UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU Master rad Antimikrobna aktivnost etarskog ulja biljnih vrsta roda Peucedanum L. Mentor: Student: Prof Dr Tatjana Mihajilov-Krstev Ljubica D. Grašić 134 Februar 2016, Niš
UNIVERSITY OF NIŠ FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS DEPARTMENT OF BIOLOGY WITH ECOLOGY Master thesis Antimicrobial activity of etheric oil of plant species of genus Peucedanum L. Menthor: Student: Prof Dr Tatjana Mihajilov-Krstev Ljubica D. Grašić 134 February 2016, Niš
Zahvala Ovom prilikom želim da se zahvalim svom mentoru prof. dr Tatjani Mihajilov Krstev na nesebičnoj pomoći prilikom izbora teme i izrade master rada. Najveću zahvalnost dugujem svojoj porodici, jer mi je omogućila školovanje i pružila mi neizmernu podršku. Takođe, veliko hvala i mojoj drugarici Mileni na poverenju, razumevanju i pruženoj podršci.
Sadržaj Sažetak... 1 Summary... 2 1. Uvod... 3 2. Opšti deo... 4 2.1. Mikroorganizmi... 4 2.1.1. Staphylococcus aureus... 4 2.1.2. Streptococcus pyogenes... 5 2.1.3. Familija Enterobacteriaceae... 5 Escherichia coli... 5 Rod Proteus... 6 Klebsiella pneumoniae... 6 2.1.4. Enterococcus faecalis... 6 2.1.5. Pseudomonas aeruginosa... 7 2.1.6. Rod Acinetobacter... 7 2.2. Familija Apiaceae... 7 2.3. Rod Peucedanum.... 8 2.3.1. Peucedanum officinale L.... 8 2.3.2. Peucedanum cervaria L.... 9 2.3.3. Peucedanum oreoselinum L.... 9 2.4. Sekundarni metaboliti biljaka... 10 2.4.1. Etarska ulja i njihova antimikrobna aktivnost... 10 3. Ciljevi istraživanja... 12 4. Materijal i metode... 13 4.1. Biljni materijal... 13 4.2. Dobijanje etarskog ulja... 13 4.3. Testiranje antimikrobne aktivnosti etarskih ulja biljnih vrsta roda Peucedanum... 14 4.3.1. Bakterijske kulture... 14 4.3.2. Mikrodiluciona metoda... 14 4.3.3. Statistička obrada podataka... 15 5. Rezultati i diskusija... 16 5.1. Hemijski sastav etarskih ulja biljnih vrsta roda Peucedanum... 16 5.1.1. Hemijski sastav etarskog ulja biljne vrste Peucedanum officinale... 16 5.1.2. Hemijski sastav etarskog ulja biljne vrste Peucedanum cervaria... 16 5.1.3. Hemijski sastav etarskog ulja biljne vrste Peucedanum oreoselinum... 17 5.2. Antimikrobna aktivnost etarskih ulja biljnih vrsta roda Peucedanum... 17 6. Zaključak... 20 7. Literatura... 21 Biografija... 23
Sažetak Biljne vrste Peucedanum officinale, P. oreoselinum i P. cervaria su prikupljane tokom jula i avgusta 2015. godine. Biljni material je sušen u periodu od dve nedelje na sobnoj temperaturi do konstantne mase. Iz 200 g osušenih i samlevenih nadzemnih delova biljnih vrsta roda Peucedanum destilovana su etarska ulja, postupkom hidrodestilacije u aparaturi po Clavenger-u u trajanju od 2,5 h. Antimikrobna aktivnost izolovanih etarskih ulja je ispitivana mikrodilucionom metodom. Kao test organizmi korišćeni su patogeni bakterijski sojevi iz grupe Gram (+) i Gram ( ) bakterija, kako iz ATCC kolekcije tako i izolati iz rana pacijenata. Ulje P. officinale je najbolje delovalo protiv sojeva Proteus mirabilis iz brisa rane, MIC=MBC=52,50 mg/ml, i Streptococcus pyogenes iz brisa rane, MIC/MBC=3,12/210,00 mg/ml. Ulje P. oreoselinum je bilo najaktivnije protiv sojeva Staphylococcus epidermidis iz brisa rane MIC=MBC=105,87 mg/ml, i Streptococcus pyogenes ATCC 19615, MIC=MBC=105,87 mg/ml. Protiv istih sojeva je i najbolje delovalo i ulje P. cervaria, MIC/MBC=13,56/108,50 mg/ml. Ispitivana ulja biljnih vrsta roda Peucedanum mogu biti prirodni izvor antimikrobnih materija u lečenju infektivnih rana. Ključne reči: Peucedanum officinale, Peucednum oreoselinum, Peucedanum cervaria, antimikrobna aktivnost, infekcije rana 1
Summary Plant species Peucedanum officinale, P. oreoselinum i P. cervaria were collected in July and August 2015. The plants were dried during two weeks at room temperature until reaching a constant mass. From 200g of dried and ground aboveground parts of the plants from Peucedanum species essential oils were distilled by the process of hydrodistillation using a Clevenger apparatus in duration of 2,5 hours. The antimicrobial activity of the obtained essential oils was examined by the micro-dilution method. As test organisms, some pathogenic bacterial strains from the groups of Gram (+) and Gram (-) bacteria were used, both from ATCC collection and from patients wounds. The P. officinale oil had the strongest effect on Proteus mirabilis strains obtained from the wounds, MIC=MBC=52,50 mg/ml, and on Streptococcus pyogenes strains obtained from the wounds, MIC/MBC=3,12/210,00 mg/ml. The P. oreoselinum oil had the strongest effect on Staphylococcus epidermidis strains obtained from the wounds, MIC=MBC=105,87 mg/ml, and Streptococcus pyogenes ATCC 19615, MIC=MBC=105,87 mg/ml. On the same strains the P. cervaria oil had the strongest effect, MIC/MBC=13,56/108,50 mg/ml. The examined essential oils of the Peucedanum genus can be a natural source of antimicrobial substances for treating infectious wounds. Key words: Peucedanum officinale, Peucedanum oreoselinum, Peucedanum cervaria, antimicrobial activity, skin infections 2
1. UVOD U raznim periodima istorije etarska ulja aromatičnog bilja su bila veoma cenjena. Mirisima je pridavan naročit značaj u mitologiji. Egipćani su ih povezivali sa besmrtnošću, Kleopatra ih je koristila da bi bila zavodljivija, a Grci su imali brojne parfimerijske radnje, koje su predstavljale mesta drušvenog okupljanja. U Indiji, kao i u drugim kulturama, hramovi su se gradili od mirisnog drveta. Vekovima se od etarskih ulja prave različite infuzije i tinkture koje se i danas koriste u fitoterapiji. Neka ulja se primenjuju u veterini, zatim kao insekticidi, a koriste se i u kožarskoj industriji i industriji boja i lakova. Najvažniji potrošači etarskih ulja su parfimerijska i kozmetička industrija. Takođe, u industriji slatkiša, alkoholnih i bezalkoholnih pića upotrebljavaju se aromatične esencije osvežavajućeg mirisa. Etarska ulja imaju značajnu ulogu u aromoterapiji kao i u prevenciji zaraznih bolesti. Neka etarska ulja se upotrebljavaju za dezinfekciju škola i bolnica, zahvaljujući njihovim osobinama, kao što su: velika isparljivost, baktericidno svojstvo, prijatan miris itd. Proizvodnja i promet etarskih ulja je izuzetno značajna i organizovana delatnost, što je, između ostalog, i rezultat jačanja ekološke svesti i saznanja o neželjenim posledicama upotrebe proizvoda sintetske hemije (Matović and Vulović, 2004). U ovom radu je ispitivana antimikrobna aktivnost etarskih ulja dobijenih iz tri vrste roda Peucedanum: P. officinale, P. oreoselinum i P. cervaria protiv bakterija koje izazivaju infekcije kože u cilju dezinfekcije ili lečenja infektivnih rana. 3
2. OPŠTI DEO 2.1. Mikroorganizmi Naziv "mikroorganizmi" potiče od latinske reči micros, što znači mali. Reč je o organizmima mikroskopskih veličina (sitniji od 0,1 mm), koji se ne mogu videti golim okom. Međutim, ovo je vrlo heterogena grupa organizama koja obuhvata i oblike koji dostižu makroskopske razmere, odnosno oblike koji su vidljivi golim okom (neke višećelijske alge i gljive). Veličina ćelija najsitnijih mikroorganizama je određena tzv. molekularnom granicom. Najsitnija ćelija mikoroorganizama mora biti nekoliko stotina puta veća od makromolekula koji učestvuju u njenoj građi (različiti enzimi, proteini, ugljeni hidrati, nukleinske kiseline...). Za mikroorganizme kažemo da su kosmopolitski, odnosno ubikvitarni organizmi (kosmopolites - građanin sveta; ubique - svuda), rašireni su svuda i ima ih na svakom mestu na Zemlji. Ovoj heterogenoj grupi pripadaju kako predstavnici eukariotskog tipa ćelijske građe (protozoe, gljive, lišajevi, alge), tako i prokariotskog tipa (bakterije i cijanobakterije). Takođe, ovoj grupi pripadaju i predstavnici acelularne građe (virusi). Među najznačajnijim zajedničkim osobinama ovih organizama su njihove mikroskopske razmere, brz metabolizam i brzo razmnožavanje, kao i raznolikost enzima i biohemijskih procesa. Značaj mikroorganizama je veoma veliki. Treba istaći njihovu degradacionu aktivnost, njihovu ulogu razlagača, primarnih producenata organske materije i kiseonika (Petrović et al, 2007). 2.1.1. Staphylococcus aureus Rod Staphylococcus su bakterije široko raspostranjene u prirodi. To su nepokretne, loptaste ćelije koje se dele binarnom deobom i nakon deobe ostaju zajedno gradeći nepravilne, grozdaste skupine. Rastu na podlogama sa visokim koncentracijama NaCl. Fakultativni su anaerobi. Najčešće su uzročnici gnojnih procesa, pa se zbog toga svrstavaju u grupu takozvanih piogenih koka (pios gnoj). Za humanu medicinu značajne su vrste: Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. intermedius i S. saprophiticus. Ove bekterije su loptastog oblika, prečnika do 1 µm. Po Gramu se boji pozitivno. Nemaju izraslina i nepokretne su. Neki sojevi imaju kapsulu. Sojevi sa kapsulom su virulentniji od sojeva bez nje, jer ih ona štiti od fagocita. Staphylococcus aureus raste na većini hranljivih podloga. Na čvrstim poglogama formira okrugle, neprozirne, glatke, sjajne kolonije veličine do 2 mm posle inkubacije do 24h. Kolonije mogu biti pigmentisane. Tako se 4
razlikuju zlatnožute, svetložute, boje krema ili bele kolonije (Radulović, 2012). Staphylococcus aureus svojim toksinima i enzimima (proteaza, hijaluronaza, fibrinolizin, koagulaza, itd.) dovodi do mnogih oboljenja. Najčešće su to gnojna oboljenja kože koja se manifestuju kao apsces, furunkul, karbunkul. Ukoliko iz ovih žarišta prodru u razne druge lokacije, mogu se javiti znaci drugih teških oboljenja, kao što su: meningitis, artritis, ostomijelitis, stafilokokne sepse itd. (Petrović, 2007). 2.1.2. Streptococcus pyogenes Streptococcus pyogenes je sitna, loptasta bakterija, veličine oko 1µ. Loptaste ćelije ostaju i nakon deobe zajedno, gradeći kraće ili duže lance (streptos ogrlica). S. pyogenes je beta hemolitička streptokoka koja je uglavnom patogena za čoveka. Često se naziva piogena koka. 2.1.3. Familija Enterobacteriaceae Enterobakterije ili crevne bakterije su velika grupa srodnih aerobnih i fakultativno anaerobnih, asporogenih, Gram negativnih bakterija. Neke od njih su normalni apatogeni stanovnici creva, neke su oportunisti, a neke su uvek patogene. Danas je u porodici enterobakterija svrstano 20 rodova sa preko 100 vrsta različitih bakterija. Bakterijske ćelije imaju štapićastu formu, dužine 2-3 µm, sa zaobljenim krajevima. Poseduju respiratorni i fermentativni tip metabolizma. Ne stvaraju spore. Mnoge vrste imaju fimbrije i pile, a neke i kapsulu. Većina vrsta raste na jednostavnim podlogama. U tečnim podlogama stvaraju zamućenje i talog, a na čvrstim okrugle, konveksne, glatke, sjajne kolonije veličine oko 2-3 mm. Patogene enterobakterije, kao i oportunističke, mogu izazvati različita oboljenja u svim delovima organizma. Iz primarno obolelog dela neke mogu prodreti u krv i izazvati generalizovano oboljenje. Escherichia coli Escherichia coli obuhvata prave štapiće, dužine 2-6 µm, sa peritrihijalnim flagelama. Mogu biti pojedinačni ili u parovima. Kod mnogih sojeva se javljaju kao fimbrije i kao makrokapsule. Ovo je fakultativni anaerob, hemoorganotrof, koji poseduje respiratorni i fermentativni tip metabolizma (Petrović et al, 2007). Raste na većini hranljivih podloga. Na čvrstim podlogama stvara okrugle, glatke kolonije. Sojevi sa kapsulom razvijaju sluzave kolonije. Na nekim podlogama kolonije imaju metalni sjaj, a na krvnom agaru neki sojevi formiraju zonu hemolize (Radulović, 2012). Escherichia coli se javlja kao deo normalne mikroflore donjih delova debelog creva toplokrvnih životinja. Može da izazove brojna gnojna 5
i crevna oboljenja. Sojevi koji imaju enterotoksin i druge faktore virulencije uzročnici su dijareje, infekcija urinarnog trakta, septikemije i meningitisa. E. coli je podeljena na veći broj serotipova na osnovu prisustva somatskog (O), kapsularnog (K) i flagelarnog (H) antigena (Petrović et al, 2007). Rod Proteus Bakterija ovog roda najviše ima na mestima gde se raspadaju organske materije, kao i u digestivnom sistemu ljudi i životinja. Uzročnici su septičkih infekcija kod ljudi. Štapići proteusa obično su dugi 1-3 µm, ali mogu biti i kraći ili duži (čak 30 µm). Po Gramu se boje negativno. Pokretni su zahvaljujući dugim peritrihijalnim flagelama. Nemaju kapsulu i ne stvaraju spore. Odlikuje ih rast na većini podloga. Na čvrstim podlogama prikazuju fenomen rojenja. Zahvaljujući izraženim flagelama i brzom razmnožavanju bakterija, kolonije se šire radijalno po podlozi u vidu talasa. Kulture proteusa imaju neprijatan miris. Vrste ovog roda najčešće izazivaju infekcije urogenitalnog i digestivnog trakta, opekotina i rana. Ređe izazivaju upalu moždanih ovojnica i sepsu. U rodu Proteus razlikuju se vrste Proteus vulgaris i Proteus mirabilis. Klebsiella pneumoniae Bakterije ove vrste su Gram negativni kratki štapići, veličine 1-2 µm, obavijeni debelom kapsulom. Nemaju flagele, nepokretne su. Većina sojeva ima fimbrije. Pripadaju grupi fakultativnih anaeroba. Dobro rastu na većini hranljivih podloga. Kolonije su im beličasto-sivkaste, krupne i sluzave. Izazivaju oboljenja raznih organa i tkiva. Najčešće su to upalni procesi u respiratornom traktu (faringitis, upala pluća itd.), urogenitalnom traktu i digestivnom traktu (kod dece). 2.1.4. Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis su Gram (+) loptaste bakterije koje formiraju lance. Ne formira kapsulu zbog nedostatka mukoidina, ali neke podgrupe mogu da je formiraju. Koristi plazmide za razmenu genetičke informacije. Može formirati pile (posebno sojevi koji izazivaju endokarditis). Ovi mikroorganizmi nastanjuju debelo crevo, deo su crevne flore, a mogu se naći u zemlji, vodi zagađenoj fekalijama i biljkama. Pored endokarditisa izaziva infekcije creva, urinarnog trakta i abdomena i infekcije rana 6
2.1.5. Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa su štapićaste bakterije, dužine 1,5-3 µm, sa jednom polarnom flagelom. Imaju dve vrste fimbrija deblje i tanje. Po Gramu su negativni, ne stvaraju sporu i kapsulu, ali neki sojevi produkuju sluzavu ovojnicu. Spada u grupu aerobnih bakterija. Pseudomonas aeruginosa raste na većini hranljivih podloga. Na čvrstim podlogama stvara kolonije koje imaju miris lipe. Na hranljivom agaru stvaraju nepravilne, sjajne, sivkaste kolonije. Produkuju pigmente piocianin (plavkastozelen) i fluorescin (žutozelen), koji difunduju u podlogu oko kolonija. Mogu izazvati bolest pseudomonijazu. Najčešće izaziva oboljenja digestivnog i respiratornog trakta, a ponekad i drugih lokalizacija (oko, koža, uho, moždane ovojnice itd.). 2.1.6. Rod Acinetobacter Vrste iz roda Acinetobacter su aerobni, Gram (-) kokobacili. Žive u zemlji, a ponekad se mogu izolovati sa kože, sluznica ili iz sekreta čoveka. Nemaju sporu ni flagele, ali imaju fimbrije. Uglavnom su komensali. Mogu izazvati pneumoniju, urinarne infekcije i infekcije kože (A. baumannii). Često se javlja otpornost na antimikrobne agense, dezinficijense i uticaje spoljašnje sredine. 2.2. Familija Apiaceae Predstavnici familije Apiaceae (štitonoše) pretežno su višegodišnje zeljaste biljke. Stablo je šuplje, sa kompaktnim čvorovima. Listovi su najčešće više puta perasto deljeni, ređe celi, sa dobro razvijenim lisnim rukavcem. Naizmenično su raspoređeni. Cvetovi su grupisani u složene cvasti koje imaju izgled štita. Cvetne drške polaze iz pazuha listića koji grade involukrum ili involucelum. Cvetovi su dvopolni, aktinomorfni, ređe mogu biti zigomorfni (Tatić and Blečić, 2002). Čašičnih i kruničnih listića je po pet, pri čemu su krunični upadljivih boja, beli ili žuti, povijeni prema centru cveta. Čašica je sitna, a ponakad je iščezla. Andreceum je izgrađen od pet prašnika. Gineceum je sinkarpan i sastoji se iz dva oplodna listića. Plod je šizokarpijum. Familija štitonoša obuhvata 300 rodova i oko 3000 vrsta rasprostranjenih pretežno u umerenoj zoni sa suvim klimatom severne polulopte. Na Balkanskom poluostrvu prisutno je oko 334 vrsta. Dosta vrsta iz ove familije čovek odavno uzgaja kao povrće, kao začinske i lekovite biljke. Mnoge vrste sadrže veoma aromatična etarska ulja (Ranđelović, 2005). 7
2.3. Rod Peucedanum L. Rod Peucedanum obuhvata oko 120 vrsta (Kuzmanov et al, 1981). Ovo su višegodišnje zeljaste biljke sa više puta tročlanim ili perasto deljenim listovima. Rizom je ponekad repasto zadebljao. Cvetovi supetočlani, dvopolni. Čašica i krunica su sa po pet listića. Čašični listići su neprimetni ili nešto malo razvijeni (Kušan, 1956). Krunični listići su obrnuto jajasti, celi ili usečeni, vrhovima povijeni prema centru cveta (Tatić and Blečić, 2002). Obično su beli, crvenkasti, zelenkasti, žućkasti ili žuti, ređe crveni (Nikolić, 1973). Prašnika ima pet. Tučak je sinkarpan i sastoji se od dva oplodna listića; plodnik je podcvetan. Stubići su mali, najčešće savijeni. Plod je spljošten, široko elipsoidnog oblika ili ponekad okrugao, sa širokim obodom. Brazde su sa 1-3 kanala, na vertikalnoj strani 2-6 kanala. Seme je sa unutrašnje strane pljosnato (Kušan, 1956). 2.3.1. Peucedanum officinale L. Peucedanum officinale je višegodišnja zeljasta biljka sa valjkasto vretenastim rizomom. Stabljika je obla, visine 60-200 cm, uspravna, glatka, tanko izbrazdana, u gornjem delu je razgranata, obrasla listovima. Prizemni listovi se nalaze na dugačkim drškama, 4-6 puta trojno perasto deljeni. Režnjevi su linearno lancetasti, dužine 5-10 cm, širine 1,5-2,5 mm, na vrhu su zašiljeni i imaju jedan srednji i dva bočna nerva. Gornji listovi su mali sa uzanim rukavcem. Štitovi se sastoje od 10-40 gotovo jednakih zrakova. Štitići su sa većim brojem cvetova. Involukruma nema. Involucelum sadrži linearno-končaste listiće. Krunični listići su bledo-žuti, jajastog oblika (Nikolić, 1973). Plod je obrnuto jajast ili elipsoidan, dužine 5-10 mm, širine 3,5-5,5 mm, gladak, dorzalno spljošten (Randall and Thornton, 1996). Brazde su sa po jednim kanalom sa etarskim uljem, a na ventralnoj strani nalaze se 2 kanala (Nikolić, 1973). Figueredo i saradnici (2009) ispitivali su sastav etarskog ulja cvetova, listova, stabljika i rizoma vrste Peucedanum officinale i ustanovili su da su monoterpeni dominantna klasa sastojaka sa ugljovodonicima kao najzastupljenijim predstavnicima. Slika 2.1. Peucedanum officinale L. 8
2.3.2. Peucedanum cervaria L. Peucedanum cervaria je višegodišnja biljka sa izduženim glavičastim rizomom, na čijem se gornjem delu nalaze crnkasti končasti ostaci listova. Stabljika je glatka, tanko izbrazdana, uspravna, okrugla, u gornjem delu može biti jednostavna ili razgranata. Listovi su čvrsti, 2-3 puta perasto deljeni, goli, skoro kožasti, svetlozelene boje jajasti ili izduženo trouglasti. Donji listovi su 2-3 puta perasto deljeni, dužine do 50 cm, širine 30 cm. Režnjevi poslednjeg reda su sedeći, jajasti, tupi ili zašiljeni, pri osnovi srcasti. Štitovi se sastoje od 20-30 hrapavo maljavih zrakova. Štitići se sastoje od većeg broja cvetova. Involukrum i involucelum sačinjava veći broj linearno lancetastih listića. Krunični listići su bele boje, eliptičnog oblika, dužine oko 1 mm. Plod je elipsoidnog ili loptastog oblika, mrko žute boje, dužine 4-6 mm, širine 3-4,5 mm. Brazde imaju po jedan kanal sa etasrkim uljem, dok se na ventralnoj strani nalaze dva kanala. Stubići su glavičasti, dužine 1-1,5 mm (Nikolić, 1973). Skalicka-Wozniak i saradnici (2009) istrazivali su etarska ulja plodova vrste Peucedanum cervaria. Ustanovili su da su glavne komponente etarskih ulja: α-pinen, sabinen, i β-pinen, koji čine više od 80% etarskog ulja. Slika 2.2. Peucedanum cervaria L. 2.3.3. Peucedanum oreoselinum L. Peucedanum oreoselinum je višegodišnja biljka sa okruglo vretenastim rizomom, na čijem se gornjem delu nalaze končasti čuperci. Stabljika je visine 30 100 cm, uspravna, okrugla, tanko izbrazdana, gola. Listovi su 2 3 puta perasto deljeni, kožasti, sjajni, sa izraženom nervaturom, dužine do 40 cm, širine oko 15 cm. Gornji listovi su sedeći sa opnastim rukavcem. Veliki štitovi su građeni od 10 30 maljavih zrakova dužine 4 8 cm. Involukrum i involucelum sačinjava veći broj linearnih listića. Štitići su sa velikim brojem cvetova. Krunični listići su beli ili ružičasti, dužine oko 1 mm. Plod je okruglog ili elipsoidnog oblika. Brazde su sa po jednim kanalom sa etarskim uljem, a na ventralnoj strani nalaze se dva kanala. 9
2.4. Sekundarni metaboliti biljaka Slika 2.3. Peucedanum oreoselinum L. Primarni metaboliti biljaka su jedinjenja koja se javljaju u svim ćelijama i igraju centralnu ulogu u metabolizmu i reprodukciji ćelija. Svoju biološku funkciju uglavnom ostvaruju unutar samih ćelija ili u okviru organizma koji je odgovoran za njihovu produkciju. U primarne metabolite spadaju: aminokiseline, nukleinske kiseline, ugljeni hidrati, masne kiseline, kao i polimeri izgrađeni od ovih komponenata (proteini, RNK, DNK, polisaharidi, lipidi itd.). Sekundarni metaboliti su jedinjenja karakteristična za određeni broj biljnih vrsta. Obuhvataju: biljne pigmente, alkaloide, terpene, izoprenoide, voskove itd. Njihova uloga je višestruka. Sa drugim organizmima ostvaruju različite biološke i ekološke efekte. Mnogi produkti sekundarnog metabolizma su baktericidi, repelentne supstance ili mogu biti otrovni za štetočine i biljojede; pigmenti iz latica deluju kao atraktanti na insekte oprašivače, a bojom mogu i delovati upozoravajuće na predatore. Biljni pigmenti štite od uticaja okoline - UV radijacije i slobodnih radikala. Pojedini sekundarni metaboliti deluju kao biljni hormoni. 2.4.1. Etarska ulja i njihova antimikrobna aktivnost Etarska ulja predstavljaju smešu mirišljavih, lako isparljivih jedinjenja, među kojima dominiraju terpeni. Stvaraju ih aromatične biljke u posebnim sekretornim strukturama koje se nalaze u različitim delovima biljaka (cvetovima, stablu, listovima, korenu, plodu, lukovicama) (Matović and Vulović, 2004). Etarska ulja se klasifikuju prema njihovim glavnim sastojcima i mogu biti: ugljovodonici (pineni, limonen), alkoholi (geraniol, citronelol, linalol, mentol), aldehidi (citral), ketoni (tujon, cineol, anetol, timol) itd (Ranđelović et al, 2012). Prema izgledu, etarska ulja mogu biti: bezbojna, mogu imati tendenciju ka žutom, zelenom, plavom ili crvenom, sve dok ne postanu mrka. Etarska ulja dobijena destilacijom su veoma malo obojena jer pigmenti normalno nisu isparljivi. 10
Etaska ulja mogu biti veoma tečna, gusta, a mogu dostići i čvrsto stanje, posebno prilikom snižavanja temperature. Uglavnom poseduju jak miris. Supstance koje sačinjavaju etarska ulja ključaju na veoma promenljivim temperaturama - od 60 do 300. Dobro se rastvaraju u alkoholu i mnogim organskim rastvaračima, a samo mali broj rastvara se u vodi (Matović and Vulović, 2004). Etarska ulja mogu atraktantno delovati na insekte i na taj način obezbediti prenošenje polena i oprašivanje biljaka. Kod nekih biljaka etarska ulja mogu prelaziti u podlogu i inhibirati klijanje semena drugih biljaka. Ova pojava naziva se autopatija. Neka etarska ulja sprečavaju kljijanje sopstvenih semena i tako obezbeđuju životni prostor svake idividue. Značajna je i njihova uloga u zaštiti biljaka od napada insekata i herbivora. Prema jednoj teoriji biljke pomoću svojih isparljivih produkata stvaraju specifičnu mikroklimu koja ih štiti od prekomerne transpiracije u nepovoljnim uslovima. Etarska ulja takođe sprečavaju razvoj mikroorganizama i na taj način suzbijaju širenje infekcija u biljkama u kojima nastaju. Biološka aktivnost etarskih ulja moze se povezati i sa njihovim delovanjem na zdravlje i druge potrebe čoveka. Neke od tih aktivnosti su: antibakterijska, antifungalna, antivirusna, sedativna, spazmolitička, diuretična, hipoglikemijska itd. Pored toga, monoterpeni, kao lako isparljiva jedinjenja koriste se u aroma terapiji za relaksaciju priilikom nervne napetosti (Ranđelović et al, 2012). 11
3. CILJEVI ISTRAŽIVANJA Ciljevi ovog istraživanja su sledeći: - Prikupljanje biljnog materijala sa određenog lokaliteta; - Izolovanje etarskih ulja biljnih vrsta Peucedanum officinale L., Peucedanum oreoselinum L. i Peucedanum cervaria L. - Ispitivanje antimikrobne aktivnosti izolovanih etarskih ulja uz pomoć mikrodilucione metode; - Tumačenje rezultata u skladu sa postojećom literaturom. 12
4. MATERIJAL I METODE 4.1. Biljni materijal Biljne vrste Peucedanum officinale, P. oreoselinum i P. cervaria suprikupljane tokom jula i avgusta 2015. godine na početku cvetanja jer se tada očekuje najveći sadržaj etarskog ulja. Biljni material je sušen u periodu od dve nedelje na sobnoj temperaturi do konstantne mase. Nakon sušenja materijal je usitnjen a zatim rađena dalja obrada. 4.2. Dobijanje etarskog ulja Iz 200 g osušenih i samlevenih nadzemnih delova biljnih vrsta roda Peucedanum destilovano je etarsko ulje u aparatu tipa Clavenger u toku 2,5 h (slika 4.1.). Ulje je ekstrahovano etrom, a etarski ekstrakt sušen anhidrovanim Na 2 SO 4 (European Pharmacopoeia, 1983). Posle odvajanja sredstva za sušenje filtracijom, etar je uklonjen uz pomoć rotacionog vakuum uparivača bez zagrevanja, a etarsko ulje je čuvano u zatopljenim kivetama na 4 C do analize. Prinos etarskog ulja je izražen preko zapreminskih procenata (%) tj. v/w, obračunato u odnosu na 100 g suvog biljnog materijala. Slika 4.1. Destilator tipa Clevenger 13
4.3. Testiranje antimikrobne aktivnosti etarskih ulja biljnih vrsta roda Peucedanum 4.3.1. Bakterijske kulture Za ispitivanje antimikrobne aktivnosti korišćeni su sojevi iz ATCC kolekcije (American Type Culture Collection), Gram (+) bakterije: Staphylococcus aureus ATCC 6538, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Enterococcus faecalis ATCC 19433 i Gram (-) bakterije: Escherichia coli ATCC 9863, Proteus mirabilis ATCC 12453, Klebsiella pneumoniae ATCC 10031, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Acinetobacter boumanii ATCC 196060, kao i odgovarajući sojevi izolovani iz briseva rana pacijenata (izvor: Institut za javno zdravlje Novi Sad). 4.3.2. Mikrodiluciona metoda Od prekonoćnih kultura ispitivanih test-sojeva mikroorganizama uzgajanih na hranljivom agaru je, u sterilnom fiziološkom rastvoru, napravljena suspenzija turbiditeta 0,5 McFarlanda koja sardži 1,5x10 8 CFU/mL (NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards, 2003). Nakon toga su, prema priloženom uputstvu, napravljene odgovarajuće podloge, Muller-Hinton bujon i Muller-Hinton agar. Tečna pologa je razlivena po 10mL u sterilne epruvete i inokulisana sa po 133 L pripremljene suspenzije mikroorganizama da bi se dobio konačan broj CFU od 2x10 6 po 1 ml. Zatim je napravljena serija duplih razređenja ulja u 10 % DMSO-u (dimetilsulfoksidu), u rasponu od 0,20 404,00 mg/ml. U svako od 96 udubljenja mikrotitarske ploče (slika 4.2.) je unešeno po 90 L inokulisane podloge i po 10 L od svakog razređenja etarskog ulja. Ukupna zapremina u bunariću je iznosila 100 L, a gustina suspenzije je bila 2x10 6 CFU/mL. Mikrotitarske ploče su inkubirane na 37 0 C u trajanju od 24h. Postupak je izveden u tri ponavljanja. Kao pozitivna kontrola je korišćen antibiotik tetraciklin. Slika 4.2. Mikrotitarska ploča sa inokulisanom hranljivom podlogom, tretirana serijom razblaženja etarskih ulja 14
Mikrobiološki rast je očitavan dodavanjem po 20 µl 20 %-nog TTC-a (trifeniltetrazolijum hlorida).koncentracija bunarića u kojoj nema vidljivog rasta predstavlja MIC. Sadržaj svih bunarića koji se nalaze ispred te koncentracije je prenesen na nove petri ploče sa odgovarajućom čvrstom podlogom (MH agar) i nakon inkubacije na 37 0 C u trajanju od 24h vršeno je brojanje poraslih kolonija. MBC se definiše kao koncentracija aktivne supstance koja ubija 99,9% bakterijskih ćelija. 4.3.3. Statistička obrada podataka Svi rezultati su statistički obrađeni analizom varijanse (ANOVA) sa sigurnošću od 95% (p 0,05). 15
5. REZULTATI I DISKUSIJA 5.1. Hemijski sastav etarskih ulja biljnih vrsta roda Peucedanum 5.1.1. Hemijski sastav etarskog ulja biljne vrste Peucedanum officinale Podaci o hemijskom sastavu etarskog ulja ove vrste sumirani su i prikazani u tabeli. Tabela 5.1. Hemijski sastav etarskog ulja biljne vrste Peucedanum officinale (iz dostupne literature) Lokalitet Sadržaj ulja (% v/w) Glavne komponente (%) Literatura bornil acetat 2,3,4 trimetil benzaldehid α-pinen Grčka - sabinen Evergetis et al, 2012 mircen limonen β-selinen - - limonen α-pinen sabinen Figueredo et al., 2009 β-pinen mircen Iran - List: fenhon (27,7) (E)-β-ocimen (18,7) β-pinen (8,1) Seme: Jaimand et al., 2006 fenhon (32) (E)-β-ocimen (17,8) (Z)-β-ocimen (9,4) Na osnovu dosadašnjih istraživanja utvrđeno je da su glavne komponente etarskog ulja vrste Peucedanum officinale: α-pinen (Figueredo et al., 2009; Evergetis et al., 2012), β-pinen (Jaimand et al., 2006; Figueredo et al., 2009), sabinen (Figueredo et al., 2009; Evergetis et al., 2012), limonen (Figueredo et al., 2009; Evergetis et al., 2012), mircen (Figueredo et al., 2009; Evergetis et al., 2012), bornil acetat, 2,3,4 trimetil benzaldehid, β-selinen (Evergetis et al., 2012), fenhon, (E)-β-ocimen i (Z)-β-ocimen (Jaimand et al., 2006). u tabeli 5.2. 5.1.2. Hemijski sastav etarskog ulja biljne vrste Peucedanum cervaria Podaci o hemijskom sastavu i sadržaju etarskog ulja ove vrste sumirani su i prikazani 16
Tabela 5.2. Hemijski sastav etarskog ulja biljne vrste Peucedanum cervaria (iz dostupne literature) Lokalitet Sadržaj ulja (% v/w) Glavne komponente (%) Literatura Buterna kiselina (oktil ester) - 2 (41.13) Domokos et. al., 2000 - - n-oktil acetat (29.76) α-pinen sabinen β-pinen Skalicka-Woźniak et al., 2009 Dosadašnja istraživanja pokazuju da je sadržaj etarskog ulja u biljnoj vrsti Peucedanum cervaria 2% v/w (Domokos et al., 2000). Glavne komponente etarskog ulja ove vrste su: buterna kiselina (41,13%), n-oktil acetat (29,76%) (Domokos et al., 2000), α-pinen, sabinen, β-pinen (Skalicka-Woźniak et al., 2009). u tabeli 5.3. 5.1.3. Hemijski sastav etarskog ulja biljne vrste Peucedanum oreoselinum Podaci o hemijskom sastavu i sadržaju etarskog ulja ove vrste sumirani su i prikazani Tabela 5.3. Hemijski sastav etarskog ulja biljne vrste Peucedanum oreoselinum (iz dostupne literature) Lokalitet Sadržaj ulja (% v/w) Glavne komponente (%) Literatura Litvanija 1,5 5 limonen (44,1 82,4) γ-terpinen (12,2 17,5) β-pinen (8,5 14,5) Motskute and Nivinskene, 1999 Dosadašnja istraživanja pokazuju da je sadržaj etarskog ulja u biljnoj vrsti Peucedanum oreoselinum 1,5 5% v/w (Motskute and Nivinskene, 1999). Takođe je utvrdjeno da su glavne komponente etarskog ulja ove vrste: limonen (44,1 82,4%), γ- terpinen (12,2 17,5%) i β-pinen (8,5 14,5%) (Motskute and Nivinskene, 1999). 5.2. Antimikrobna aktivnost etarskih ulja biljnih vrsta roda Peucedanum Ispitivanje je pokazalo da etarska ulja biljnih vrsta Peucedanum officinale, Peucedanum oreoselinum i Peucedanum cervaria pokazuju antimikrobnu aktivnost prema svim ispitivaninm bakterijskim sojevima Gram (+) i Gram ( ) bakterija (tabela 5.4). 17
Tabela 5.4. Antimikrobna aktivnost (MIC/MBC u mg/ml) etarskih ulja biljnih vrsta P. officinale, P. oreoselinum i P. cervaria i referentnog antibiotika protiv patogenih bakterija izazivača infekcija kože Etarska ulja Antibiotik Izolovani i ATCC bakterijski sojevi P. officinale P. oreoselinum P. cervaria Doxycyclin Gram (+) Izvor Staphylococcus aureus Bris rane 52,50/105,00 105,87/211,75 108,50/108,50 7,81/7,81 Staphylococcus aureus ATCC6538 52,50/105,00 105,87/211,75 108,50/108,50 7,81/15,61 Staphylococcus epidermidis Bris rane 26,25/105,00 105,87/105,87 13,56/108,50 3,91/3,91 Staphylococcus epidermidis ATCC12228 26,25/210,00 105,87/211,75 108,50/434,00 3,91/7,81 Streptococcus pyogenes Bris rane 13,12/210,00 26,47/423,50 27,12/434,00 0,06/0,12 Streptococcus pyogenes ATCC19615 25,00/105,00 105,87/105,87 13,56/108,50 0,06/0,12 Enterococcus faecalis Bris rane 52,50/105,00 105,87/211,75 27,12/108,50 0,25/0,25 Enterococcus faecalis ATCC19433 105,00/105,00 105,87/211,75 27,12/108,50 0,25/0,49 Gram (-) Izvor Escherichia coli Bris rane 420,00/>420,00 423,50/>423,50 434,00/>434,50 7,81/7,81 Escherichia coli ATCC9863 105,00/105,00 423,50/>423,50 434,00/434,50 7,81/15,61 Pseudomonas aeruginosa Bris rane 52,50/210,00 211,75/>423,50 217,00/434,00 7,81/15,61 Pseudomonas aeruginosa ATCC9027 105,00/105,00 211,75/423,50 434,00/>434,50 15,61/15,61 Acinetobacter sp. Bris rane 210,00/210,00 423,50/423,50 217,00/434,00 15,61/15,61 Acinetobacter boumanii ATCC196060 105,00/105,00 423,50/>423,50 217,00/217,00 15,61/15,61 Proteus mirabilis Bris rane 52,50/52,50 423,50/423,50 54,25/217,00 7,81/15,61 Proteus mirabilis ATCC12453 105,00/105,00 211,75/423,50 217,00/217,00 7,81/15,61 Klebsiella sp. Bris rane 52,50/210,00 211,75/>423,50 217,00/434,00 15,61/15,61 Klebsiella pneumoniae ATCC10031 105,00/>420,00 211,75/>423,50 217,00/217,00 15,61/15,61 Kod bakterijskih sojeva izolovanih iz briseva rana pacijenata MIC etarskog ulja biljne vrste Peucedanum officinale se kreće od 13,12 mg/ml (Streptococcus pyogenes) do 420,00 mg/ml (Escherichia coli). MBC se kreće od 52,50 mg/ml (Proteus mirabilis) do >420,00 mg/ml (Escherichia coli). Kod ATCC sojeva MIC se kreće od 26,25 mg/ml (Streptococcus pyogenes) do 105,00 mg/ml (Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter boumanii, Proteus mirabilis i Klebsiella pneumoniae). MBC se kreće od 105,00 mg/ml (Streptococcus pyogenes, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter boumanii, Proteus mirabilis) do 210,00 mg/ml (Staphylococcus epidermidis). Kod bakterijskih sojeva izolovanih iz briseva rana pacijenata MIC etarskog ulja biljne vrste Peucedanum oreoselinum se kreće od 26,47 mg/ml (Streptococcus pyogenes) do 423,50 mg/ml (Escherichia coli, Acinetobacter sp., Proteus mirabilis). MBC se kreće od 105,87 mg/ml (Staphylococcus epidermidis) do >423,50 mg/ml (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis i Klebsiella sp.). Kod ATCC sojeva MIC se kreće od 105,87 mg/ml (Streptococcus pyogenes, Acinetobacter boumanii) do 423,50 mg/ml (Staphylococcus epidermidis). MBC je u opsegu od 105,87 mg/ml (Streptococcus pyogenes) do 423,50 mg/ml (Staphylococcus epidermidis). 18
Kod bakterijskih sojeva izolovanih iz briseva rana pacijenata MIC etarskog ulja biljne vrste Peucedanum cervaria se kreće od 13,56 mg/ml (Staphylococcus epidermidis i Streptococcus pyogenes) do 434,00 mg/ml (Escherichia coli i Pseudomonas aeruginosa). MBC se kreće od 108,50 mg/ml (kod svih Gram pozitivnih sojeva) do >434,00 mg/ml (Escherichia coli i Pseudomonas aeruginosa). Kao referentni antibiotik korišćen je Doxycyclin. Kod bakterijskih sojeva izolovanih iz briseva rana pacijenata MIC se kreće od 0,06 mg/ml (Streptococcus pyogenes) do 15,61 mg/ml (Acinetobacter sp. i Klebsiella pneumoniae). MBC ima vrednosti od 0,12 mg/ml (Streptococcus pyogenes) do 15,61 mg/ml (Pseudomonas aeruginosa i Acinetobacter sp.). Kod ATCC sojeva MIC se kreće od 0,06 mg/ml (Streptococcus pyogenes) do 15,61 mg/ml (Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter boumanii i Klebsiella pneumoniae). MBC je u opsegu od 0,12 mg/ml (Streptococcus pyogenes) do 15,61 mg/ml (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter boumanii, Proteus mirabilis i Klebsiella pneumoniae). 19
6. ZAKLJUČAK Biljne vrste Peucedanum officinale, P. oreoselinum i P. cervaria su prikupljane tokom jula i avgusta 2015. godine i to na početku cvetanja jer se tada očekuje najveći sadržaj etarskog ulja. Biljni material je sušen u periodu od dve nedelje na sobnoj temperaturi do konstantne mase. Nakon sušenja materijal je usitnjen a zatim rađena dalja obrada. Iz 200 g osušenih i samlevenih nadzemnih delova destilovano je etarsko ulje u aparatu tipa Clavenger u toku 2,5 h. Antimikrobna aktivnost ispitivana je mikrodilucionom metodom. Kao test organizmi korišćeni su patogeni bakterijski sojevi iz grupe Gram (+) i Gram ( ) bakterija. Analiza dobijenih rezultata je pokazala da su se minimalne inhibitorne koncentracije (MIC) i minimalne baktericidne koncentracije etarskih ulja ispitivanih biljnih vrsta kretale u opsegu od 13,12 420,00 mg/ml i od 52,50 >420,00 mg/ml (za ulje dobijeno iz P. officinale), od 26,47 423,50 mg/ml i od 100,00 >423,50 mg/ml (za ulje dobijeno iz P. oreoselinum) i od 0,06 434,00 mg/ml i 0,12 >434,00 mg/ml (za ulje dobijeno iz P. cervaria). Ulje P. officinale je najbolje delovalo protiv sojeva Proteus mirabilis iz brisa rane, MIC=MBC=52,50 mg/ml i Streptococcus pyogenes iz brisa rane, MIC/MBC=3,12/210,00 mg/ml. Ulje P. oreaselinum protiv sojeva Staphylococcus epidermidis iz brisa rane MIC=MBC=105,87 mg/ml, i Streptococcus pyogenes ATCC 19615, MIC=MBC=105,87 mg/ml. Protiv istih sojeva je i najbolje delovalo i ulje P. cervaria, MIC/MBC=13,56/108,50 mg/ml. Ispitivana ulja biljnih vrsta roda Peucedanum mogu biti prirodni izvor antimikrobnih materija u lečenju infektivnih rana. 20
7. LITERATURA Domokos, J., Pálinkás, J., Héthelyi, E., Korány, K., Perédi, J. (2000): Examination on volatile and fatty oils of the seed of broad-leaved spingel (Peucedanum cervaria L.). Acta horticulture, 523: 97 104. Evergetis, E., Michaelakis, A., Haroutounian, S.A. (2012): Essential Oils of Umbelliferae (Apiaceae) Family Taxa as Emerging Potent Agents for Mosquito Control. In: Soloneski S. (ed.): Integrated Pest Management and Pest Control Current and Future Tactics. InTech. Shanghai. 613 638. Figuérédo, G., Chalchat, C., Petrović, S., Maksimović, Z., Gorunović, M., Boza, P., Radić, J. (2009): Composition of Essential Oils of Flowers, Leaves, Stems and Rhizome of Peucedanum officinale L. (Apiaceae). Journal of Essential Oil Research, 21(2): 123-126. Jaimand, K., Ashorabadi, E.S., Dini, M. (2006): Chemical Constituents of the Leaf and Seed Oils of Peucedanum officinale L. Cultivated in Iran. Journal of essential oil research, 18(6): 670 671. Kušan, F. (1956): Ljekovito i drugo korisno bilje. Poljoprivredni nakladni zavod. Zagreb. Kuzmanov, B., Andreev, N., Kozovska, V. (1981): Chemotaxonomic study on Bulgarian species of Peucedanum L. I.. Adas HI Congr. OPTIMA Anales Jard. Bot. Madrid, 37(2): 779-788. Matović, M., Vulović, D. (2004): Čarobni svet biljnih esencija. SD Publik. Beograd. Motskute, D., Nivinskene, O. (1999): Essential oil of Peucedanum oreoselinum fruit collected near Vilnius. Chemistry of Natural Compounds, 35(6): 635 637. Nikolić, V. (1973): Araliales - Apiaceae. In: Josifović, M- (ed.): Flora SR Srbije V. Srpska akademija nauka i umetnosti. Beograd. Petrović, O., Knežević, P., Simeunović, J. (2007): Mikrobiologija. Univerzitet u Novom Sadu, Prirodno-maematički fakultet, Departman za biologiju i ekologiju. Novi Sad. Radulović, Š. (2012): Mikrobiologija sa epidemiologijom. Zavod za udžbenike i nastavna sredstva. Beograd. Randall, R. E., Thornton, G. (1996): Peucedanum officinale L. Journal of Ecology 84: 475-485. 21
Ranđelović, V. (2005): Botanika. Biološko društvo "Dr Sava Petrović". Niš. Ranđelović, V., Matejić, J., Mitić, Z. (2012): Praktikum iz sistematike i ekologije lekovitih biljaka. Grafičko izdavačko preduzeće d.o.o. PUNTA, Niš. Biološko društvo "Dr Sava Petrović". Niš. Skalicka-Woźniak, K., Glowniak. K. (2008): Quantitative Analysis of Phenolic Acids in Extracts Obtained from the Fruits of Peucedanum alsaticum L. and Peucedanum cervaria (L.) Lap. Chromatographia Supplement, 68: S85-S90. Skalicka-Woźniak, K., Los, R., Glowniak, K., Malm, A. (2009): Volatile Compounds in Fruits of Peucedanum cervaria (L AP.) L. Chemistry and Biodiversity, 6(7): 1087-1092. Skalicka-Woźniak, K., Los, R., Glowniak, K., Malm, A. (2010): Antimicrobial Activity of Fatty Acids from Fruits of Peucedanum cervaria and P. alsaticum. Chemistry and Biodiversity, 7(11): 2748-2754. Tatić, B., Blečić, V. (2002): Sistematika i filogenija viših biljaka. Drugo izdanje. Zavod za udžbenike i nastavna sredstva. Beograd. 22
Biografija Ljubica Grašić rođena je 30.06.1991. u Ćupriji. Osnovnu školu Momčilo Popović Ozren završila je 2006. godine i upisala srednju medicinsku školu Danilo Dimitrijević u Ćupriji. Srednju školu zavrsila je 2010. godine i upisala osnovne studije biologije na Prirodno matematičkom fakultetu u Nišu, koje je završila 2013. godine, kada je i upisala master studije na smeru Ekologija i zaštita prirode na istom fakultetu. 23
Прилог5/1 ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИФАКУЛТЕТ НИШ КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА Редни број, РБР: Идентификациони број, ИБР: Тип документације, ТД: Тип записа, ТЗ: Врста рада, ВР: Аутор, АУ: Ментор, МН: Наслов рада, НР: Монографска Текстуални / графички Мастер рад Љубица Грашић Татјана Михајилов Крстев Антимикробна активност етарских уља биљних врста рода Peucedanum L. Језик публикације, ЈП: Језик извода, ЈИ: Земља публиковања, ЗП: Уже географско подручје, УГП: Српски Енглески Р. Србија Р. Србија Година, ГО: 2016 Издавач, ИЗ: Ауторски репринт Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33. Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ 23 стране. 4 табеле, 5 слика Научна област, НО: Биологија Научна дисциплина, НД: Предметна одредница/кључне речи, ПО: УДК Микробиологија Peucedanum officinale, Peucednum oreoselinum, Peucedanum cervaria, антимикробна активност, инфекције рана Чува се, ЧУ: Библиотека Важна напомена, ВН: Биљне врсте Peucedanum officinale, P. оreoselinum i P. цervaria су прикупљане током јула и августа 2015. године. Биљни материјал је сушен у периоду од две недеље на собној температури до константне масе. Из Извод, ИЗ: 200 g осушених и самлевених надземних делова биљних врста рода Peucedanum дестилована су етарска уља, поступком хидродестилације у апаратури по Clavenger-у у трајању од 2,5h. Антимикробна активност изолованих етарских уља је испитивана микродилуционом методом. Датум прихватања теме, ДП: 17.02.2016. Датум одбране, ДО: Чланови комисије, Председник: КО: Члан: Члан, ментор: ОбразацQ4.09.13- Издање
Прилог 5/2 ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИФАКУЛТЕТ НИШ KEY WORDS DOCUMENTATION Accession number, ANO: Identification number, INO: Document type, DT: Type of record, TR: Contents code, CC: Author, AU: Mentor, MN: Title, TI: Monograph textual / graphic Master s thesis Ljubica Grašić Tatjana Mihajilov Krstev Antimicrobial activity of essential oils of plant species Peucedanum L. Language of text, LT: Language of abstract, LA: Country of publication, CP: Locality of publication, LP: Serbian English Republic of Serbia Serbia Publication year, PY: 2016 Publisher, PB: author s reprint Publication place, PP: Niš, Višegradska 33. Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures 23 pages, 4 tables, 5 pictures Scientific field, SF: Biology Scientific discipline, SD: Subject/Key words, S/KW: UC Microbiology Peucedanum officinale, Peucednum oreoselinum, Peucedanum cervaria, antimicrobial activity, skin infections Holding data, HD: Note, N: Abstract, AB: Accepted by the Scientific Board on, ASB: Defended on, DE: Defended Board, President: DB: Member: Member, Mentor: Library Plant species Peucedanum officinale, P. oreoselinum i P. cervaria were collected in July and August 2015. The plants were dried during two weeks at room temperature until reaching a constant mass. From 200g of dried and ground aboveground parts of the plants from Peucedanum species essential oils were distilled by the process of hydrodistillation using a Clevenger apparatus in duration of 2,5 hours. The antimicrobial activity of the obtained essential oils was examined by the micro-dilution method. As test organisms, some pathogenic bacterial strains from the groups of Gram (+) and Gram (- 17.02.2016. ОбразацQ4.09.13- Издање 1