SVEUČILIŠTE U ZAGREBU

SVEUČILIŠTE U ZAGREBU AGRONOMSKI FAKULTET UTJECAJ DULJINE MACERACIJE NA KAKVOĆU VINA TERAN DIPLOMSKI RAD Sara Rossi Zagreb, lipanj, 2017.

SVEUČILIŠTE U ZAGREBU AGRONOMSKI FAKULTET Diplomski studij: Hortikultura- Vinogradarstvo i vinarstvo UTJECAJ DULJINE MACERACIJE NA KAKVOĆU VINA TERAN DIPLOMSKI RAD Sara Rossi Mentor: prof.dr.sc. Ana Jeromel Zagreb, lipanj, 2017.

SVEUČILIŠTE U ZAGREBU AGRONOMSKI FAKULTET IZJAVA STUDENTA O AKADEMSKOJ ČESTITOSTI Ja, Sara Rossi, JMBAG 0178089988, rođena 07.01.1993. u Puli, izjavljujem da sam samostalno izradila diplomski rad pod naslovom: UTJECAJ DULJINE MACERACIJE NA KAKOVĆU VINA TERAN Svojim potpisom jamčim: da sam jedina autorica ovoga diplomskog rada; da su svi korišteni izvori literature, kako objavljeni tako i neobjavljeni, adekvatno citirani ili parafrazirani, te popisani u literaturi na kraju rada; da ovaj diplomski rad ne sadrži dijelove radova predanih na Agronomskom fakultetu ili drugim ustanovama visokog obrazovanja radi završetka sveučilišnog ili stručnog studija; da je elektronička verzija ovoga diplomskog rada identična tiskanoj koju je odobrio mentor; da sam upoznata s odredbama Etičkog kodeksa Sveučilišta u Zagrebu (Čl. 19). U Zagrebu, dana Potpis studentice

SVEUČILIŠTE U ZAGREBU AGRONOMSKI FAKULTET IZVJEŠĆE O OCJENI I OBRANI DIPLOMSKOG RADA Diplomski rad studentice Sare Rossi, JMBAG 0178089988, naslova UTJECAJ DULJINE MACERACIJE NA KAKVOĆU VINA SORTE TERAN obranjen je i ocijenjen ocjenom, dana. Povjerenstvo: potpisi: 1. prof.dr.sc. Ana Jeromel mentor 2. izv.prof.dr.sc. Marko Karoglan član 3. izv.prof.dr.sc. Stjepan Sito član

Zahvala Zahvaljujem se svojoj mentorici prof. dr. sc. Ani Jeromel na pomoći, potpori i poticaju te mnogobrojnim stručnim savjetima koji su mi pomogli pri izradi ovog diplomskog rada. Također, zahvaljujem se svim svojim prijateljima, prijateljicama i dragim ljudima koji su mi studentske dane učinili nezaboravnima. Hvala vam na zajedničkim trenutcima, iskustvima i razgovorima koji su od mene učinili osobu kakva danas jesam. Zahvalnost iskazujem i cijeloj svojoj obitelji koja me je uvijek podržavala i upućivala na pravi put. I na kraju, najveću zaslugu za ono što sam postigla pripisujem svojim roditeljima, koji su uvijek bili tu uz mene i bez kojih sve ovo što sam do sad postigla ne bi bilo moguće. Hvala vam na beskonačnom strpljenju, neizmjernoj vjeri u moj uspjeh, razumijevanju i ljubavi. Hvala svima!

Sadržaj 1.0. Uvod... 3 1.1. Teran Vitis vinifera L.... 4 1.2. Maceracija... 5 1.3. Produljena maceracija... 7 1.4. Fenolni spojevi... 9 1.4.1. Flavonoidi... 10 1.4.2. Neflavonoidi... 13 2.0. Materijali i metode... 16 2.1. Materijali... 16 2.1.1. Grožđe... 16 2.1.2. Vinifikacija... 17 2.2. Metode... 18 2.2.1. Fizikalno kemijska analiza početnog uzorka mošta... 18 2.2.2. Osnovna kemijska analiza vina... 19 2.2.3. Određivanje kromatskih karakteristika vina... 21 3.0. Rezultati i rasprava... 24 3.1. Osnovna analiza mošta... 24 3.2. Osnovna analiza vina... 24 3.3. Kromatske karakteristike vina... 25 3.3.1. Određivanje boje na spektrofotometru... 25 3.3.2. Ukupni fenoli... 30 3.3.3. Pojedinačni polifenoli... 31 3.4. Senzorna analiza vina... 36 4.0. Zaključak... 37 5.0. Literatura... 38 6.0. Prilozi... 45 Životopis... 47

Sažetak Diplomskog rada studentice Sare Rossi, naslova UTJECAJ DULJINE MACERACIJE NA KAKVOĆU VINA TERAN Maceracija je kontakt krute i tekuće faze, odnosno kožice bobice, sjemenke, te soka. Proces maceracije je zaslužan za nakupljanje polifenolnih spojeva u moštu i vinu. Polifenoli su spojevi koji imaju vrlo značajan utjecaj na kakvoću vina, oni utječu na strukturu, oporost, trpkoću, gorčinu, boju vina i potencijal starenja, te imaju pozitivan utjecaj na zdravlje čovjeka. Koncentracije polifenola u vinu ovise o sorti, stupnju zrelosti grožđa, klimi, tlu, ampelotehničkim zahvatima u vinogradu te o procesima tijekom vinifikacije. U tehnologiji proizvodnje crvenih vina razlikujemo više načina maceriranja grožđa, ovisno o dužini i temperaturi maceracije, odnosno različitim tehnološkim postupcima tijekom vinifikacije grožđa. U ovom istraživanju su ispitane tri različite duljine maceracije na istarskoj autohtonoj sorti ''Teran'' u trajanju od 7, 14 i 28 dana, te je provedena osnovna kemijska analiza mošta i vina, određena koncentracija ukupnih i pojedinačnih polifenola vina, definirane karakteristike boje, te senzorna svojstva vina. Rezultati svih analiza su pokazali da postoje vidljive razlike izdvajanju polifenolnih sastojaka u vino. Maceracija u trajanju od 14 dana je utjecala na izdvajanje najviših koncentracija ukupnih i pojedinačnih polifenola, najbolji utjecaj na karakteristike boje, a senzornom analizom vina je također najbolje ocijenjena. Ekstrakcija pojedinih tvari masulja, tijekom maceracije, mora biti u funkciji svojstava i kvalitete grožđa, te tipa vina koje želimo proizvesti, stoga kako dobiveni rezultati ukazuju na postojanje razlika među primijenjenim duljinama maceracije, pri proizvodnji željenog tipa vina definiranih mirisnih i okusnih svojstava potrebno je pažljivo odabrati kako tip tako i duljinu maceracije. Ključne riječi: maceracija, produljena maceracija, polifenoli, sorta ''Teran'' 1

Summary Of the master's thesis- student Sara Rossi, entitled THE INFLUENCE OF SKIN MACERATION TIME ON QUALITY OF RED WINE TERAN Maceration is the winemaking process where the phenolic materials of the grape are leached from the grape skins, seeds and stem into the must. Phenolic compounds are important to red wine quality because they have significant effect on color, structure, body, flavour, mouthfeel, ageability and positive effect on human health. The phenolic composition of wines depends on the grape variety, degree of grape maturity, climate, soil, ampelotehnical procedures in vineyard and winemaking conditions. In the technology of red wine production, we differentiate ways of macerating grapes depending on the maceration time and temperature. Effect of different skin maceration duration ( 7, 14 and 28 days) on total phenolics, flavonoids, nonflavonoids, individual and total anthocyanins, phenolic acids, color characteristics ( intensity, hue and density) and sensory properties in red grapevine variety Teran has been investigated in this study. The results showed that in general different skin contact time influenced on content of phenols. The wine made by 14-day maceration contained the higest amounts of total and individual polyphenols, the best color characteristics and sensory attributes of wine. The extraction of substances during maceration must be in function of grape quality and the type of wine we want to produce. The production of the desired type of wine with defined aromatic and sensory characteristics needs careful choice of type and time of the maceration. Key words: maceration, extended maceration, polyphenols, variety "Teran 2

1.0. Uvod Vino je vrlo kompleksan proizvod poznat i kao jedno od najstarijih prirodnih pića. Uz alkohol etanol kao kvantitativno najzastupljeniji sastojak vino sadrži na stotine spojeva različitih kemijskih struktura i svojstava. Svakoj grupi spojeva pripada veća ili manja važnost u definiranju kakvoće vina. Grožđe je bogat izvor organskih kiselina, ugljikohidrata, minerala, dušikovih spojeva i vode, a za senzorske karakteristike vina odgovorni su aromatski spojevi i polifenoli. Polifenoli imaju značajnu ulogu u kakvoći vina, utječu na boju, okus, trpkoću, gorčinu i potencijal starenja, te imaju antioksidacijska, antikancerogena i neuroprotektivna svojstva. Uz grožđe, na njihov sadržaj važnu ulogu imaju tehnologija proizvodnje vina i uvjeti dozrijevanja. Crna vina dobivaju se paralelnim postupkom maceracije i alkoholne fermentacije. Maceracija, neizbježan postupak u proizvodnji crnih vina, je proces prelaska tvari, odnosno polifenolnih spojeva iz kožice i sjemenke bobice u vino. Izrazito bitan čimbenik u procesu maceracije uz temperaturu je i duljina trajanja maceracije. Ovisno o karakteristikama i kvaliteti grožđa, tipu vina kojeg želimo proizvesti i uvjetima tijekom fermentacije, maceracija može biti duža ili kraća. Tako se za mlada crna vina, koja su namijenjena brzoj potrošnji provodi kraća maceracija, dok se za vina namijenjena starenju provodi duža maceracija. Produljenje trajanja maceracije izvan perioda trajanja alkoholne fermentacije primjer je stare vinarske tehnike koja je ponovno usvojena u modernom vinarstvu. Obično traje od 14 do 28 dana, ponekad i duže, a provodi se na temperaturama između 15 C i 35 C. Vinarije strateški upotrebljavaju tehniku produljene maceracije, grožđe za takva vina se bira s najboljih položaja, te imaju višu cijenu proizvodnje, a samim time se povećava i cijena vina dobivenih produljenom maceracijom. Cilj ovog diplomskog rada je ustanoviti u kojoj mjeri će različita duljina trajanja maceracije od 7, 14 i 28 dana utjecati na kakvoću vina autohtone istarske sorte ''Teran''. Kakvoća će se utvrditi kroz osnovnu kemijsku analizu mošta i vina, koncentraciju ukupnih i pojedinačnih polifenola, te senzorsku analizu vina. Od ovih se analiza očekuje da će se jasno moći očitati poveznica između primijenjene duljine maceracije i dobivenih rezultata, te da će se na kraju istraživanja moći utvrditi koju duljinu maceracije je najbolje upotrijebiti za dobivanje željenog tipa vina, odnosno vina željenih fizikalno-kemijskih, kromatskih i senzorskih svojstava. 3

1.1. Teran Vitis vinifera L. Teran je autohtona sorta istarskog poluotoka koja je do prije 100 godina bila glavna istarska sorta. Danas je treća po zastupljenosti u Istri, zauzima površinu od 260.37 ha sa 1.056.644 trsova ( Vinogradarski registar, 2016). Kroz povijest često se poistovjećivala s refoškom, međutim na osnovi opažanja i proučavanja hrvatskih autora (E. Maletić i sur., 2014), utvrdilo se da unutar ove sorte, postoje različiti klonovi, koji se morfološki, fiziološki i gospodarski razlikuju. Vivoda (1996.) kao jednu od glavnih morfoloških razlika između sorte Teran i sorte Refošk navodi dlakavost unutarnje strane lista Terana, dok je list Refoška gladak. Vršci mladica Terana su svijetlozeleni, jako runjavi, a rubovi mladih listića su crvenkasti. Cvijet je dvospolan. Odrasli list je okruglast ili produljen, srednji dio je širok, trodijelan ili peterodijelan, sinus peteljke je oblika otvorenog V, lice jasno zeleno, u jesen ljubičastosmeđe, uzduž rebara zeleno, naličje bjelkasto vunasto ( N. Mirošević, Z. Turković, 2003). Grozd je srednje velik ili velik, gust do rahli i granat, peteljka grozda je srednje duga, jaka, do koljenca odrvenjela, inače karakteristično zelena, kao i cijela peteljka. Zrele bobice su srednje veličine, crno-ljubičaste, jajolike. Kožica je vrlo otporna, meso praskavo, pod kožicom crvenkasto, sok kiselkast, bez osobitog okusa. Rodnost je obilna, otpornost prema bolestima je dobra. Teran akumulira prosječno 16 % šećera i ukupnih kiselina i do preko 10 g/l. Izrazito visok ili viši sadržaj ukupnih kiselina, jedna je od glavnih tehnoloških karakteristika. Dozrijeva kasno (IV. razdoblje) i ako su vremenske prilike tijekom rujna dobre, daje visoku kvalitetu (preko 19 % šećera). Vino Teran ima karakterističnu rubin-crvenu boju. Aroma je izražena i prepoznatljiva, tipičnog voćnog karaktera kod kojeg dominira miris maline. Relativno visoka ukupna kiselost i prisutnost određene razine trpkosti, uklopljena u visok ekstrakt, daje ovom vinu karakterističan okus punog, robusnog ali i ugodno sljubljenog vina ( N. Mirošević, Z. Turković, 2003). Slika 1. Grožđe sorte Teran ( Izvor: vlastita izrada autora, 2015). 4

1.2. Maceracija Maceracija je proces prelaska tvari, odnosno polifenolnih spojeva iz kožice i sjemenke bobice u vino. Pri proizvodnji crnih vina od posebnog značaja je prelazak sastojaka iz čvrstih dijelova grožđa u mošt, vino. Među ovim sastojcima najznačajniji su antocijani i tanini, a zatim i drugi spojevi poput tvari arome, nitrata, minerala i dr. Većina fenolnih spojeva se nalaze u kožici bobice i u sjemenkama (Kennedy i sur. 2001, Souquet i sur. 1996). Fenoli utječu na boju vina i senzorske karakteristike (Auw i sur. 1996, Somers i Evans 1974, Zimman i sur. 2002). S obzirom na to, kompozicija i organoleptičke karakteristike crvenog vina pod velikim su utjecajem maceracije i ekstrakcije fenolnih spojeva iz grožđa, kao i njihovim naknadnim reakcijama u vinu (Basha i sur. 2004, King i sur. 2003, Sims i Bates 1994). Osim na ekstrakciju fenolnih spojeva, maceracija utječe i na oslobađanje voćnih aroma i prekursora arome koji su smješteni u kožici bobice. Podjela maceracije: 1. pred-fermentativna maceracija traje relativno kratko od nekoliko sati do nekoliko dana i odvija se prije početka alkoholne fermentacije, 2. fermentativna maceracija odvija se tijekom alkoholne fermentacije i traje nekoliko dana (2-7), 3. post-fermentativna maceracija odvija se nakon završetka alkoholne fermentacije i traje od nekoliko dana do nekoliko tjedana. Predfermentativna maceracija je proces u kojem je tekući dio masulja u kontaktu sa krutim prije nego što započne fermentacija. Budući da fermentacija nije započela alkohol i ugljični dioksid nisu prisutni. Ta tehnologija se koristi u proizvodnji ružičastih vina, ali i u proizvodnji bijelih vina. Najčešće se naziva i hladna maceracija s obzirom na temperaturu na kojoj se provodi a koja je najčešće oko 10 C. Fermentativna maceracija je proces u kojem je tekući dio masulja u kontaktu sa krutim dok traje fermentacija. Budući da su kvasci započeli svoj rad, stvaraju se alkohol, ugljični dioksid i druge značajne tvari koje mijenjaju medij maceracije, a koji utječe na ekstrakciju (kvalitativno i kvantitativno) tvari iz krutog dijela masulja. Ta tehnologija se koristi u proizvodnji crnih vina, a ponekad i u proizvodnji bijelih vina. 5

Post-fermentativna maceracija je proces u kojem je tekući dio masulja u kontaktu sa krutim nakon što završi fermentacija, tzv. produžena maceracija. Budući da je fermentacija završila medij maceracije je bitno drugačiji nego prije početka fermentacije, prisutan je alkohol, ugljični dioksid, šećeri su se znatno smanjili ili ih uopće nema i druge značajne tvari koje mijenjaju medij maceracije, a koji itekako utječu na ekstrakciju tvari iz krutog dijela masulja. Ta tehnologija se koristi u proizvodnji crnih vina, a ponekad i u proizvodnji bijelih. Količina fenola koja će se ekstrahirati maceracijom prije svega ovisi o njihovoj koncentraciji u grožđu. Osim količine, za tijek i učinak maceracije bitne su osobine istih. Topljivost pigmenata pokožice naročito je povezana sa stupnjem zrelosti grožđa. Uz fenolnu zrelost koja odgovara optimalnoj akumulaciji fenolnih spojeva u bobici, definirana je i stanična zrelost koja je povezana sa stupnjem degradacije staničnih pregrada, sa većom ili manjom lakoćom ekstrakcije fenolnih sastojaka (Amrani,1993). Sorta i utjecaji terroir -a reguliraju fenolnu zrelost. Maceracija je regulirana različitim procesima: Ekstrakcija i topivost različitih tvari čvrstih dijelova masulja u tekuću fazu Topivost tvari prije svega ovisi o sorti grožđa, stupnju zrelosti i zdravstvenom stanju grožđa. Potpomognuta je razaranjem tkiva, bilo enzimskim putem ili tijekom muljanja. Ovisi i o različitim operacijama koje dovode do razaranja stanica tkiva: sulfitiranje, prisustvo etanola, povišene temperature i vrijeme kontakta. Difuzija ekstrahiranih tvari u masulj Tekuća faza se brzo zasićuje ekstrahiranim tvarima te tada prestaje difuzija. Daljnja je topivost i difuzija osigurana obnavljanjem novom tekućom fazom, koja je posljedica remontaže ili potapanja masulja. Refiksacija ekstrahiranih tvari na pojedine tvari sredine Fenomen je objašnjen istraživanjem Feere (1958), gdje pojedini drveni dijelovi peteljke, sjemenke, te kvasci apsorbiraju ekstrahirane tvari, naročito antocijane. Modifikacija ekstrahiranih tvari Postoji mogućnost privremene redukcije antocijana u bezbojnu formu. Reakcija je reverzibilna jer ostavimo li mlado vino 24 sata na zraku intenzitet boje se pojačava. Formiranje kompleksa antocijana i željeza (Fe) u kontaktu sa kisikom iz zraka, može pridonijeti tom povećanju boje. 6

Topivost fenolnih tvari je ovisno o vremenu maceriranja, ali ne postoji proporcionalnost između vremena trajanja maceracije i sadržaja fenolnih sastojaka. U početnoj fazi maceracije fenoli se najlakše ekstrahiraju iz pokožice. Ekstrakcija antocijana započinje već u predfermentativnoj fazi maceracije. Antocijani pokožice se prvi ekstrahiraju i to zato jer za njihovo otapanje nije potreban etanol. Kada alkoholna fermentacija dostigne određenu razinu ekstrakcija je skoro gotova. Poznato je da se tijekom maceracije intenzitet obojenja povećanja prvih 8-10 dana, a nakon toga opada. Ekstrakcija fenola ovisi najviše o koncentraciji tanina koja je u grožđu otprilike 10 puta veća od koncentracije antocijana. Različiti dijelovi grozda (pokožica, sjemenke, peteljke) sadrže specifične fenolne spojeve čija je ekstrakcija varijabilna ovisno o uvjetima. Tanini pokožice ekstrahiraju se zajedno s antocijanima, ali se njihova ekstrakcija nastavlja u duljem periodu. Razlog je tome smještaj tanina u stanicama pokožice bobice. Otapanje tanina pokožice započinje kasnije, potpomognuto etanolom. Sjemenke sadrže visoke koncentracije fenola, uglavnom monomera flavan-3-ola i proantocijanidine. Proantocijanidini se ekstrahiraju u onom trenutku kada se kutikula sjemenke otvori, a to se najčešće odvija u polovici alkoholne fermentacije. Ekstrakcija ovih komponenata se nastavlja u post-fermentativnoj maceraciji (Kovač i sur. 1992, Vrhovšek i sur. 2002, Damijanić i sur. 2011) Naposljetku, za ekstrakciju tanina iz sjemenki potrebno je duže vrijeme maceriranja jer je prisutnost etanola neophodna za eliminaciju lipida sjemenke. Tanini pokožice su puno mekši ali mogu postati gorki ako je grožđe nedovoljno zrelo. Značajne koncentracije fenola pronađene su u peteljci grozda, od čega je od četrdeset do pedeset posto polimerizirano, a upravo je to razlog zašto vina koja su proizvedena uz dodatak peteljke imaju veću količinu fenola. 1.3. Produljena maceracija Ekstrakcija fenolnih spojeva iz čvrstih dijelova grožđa u vino, može biti produljena izvan razdoblja trajanja alkoholne fermentacije. Produljenje trajanja maceracije izvan perioda trajanja alkoholne fermentacije primjer je stare vinarske tehnike koja je usvojena u modernom 7

vinarstvu. Obično traje od 4 dana do 4 tjedna i provodi se na temperaturama između 15 C i 35 C ovisno o tipu vina koji želimo proizvesti. Vinari mogu produljiti trajanje maceracije na način tako da nakon što izmuljaju grožđe odgađaju inokulaciju kvascima nekoliko dana, pa imamo produljenje maceracije prije početka alkoholne fermentacije (predfermetativna maceracija), ili odgađanjem prešanja grožđa nakon završetka alkoholne fermentacije (post-alkoholna maceracija) (Watson i sur. 1997, Heatherbell i sur. 1996, Boulton i sur. 1998). Produljenje trajanja maceracije prije ili nakon alkoholne fermentacije se provodi kako bi se povećala koncentracija fenolnih tvari u vinu. Jednom kad ti spojevi dođu u vino, podvrgavaju se brojnim kemijskim rekacijama koje tijekom čitavog života vina utječu na senzorna svojstva (Gomez-Plaza i sur. 2001, Reynolds i sur. 2001, Sucdamore-Smith i sur. 1990, Yokotsuka i sur. 1999). Produljenje maceracije nakon završetka alkoholne fermentacije je poželjno za ekstrakciju spojeva koji su topivi u alkoholu molekula velike molekularne mase koje uzrokuju astringenciju i gorčinu, kao što su tanini iz sjemenki grožđa (Singleton i Noble 1976, Cerpa- Calderòn i Kennedy 2008). Kantz i Singleton (1991) su dokazali da se ekstrakcija monomernih i polimernih fenola povećava produljenjem maceracije, te da su koncentracije koje se ekstrahiraju u vino proporcionalne onima koje su prisutne u grožđu. Osim toga, ekstrahiraju se dodatni tanini iz kožice i sjemenke, i pigmentirani tanini iz pulpe čime se osigurava poželjan mouthfeel vinu i povećava stabilnost boje. Post-fermentativna maceracija utječe na stabilnost boje zbog povećane ekstrakcije fenola i naknadne polimerizacije tanina s antocijanima. Također se smatra da se polimerizacijom tanina može dobiti kompleksnije, bogatije i mekše vino s boljim karakteristikama i sposobnošću za starenje. Vinarije strateški upotrebljavaju tehniku produljenje maceracije, grožđe za takva vina se većinom bira s najboljih položaja te imaju višu cijenu proizvodnje, samim time se povećava i cijena vina dobivenih produljenom maceracijom. Današnja je teza da post-fermentativna maceracija povećava stabilnost boje preko povećane ekstrakcije fenola i polimerizacije tanina sa antocijanima i sukladno tome je i mišljenje da polimerizacija rezultira kompleksnijim, bogatijim vinom sa boljim kapacitetom za sazrijevanje što omogućuje bolja organoleptička svojstva vina (Sipiora i Granda, 1998; Auw i sur. 1996; Yokotsuka i sur. 1999). 8

1.4. Fenolni spojevi Grožđe je bogat izvor organskih kiselina, ugljikohidrata, fenola, minerala, dušikovih i aromatskih spojeva i vode. Za senzorske karakteristike vina jednim dijelom odgovorni su fenolni spojevi, koji iz kožice i opne sjemenke prelaze u vino. Fenoli imaju značajnu ulogu u kakvoći vina, utječu na boju, okus, astringenciju, gorčinu i potencijal starenja, te imaju antioksidacijska, antikancerogena i neuroprotektivna svojstva. Fenoli su organski spojevi kod kojih je hidroksilna grupa (-OH) neposredno vezana na C atom atomske jezgre. Slika 2. Struktura fenola (Izvor: https://bs.wikipedia.org/wiki/fenoli) Fenoli su smješteni u kožici bobice, opni sjemenke, u soku i u mesu iz kojih prelaze u mošt i vino. Distribucija ukupnih fenola u bobici je: 65 % u sjemenci, 30% u kožici i 4-5% u mesu. Odgovorni su za boju crnih vina, a njihova ukupna koncentracija u crnom vinu je oko 5 500 mg/l Koncentracija ovisi o sorti, klimatskim uvjetima, ampelotehničkim zahvatima, i tehnologiji proizvodnje vina. Tijekom dozrijevanja grožđa počinju se u bobici stvarati fenoli, najprije monomeri, a poslije polimeri. Tijekom alkoholne fermentacije mošta od crvenog grožđa, fenolni spojevi i ostali sastojci koji se nalaze u grožđu dolaze u vino procesom difuzije. Difuzija je proces kojim se sastojci kreću iz područja više koncentracije prema području niže koncentracije. Neki od faktora koji utječu na proces difuzije fenolnih spojeva iz grožđa u vino tijekom maceracije su: temperatura mošta ili vina, trajanje kontakta kožice i sjemenke sa sokom, fizičko tretiranje mošta uključujući potapanje klobuka, razina alkohola u moštu te razina sumpornog dioksida, prisustvo peteljkovine grožđa tijekom fermentacije, odabir kvasaca, sorta te dozrelost grožđa (Williams 1997, Arnous i sur. 2002, Singleton i Trousdale 1983, Mazza i sur. 1999, Soleas i sur. 1998, Blanco i sur. 1998, Bakker i sur. 1998, Gomez-Plaza i sur. 2000). 9

Slika 3. Osnovna podjela polifenola ( Izvor: vlastita izrada autora, 2017). 1.4.1. Flavonoidi Flavonoidi predstavljaju najrašireniju grupu prirodnih složenih fenola. Karakteristični su za crna vina jer sadrže 85% ili više ukupnih polifenola, dok u bijelim vinima prevladavaju neflavonoidi. Nalaze se u sjemenkama, kožici i peteljkovini grožđa, a u soku ih ima vrlo malo. U grožđu su identificirane sljedeće skupine flavonoida : antocijani, flavan - 3 - oli, proantocijanidini, flavonoli i dihidroflavonoli. Broj poznatih flavonoida u prirodi je vrlo velik (oko 4000 od ukupno poznatih 10000 polifenola), a u njih se ubrajaju i ostale skupine flavonoida koje nisu identificirane u grožđu : flavoni, flavanoni, halkoni i dihidrohalkoni. 10

1.4.1.1. Flavonoli Flavonoli se primarno nalaze kao 3-glikozidi od 6 aglikona: miricetin, kvercetin, kemperfol, laricitin, siringetin i izoramnetin u grožđu Vitis vinifere, te u njezinom vinu. Uslijed različite kombinacije glikozidnih formi, čak je 21 različiti flavonol pronađen u vinu. Kvercetin, kempferol i miricetin su najzastupljeniji flavonoli u bijelom i crvenom grožđu i vinu. Koncentracija flavonola u crvenom vinu je oko 100 mg/l, dok je koncentracija u bijelom vinu 1-3 mg/l. Sa spektralnog gledišta, flavonoli su žuti pigmenti, i snažno apsorbiraju svjetlo u vidljivom dijelu spektra 325-400 nm (Price i sur. 1995, Waterhouse 2002, Castillo-Muῆoz i sur. 2009). Nositelji su boje bijelih vina, a u crnim vinima su maskirani antocijanima-crvenim pigmentima (Arnous i sur. 2002). Slika 4. Struktura flavonola (Izvor: article.sapub.org) 1.4.1.2. Flavan-3-oli ( flavanoli) Flavan-3-oli su bezbojni spojevi, prisutni u prirodnim supstratima kao aglikoni koji su najčešće monomeri ili polimeri. U grožđu i vinu najznačajniji flavan-3-oli su: (+) katehin, (-) epikatehin, (+) galokatehin, (-) epigalokatehin, epikatehin-3-o-galat, katehin galat i katehinkatehin-galat (Ribèrau-Gayon, 2006). Koncentracija im varira s obzirom na sortu od 5-100 mg/l. Ekstrahiraju se u vino iz sjemenke, kožice i peteljke. Ne utječu na boju vina, ali daju oporost okusu. Tijekom dozrijevanja vina kondenziraju se i talože. Katehina ima najviše u sjemenkama, dok u peteljci i kožici manje, a količina koja će se ekstrahirati ovisi o maceraciji i pritiscima tijekom prešanja. 11

Slika 5. Struktura flavan-3-ola, (+) katehin i (-) epikatehin (Izvor: chemistry.muohio.edu) 1.4.1.3. Proantocijanidini ( kondenzirani tanini) Tanini su polimeri flavonoidnih i neflavonoidnih fenola. Nalaze se u čvrstim dijelovima grožđa, kožici i sjemenkama. Najveći utjecaj imaju na trpkost, gorčinu i oporost vina. Tanini u grožđu i vinu dijele se u tri velike skupine: kondezirajuće, hidrolizirajuće i kompleksne (Khanbabaee i Van Ree, 2001). Kondenzirajući tanini (procijanidini ili katehinski tanini) su tanini kožice crvenog i bijelog grožđa i tanini sjemenke bobice grožđa (Casassa i sur. 2013, Sacchi i sur. 2005). Hidrolizirajući tanini su galotanini i elagitanini, a u vino dolaze iz drva, bilo fermentacijom ili dozrijevanjem vina u drvenom posuđu, korištenjem čipsa i praškastih (egzogenih) tanina. Kompleksni tanini nastaju tijekom dozrijevanja vina spajanjem tanina grožđa i tanina drva. Koncentracija tanina kod crnog mošta je 1-2,5 g/l, a u crnom vinu 4 g/l (Rib ereau-gayon, 2006). Slika 6. Struktura proantocijanidina (tanina) ( Izvor: www.sciseek.com ) 12

1.4.1.4. Antocijani Antocijani su pigmenti crvene do plave boje. Nalaze se kao C3 heterozidi čiji aglikon ili antocijanidin je izveden od 2-benzil-1-benzopirilium kationa (flavilium ion). U antocijanima najčešće nalazimo glukozu koja se može vezati na C-3 i / ili C-5 položaj molekule antocijanidina i na taj se način povećava kemijska stabilnost i topivost antocijana (Clifford i sur., 2000). Od 23 antocijanidina koji se nalaze u biljkama (Kong i sur., 2003), samo ih je 6 pronađeno u Vitis viniferi: pelargonidin, cijanidin, peonidin, delfinidin, petunidin i malvidin (Cheynier, 2006, Castillo-Muῆoz i sur., 2009, He i sur., 2010). Za većinu sorata Vitis vinifere malvidin-3- glukozid je prevladavajući antocijan, i u grožđu derivati malvidina mogu činiti 39-72% od ukupnog antocijanskog profila (Baldi i sur., 1995, Castellarin i sur., 2006, Cortell i sur., 2007, Downey i Rochfort 2008, Manfra i sur., 2011). Slika 7. Struktura antocijana (Izvor: www.enoviti-hanumangirl.blogspot.com) Raspodjela i koncentracija antocijana u grožđu ovisi o sorti, zrelosti grožđa, klimatskim uvjetima, području proizvodnje te prinosu. Antocijani su vrlo osjetljivi spojevi te na njihovu stabilnost utječu brojni čimbenici: ph, temperatura, svjetlo, prisutnost drugih fenolnih spojeva, enzimi, ioni metala, šećer, askorbinska kiselina, kisik i sumporni dioksid (Clifford i sur., 2000). 1.4.2. Neflavonoidi Neflavonoidi su sastavni su dio lignina i tkiva biljaka, a dolaze vezani na antocijane i šećere. Nalaze se u kožici bobice u količini od 0,1 30 mg/l. U vinu se nalaze slobodni ili u obliku estera, te pridonose aromi vina. 13

1.4.2.1. Hidroksibenzojeve kiseline Hidroksibenzojeve kiseline su derivati benzojeve kiseline sa karakterističnom strukturom tipa C6-C1. Galna, vanilinska i siringinska kiselina su najzastupljenjije hidroksibenzojeve kiseline u vinu. Galna kiselina se najčešće predstavlja kao najvažnija jer je prekursor svih hidrolizirajućih tanina (Garido, 2013). Koncentracije hidroksibenzojevih kiselina u vinu dosta variraju te ovise o sorti vinove loze i uvjetima uzgoja. Slika 8. Struktura hidroksibenzojeve kiseline ( Izvor: Robards i sur., 1999). 1.4.2.2. Hidroksicimetne kiseline Pripadaju grupi fenilpropanoida, te imaju strukturu C6-C3 tipa. Najznačajniji predstavnici ove skupine kiselina su: kafeinska kumarinska, kaftarna, cimetna i ferulinska kiselina. U vinima su najčešće vezane esterskim vezama s vinskom kiselinom, nešto manje s jabučnom kiselinom, a malim dijelom se nalaze i u slobodnom stanju. Najzastupljenija hidroksicimetna kiselina u vinu jest kaftarna sa više od 50%. Ostali značajni predstavnici su esteri vinske kiseline s p-kumarnom i feruličnom kiselinom ( Palčić, 2011). Slika 9. Struktura hidroksicimetne kiseline ( Izvor: Macheix i sur., 1990). 14

1.4.2.3. Stilbeni Stilbeni su derivati cimetne kiseline koji nastaju u biljkama kao posljedica izloženosti stresu. Iako su zastupljeni u malim količinama oni zaokupljaju interes mnogih znanstvenika zbog svojih pozitivnih učinaka na zdravlje ( antioksidativno, antikancerogeno i antimutageno djelovanje). Grožđe i vino su dva glavna izvora ovih spojeva. Najviše ih ima u pokožici, ali bitna količina se može pronaći i u peteljci. Resveratrol je glavni stilben grožđa, a postoji u dva izomerna oblika ( Kashif, 2010). Najviše proučavani stilben u vinu je trans- resveratrol. Sadržaj stilbena u vinu vrlo je varijabilan ( ali najčešće je to oko 5 mg/l) i ovisi o klimi, sorti, infekciji gljivicama ( posebno Botrytis Cinerea), UV zračenju, sadržaju iona teških metala te tehničkim postupcima tijekom vinifikacije ( Palčić, 2011). Slika 10. Struktura resveratrola ( Izvor: www.wikipedia.org) 15

2.0. Materijali i metode 2.1. Materijali 2.1.1. Grožđe Istraživanje je provedeno 2015. godine na sorti Teran ( Vitis Vinifera, L.) na obiteljskom poljoprivrednom gospodarstvu Pino Rossi Vina. Vinograd u kojem je provedena berba grožđa za istraživanje se uzdiže nad dolinom rijeke Mirne, a nalazi se ispod sela Bajkini. Vinogorje je Zapadna Istra, a lokacija ''Božja njiva'' koja je udaljena 15 kilometara od grada Poreč. Nalazi se na 200 metara nadmorske visine, južne je ekspozicije, blagog nagiba i smjera redova sjever-jug. Zemlja je tipična crvenica, a klima Mediteranska koju karakteriziraju topla i suha ljeta, te blage zime. Starost trsova u navedenom vinogradu je između 12 i 15 godina. Korištena je standardna vinogradarska praksa za sortu i regiju. Berba je obavljena 16.9.2015. godine u doba tehnološke zrelosti, a stupanj zrelosti se odredio standardnim kemijskim analizama ( šećer, ph, ukupna kiselost izražena kao vinska ). Berba je obavljena ručno u plastične posude zapremine 22 kilograma koje su pomoću traktorske prikolice prevezene do podruma gdje se odmah pristupilo preradi. Provedena je primarna prerada grožđa koristeći runjaču-muljaču, te sulfitiranje ( 45 mg/l). Količina grožđa od 500 kilograma se zajedno preradila i ravnomjerno raspodijelila u inox tankove za fermentaciju, a svaki je tank napunjen sa 100 litara masulja. Za istraživanje su korišteni inox tankovi hrvatskog proizvođača iz Čakovca, Letina. Tankovi su zapremnine od 150 litara, imaju zračni poklopac i vrenjaču koji omogućavaju fermentaciju i čuvanje vina. Slika 11. Grožđe sorte Teran ( Izvor: vlastita izrada autora, 2015). Slika 12. Tankovi za mini vinifikaciju ( Izvor: vlastita izrada autora, 2015). 16

2.1.2. Vinifikacija Pokus je postavljen u 3 varijante: Varijanta 1- Maceracija u trajanju od 7 dana Varijanta 2- Maceracija u trajanju od 14 dana Varijanta 3- Maceracija u trajanju od 28 dana Svi moštovi inokulirani su kvascem Red Fruit ( Saccharomyces cerevisiae), a rad kvasaca je potaknut hranom za kvasce Nutriferm Advance. Tijekom fermentacije u sva tri tanka provodila se maceracija uz ručno potapanje klobuka tri puta dnevno. Zbog odvajanja klobuka i tekućeg dijela masulja miješanje odnosno potapanje klobuka je potrebno radi bolje ekstrakcije tvari iz čvrstih dijelova. Duljina alkoholne fermentacije bila je podjednaka u sve tri varijante, te je trajala između 7 i 14 dana. Temperatura fermentacije nije bila kontrolirana, međutim ona je praćena svaki dan, te je iznosila između 15 i 35 C, ovisno o fazi fermentacije. 7 dana od berbe, (22.09.) obavljeno je otakanje sa masulja i sulfitiranje prve varijante, 14 dana nakon berbe (29.09.) obavljeno je otakanje sa masulja i sulfitiranje druge varijante, te 28 dana nakon berbe ( 14.10.) obavljeno je otakanje sa masulja i sulfitiranje posljednje, odnosno treće varijante. U vinifikaciji su korištena slijedeća enološka sredstva: kalij metabisulfit Winy, Enartis, USA kvasci Red Fruit ( Saccharomyces cerevisiae) Enartis, SAD enzimi Color Plus, Enartis, USA hrana za kvasce Nutriferm Advance, Enartis, USA Tijekom vinifikacije od svake varijante odvajani su uzorci mošta ( 0.250 mlx 2 ), koji su potom zamrznuti kako bi se kasnije moglo pristupiti kemijskim analizama mošta i vina (određivanje šećera, ph i ukupnih kiselina koje je određeno na dan prerade grožđa, te određivanje nijanse, kompozicije i intenziteta boje, ukupnih polifenola i pojedinačnih polifenola koje je odrađeno u proljeće 2016. godine). Uzorci su za svaku varijantu uzeti na dan prerade grožđa, na kraju alkoholne fermentacije, te na kraju maceracije. Uzeti su i uzorci gotovog vina, te se u proljeće 2016. godine pristupilo osnovnoj analizi vina, a potom u proljeće 2017. godine i senzorskoj analizi vina. Metode prethodno navedenih analiza su opisane u nastavku. 17

2.2. Metode 2.2.1. Fizikalno kemijska analiza početnog uzorka mošta Na dan berbe, 16.09.2015. odrađena je fizikalno-kemijska analiza mošta u vinarskom laboratoriju Instituta za poljoprivredu i turizam u Poreču. Fizikalno-kemijska analiza provedena je metodama koje su propisane Pravilnikom o fizikalno-kemijskim metodama analize mošta, vina, drugih proizvoda od grožđa i vina te voćnih vina (N.N., br.106/04). Određen je sadržaj šećera, ph vrijednost te ukupna kiselost izražena kao vinska. Osnovnom fizikalno-kemijskom analizom početnog uzorka mošta obuhvaćeni su slijedeći parametri: Šećer, određen je pomoću aerometra ili moštne vage ( Baboo) i refraktometra, odnosno fizikalnim metodama koje su brze i jednostavne. Iako su manje točne od kemijskih, u praksi daju zadovoljavajuće rezultate i najčešće se koriste. Mjere ukupnu topivu tvar u moštu što je direktni pokazatelj sadržaja šećera, pošto šećer predstavlja oko 95% ukupne topive tvari mošta. Metode određivanja šećera u moštu: Baboov moštomjer (Klosterneuburška moštna vaga) izražava sadržaj šećera u masenim postocima (w/w) tj. stavlja u odnos masu otopljene tvari (šećera) sa masom otopine (mošta) 100 %. Kl predstavljaju težinski % šećera Kl = koliko kg šećera ima u 100 kg mošta Baboov moštomjer je stakleni areometar koji u gornjem djelu ima tanku zatvorenu cijev sa skalom, dok je donji dio širi, valjkastog oblika i završava s rezervoarom, kuglaste forme u kojem se nalazi olovna sačma ili živa koja mu daje određenu težinu. Raspon skale je 0 32 %. Baždaren je na 17.5 C ili na 15 C. Korekcija: -za svaka 2 C ispod označene temperature, od očitane vrijednosti se oduzme 0.1% -za svaka 2 C iznad označene temperature, očitanoj vrijednosti se dodaje 0.1% Refraktometar je optički instrument čiji se rad zasniva na prelamanju svjetlosti koja prolazi kroz sloj mošta. Veličina kuta pod kojim se svjetlost lomi zavisi od gustoće mošta. Ako je gustoća veća to je lom svijetla veći i obrnuto. Lom svijetla se na skali refraktometra vidi u obliku manjeg ili većeg stupca sjene, a očitavaju se vrijednosti koje se nalaze na granici 18

svijetlog i tamnog polja. Očitane vrijednosti predstavljaju % suhe tvari. Formula za preračunavanje postotka suhe tvari : % suhe tvari 4,25 = Oe, % suhe tvari 0,85 = Kl. Realna kiselost (ph vrijednost), pod realnom kiselošću (aciditetom) mošta ili vina podrazumijeva se koncentracija slobodnih vodikovih iona u moštu ili vinu. Vrijednost ovisi o stupnju disocijacije pojedinačnih organskih kiselina te koncentraciji kalijevih i natrijevih iona. Vinska kiselina disocira najjače, jabučna slabije, a ostale kiseline još slabije. ph vrijednost mošta i vina se uglavnom kreće između 2,8 i 4,0. Realna kiselost utječe na niz biokemijskih i fizikalno-kemijskih procesa tijekom dozrijevanja i starenja vina. Vina sa nižim vrijednostima ph su kiselija i lakše se čuvaju jer se u njima teško razmnožavaju nepoželjni mikroorganizmi. ph vrijednost mošta i vina se određuje ph-metrom. Ukupna kiselost (izražena kao vinska), ukupnu kiselost čine slobodne organske i neorganske kiseline te njihove soli kao i druge kisele tvari koje se mogu titrirati bazom. Ukupna kiselost određuje se metodom direktne titracije. Ova metoda bazira se na neutralizaciji svih kiselih frakcija otopinom neke lužine. Na osnovi utroška lužine (NaOH) izračunava se ukupna kiselost, a kao indikatori najčešće se koristi bromtimolplavi. Titracijska kiselost izražava se u g/l (kao vinska). Ukupna kiselost ( g/l kao vinska) = ml utrošene 0,1 M NaOH 0,0075 100 = ml utrošene 0,1 M NaOH 0,75 2.2.2. Osnovna kemijska analiza vina Po završetku vinifikacije i nakon obavljenog pretoka vina, 24. ožujka 2016. godine, sve 3 varijante vina su analizirane u vinarskom laboratoriju Zavoda za vinogradarstvo i vinarstvo Agronomskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu. Kemijska analiza vina provedena je metodama koje su propisane Pravilnikom o fizikalno-kemijskim metodama analize mošta, vina, drugih proizvoda od grožđa i vina te voćnih vina (N.N.,br.106/04). Osnovnom kemijskom analizom su obuhvaćeni slijedeći parametri: Specifična težina ( 20/20 o C), određena je denzimetrijski, predstavlja omjer gustoće određenog volumena vina, odnosno mošta pri 20 o C i gustoće istog volumena vode pri istoj temperaturi od 20 C. 19

Alkohol ( vol %), određen je metodom destilacije vina ( denzimetrijski). Metoda se temelji na odvajanju alkohola od drugih sastojaka vina. Prema specifičnoj težini destilata pri 20 o C i pri specifičnoj težini vode pri 20 o C se iz tablice po Reichardu očitaju odgovarajuće vrijednosti za alkohol u vol.%. Ekstrakt ukupni (g/l), uključuje sve tvari koje nisu hlapive pod specifičnim fizičkim uvjetima ( šećer, kiseline, minerali, tanini). Određuje se iz ostatka koji ostane u Kjeldahovoj zdjelici nakon što je provedena destilacija uzorka s ciljem određivanja alkohola. Izražava se u g/l. Šećer reducirajući (g/l), oni koji imaju funkcionalnu grupu (keto ili aldehidna) koja će reagirati s ionima bakra. Obuhvaća najvećim dijelom nefermentiranu glukozu i fruktozu, te pentoze podrijetlom iz grožđa. Određuje se metodom po Rebeleinu, koristi se 6 otopina ( Fehling I, Fehling II, otopina KI, 16%-tna sumporna kiselina, otopina škroba ( indikator), otopina natrijevog tiosulfata ( titracija)). Boja bijele kave nas upućuje na kraj reakcije odnosno titracije- dolazi do potpunog vezanja joda. Ekstrakt bez šećera, predstavlja ukupni suhi ekstrakt umanjen za vrijednost ukupnog šećera. Ukupna kiselost ( kao vinska) g/l, ukupna kiselost obuhvaća hlapive i nehlapive kiseline. Određena je metodom neutralizacije s 0.1 M NaOH uz indikator brom-timol plavo i izražene su kao vinska kiselina u g/l. Hlapiva kiselost ( kao octena) g/l, predstavlja homologe octene kiseline prisutne u vinu u slobodnom obliku ili u obliku soli, koje nastaju radom kvasaca ili bakterija tijekom fermentacije ili nakon nje. Određuje se metodom destilacije uzorka u struji vodene pare, destilat se uz nekoliko kapi fenoftaleina titrira s 0.1 M NaOH do pojave svijetlo ružičaste boje. Hlapiva kiselost (kao octena) = utrošak NaOH x 1.2 ( g/ L ) Nehlapive kiseline g/l, dobiva se računski oduzimanjem vrijednosti hlapive kiselosti od ukupne kiselosti. Izražena je kao vinska kiselina u g/l. ph, određen je pomoću ph metra. 20

SO2 slobodni mg/l, određuje se metodom po Paulu. Temelji se na oslobađanju SO2 iz zakiseljenog uzorka vina u struji zraka te njegovog vezanja na H2O2 pri čemu nastaje sumporna kiselina SO2 + H2O2 SO3 + H2O 2H+ + SO 2-4 Indikator: kombinacija metil crvenog i metil plavog. Titracija sa 0,01 M NaOH do pojave maslinasto zelene boje. Slobodni SO2 dobijemo tako da pomnožimo utrošak NaOH sa 32. Izražavamo ga u mg/l. SO2 vezani mg/l, dobiva se tako da vino koje je nakon određivanja slobodnog sumpora ostalo u tikvici za kuhanje ostaje i dalje u toj tikvici. Mijenja se reagens u maloj apsorpcionoj tikvici, a zatim se pod tikvicu za kuhanje stavi mali plamenik, pa se grije se uz lagano vrenje točno 10 minuta. Utrošene ml 0,01 M NaOH pomnožimo s 32 i dobijemo mg vezanog SO2 u 1 litri vina. SO2 ukupni mg/l, dobije se zbrajanjem vrijednosti slobodnog i vezanog SO2. Pepeo g/l, ukupnost svih produkata koji ostaju nakon spaljivanja taloga preostalog od isparavanja vina, a predstavlja mineralne tvari vina (K, Ca, Mg ). Pepeo je određen spaljivanjem organske tvari vina u parnoj kupelji, a potom Mufolnoj peći na 525 C. Masu pepela množimo s 50, da bismo dobili rezultat u g/l. 2.2.3. Određivanje kromatskih karakteristika vina 2.2.3.1. Određivanje boje na spektrofotometru Boja vina, definirana je kao optička gustoća vina izmjerena na tri valne duljine: 520 nm (crvena), 420 nm (žuta), 620 nm (plava). Boja je određena pomoću spektrofotometra SPECORD 400 Jena ( Jena, Njemačka). Ovim određivanjem moguće je odrediti slijedeće karakteristike boje: intenzitet boje (Glories, 1984), nijansa boje (Sudraud, 1958), kompozicija boje (Glories, 1984). Postupak određivanja: Izmjeri se optička gustoća vina na tri valne duljine: 520 nm, 420 nm i 620 nm, u kiveti od 1 mm nasuprot destiliranoj vodi kao slijepoj probi. Intenzitet boje ( CI ) = D420 +D520 +D620 21

Nijansa boje ( T ) = D420/ D520 Kompozicija boje: % crvene = D520/ (D420 + D520 + D620) * 100 % žute = D420/ (D420 + D520 + D620) * 100 % plave = D620/ (D420 + D520 + D620) * 100 2.2.3.2. Određivanje ukupnih fenola Ukupan udio polifenolnih spojeva određuje se reakcijom sa Folin Ciocalteu metodom prema Singelton i Rossi (1966). Priprema reagensa: Priprema zasićene otopine natrijevog karbonata: 200 g natrijevog karbonata otopi se u 800 ml destilirane vode te se dobivena otopine zagrije do vrenja. Nakon hlađenja, u otopinu se doda nekoliko kristalića Na2CO3 te se nakon 24 sata otopina filtrira i razrijedi destiliranom vodom. Postupak određivanja: U odmjernu tikvicu od 25 ml otpipetira se 50 μl crnog vina, doda 15 ml destilirane vode i 1,25 ml Folin- Ciocaulteu-ovog reagensa. Reakcijska smjesa se miješa 8 minuta i 30 sekundi, te se nakon toga doda 5 ml 20% otopine natrijeva karbonata. Odmjerne tikvice se zatim destiliranom vodom nadopune do oznake. Tako pripremljene otopine se ostave stajati 16 minuta u vodenoj kupelji na 50 C. Apsorbancija se mjeri pri valnoj duljini od 765 nm. Slijepa proba je ovako pripremljena otopina samo umjesto vina se doda 1 ml destilirane vode. Rezultat se izražava u ekvivalentima galne kiseline, GAE/ mgl -1. Kako se kod crnih vina radi razrjeđenje, dobiveni rezultat se množi s faktorom 5. 2.2.3.3. Određivanje pojedinačnih fenola Pojedinačni polifenoli određuju se tako da se volumen od 2 ml vina prethodno filtrira kroz PTFE membranski filtar veličine pore 0.22 μm u tekućinskokromatografski sustav ( HPLC tvrtke Agilent 1100). Analiza je provedena na fenil-heksilnoj koloni ( kolona Luna Phenyl- 22

Hexyl, Phenomenex, Torrance, CA, SAD) uz detektor s nizom dioda. Vrijeme trajanja analize je bilo 65 minuta. 2.2.3.4. Senzorno ocjenjivanje vina Kvaliteta vina ocjenjuje se na temelju objektivnih metoda (kemijska analiza i mikrobiološka analiza) i subjektivnih metoda (senzorno ocjenjivanje). Senzorna svojstva vina koja ocjenjujemo su: boja, bistroća, miris, okus i opip. Senzorno ocjenjivanje vina je provedeno brojčanim metodama gdje dojmove ocjenjivanja izražavamo brojevima, odnosno provedena je metoda redoslijeda, te apsolutna metoda od 100 pozitivnih bodova uz sudjelovanje 7 ocjenjivača. Metoda redoslijeda, ocjenjuje se n (3) broj uzoraka. Ocjena 1 se daje najboljem uzorku, dok se ocjena n (3) daje najlošijem uzorku. Zbrajanjem ocjena svih ocjenjivača (7) za pojedini uzorak dobije se konačn1i slijed. Apsolutna metoda, ocjenjivač dobije samo 1 uzorak koji ocjenjuje prema odgovarajućoj shemi bodovanja, u ovom slučaju je korištena O.I.V./ U.I.O.E metoda od 100 pozitivnih bodova. Tablica 1. Ocjenjivački listić, metoda 100 pozitivnih bodova ( Izvor: vlastita izrada autora, 2017). MIRNA VINA odlično vrlo dobro dobro dovoljno nedovoljno Vanjski izgled Bistroća 5 4 3 2 1 Boja 10 8 6 4 2 Intenzitet 8 7 6 4 2 Miris Čistoća 6 5 4 3 2 Kakvoća 16 14 12 10 8 Intenzitet 8 7 6 4 2 Čistoća 6 5 4 3 2 Okus Kakvoća 22 19 16 13 10 Postojanost 8 7 6 5 4 arome Opći dojam 11 10 9 8 7 23

3.0. Rezultati i rasprava 3.1. Osnovna analiza mošta Tablica 2. Osnovna analiza mošta ( Izvor: vlastita izrada autora, 2017). Fizikalno-kemijski parametri Metoda Vrijednost Jedinica Mjerna nesigurnost Šećer Aerometrija 17,0 KI Šećer Refraktometrija 19,8 Brix ph 3,21 0,004 Ukupna kiselost kao vinska 8,4 g/l 0,2 Mošt Terana sadržavao je zadovoljavajuću koncentraciju šećera 17,0 KI, odnosno 19,8 Brix-a, što bi trebalo rezultirati srednje visokim sadržajem alkohola u budućem vinu. Ukupna kiselost izražena kao vinska je izmjerena u koncentraciji od 8,4 g/l, što je za Teran poznat po višim koncentracijama ukupnih kiselina karakteristično, dok je ph 3,21. 3.2. Osnovna analiza vina Tablica 3. Osnovna kemijska analiza vina ( Izvor: vlastita izrada autora, 2017). Kemijski parametri Varijanta 1 Varijanta 2 Varijanta 3 Specifična težina ( 20/20 C) 0,9950 0,9957 0,9953 Alkohol ( g/l) 98,8 91,2 91,9 Alkohol ( vol%) 12,51 11,56 11,64 Ekstrakt ukupni (g/l) 29,4 28,4 27,6 Šećer reducirajući (g/l) 3,9 4,2 3,5 Ekstrakt bez šećera (g/l) 26,5 25,2 25,1 Ekst. bez šećera i nehl.kis. (g/l) 21,3 20,2 20,2 Ukupne kiseline kao vinska ( g/l) 6,4 6,1 5,8 Hlapive kiseline kao octena (g/l) 0,98 0,89 0,72 Nehlapive kiseline (g/l) 5,2 5,0 4,9 ph 3,52 3,54 3,55 SO2 slobodni ( mg/l) 20,0 20,0 22,0 SO2 vezani ( mg/l) 25,0 17,0 20,0 SO2 ukupni (mg/l) 45,0 37,0 42,0 Pepeo (g/l) 2,75 2,84 2,86 Osnovna kemijska analiza vina je što se tiče specifične težine vina, u sve tri varijante pokazala gotovo jednake rezultate ( 0.9950, 0.9957, 0.9953). Što se volumnih % alkohola 24

tiče, razlike između drugog i trećeg uzorka bile su minimalne, dok je kod prvog uzorka postotak alkohola bio nešto viši (12.51, 11.56, 11.64 vol%). Koncentracija ukupnog ekstrakta pokazuje nam male razlike, odnosno blagi pad koncentracije od prve prema trećoj varijanti (29.4, 28.4, 27.6 g/l ). Prema količini neprovrela šećera, odnosno prema rezultatima reducirajućeg šećera utvrđene razlike bile su minimalne te nisu imale utjecaja na okusna svojstva dobivenih vina sorte Teran. Koncentracija ukupne kiselosti izražene kao vinska pokazuje male razlike u sve tri varijante s blagim padom koncentracije od prvog prema trećem uzorku ( 6.4, 6.1, 5.8 g/l), koncentracija hlapive kiselosti izražene kao octena također pokazuje male razlike s blagim padom koncentracije od prvog prema trećem uzorku ( 0.98, 0.89, 0.72 g/l), a koncentracija nehlapivih kiselina je gotovo jednaka u sva tri uzorka s također blagim padom od prve prema trećoj varijanti ( 5.2, 5.0, 4.9 g/l), tj. duljina maceracije utjecala je na neznatan pad koncentracije ukupne kiselosti izražene kao vinska i nije uvjetovalo razlike u vrijednostima ph koje su bile gotovo identične u sve tri varijante ( 3.52, 3.54, 3.55). Što se tiče koncentracije pepela iz rezultata vidimo vrlo male razlike s blagim rastom od prve prema trećoj varijanti, odnosno blagi rast uočen je s povećanjem duljine maceracije ( 2.75, 2.84, 2.86 g/l). 3.3. Kromatske karakteristike vina 3.3.1. Određivanje boje na spektrofotometru Tablica 4. Intenzitet boje ( Izvor: vlastita izrada autora, 2017). Apsorbancija Varijanta 1 (maceracija 7 dana) Varijanta 2 ( maceracija 14 dana) Varijanta 3 (maceracija 28 dana) 420 nm 3.738 3.629 3.126 520 nm 3.422 3.384 3.384 620 nm 1.688 1.529 1.115 I= A420+A520+A620 8.848 8.542 7.625 25

Graf 1. Intenzitet boje ( Izvor: vlastita izrada autora, 2017). Intenzitet boje predstavlja količinu boje, a iz tablice i grafa je vidljivo da ne postoji znatna razlika u intenzitetu boje između varijanti. Uočavamo blagi pad s obzirom na duljinu maceracije. Varijanta 1, odnosno maceracija u trajanju od 7 dana pokazuje najvišu vrijednost ( 8.848), varijanta 2, maceracija u trajanju od 14 dana nešto nižu vrijednost ( 8.542), a varijanta 3, odnosno maceracija od 28 dana nam pokazuje najnižu vrijednost ( 7.652). Puertas i sur. (2015) su u svojim istraživanjima na sorti Tempranillo također dobili rezultate i zaključke slične ovom istraživanju. Tako je intenzitet boje nakon muljanja u kontrolnom uzorku i uzorku produljenje maceracije ( trajanje maceracije 7 dana nakon kraja fermentacije) bio 0.098, nakon prešanja razlika je značajna, intenzitet boje u kontrolnom uzorku je bio 1.254 dok je u uzorku produljene maceracije bio 0.935. Prije punjenja vina u boce intenzitet boje u kontrolnom uzorku je bio 0.785 dok je u uzorku produljene maceracije bio viši 0.988. Intenzitet boje u odnosu je sa koncentracijom antocijana, što je veća koncentracija antocijana veći je i intentzitet boje. Ako imamo u vidu da uvjeti maceracije mogu biti veoma različiti, onda možemo razumjeti koliko je prelaženje obojenih tvari u vino složeno i zašto se ne može uvijek dobiti zadovoljavajući intenzitet boje vina. Intenzitet boje crnih vina ne ovisi samo od toga koliko će obojenih elemenata prijeći iz pokožice već i koliko će se zadržati u vinu. Poznato je, da napuštajući pokožicu antocijani podliježu promjenama. Jednim dijelom prelaze u netopljivo stanje i talože se, a dijelom ih apsorbiraju i čvrsti dijelovi masulja, stanice 26

kvasca, itd.. Uslijed ovih pojava sadržaj obojenih tvari u određenoj fazi fermentacije može se i smanjiti umjesto da se povećava. Sve ovo ukazuje na veliki značaj procesa maceracije i uvjeta pod kojima se ovaj proces odvija (Ribèrau-Gayon i sur. 1997). Tablica 5. Nijansa boje ( Izvor: vlastita izrada autora, 2017). Apsorbancija Varijanta 1 (maceracija 7 dana) Varijanta 2 ( maceracija 14 dana) Varijanta 3 (maceracija 28 dana) 420 nm 3.738 3.629 3.126 520 nm 3.422 3.384 3.384 T= A420/A520 1.092 1.072 0.923 Graf 2. T-nijansa boje ( Izvor: vlastita izrada autora, 2017). Nijansa boje je u skladu s rezultatima intenziteta boje, te nam ne pokazuje razlike između varijanti, no također uočavamo blagi pad vrijednosti s obzirom na duljinu maceracije. Varijanta 1, odnosno maceracija od 7 dana nam pokazuje najvišu vrijednost ( 1.092), varijanta 2, maceracija od 14 dana nam pokazuje nešto nižu vrijednost ( 1.072), a varijanta 3, odnosno maceracija od 28 dana nam pokazuje najnižu vrijednost (0.923). Nijansa boje, kao i intenzitet boje, povezana je sa koncentracijom antocijana. Dokazano je da razmjerno više obojenih tvari iz pokožice prijeđe na početku fermentacije, pri nižim koncentracijama alkohola. Sa povećavanjem sadržaja alkohola obojene tvari i dalje prelaze u otopinu ali ne u onoj mjeri kao i na početku fermentacije. 27

Puertas i sur. ( 2015) su u svom istraživanju na sorti Tempranillo dobili slične rezultate, nakon prerade nijansa boje je u kontrolnom uzorku i uzorku produljene maceracije bila 0.816, nakon prešanja nijansa boje u kontrolnom uzorku je 0.530, dok je u uzorku produljene maceracije bila 0.570. Prije punjenja u boce nijansa boje u kontrolnom vinu je bila 0.644, dok je u vinu produljene maceracije koja je trajala 7 dana nakon završetka fermentacije nijansa boje iznosila 0.670. Derivati antocijana imaju drugačije značajke od prirodnih antocijana te vode promjeni percipirane boje. Formiranje ovih produkata započinje odmah nakon muljanja grožđa, a uobičajeno je da se tijekom produljene maceracije događaju najznačajnije promjene u nijansi i zasićenju boje vina. Ovi spojevi, zajedno s formiranjem oligomernih i polimernih pigmenata, dovode do promijene boje vina: od duboke ljubičaste (zbog monomernih antocijana i kopigmentacijskih reakcija u mladim vinima), do narančaste boje, i ciglasto crvenih tonova (zbog formiranja derivata antocijana i polimernih pigmenata) (Singleton i Noble 1976, Vidal i sur., 2004). Tablica 6. Kompozicija boje ( Izvor: vlastita izrada autora, 2017). Varijanta 1 (maceracija 7 dana) Varijanta 2 ( maceracija 14 dana) Varijanta 3 (maceracija 28 dana) % crvene boje 38.67 39.61 44.17 % žute boje 42.24 42.48 40.80 % plave boje 19.07 17.89 14.55 Graf 3. Kompozicija boje ( Izvor: vlastita izrada autora, 2017). 28