciju. Ovaj potencijal ćelije ili tkiva da formira sve tipove ćelija jedne biljke predstavlja osnovu principa kulture tkiva. In vitro kultura je jedna od glavnih tehnika u biljnoj biotehnologiji čiji je koncept bio predstavljen od strane Haberlandt-a (1902). Mikropropagacija u užem smislu predstavlja postupak in vitro razmnožavanja u kome se kao početni eksplantati koriste izdanci (vršni i bočni). Ove kulture se održavaju u formi kultura izdanka sa kojih se izduženi izdanci izoluju, a zatim ožiljavaju. Mikropropagacija u širem smislu podrazumeva bilo koji postupak kulture in vitro koji obezbeđuje klonsko razmnožavanje, odnosno da je ishodni materijal razmnožavanja genetički identičan polaznom (Vinterhalter & Vinterhalter, 1996). 3

Mikropropagacija u užem smislu se može podeliti u nekoliko faza. Podelu je predložio Murashige (1974) i nekoliko godina kasnije Debergh i Maene (1981). Murashige deli mikropropagaciju u tri faze. Razvijanje aseptičnih uslova (faza I), proliferacija izdanaka (faza II) i ožiljavanje in vitro (faza III). Međutim, Debergh i Maene (1981) mikropropagaciju dele u pet faza. To su selekcija donorske biljke i njena preparacija (faza 0), uspostavljanje aseptične kulture (faza I), produkcija pogodnih propagula (faza II), pripremanje za rast u prirodnom okruženju, odnosno izduživanje izdanaka i in vitro ožiljavanje izdanaka (faza III) i prenošenje biljke u prirodno okruženje (faza IV). Sistem Debergh i Maene (1981) se smatra pogodnim za masovno komercijalno razmnožavanje, dok su istraživačkom radu bliže različite varijante sistema Murashinge (1974) sa ožiljavanjem kao poslednjom, in vitro fazom (Vinterhalter & Vinterhalter, 1996). 1.2. Faktori koji utiču na rastenje biljnih kultura in vitro Po načinu dejstva faktori koji utiču na rastenje biljnih kultura in vitro se prema Hughes (1981) mogu podeliti na interne i eksterne. Prema ovoj podeli u eksterne faktore spadaju abiotički faktori: atmosfera, svetlost i temperatura, a u interne spadaju faktori hranljive podloge: voda, agar, mineralne soli, ph vrednost podloge, vitamini i organski aditivi, antibiotici, biljni regulatori rastenja i ugljeni hidrati. Šećeri u kulturi in vitro su potrebni zbog fenomena heterotrofije/miksotrofije. Šećeri nadoknađuju ugljene hidrate koji bi se sintetisali fotosintezom (Kumar, 2001). Heterotrofija je rezultat male fotosintetičke aktivnosti i predstavlja jedan od glavnih limitirajućih faktora za unapređenje efikasnosti mikropropagacije (Kumar & Singh, 2009). Izvor ugljenika je veoma bitan, jer svoj uticaj ispoljava delimično na rastenje i morfogenezu svojom nutritivnom vrednošću, a delimično utiče na promenljiv osmotski potencijal, koji utiče na brzinu ćelijske deobe ili na nivo morfogeneze ćelija (Fotopoulos & Sotiropoulos, 2004). Najčešće korišćeni ugljeni hidrat u kulturi in vitro je disaharid saharoza i to u koncentraciji 2-3%. Sem saharoze koriste se, mada ređe, glukoza i fruktoza, konstruktivne heksoze saharoze. Većina biljaka lako metaboliše navedena tri šećera. Korišćenje drugih ugljenih hidrata uglavnom ima manje efekta. Ukoliko se medijum tokom sterilizacije izloži previsokoj temperaturi i pritisku, usled oksidacije saharoze medijum može da promeni boju, odnosno karameliše i takav medijum se ne treba upotrebljavati. Degradaciju saharoze u procesu autoklaviranja može izazvati i so gvožđa FeEDTA. Visoke koncentracije šećera, posebno saharoze, stimulišu androgenezu i somatsku embriogenezu kod različitih biljnih vrsta, a kod 4

krompira izazivaju modifikaciju bočnih izdanaka u krtole tzv. tuberizaciju. Ugljeni hidrati osim fiziološke aktivnosti imaju i regulatornu ulogu, odnosno regulišu osmotski potencijal medijuma. 5

2.CILJ RADA Ispitivanje uticaja koncentracije saharoze na indukciju, multiplikaciju i elongaciju aksilarnih pupoljaka Micromeria pulegium u kulturi in vitro; Ispitivanje uticaja koncentracije saharoze na produkciju biomase eksplantata M. pulegium; Statistička obrada rezultata, njihovo tumačenje i izvođenje zaključka. 6

3. MATERIJAL I METODE 3.1. Biljni materijal U ovom radu su korišćeni nodalni segmenti vrste Micromeria pulegium koja je ranije uvedena u kulturu in vitro (Tošić et al. 2015). Na svaku podlogu postavljeno je po 30 nodalnih eksplantata (po 10 eksplantata u jednu teglu). Nodalni eksplantat obuhvata jedan nodus sa parom listića i aksilarnim pupoljcima u njihovom pazuhu i delove dve internodije. Svi eksplantati koji su korišćeni su bili približno iste veličine, oko 5 mm. Vršni pupoljci nisu korišćeni. 3.2. Sastav hranljive podloge Hranljiva podloga koja je korišćena za gajenje eksplantata u kulturi in vitro bila je Murashige, T. i Skoog, F. (1962), odnosno MS podloga. Hranljiva podloga predstavlja vodeni rastvor mineralnih soli, šećera, vitamina, alkohola inozitola, različitih aminokiselina, hormona i kofaktora geliranog uz pomoć agara. Sastav podloge dat je u tabelama 1, 2 i 3. Tabela 1. Makro soli MS podloge Makro mineralne soli NH 4 NO 3 KNO 3 CaCl 2 X 2H 2 O MgSO 4 X 7H 2 O Makro mineralne soli KH 2 PO 4 NH 4 NO 3 Mikro mineralne soli KNO 3 CaCl 2 X 2H 2 O MnSO 4 X 4H 2 O MgSO 4 X 7H 2 O Tabela 2. ZnSO Mikro 4 X soli 7H 2 OMS podloge KH 2 PO 4 Mikro mineralne soli H 3 BO 3 KJ MnSO 4 X 4H 2 O ZnSO 4 X 7H 2 O Na 2 MoO 4 X 2H 2 O H 3 BO 3 KJ CuSO 4 X 5H 2 O Na 2 MoO 4 X 2H 2 O CoCl 2 X 6H 2 O CuSO 4 X 5H 2 O FeSO 4 X 7H 2 O CoCl 2 X 6H 2 O Na FeSO 2 EDTA 4 X X 7H2H 2 O 2 O Na 2 EDTA X 2H 2 O mg/l 1650 1900 440 370 mg/l 170 1650 mg/l 1900 22.3 440 370 8.6 170 mg/l 6.2 0.83 22.3 8.6 0.25 6.2 0.83 0.25 0.025 0.025 0.025 27.8 0.025 37.3 27.8 37.3 7

Tabela 3. Organska jedinjenja MS podloge Organska jedinjenja Vitamin B1 Vitamin B6 Nikotinska kiselina Glicin Mioinozitol Saharoza Agar mg/l 0.4 0.5 0.5 2 g/l 0.1 30 7 Korišćenjem 0,1 N NaOH ili 0,1 N HCl ph vrednost podloge je nivelisana na 5,8. 3.3. Hranljiva podloga za indukciju aksilarnih pupoljaka Micromeria pulegium Da bi se ispitao uticaj šećera na indukciju aksilarnih pupoljaka, u MS hranljivu podlogu dodat je šećer saharoza, u koncentracijama: 0%, 1%, 3% i 5%. Svaka pripremljena podloga bila je razlivena u po 3 tegle. Za gajenje eksplantata korišćene su staklene tegle istih dimenzija. Tegle su sadržale istu količinu podloge i zatvarane su metalnim zatvaračima sa otvorom u sredini kroz koji je provučena vata (zbog provetravanja i očuvanja aseptičnih uslova). U svaku teglu je postavljeno po 10 eksplantata, odnosno 30 po tretmanu. Eksplantati su gajeni na temperaturi od 21 ± 2 C i fotoperiodu od 16 sati svetlosti i 8 sati mraka. Kao izvor svetlosti korišćene su bele fluorescentne cevi Tesla Pančevo sa gustinom fotonskog fluksa od 50 μmol s -1 m -2. Nakon 5 nedelja evidentiran je broj pupoljaka na eksplantatima i merena je njihova dužina na milimetarskom papiru. Zatim je merena sveža masa biljnog materijala, a nakon 7 dana sušenja na sobnoj temperaturi merena je i suva masa. Merenja su obavljena na analitičkoj vagi sa preciznošću od 0.1 mg. Svi dobijeni rezultati su statistički obrađeni. 3.4. Sterilizacija Hranljive podloge su sterilisane u autoklavu na temperaturi od 120 ºC u trajanju od 30 minuta. Pincete, skalpeli, petri kutije i ostalo posuđe i pribor pakovani su u aluminijumsku foliju, pa 8

su sterilisani suvom sterilizacijom 1-2 sata na temperaturi od 160-180 ºC. Prostor u kome je vršeno pasažiranje kultura je tretiran UV lampom u trajanju od najmanje 2 sata. Radna površina je pre i u toku rada stalno dezinfikovana 96%-tnim etil alkoholom. Tokom izvođenja eksperimenta pribor je sterilisan nad plamenikom, koji je ujedno dodatno sterilisao vazduh. Laboratorijski pribor je stalno menjan, potapan u 96% etil alkohol i sterilisan nad plamenom. 3.5. Statistička analiza Obrada podataka je urađena statističko-grafičkim paketom Statgraphics, procedura ANOVA i test LSD na nivou značajnosti p 0.05. Statistička analiza je urađena za svaki parametar i u tabelama je predstavljena slovima. Statistički značajne razlike predstavljene su različitim slovima, ista slova označavaju da tih razlika nije bilo. 9

4. REZULTATI Za potrebe ovog eksperimenta korišćen je biljni materijal Micromeria pulegium iz kulture in vitro (Tošić et al, 2015). Nodalni eksplantati, odnosno deo stabla sa nodusom i parom listova u čijem se pazuhu nalaze aksilarni pupoljci, su bazalnim delom uranjani u hranljivu podlogu. Kako bi se izbegla nekroza listova koja nastaje u kontaktu sa hranljivom podlogom listovi su ostajali iznad podloge. Eksplantati su gajeni 5 nedelja. Nakon ovog vremena na eksplantatima gajenim na podlozi bez saharoze nije došlo do rastenja aksilarnih pupoljaka. Na eksplantatima gajenim na podlogama sa 1%, 3% i 5% saharoze došlo je do formiranja brojnih pupoljaka, čiji su broj i dužina prikazani u Tabeli 4. U tabeli 5. prikazana je sveža i suva masa eksplantata. Tabela 4. Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima Micromeria pulegium Hranljiva podloga Prosečan broj pupoljaka Prosečna dužina po eksplantatu pupoljaka (mm) 1 MS - - 2 MS + saharoza 1% 4,20 ± 0,40 a 8,65 ± 0,98 b 3 MS + saharoza 3% 5,23 ± 0,50 b 6,65 ± 0,61 a 4 MS + saharoza 5% 5,86 ± 0,31 b 6,13 ± 0,55 a Višestruki test intervala - vrednosti označene istim slovom u koloni ne pokazuju razliku na nivou značajnosti p 0.05 Tabela 5. Uticaj različitih tretmana na masu biljaka Micromeria pulegium Hranljiva podloga Prosečna sveža masa (g) Prosečna suva masa (g) 1 MS - - 2 MS + saharoza 1% 0,057 ± 0,005 b 0,0076 ± 0,0005 a 3 MS + saharoza 3% 0,048 ± 0,004 a 0,0074 ± 0,0005 a 4 MS + saharoza 5% 0,067 ± 0,004 c 0,0150 ± 0,0008 b Višestruki test intervala - vrednosti označene istim slovom u koloni ne pokazuju razliku na nivou značajnosti p 0.05 10

Na eksplantatima gajenim na podlogama bez saharoze aksilarni pupoljci se nisu raazvijali. Od dana kada su postavljeni, pa sve dok je trajao eksperiment, eksplantati su ostali istih dimenzija, odnosno nisu rasli. Nakon pet nedelja većina eksplantata je bila smeđe boje i nekrotična, mali broj eksplantata je ostao zelene boje, ali znakova izduživanja aksilarnih pupoljaka i rastenja nije bilo (Sl. 4 i 5). Slika 4. Eksplantati M. pulegium na podlozi bez saharoze Slika 5. Grupa eksplantata na podlozi bez saharoze 11

Na eksplantatima gajenim na podlozi sa 1% saharoze prosečan broj pupoljaka po eksplantatu bio je 4.20, a njihova prosečna dužina bila je 8.65 mm (Tab. 4). Prosečna sveža masa bila je 0.057 g, a prosečna suva masa 0.0076 g (Tab. 5). Eksplantati, koji su gajeni na ovoj podlozi, bili su vitalni i zelene boje (Sl. 6). Po morfologiji eksplantati se mogu podeliti u dve grupe, grupa eksplantata sa skraćenim internodijama žbunaste forme (Sl. 7a) i eksplantata sa izduženim internodijama i izduženim izdancima (Sl. 7b). Slika 6. Eksplantati M. pulegium na podlozi sa 1% saharoze a b Slika 7. Izolovani eksplantati gajeni na podlozi sa 1% saharoze 12

Na eksplantatima gajenim na podlozi sa 3% saharoze prosečan broj pupoljaka po eksplantatu bio je 5.23, a prosečna dužina pupoljaka 6.65 mm (Tab. 4). Prosečna sveža masa bila je 0.048 g, a prosečna suva masa 0.0074 g (Tab. 5). Eksplantati su, kao i na prethodnoj podlozi, bili vitalni i zelene boje, s tim da su u ovom slučaju eksplantati bili manje-više uniformnog rasta, razgranati sa izduženim internodijama (Sl. 8). Na određenim eksplantatima došlo je i do formiranja adventivnih korenova (Sl. 9). Slika 8. Eksplantati M. pulegium na podlozi sa 3% saharoze Slika 9. Eksplantat sa adventivnim korenom gajen na podlozi sa 3% saharoze 13

Na eksplantatima gajenim na podlozi sa 5% saharoze prosečan broj pupoljaka po eksplantatu bio je 5.86, a prosečna dužina pupoljaka 6.13 mm (Tab. 4). Prosečna sveža masa bila je 0.067 g, a prosečna suva masa 0.0150 g (Tab. 5). Stariji listovi eksplantata su bili smeđe boje i nekrotični, dok su mlađi listovi još uvek bili zeleni, ali malo tamniji za razliku od eksplantata gajenim na podlogama sa nižim koncentracijama saharoze (Sl. 10). Na ovoj podlozi, na pojedinim eksplantatima, došlo je do pojave cvetova (Sl. 11), što može biti posledica stresnih uslova visokog osmotskog potencijala podloge. Slika10. Eksplantati M. pulegium na podlozi sa 5% saharoze Slika11. Eksplantat sa cvetom gajen na podlozi sa 5% saharoze 14

Uporedni prikaz broja i dužine aksilarnih pupoljaka u odnosu na podloge sa različitim koncentracijama saharoze, prikazan je na histogramu 1. Na podlozi sa 5% saharoze zabeležen je najveći prosečan broj pupoljaka po eksplantatu, ali je tada njihova dužina bila najmanja. Najveću prosečnu dužinu imali su pupoljci sa eksplantata gajenih na podlozi sa 1% saharoze, ali je tada njihov broj bio najmanji. Ipak oni su bili vitalniji i spremniji za sledeću etapu mikropropagacije ožiljavanje. 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 1% saharoza 3% saharoza 5% saharoza Prosečan broj pupoljaka Prosečna dužina pupoljaka Histogram 1. Uporedni prikaz uticaja različitih koncentracija saharoze na broj i dužinu aksilarnih pupoljaka M. pulegium Nakon evidentiranja prosečnog broja pupoljaka i merenja prosečne dužine pupoljaka, uticaj saharoze ispitivan je i na produkciju biomase. Izvršeno je merenje sveže mase biljnog materijala, a nakon nedelju dana sušenja na vazduhu sobne temperature izvršeno je merenje suve mase. Najveća produkcija sveže biomase, 0,067 g, bila na podlozi sa 5% saharoze. Na istoj podlozi je izmerena najveća suva biomasa od 0,0150 g (Tab. 5). Najmanje vrednosti prosečne sveže i suve mase zabeležene su na podlozi sa 3% saharoze. Na histogramu 2 je uporedni prikaz produkcije sveže i suve mase na podlogama sa različitim koncentracijama saharoze. 15

0.08 0.07 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0 1% saharoza 3% saharoza 5% saharoza Prosečna sveža masa Prosečna suva masa Histogram 2. Uporedni prikaz uticaja različitih koncentracija saharoze na svežu i suvu masu izdanaka M. pulegium 16

5. DISKUSIJA Mikropropagacija in vitro vrste M. pulegium se pokazala uspešnom. Do sada ova vrsta je bila predmet istraživanja jedne doktorske disertacije (Tošić, 2015), naučnih članaka (Stojičić et al., 2016; Stojičić et al., 2017) i mnogobrojnih master radova. U master radovima je ispitivan uticaj različitih hormona na indukciju aksilarnih pupoljaka (Spasić, 2013; Šelmić, 2013), izvora azota (Simonović, 2016), jačine MS hranljive podloge (Pavlović, 2016), maltoze (Golubović, 2015). Ovaj rad nastavlja sveobuhvatna istraživanja ove vrste u uslovima in vitro. U ovom radu ispitivan je uticaj različitih koncentracija šećera saharoze na indukciju aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima M. pulegium. Rastenje i razviće eksplantata pod dejstvom različitih koncentracija saharoze upoređivano je sa kontrolnom grupom, koja nije sadržala saharozu (MS 0). Na eksplantatima M. pulegium gajenim na hranljivoj podlozi MS bez šećera nije došlo do formiranja aksilarnih pupoljaka. U prilog ovome idu i rezultati uticaja saharoze na indukciju aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima M. juliana gde na podlozi bez šećera nije došlo do formiranja pupoljaka (Petrunović, 2018, master rad). Suprotno ovome, većina podataka iz literature pokazuje da je na hranljivoj podlozi bez šećera dolazilo do indukcije i rastenja izdanaka (Nordine et al., 2013; Zahara et al., 2017). Prisustvo saharoze u podlozi dovodilo je do formiranja većeg broja pupoljaka. Veća koncentracija saharoze stimulativno je uticala na razviće aksilarnih pupoljaka, tako se na eksplantatima na podlozi sa 1% razvilo prosečno 4,20 pupoljaka, na podlozi sa 3% 5,23 pupoljaka a na podlozi sa 5% 5,86 pupoljaka po eksplantatu. Povećavanje prosečnog broja pupoljaka sa većom koncentracijom saharoze je takođe zabeleženo kod Mentha piperita (Sujana & Naidu, 2011), gde je povećanje koncentracije šećera do 4% povoljno uticalo na rastenje pupoljaka. Najveći broj pupoljaka po eksplantatu zabeležen je kada su eksplantati M. pulegium gajeni na podlozi sa najvećom korišćenom koncentracijom saharoze (5%). Visoke koncentracije drugih šećera (5% maltoze) su se takođe pokazale kao najuspešnije u stimulisanju razvića aksilarnih pupoljaka M. pulegium (Golubović, 2016, master rad). Sa povećanjem koncentracije saharoze u podlozi dužina aksilarnih pupoljaka formiranih na eksplantatima bila je manja. Najveća prosečna dužina pupoljaka 8,65 mm razvijala se na eksplantatima gajenim na podlozi sa 1% saharoze. Najmanja prosečna dužina pupoljaka 6,13 mm 17

izmerena je kod eksplantata gajenih na podlozi sa 5% saharoze. U istim uslovima kulture dobijeni su slični rezultati na eksplantatima M. juliana (Petrunović, 2018, master rad). Kod ove vrste prosečna dužina pupoljaka je bila najveća na koncentraciji od 1% saharoze, dok je visoka koncentracija saharoze (5%) uticala da prosečna dužina pupoljaka bude najmanja. Upotreba visokih koncentracija šećera u kulturi može dovesti do negativnog efekta na biljni materijal uzrokovan visokim osmotskim pritiskom ili zbog toksičnosti izvora ugljenika. To bi moglo objasniti promenu boje kada je u kulturi korišćena saharoza veća od 3% (Rihan et al., 2015; Ślesak et al., 2004). U ovom istraživanju je merena prosečna sveža masa i suva masa M. pulegium. Najveća produkcija biomase je izmerena na podlozi sa 5% saharoze. Najveća sveža masa je iznosila 0,067g, dok je najmanja iznosila 0,048g. Najveća suva masa je vrednosti 0,0150g, dok je najmanja 0,0074g. Ovome idu u prilog i rezultati uticaja saharoze i maltoze na indukciju aksilarnih pupoljaka M. pulegium, gde su najveća sveža i suva masa dobijeni takođe na podlogama sa 5% (Stojičić et al., 2017). 18

6. ZAKLJUČAK Micromeria pulegium se uspešno gaji u kulturi in vitro. Eksplantati su u zavisnosti od koncentracije saharoze manje ili više uspešno rasli na podlogama. To je utvrđeno praćenjem sledećih parametara: prosečnog broja pupoljaka po eksplantatu, prosečne dužine pupoljaka, kao i prosečne sveže i suve mase. Eksplantati koji su gajeni na hranljivoj podlozi bez saharoze nisu uopšte rasli. Prisustvo saharoze u hranljivoj podlozi stimulativno je delovalo na razviće i rastenje aksilarnih pupoljaka. Povećanje koncentracije saharoze (od 1-5%) u podlozi uzrokovalo je da prosečan broj pupoljaka po eksplantatu bude sve veći, najveći broj pupoljaka dobijen je kada su eksplantati gajeni na podlozi sa 5% saharoze. Sa druge strane dužina aksilarnih pupoljaka je bila manja, pa je najveća prosečna vrednost dužine pupoljaka izmerena kod eksplantata gajenih na podlozi sa 1% saharoze. Najveće vrednosti sveže i suve biljne mase zabeležene su na podlozi sa 5% saharoze. Ipak, eksplantati i aksilarni pupoljci gajeni na podlozi sa 1% i 3% pokazali su veću vitalnost u poređenju sa eksplantata gajenih na podlozi sa 5% saharoze. Na eksplantatima gajenim na podlozi sa 3% saharoze razvijali su se adventivni korenovi, što ukazuje da je izvršena kompletna regeneracija M. pulegium u uslovima in vitro. Dobijeni rezultati pokazuju da se metode kulture in vitro mogu uspešno primenjivati u postupku umnožavanja vrste Micromeria pulegium. Na taj način se od male početne količine biljnog materijala može dobiti veliki broj biljaka, koje se mogu reintrodukovati u njihova prirodna staništa, čime bi se sprečilo iščezavanje ove biljne vrste i postigla dodatna zaštita prirodnih staništa. Takođe, ovako dobijen materijal je identičnog genetičkog sastava i kvaliteta, bez infekcije, što predstavlja idealnu biljnu sirovinu koja se može koristiti u različitim industrijama. 19

7. LITERATURA 1) Altman, A. (2000) Micropropagation of plants, principles and practice. In: Spier, R. E. Encyclopedia of Cell Technology. New York: John Wiley & Sons, 916-929. 2) Bentham, G. (1829) Micromeria Bot Reg 15: t. 1282. 3) Bogosavljević, S., Zlatković, B., Ranđelović, V. (2007): Flora klisure Svrljiškog Timoka. 9th Symposium on Flora of Southeastern Serbia and Neighbouring Regions, Niš, proceeding, 41-54. 4) Bräuchler, C., Meimberg, H., Heubl, G. (2006) New names in Old World Clinopodium the transfer of the species of Micromeria sect. Pseudomelissa to Clinopodium. Taxon, 55: 977 981. 5) Bräuchler, C., Ryding, O., Heubl, G. (2008) The genus Micromeria (Lamiaceae), a synoptical update. Willdenowia, 38: 363-410. 6) Chater, A. O., & Guinea, E. (1972). Micromeria Bentham. Flora europaea, 3, 167-170. 7) Debergh, P.C., Maene, L.J. (1981) A scheme for commercial propagation of ornamental plants by tissue culture. Sci. Hortic., 14, 335-345. 8) El-Gazzar, A., Watson, L. (1970) A taxonomic study of Labiatae and related genera. New Phytologist 69: 451 486. 9) Fotopoulos, S., Sotiropoulos, T. (2004) In vitro propagation of the peach rootstock: the effect of different carbon sources and types of sealing material on rooting. Biol Plant 48(4):629 631 10) Giuliani, C., and Maleci B. L. (2008) Insight into the structure and chemistry of glandular trichomes of Labiatae, with emphasis on subfamily Lamioideae. Plant Systematic and Evolution, 276: 199-208. 11) Golubović, A. (2016) Uticaj maltoze na indukciju aksilarnih pupoljaka Micromeria pulegium (Benth.), Master rad, - Prirodno-matematički fakultet, Niš. 12) Haberlandt, G. (1902) Kulturversuche mit isollierten pflanzenzellen. S.B. Weisen Wien Naturwissenschaften.111, 69-92. 13) Harley, R. M., Atkins, S., Budantsev, A. L., Cantino, P. D., Conn, B. J., Grayer, R., Harley, M. M., de Kok, R., Krestovskaja, T., Morales, R., Paton, A. J., Ryding, O., Upson, T. (2004) Labiatae. In: Kadereit, J. W., Kubitzki, K. (eds) The families and genera of vascular plants 20

VII. Flowering plants. Dicotyledons: Lamiales (except Acanthaceae including Avicenniaceae). Springer, Berlin, pp 167 275. 14) Hughes, K.W. (1981.) In vitro ecology: exogenous factors affecting growth and morphogenesis in plant culture system. Environmental and Experimental Botany, 21, 281-288. 15) Kumar, S., Singh, M.P. (2009) Plant Tissue Culture. APH Publishing Corporation, New Delhi 16) Kumar, U. (2001) Methods in Plant Tissue Culture. APH publishing corporation, New Delhi 17) Murashige, T. (1974) Plant propagation throught tissue cultures. Ann Rev. Plant Physiol., 25, 135-165. 18) Murashige, T., Skoog, F. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Phisol. Plant. 15: 473-497 19) Nordine, A., Bousta, D., Elkanchoufi, A., El Meskaoui, A., (2013) An efficient and rapid in vitro propagation system of Thymus hyemalis lange, a wild medicinal and aromatic plant of mediterranean region. International Journal of Pharma Bioscience and Technology. 2013; 1(3): 118-129. 20) Pavlović, J. (2016) Uticaj jačine mineralnih soli na indukciju aksilarnih pupoljaka Micromeria pulegium (Benth.), Master rad, - Prirodno-matematički fakultet, Niš. 21) Petrunović, M. (2018) Uticaj saharoze na indukciju aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima Mcromeria juliana (L.) Benth. in vitro, Master rad, - Prirodno-matematički fakultet, Niš. 22) Rihan, Z.H., Al-Shamari, M., Al-Swedi, F., Burchett, S., Fuller, M.P. (2015) The effect of sugar type, source and concentration on Brassica oleraceae var botrytis microproshoot production. School of Biomedical and Biological Sciences, Faculty of Science and Technology, University of Plymouth, UK, PL4 8AA 23) Šelmić, N. (2013) Efekat različitih regulatora rastenja na regeneraciju Micromeria pulegium in vitro, Master rad, - Prirodno-matematički fakultet, Niš. 24) Šilić, Č. (1979) Monografija rodova Satureja L., Calamintha Miller, Micromeria Bentham, Acinos Miller i Clinopodium L. u flori Jugoslavije, Zemaljski Muzej BiH, Sarajevo. 440p 25) Simonović, J. (2016) Uticaj kazein-hidrolizatana indukciju aksilarnih pupoljaka Micromeria pulegium (Benth.), Master rad, - Prirodno-matematički fakultet, Niš. 26) Ślesak, H., Skoczowski, A., and Przywara, L. (2004) Exogenous Carbohydrate Utilisation by Explants of Brassica napusltt; Cultured in vitro. Plant cell tiss org. 79:45-51. 21

27) Spasić, J. (2013) Mikropropagacija Micromeria pulegium (Benth.), Master rad, - Prirodnomatematički fakultet, Niš. 28) Stojičić, D., Tošić, S., Slavkovska, V., Zlatković, B., Budimir, S., Janošević, D., Uzelac, B. (2016). Glandular trichomes and essential oil characteristics of in vitro propagated Micromeria pulegium (Rochel) Benth. (Lamiaceae). Planta 244(2): 393-404. 29) Stojičić, D., Tošić, S., Pavlović, J., Golubović, A., Simonović, J., Zlatković, B. (2017) Factors influencing axillary bud induction on nodal segments of Micromeria pulegium (Rochel) Benth. Biologica Nyssana, 8 (1), 93-98. 30) Sujana, P., Naidu, C.V., (2011) Impact of Different Carbohydrates on High Frequency Plant Regeneration from Axillary Buds of Mentha piperita (L.) An Important Multipurpose Medicinal Plant. Journal of Phytology 2011, 3(5): 14-18. 31) Takhtajan, A. (2009) Flowering Plants, 2nd edn. Springer Science & Business Media B.V., Dordrecht. 32) Tošić, S. (2015) Fiziološki i biohemijski aspekti propagacije endemičnih vrsta Micromeria pulegium (Rochel) Benth. i Micromeria croatica (Pers.) Schott in vitro, Doktorska disertacija, - Biološki fakultet, Beograd. 33) Tošić, S., Stojičić, D., Stankov-Jovanović, V., Mitić, V., Mihajilov-Krstev, T., Zlatković, B., (2015) Chemical Composition, Antioxidant and Antimicrobial Activites of Micropropagated and Native Micromeria pulegium (Lamiaceae) Extracts, OXIDATION COMMUNICATIONS vol.38 br. 1, str. 55-66. 34) Vinterhalter, D., Vinterhalter, B. (1996) Kultura in vitro i mikropropagacija biljaka. Axial, P. O., Beograd. 35) Zahara, M., Datta A., Boonkorkaew P., Mishra A., (2017) The Effects of Different Media, Sucrose Concentrations and Natural Additives on Plantlet Growth of Phalaenopsis Hybrid Pink. Braz. Arch. Biol. Technol. v.60: e160149. 22

Biografija kandidata Saša Cvetković, rođen je u Nišu 19.04.1993. godine. Osnovnu školu Vuk Karadžić završio je u Pukovcu (opština Doljevac), a Srednju medicinsku školu Dr Milenko Hadžić (laboratorijski tehničar) u Nišu. Prirodno matematički fakultet Univerziteta u Nišu upisuje 2012. godine na Departmanu za biologiju i ekologiju, gde završava Osnovne akademske studije 2016. godine i iste godine upisuje Master akademske studije smer Biologija.

Прилог 5/1 ПРИРОДНO-MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА Редниброј, РБР: Идентификациониброј, ИБР: Типдокументације, ТД: Типзаписа, ТЗ: Врстарада, ВР: Аутор, АУ: Ментор, МН: Наслов рада, НР: Језик публикације, ЈП: Језик извода, ЈИ: монографска текстуални / графички Мастер рад Саша Цветковић Драгана Стојичић српски Утицај сахарозе на индукцију аксиларних пупољака Micromeria pulegium L. (Benth.) in vitro енглески Земља публиковања, ЗП: Р. Србија Уже географско подручје, УГП: Р. Србија Година, ГО: 2019. Издавач, ИЗ: ауторскирепринт Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33. Физички опис рада, ФО: 21 стр.; 11 слика; 5 табеле; 2 histograma. Научна област, НО: Научна дисциплина, НД: Предметна одредница/кључне речи, ПО: Биологија Биологија Micromeria pulegium, mikropropagacija, saharoza, aksilarni pupoljci УДК 664.1:581.44+542:582.919.4 Чувасе, ЧУ: библиотека Важна напомена, ВН: Извод, ИЗ: Micromeria pulegium (Rochel) Benth. је ендемична врста јужних Карпата из породице Lamiaceae. Ова фамилија обухвата често коришћене биљке у кулинарству и народној медицини. M. pulegium насељава камењаре, углавном клисуре, на надморској висини од 1000 до 1200 м. Природне популације ове врсте имају мали број јединки, па се намеће потреба за проналажењем начина њихове заштите, гајења и умножавања. У овом истраживању испитиван је утицај концентрације сахарозе (извора угљеника) на индукцију аксиларних пупољака M. pulegium. Експеримент је показао да је највећи просечан број пупољака по експлантату развијен на подлози са 5% сахарозе. Највећа просечна дужина пупољака добијена је гајењем експлантата на подлози са 1% сахарозе, док је највећа свежа и сува маса добијена када су експлантати гајени на подлози са 5% сахарозе. Датум прихватања теме, ДП: 09.05.2019. Датум одбране, ДО: Чланов икомисије, КО: Председник: Члан: Члан, ментор: Образац Q4.09.13 - Издање 1

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ KEY WORDS DOCUMENTATION Accession number, ANO: Identification number, INO: Document type, DT: Type of record, TR: Contents code, CC: Author, AU: Mentor, MN: Title, TI: monograph textual / graphic master thesis Saša Cvetković Dragana Stojicić Influence of sucrose on axillary bud induction of Micromeria pulegium L. (Benth.) in vitro Language of text, LT: Serbian Language of abstract, LA: English Country of publication, CP: Republic of Serbia Locality of publication, LP: Serbia Publication year, PY: 2019 Publisher, PB: author s reprint Publication place, PP: Niš, Višegradska 33. Physical description, PD: 21 p; 11pictures; 5 tab; 2 chart. Scientific field, SF: Biology Scientific discipline, SD: Biology Subject/Key words, S/KW: Micromeria pulegium, micropropagation, sucrose, axillary buds UC 664.1:581.44+542:582.919.4 Holding data, HD: library Note, N: Abstract, AB: Micromeria pulegium (Rochel) Benth. is an endemic species of Southern Carpathians from the Lamiaceae family. These families include frequently used plants in culinary and folk medicine. M. pulegium settles rocks, mostly gorges, at an altitude of 1000 to 1200 m. Natural populations of this species have a small number of individuals, so the need for finding ways of their protection, cultivation and reproduction is imposed. In this study, the influence of sucrose (carbon source) concentration on the induction of axillary buds M. pulegium was investigated. The experiment showed that the largest average number of buds per explant developed on medium with 5% sucrose. The highest average length of buds was obtained by cultivating explants on the surface with 1% sucrose, while the largest fresh and dry weight was obtained when the explants were grown on a 5% sucrose substrate. Accepted by the Scientific Board on, ASB: 09.05.2019. Defended on, DE: Defended Board, DB: President: Member: Member, Mentor: Образац Q4.09.13 - Издање 1