UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO-MATEMATIĈKI FAKULTET DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU Danica D. Biberović Kultivacija mezenhimskih matiĉnih ćelija masno

Транскрипт

1 UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO-MATEMATIĈKI FAKULTET DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU Danica D. Biberović Kultivacija mezenhimskih matiĉnih ćelija masnog tkiva iz epididimisa miša Master rad Niš, 2015.

2 UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO-MATEMATIĈKI FAKULTET DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU Kultivacija mezenhimskih matiĉnih ćelija masnog tkiva iz epididimisa miša Master rad Kandidat Danica D. Biberović 83 Mentor prof. dr Stevo Najman Niš, oktobar, 2015.

3 UNIVERSITY OF NIŠ FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY Cultivation of mesenchymal stem cells from mouse epididymal fat tissue Master thesis Candidate Danica D. Biberović 83 Mentor prof. dr Stevo Najman Niš, October, 2015.

4 Zahvaljujem se svom mentoru prof. dr Stevu Najmanu na ukazanoj pomoći i vođstvu tokom izrade ovog master rada. Izuzetnu zahvalnost dugujem asistentici Jeleni Najdanović, koja je veliki deo svog vremena uložila za pomoć u realizaciji eksperimentalnog dela ovog master rada, kao i u tumačenju rezultata. Najveću zahvalnost dugujem porodici na omogućenom dosadašnjem školovanju i velikoj podršci.

5 Sažetak Stem ćelije su nespecijalizovane ćelije u vrlo ranom stadijumu razvića, koje imaju sposobnost diferencijacije u razliĉite tipove ćelija. Multipotentne ćelije masnog tkiva se nalaze u stromalnoj vaskularnoj frakciji (SVF), a postupkom digestije pomoću enzima kolagenaze mogu da se odvoje od masnih ćelija. Matiĉne ćelije masnog tkiva (ADSCs) su znaĉajne za primenu u tkivnom inženjerstvu, jer su depoi masnog tkiva lako dostupni u organizmu. Cilj ovog rada je ispitivanje uslova za in vitro kultivaciju i propagaciju mezenhimskih matiĉnih ćelija iz masnog tkiva epididimisa miša. Izolacija masnog tkiva je raċena zbog dobijanja mezenhimskih matiĉnih ćelija, radi ispitivanja njihove potencijalne terapijske primene. Masno tkivo miša je izolovano, digestovano, te su dobijene ćelije zasejane u in vitro uslovima specifiĉnim za ćelije sisara. Morfologija ćelija praćena je do pete pasaže. Broj i vijabilnost su odreċene bojenjem Trypan blue dye exclusion (TBE) metodom, a morfološke promene kultivisanih ćelija su praćene pomoću invertnog svetlosnog mikroskopa, pod faznim kontrastom. Analizirana je i morfologija mrtvih ćelija bojenih Gimzom. Fibroblastolike ćelije iz stromalne vaskularne frakcije pokazale su dobru adherenciju za plastiku u ćelijskoj kulturi i oĉuvale su proliferativnu moć do ĉetvrte pasaže. Fibroblastni fenotip ćelija gubi se tokom in vitro propagacije nakon ĉetvrte pasaže, kada se ćelije spljoštavaju, dobijaju lamelipodiĉne nastavke i ulaze u apoptozu. Epitelolike ćelije dobijene iz supernatanta inicijalnih flaskova imaju ograniĉenu proliferativnu moć do perioda nakon prve pasaže, te nisu pogodan model za kultivaciju i nemaju potencijalnu primenu u regenerativnoj medicini. ADSCs kultivisane i propagirane kroz manji broj pasaža (P01-P03) mogu imati potencijalnu terapijsku primenu. Kljuĉne reĉi: miševi Balb/c soja, epididimis, mezenhimske matiĉne ćelije, masno tkivo

6 Abstract Stem cells are nonspecialized cells in early stage of development with ability to differentiat into different types of cells. Multipotent stem cells of fat tissue localized in stromal vascular fraction, may be separated from fat cells by collagenase digestion. ADSCs are importnant to use in tissue engineering, because the adipose tissue depots in the body are readily available. The aim of this study is testing conditions for in vitro cultivation and propagation of mesenchymal stem cells from a fat tissue of a mouse epididymis. Fat tissue was isolated to get mesenchymal stem cells, for examination of their potential therapeutic use. Fat tissue was isolated, digested, and then the cells were cultivated in vitro, in the conditions specific for mammal cells. The morphology of cells was controled by fifth passage. Number and viability of cells were determined by staining with Trypan blue dye exclusion method. Morphological changes of cultured cells were controlled by phase-contrast microscope. Also, the dead cells stained with Giemsa, were analized. Fibroblast-like cells from the stromal vascular fraction showed good adherence to plastic in cell culture and preserve the proliferative capacity up to fourth passage. Fibroblastic phenotype of cells is lost during in vitro propagation, after the fourth passage, when the cells flatten, getting lamellipodia extensions, and entering apoptosis. Epithelial cells from supernatant have limited proliferative power until the time after first passage, and therefore are not a suitable model for the cultivation and don t have a potential use in regenerative medicine. Cultivated ADSCs, which were passaged through a few passages (P01- P03) may have a potential therapeutic use. Keywords: Balb/c strain of mice, epididymis, mesenchymal stem cells, fat tissue

7 Sadržaj: 1. Uvod Stem ćelije Tipovi stem ćelija Mezenhim Mezenhimske matiĉne ćelije Masno tkivo Belo (unilokulano) masno tkivo Mrko (multilokularno) masno tkivo Matiĉne ćelije i masno tkivo Izvori mezenhimskih matiĉnih ćelija Primena matiĉnih ćelija u regenerativnoj medicini i tkivnom inženjerstvu Regenerativna medicina Regeneracija mekih tkiva Tkivno inženjerstvo Cilj rada Ćelijska kultura Materijal i metode Materijal Kultivacioni medijum za ćelijsku kulturu Digestija tkiva kolagenazom Fosfatni pufer Fetalni goveċi serum Medijum za kultivaciju ćelija Etilen diamin tetra sirćetna kiselina May Grunwald Giemsa Laboratorijska oprema... 15

8 Centrifuga Inkubator Invertni svetlosni mikroskop Vodeno kupatilo Metodologija rada sa ćelijama Odabir i priprema životinja za uzimanje masnog tkiva Animalni model Uzimanje masnog tkiva i izdvajanje ćelija iz njega Priprema ćelija za kultivaciju SaĊenje i kultivacija ćelija Tripan plavo Pasažiranje kultura Mikroskopska analiza živih kultura Bojenje kultura Mikroskopska analiza obojenih kultura Rezultati Diskusija Zakljuĉak Literatura... 31

9 1. UVOD 1.1. Stem ćelije Stem ćelije su nespecijalizovane ćelije u vrlo ranom stadijumu razvića, koje imaju sposobnost diferencijacije u razliĉite tipove ćelija kao što su B-ćelije pankreasa koje produkuju insulin, funkcionalni miociti, neuroni i druge ćelije (Slika 1; Slika 2). Smatra se da je moguća terapijska primena tkiva dobijenih od stem ćelija velika. Glavne karakteristike stem ćelija sisara su: sposobnost samoobnavljanja, pluripotentnost, velika mogućnost migracije, sposobnost imunološke tolerancije ne dovode do odbacivanja kalema (Nikolić et al., 2007). Neke njihove kćerke ćelije ostaju matiĉne ćelije, dok se druge mogu pretvarati u specifiĉne, trajno diferencirane ćelije. Matiĉne ćelije iz kostne srži se mogu prouĉavati i eksperimentalnim metodama za analizu hematopoeze in vivo i in vitro (Junquieira & Carneiro, 2005). Slika 1. Diferencijacija stem ćelija ( 1

10 Slika 2. Mikroskopski prikaz diferenciranih stem ćelija ( Tipovi stem ćelija Stem ćelije, poznate su i pod nazivom besmrtne (imortalne), zbog neograniĉene sposobnosti deobe. Mogu se diferencirati u razliĉite progenitorne ćelije (opredeljene matiĉne ćelije) koje se opredeljuju za dalje sazrevanje u pravcu specifiĉnih vrsta ćelija. Na osnovu mogućnosti diferencijacije u druge tipove ćelija, stem ćelije se klasifikuju kao: 1. Totipotentne imaju najveći potencijal za diferencijaciju jer njihovim deobama može nastati bilo koji tip ćelija. Totipotentnost je svojstvo embrionalne ćelije do stupnja razvoja od 8 blastomera; 2. Pluripotentne imaju manji potencijal za diferencijaciju te njihovom deobom ne mogu nastati svi tipovi ćelija kao u sluĉaju totipotentnih, ali može veliki broj razliĉitih tipova ćelija; 2

11 3. Multipotentne imaju manji potencijal za diferencijaciju u odnosu na prethodna dva tipa. Nalaze se u tkivima odraslih organizama koje mogu dalje da se diferenciraju u meċusobno bliske tipove ćelija; 4. Unipotentne progenitorne, opredeljene, diferenciraju se u samo jedan tip specifiĉnih ćelija (Nikolić et al., 2007). Stem ćelije mogu biti embrionalne (engl. embryonic stem cells, ESCs), fetalne (engl. foetal stem cells, FSCs) i adultne (engl. adult stem cells, ASCs) (Nikolić et al., 2007). Iako su embrionalne stem ćelije pluripotentne, problemi u vezi sa etiĉkim normama, njihovom regulacijom i dostupnošću usmeravaju na korišćenje adultnih stem ćelija u tkivnom inženjerstvu (Tapp et al., 2009) Mezenhim Mezenhim je saĉinjen od poluteĉne osnovne supstance i trodimenzionalne mreže mezenhimskih ćelija zvezdastog oblika, veliĉine µm sa izraženim citoplazmatskim produžecima. Imaju centralno postavljeno, ovalno, euhromatiĉno jedro i uoĉljivo jedarce. Citoplazma sadrži oskudne organele. Mezenhim omogućava transport materija izmeċu formirajućih tkiva, a njegove pluripotentne ćelije mogu da se diferenciraju u razliĉite ćelije vezivnog tkiva, kao što su: fibroblasti, retikularne ćelije, masne ćelije, hondroblasti i osteoblasti (Nikolić et al., 2007) Mezenhimske matiĉne ćelije Mezenhimske matiĉne ćelije (engl. mesenchymal stem cells, MSCs) su nehematopoetske ćelije. Fridenstein sa saradnicima je ove ćelije opisao godine kao klonalne, adherentne ćelije koje se pre svega mogu diferencirati u osteoblastnu, adipogenu i hondrogenu ćelijsku liniju. S obzirom na njihove karakteristike i veliku primenu u kliniĉkoj praksi, interesovanje za ovaj tip matiĉnih ćelija je veliko (Bobis et al., 2006). 3

12 Glavni izvor MSCs je kostna srž. MeĊutim, osim u kostnoj srži, mezenhimske matiĉne ćelije se nalaze i u drugim delovima tela. Prisutne su u masnom tkivu, u krvi pupĉane vrpce, u horionskim resicama placente, u amnionskoj teĉnosti, perifernoj krvi, u jetri fetusa, u plućima. S godinama, broj MSCs opada. Najveći broj je opisan kod novoroċenĉadi, a tokom života njihov broj se duplo smanji do 80. godine života (Bobis et al., 2006). Specifiĉne karakteristike MSCs, ukljuĉujući i njihovu sposobnost proliferacije i diferencijacije u razliĉite tipove ćelija, pre svega u osteoblaste, hondrocite i adipocite, ĉine ih pogodnim za primenu u regenerativnoj medicini. Posebno je izražena njihova primena u ćelijskoj biologiji i genskoj terapiji, pa se samim tim povećava broj kliniĉkih ispitivanja koje ukljuĉuju primenu ovih ćelija. Mogu se izolovati iz razliĉitih tkiva i umnožiti u kulturi, što omogućava stvaranje tkiva koja sadrže ove ćelije, koja se mogu opet uneti u pacijenta. Matiĉne stem ćelije, unete infuzijom u cirkulaciju, imaju sposobnost migracije do mesta povrede. Ovo je primećeno kod mnogih životinja sa prelomima kostiju, cerebralnom ishemijom ili infarktom miokarda (Bobis et al., 2006) Masno tkivo Masno tkivo je vrsta vezivnog tkiva u kome dominiraju masne ćelije, odnosno adipociti. One se uglavnom nalaze grupisane u vidu masnog tkiva, koje skladišti energiju. Mast ima funkciju u toplotnoj izolaciji tela. Masno tkivo pokazuje i funkciju sekrecije odreċenih molekula koji mogu da se raznose putem krvi do drugih organa, a zatim da ispolje svoje dejstvo. Postoje dve vrste masnog tkiva (Slika 3), koje se meċusobno razlikuju po graċi, lokalizaciji, boji i patološkim karakteristikama. To su: unilokularno (belo) masno tkivo multilokularno (mrko) masno tkivo (Junquieira & Carneiro, 2005). 4

13 Belo (unilokularno) masno tkivo Ćelije belog masnog tkiva u svojoj citoplazmi sadrže jednu veliku kapljicu žute masti. Boja potiĉe od biljnih pigmenata karotenoida koji su rastvoreni u masnim kapljicama. Unilokularno masno tkivo nije prisutno u veċama, penisu, skrotumu i ušnoj školjki. Kod novoroċenĉadi, masno tkivo je rasporeċeno po ĉitavom telu, a s godinama u nekim delovima tela išĉezava, a u nekim delovima tela se nagomilava. Masno tkivo je dobro vaskularizovano. Masne ćelije nastaju od lipoblasta koji potiĉe od mezenhima i imaju sposobnost deponovanja masti u citoplazmi (Junquieira & Carneiro, 2005) Mrko (multilokularno) masno tkivo Ćelije mrkog masnog tkiva sadrže više kapljica masti i mnogo mitohohondrija (koje sadrže obojene citohrome). Nalazi se samo u odreċenim delovima tela. Obilnije je kod životinja koje spavaju zimski san. Kod pacova ili drugih sisara, mrko masno tkivo je smešteno oko ramenog pojasa. Kod ĉoveka, bitnu funkciju ima po roċenju, kada štiti novoroċenĉe od hladnoće, tako što proizvodi toplotu (Junquieira & Carneiro, 2005). Slika 3. Belo i mrko masno tkivo ( 5

14 Matiĉne ćelije i masno tkivo Multipotentne stromalne ćelije masnog tkiva se nalaze u vaskularnoj frakciji strome (engl. stromal vascular fraction SVF), a postupkom digestije pomoću enzima kolagenaze mogu da se odvoje od masnih ćelija (Zuk et al., 2002; Gimble & Guilak, 2003). Matiĉne ćelije masnog tkiva (engl. adipose-derived stem cells, ADSCs) su znaĉajne za primenu u tkivnom inženjerstvu, jer su depoi masnog tkiva lako dostupni u organizmu. Osim toga, masnog tkiva ima u dovoljnim koliĉinama, a procedura uzimanja nije komplikovana. ADSCs se uglavom dobijaju nakon aspiracije ili ekcizije masnog tkiva (Torio-Padron et al., 2010) Izvori mezenhimskih matiĉnih ćelija Kostna srž se smatra referentnim izvorom za izolaciju mezenhimskih matiĉnih ćelija. Do danas su mezenhimske matiĉne ćelije izolovane iz mnoštva adultnih tkiva poput mišićnog, masnog i vezivnog tkiva, trabekularne kosti, sinovijalne teĉnosti i perinatalnih tkiva kao što su pupĉana vrpca, amnionska teĉnost i placenta. Sveprisutnost, lakoća pronalaženja i minimalno invazivna procedura, neophodna za iskorišćavanje masnog tkiva, ĉini ga idealnim izvorom za dobijanje visokog prinosa mezenhimskih matiĉnih ćelija (Barba et al., 2013). Ustanovljeno je da se stem ćelije, izolovane iz masnog tkiva, diferenciraju pod odreċenim uslovima u kulturi u adipogene, hondrogene, miogene i osteogene ćelije. Njihova plastiĉnost, kao i mogućnost dobijanja velikog broja ovih ćelija minimalno invazivnim metodama, povećala je interesovanje za matiĉne ćelije iz masnog tkiva u cilju primene u regenerativnoj medicini. Ćelije izolovane iz masnog tkiva, bilo da su sveže izolovane ili kultivisane in vitro, pokazale su svoju ulogu u poboljšanju funkcije leve komore u modelima akutnog i hroniĉnog infarkta miokarda. Matiĉne ćelije iz masnog tkiva se mogu diferencirati in vitro ili in vivo, u kardiomiocite ili endotelske ćelije (Fontijn, 2014). 6

15 1.5. Primena matiĉnih ćelija u regenerativnoj medicini i tkivnom inženjerstvu Regenerativna medicina Stem ćelije su znaĉajne u regenerativnoj medicini i tkivnom inženjerstvu, gde predstavljaju važan izvor ćelija i tkiva zbog mogućnosti izolovanja i umnožavanja u uslovima in vitro, ali i zbog pluripotentnosti. Kada se stem ćelije razmnožavaju u uslovima in vitro, ĉesto se koriste izrazi kultivacija, odnosno odgajanje, propagacija odnosno umnožavanje i pasažiranje, odnosno prenošenje ćelija sa jedne podloge na drugu, tj. presaċivanje (Nikolić et al., 2007). Prilikom deobe matiĉnih ćelija, svaka novonastala ćelija ima mogućnost da zadrži osobine matiĉne, ali i da postane neka druga vrsta ćelije sa usko specijalizovanom funkcijom poput mišićne, krvne ili moždane ćelije. Ova nauĉna oblast je omogućila istraživaĉima da ispitaju mogućnost terapije zasnovane na ćelijama, poznatijoj pod nazivom regenerativna ili reparativna medicina, za leĉenje bolesti (Sandhaanam et al., 2013). Umesto termina regenerativna medicina ĉesto se upotrebljavaju i termini regenerativna ćelijska terapija, ćelijska terapija bazirana na stem ćelijama i ćelijska transplataciona terapija (Nikolić et al., 2007). Ćelijska terapija je evoluirala tokom poslednje decenije, kako u in vivo, tako i u in vitro kliniĉkim i pretkliniĉkim istraživanjima (Wang et al., 2012) Regeneracija mekih tkiva Masno tkivo ĉoveka je dostupan izvor adultnih matiĉnih ćelija za primenu u tkivnom inženjerstvu i regenerativnoj medicini. Cilj tkivnog inženjerstva je regeneracija oštećenih organa kombinacijom tri komponente: citokina, biomaterijala/matrica i ćelija. Idealna ćelija za ovu svrhu treba da ispunjava sledeće uslove: 7

16 da bude dostupna u velikim koliĉinama da se može uzeti iz donora uz minimalno invazivne procedure da se može diferencirati u multiple ćelijske linije da se može transplatovati autolognim ili alogenim naĉinom potpuno bezbedno (Gimble & Guilak, 2003) Tkivno inženjerstvo Pojam tkivnog inženjerstva (engl. Tissue Engineering, TE) prvi put su uveli Langer i Vacanti godine kao interdisciplinarnu oblast istraživanja koja se bazira na primeni principa inženjerstva i prirodnih nauka u pravcu razvoja bioloških supstituenata, što za cilj ima obnovu ili poboljšanje funkcije tkiva (Langer & Vacanti, 1993). Stem ćelije su od izuzetnog znaĉaja u regeneraciji i reparaciji oštećenih tkiva. Kada se radi o primeni stem ćelija za stvaranje bioloških tkiva, izbor se svodi na embrionalne ili adultne stem ćelije (Ogawa, 2006). 8

17 2. CILj RADA Cilj ovog rada je bilo ispitivanje uslova za in vitro kultivaciju i propagaciju mezenhimskih matiĉnih ćelija iz masnog tkiva koje okružuje epididimis miša. 9

18 3. ĆELIJSKA KULTURA Ćelijska kultura predstavlja ćelije, tkiva i organe koji se gaje u in vitro uslovima više od 24h (generacijsko vreme za animalne ćelije), u strogo kontrolisanim uslovima, što nije sluĉaj u organizmu. In vitro metode imaju svoje prednosti, ali i nedostatke. Prednosti metoda in vitro: Nema varijacija koje postoje u organizmu Kontrola uslova sredine za rast ćelija uniformiše uzorak Ćelije mogu biti izlagane supstancama u definisanim koncentracijama, odnosno fiziĉkim agensima definisanog intenziteta Izbegavaju se legalni, moralni i etiĉki problemi vezani za eksperiment sa životinjama Znatno niži troškovi ispitivanja Nedostaci metoda in vitro: Moraju se razviti standardizovane tehnike da bi se saĉuvale reproducibilne ćelije za eksperimente Potrebno je vreme da se osvoje aseptiĉne tehnike Koliĉina materijala može biti ograniĉena Scale up je vrlo zahtevan (engl. scale up, skaliranje prenošenje podataka sa malog sistema kako bismo ih imali na velikom sistemu) Ne mora biti identiĉan in vivo genotipu ili fenotipu Može doći do dediferencijacije i selekcije ćelija, mnogi originalni ćelijski mehanizmi mogu biti izgubljeni GLP (Good Laboratory Practise) ili dobra laboratorijska praksa je od velikog znaĉaja prilikom rada u ćelijskoj kulturi. Bazira se na regulisanju pravila ponašanja i mera 10

19 predostrožnosti koje je neophodno primenjivati pre, tokom, kao i nakon rada u ćelijskoj kulturi, kako ne bi došlo do kontaminacije mikroorganizmima ili drugim ćelijskim linijama (Freshney, 2005). Prostor ćelijske kulture je radni prostor u kome važe pravila rada i ponašanja: Ne radi se istovremeno sa više od jedne ćelijske linije, kako bi se izbegla unakrsna kontaminacija Za svaku ćelijsku liniju koriste se posebne boce medijuma Treba izbegavati ponavljanje zagrevanja i odlivanja medijuma posle više od šest nedelja Treba izbegavati kontinuiranu upotrebu antibiotika, antimikotika i sl. Treba izbegavati da ćelijska kultura postane suviše konfluentna Nove ćelijske linije u kulturi moraju biti kultivisane u posebno namenjenom prostoru pre nego što se testiraju Kabinet, inkubator i radne površine se moraju održavati ĉistim i sterilnim, kao i sve što dolazi u kontakt sa kulturom Radni prostor u radu sa ćelijama ĉine laminarni kabineti koji mogu biti horizontalni protoĉni kabineti i kabineti klase II. Prednost horizontalnih laminarnih kabineta je pružanje najsterilnijih uslova, meċutim nedostatak je nedovoljna zaštita operatera. U kabinetu je najdublji deo najsterilniji, zbog toga što se filtrirani vazduh koji ulazi sa zadnje strane, usmerava napred, odnosno ka operateru. Za razliku od laminarnih, kabineti klase II pružaju dobre sterilne uslove za rad. Vazduh je usmeren sa vrha kabineta na radnu površinu. Tokom rada je jako bitno da se nesterilni predmeti ne prenose preko sterilnih. Kako je sterilni vazduh unutar kabineta, njegova prednja strana je nesterilna. Sa humanim i primatskim ćelijama mora da se radi u ovakvom tipu kabineta (Freshney, 2005). Bezbednost je važan uslov za rad u ćelijskoj kulturi. Stoga treba voditi raĉuna prilikom rada sa supstancama opasnim po zdravlje, kao i o odstranjivanju otpadaka. Svi otpaci koji su bili u kontaktu sa ćelijama, moraju biti autoklavirani (Freshney, 2005). 11

20 4. MATERIJAL I METODE 4.1. MATERIJAL Kultivacioni medijum za ćelijsku kulturu Najveći broj kultura su teĉne i poluĉvrste zbog toga što teĉnost služi za rastvaranje poluĉvrste podloge. Medijum predstavlja teĉnost u kojoj ćelije rastu i najvažnija je komponenta za kultivaciju ćelija. ObezbeĊuje ćelijama neophodne hranljive materije, faktore rasta i hormone, reguliše se ph i osmotski pritisak kulture (Freshney, 2005). Karakteristike medijuma su: Fiziološke (ph, osmolarnost) Suprafiziološke (hormoni, hranljive supstance) Nefiziološke (boje, antibiotici) Digestija tkiva kolagenazom Digestija kolagenazom je veoma jednostavna i efektna procedura za mnoga tkiva ukljuĉujući embrionalna, adultna, normalna i maligna tkiva. Od najvećeg je znaĉaja njena upotreba umesto tripsina za tkiva koja su previše fibrozna ili previše osetljiva. Disagregacija kolagenazom je naroĉito pogodna u ćelijskoj kulturi humanih tumora, ćelija bubrega miša, humanog adultnog i fetalnog mozga, jetre, pluća i mnogih drugih uglavnom epitelnih tkiva. Proces digestije kolagenazom je blag i ne zahteva mehaniĉko mešanje kao ni specijalnu opremu. MeĊutim, kada se digestuje više od 1g tkiva, proces postaje dug u stadijumu disekcije i može biti skup zbog potrebne velike koliĉine kolagenaze. Pošto se ovim postupkom oslobaċa većina ćelija vezivnog tkiva, dolazi do problema pojave velikog broja fibroblasta. Iz tih 12

21 razloga, procedura digestije kolagenazom bi trebalo da bude praćena selektivnom kultivacijom ili separacijom ćelija (Freshney, 2005) Fosfatni pufer Fosfatni pufer (engl. Phosphate buffer saline, PBS), se koristi za ispiranje ćelija u kulturi. Ima funkciju održavanja ph i osmotske ravnoteže, pa se zbog toga ĉesto koristi u biološkim ispitivanjima ( Nije toksiĉan za ćelije. Osim za ispiranje ćelija, može se koristiti i kao rastvaraĉ pojedinih supstanci (Freshney, 2005) Fetalni goveċi serum Fetalni goveċi serum (engl.fetal bovine serum, FBS) je serum koji se najĉešće koristi za in vitro kultivaciju eukariotskih ćelija. Sadrži nizak nivo antitela i više faktora rasta. Fetalni goveċi serum (FBS) je frakcija krvi koja preostane nakon prirodne koagulacije krvi, uz proces centrifugiranja kako bi se uklonili preostali eritrociti. Fetalni goveċi serum potiĉe iz krvi uzete iz fetusa. Globularni protein, goveċi albuminski serum (engl. Bovine serum albumin, BSA) je glavna komponenta fetalnog goveċeg seruma. Raznolikost proteina u fetalnom goveċem serumu održava kultivisane ćelije u medijumu u kome mogu da prežive, rastu i da se dele ( Medijum za kultivaciju ćelija Svaka ćelijska linija koja se gaji ima svoje specifiĉne zahteve. Mezenhimske matiĉne ćelije mogu biti gajene u standardnom hranljivom medijumu za ćelijske kulture Dulbeco s modified Eagle s medium (DMEM) sa 10% FBS-a, L-glutaminom (koji se zbog svoje nestabilnosti dodaje neposredno pre upotrebe) i kombinacijom antibiotika (penicillina i streptomicina). 13

22 Etilen diamin tetra sirćetna kiselina Etilen diamin tetra sirćetna kiselina (engl. Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA) je helator kalcijuma što znaĉi da pomaže u vezivanju jona kalcijuma nakon ĉega tripsin može da deluje na proteine ćelijskog matriksa ( ayers%20using%20trypsin.pdf). Pre zasejavanja ćelija u flaskove ili ploĉe za kultivaciju ćelija sa bunarĉićima, neophodno je odvojiti ćelije od dna flaska za koje su adherirane odnosno izvršiti pasažu ćelija. Budući da se pasaža obavlja pomoću enzima tripsina, naziva se još i tripsinizacija. Ovaj proces podrazumeva disocijaciju ćelija delovanjem tripsina koji razdvaja adherentne ćelije iz posuda u kojima su zasejane ( Proces tripsinizacije se radi brzo, a u zavisnosti od ćelijske kulture sa kojom se radi, ćelije se izlažu dejstvu enzima, 3-10 minuta (Freshney, 2005). Uz pomoć fazno-kontrastnog mikroskopa se posmatra stanje ćelija, da li su još uvek adherirane za dno flaska ili su se odvojile. Flask je potrebno mehaniĉki protresti kako bi se ćelije odvojile sa dna (Freshney, 2005) May Grunwald Giemsa May Grunwald Giemsa (MGG) bojenje se pre svega koristi za morfološki prikaz i diferencijalno brojanje krvnih ćelija. May Grunwald bojenje kombinuje efekat kiselog eozina i alkalnog metilen plavog. Ovim bojenjem se boje sve ćelijske komponente. ph vrednost je važan faktor u bojenju, tako da prilikom svake promene ph dolazi do pogrešne reakcije bojenja ( et/file.postfileloader.html%3fid%3d5485e0f3d039b16a2e8b462e%26assetkey%3das%253a % &cd=1&hl=en&ct=clnk&gl=rs). 14

23 4.2. LABORATORIJSKA OPREMA Centrifuga Svaka laboratorija za ćelijsku kulturu ima centrifugu sa hlaċenjem, koja se koristi za razdvajanje ĉestica razliĉitih veliĉina. Tokom rada sa ćelijama, potrebno je, nakon pasažiranja, odvojiti ćelije od medijuma koji sadrži razblažen tripsin i ostatke ćelija. Nakon procesa centrifugiranja, na dnu epruvete se izdvajaju ćelije, a iznad njih je supernatant. Humane ćelije se moraju centrifugirati u zatvorenim rotorima. U zavisnosti od tkiva i ćelija koje želimo izdvojiti, kao i u zavisnosti od tipa eksperimenta, podešava se brzina za sedimentaciju ćelija (Freshney, 2005) Inkubator Deo neophodne opreme u laboratoriji za rad sa ćelijama u kulturi je inkubator. Koristi se za rast i održavanje mikrobioloških i ćelijskih kultura. Održava optimalnu temperaturu, vlažnost, ugljen dioksid (CO 2 ) i kiseonik (O 2 ). Obiĉno rade na 37ºC i 5% CO 2, kako bi se saĉuvao medijum u adekvatnoj ph vrednosti (sredini). Svi tipovi inkubatora registruju temperaturu i nivo gasa. U laboratoji za ćelijsku kulturu koriste se CO 2 i O 2 inkubatori, u zavisnosti od toga koji gas se kontroliše u njemu. Postoje i kombinovani inkubatori (Freshney, 2005) Invertni svetlosni mikroskop Jedno od najvažnijih tehniĉkih sredstava za prouĉavanje ćelijske strukture je mikroskop. U laboratoriji se za brojanje ćelija i posmatranje obojenih preparata i struktura, koristi svetlosni mikroskop. Uz pomoć njega možemo posmatrati žive ćelije bez bojenja, ali i pratiti njihovu aktivnost. Invertni svetlosni mikroskop (Slika 4) ima opciju posmatranja pod faznim kontrastom ( 15

24 Slika 4. Invertni svetlosni mikroskop ( Vodeno kupatilo Vodeno kupatilo je potrebno u ćelijskoj kulturi kako bi se u njemu grejali medijum i drugi reagensi koji se koriste u radu sa ćelijama. Topla voda u vodenom kupatilu je idealna sredina za rast mikroorganizama i drugih kontaminanata. Stoga se vodeno kupatilo mora ĉistiti redovno, a voda se mora menjati novom, svežom destilovanom vodom ( 16

25 4.3. METODOLOGIJA RADA SA ĆELIJAMA Odabir i priprema životinja za uzimanje masnog tkiva Eksperimentalne životinje se rutinski koriste u funkciji screening -a izvodljivosti hirurških tehnika. U raznim nauĉnim oblastima postoje životinjski modeli koji pokazuju sliĉnost sa ljudskim fiziološkim uslovima i bolestima. Za razliku od studija in vitro, eksperimenti na životinjama su praktiĉniji. Eksperimentalne životinje se dele u dve grupe: Male eksperimentalne životinje (miševi i pacovi) Velike eksperimentalne životinje (kunići, majmuni, psi, ovce) (Vuĉković, 2013) Animalni model Animalni modeli su neophodni za biomedicinska istraživanja. Koriste se od poĉetka nauĉnih otkrića i još uvek imaju veliki doprinos u razumevanju funkcija individualnih gena, mehanizama razliĉitih bolesti kao i efekata i toksiĉnosti razliĉitih lekova i hemikalija. U eksperimentu su za ovaj master rad korišćeni miševi Balb/c soja muškog pola, starosti 8-10 nedelja (Slika 5). Istraživanja pokazuju da su miševi najpogodnije laboratorijske životinje, a Balb/c miševi svakako spadaju u grupu najrasprostranjenijih sojeva. Miševi su, kao i pacovi, jeftini za uzgoj i održavanje. Brzo se razmnožavaju i na taj naĉin omogućavaju istraživaĉima da prouĉavaju funkciju odreċenih gena kroz nekoliko generacija potomaka u relativno kratkom vremenskom periodu. Balb/c je albino, imunodeficijentna linija miševa sa minimalnim varijacijama u težini izmeċu mužjaka i ženki, a uzgajaju se lako. Prednost im je što je incidenca tumora mleĉne žlezde kod njih niska, ali su jako ostetljivi na karcinogene i mogu se razviti tumori pluća, retikularne 17

26 neoplazme i tumori bubrega. Balb/c miševi se koriste ĉesto u studijama gde se radi nokaut gena (neki od gena se uĉini nefunkcionalnim). ( Mice-and-Rats.html). Slika 5. Miševi soja Balb/c ( Uzimanje masnog tkiva i izdvajanje ćelija iz njega Prve metode za izolaciju ćelija iz masnog tkiva upotrebili su Rodbell i Jones godine koristeći masno tkivo pacova. Sadašnje metode za izolaciju ADSCs se baziraju na digestiji kolagenazom nakon koje sledi centrifugiranje i odvajanje ćelija stromalne vaskularne frakcije od primarnih adipocita (Tremp et al., 2011). Supraepididimalno masno tkivo Balb/c soja miševa muškog pola je prvo isprano PBSom, izolovano priborom za disekciju, a potom izmacerirano. Tkivo je digestovano kolagenazom tipa I, u vodenom kupatilu, na 37 C, u trajanju od jednog sata. Nakon digestije tkivo je filtrirano kroz sito pora 100 µm i centrifugirano na 1000 rpm. Supernatant koji sadrži zrele adipocte je aspiriran, a talog je oznaĉen kao stromalna vaskularna frakcija (Najdanović et al., 2015; Cvetković et al., 2015). 18

27 Priprema ćelija za kultivaciju SVF je resuspendovana u medijumu za kultivaciju ćelija, pa zasejana u sterilne flaskove. Na kraju su flaskovi sa ćelijama ubaĉeni u inkubator podešen na temperaturu od 37ºC i sa 5% CO 2. Nakon 24h od izolacije, medijum je promenjen kako bi se uklonile neadherentne ćelije, eritrociti i kapljice masti, dok su adherentne ćelije bile potencijalne ADSCs (Najdanović et al., 2015; Cvetković et al., 2015) SaĊenje i kultivacija ćelija Izolovana stromalna vaskularna frakcija zasejana je u flaskove zapremine 25 cm 3. Ćelije su gajene u hranljivom medijumu za kultivaciju ćelija, DMEM-u sa 10% FBS-a (PAA Laboratories), dodatkom L-glutamina (PAA Laboratories) i 100 IU penicillin-streptomicina (Peniciline/Steptomicine PAA Laboratories). Posle 24h zasejan je i supernatant inicijalnog flaska. Ćelije su tokom našeg eksperimenta pet puta pasažirane (Najdanović et al., 2015; Cvetković et al., 2015). U cilju održavanja ćelijske kulture izolovanih ćelija, medijum je menjan na svaka dva do ĉetiri dana. ADSCs su pasažirane kada su ćelije postigle konfluentnost od 70-80%. Broj i vijabilnost su odreċene bojenjem Trypan blue dye exclusion (TBE) metodom (Najdanović et al., 2015; Cvetković et al., 2015) Tripan plavo Tripan plavo (engl. Trypan blue) je boja koja se koristi za selektivno bojenje prilikom rada sa ćelijskim kulturama. Kako bismo podesili broj ćelija u suspenziji na željenu gustinu za zasejavanje u flask ili bunarĉiće ploĉe za kultivaciju, potrebno je znati njihov broj u 1 ml (Stojanović, 2012). S obzirom na selektivnu propustljivost ćelijske membrane, prilikom bojenja 19

28 tripan plavim ne dolazi do bojenja živih ćelija. MeĊutim, kod mrtvih ćelija je narušen integritet membrane, boja ulazi u ćelije i na taj naĉin ih boji pa se pod mikroskopom vide kao plavo obojene. Boja Tripan plavo nosi ovaj naziv zbog svoje sposobnosti da ubija tripanozome, parazite koji izazivaju bolest spavanja ( Bojenje Tripan plavim omogućava precizno brojanje ćelija, a pre posmatranja pod mikroskopom, boju i sadržaj sa ćelijama je potrebno mešati o odnosu 1:1, a nakon toga naneti na ploĉicu (Stojanović, 2012) Pasažiranje kultura Proces supkultivacije ćelija naziva se pasaža ćelija. Prilikom pasaže u flaskove se presaċuje manji broj ćelija zahvaljujući ĉemu im se obezbeċuju resursi za deobu i rast. Ponekad je potrebno odložiti ćelije za dalju upotrebu. To se radi zamrzavanjem u teĉnom azotu, a ćelije se odlažu u kriovajle sa specijalno napravljenim medijumom za zamrzavanje Freezing medijumom. Ovaj medijum osim DMEM-a, FCS-a i antibiotika, sadrži i dimetil sulfoksid (DMSO) sa funkcijom antifriza, što spreĉava formiranje kristalića leda koji mogu razoriti ćelije. Odmrzavanje ćelija iz teĉnog azota podrazumeva prethodnu pripremu kako bi ćelije mogle da se ožive iz stanja dubokog zamrzavanja, a potom i koriste u daljem radu Mikroskopska analiza živih kultura Morfološke promene kultivisanih ćelija su praćene pomoću invertnog svetlosnog mikroskopa, pod faznim kontrastom (Observer Z1, Carl Zeiss, Germany). Ćelije su fotografisane korišćenjem pripadajuće kamere AxioCam HR (Carl Zeiss, Germany) i softvera (Axiovision, Carl Zeiss, Germany). 20

29 Bojenje kultura Metoda bojenja May-Grunwald-Giemsa se koristi u morfološkom ispitivanju i diferencijalnom brojanju krvnih ćelija. Ova metoda kombinuje efekat kiselog eozina i baznog metilen plavog. Bojenjem Gimzom se stvara azurna boja. Ovim bojenjem se boje sve ćelijske komponente. Jedan od najvažnijih faktora u bojenju je ph, tako da bilo kakva promena dovodi do pogrešne reakcije bojenja. Granice najpogodnije ph su izmedju 6.5 i 6.8. Bojiti osušene uzorke ćelija radnim rastvorom May Grunwalda tokom 5 minuta Isprati vodom Bojiti radnim rastvorom Gimze tokom 15 minuta Isprati vodom Sušiti preparate u uspravnom položaju na sobnoj temperaturi Pokrovno staklo postaviti preko uzorka namontirati preparate pomoću Kanada balsama Radni rastvor Gimze dobija se rastvaranjem 5 ml ove boje u 50 ml destilovane vode. Kisele komponente u ćelijama se boje metilen plavim u plavo, bazne eozinom narandžasto, a osnovne ćelijske komponente azurom u crveno i ljubiĉasto. Bojene su ćelije iz inicijalnog flaska nakon prvog pasaža i ćelije zasejane iz supernatanta prvog flaska koje su takoċe jednom pasažirane Mikroskopska analiza obojenih kultura Ćelije obojene May Grunwald-Giemsa metodom posmatrane su pod invertnim svetlosnim mikroskopom (Observer Z1, Carl Zeiss, Germany), korišćenjem opcije svetlo polje (engl. bright field, BF). 21

30 5. REZULTATI Posle 24 ĉasovne kultivacije ćelija stromalne vaskularne frakcije, u kulturi su uoĉene uglavnom sitne, pojedinaĉne ćelije, ĉija je morfologija bila nalik fibroblastima (Slika 6). Pored toga, u medijumu su se nalazile i kapljice masti, eritrociti i mrtve, neadherirane ćelije (Slika 6A). Drugog dana od izolacije ćelija, dobro adherirane fibroblastolike ćelije su se delile tako da su nakon deobe formirale strukture nalik na fokuse (Slika 6B). Slika 6: A) ADSCs 24 h po izolaciji, 100x, fazni kontrast; B) ADSCs 72 h po izolaciji, 100x, fazni kontrast Pet dana nakon izolacije, osim fibroblastolikih uoĉene su i epitelolike ćelije. Ćelije nalik epitelnim su rasle tako da su formirale strukture koje su imale izgled epitelnih ploĉa (Slika 7A). Ove ćelije su podvrgnute prvom pasažu (P01) jer je pokrivenost dna flaska ćelija tj. konfluentnost ćelija tada bila oko 80%. Jedan dan nakon prve pasaže, fibroblastolike, potencijalno mezenhimske ćelije, zadržale su proliferativnu moć. Kapljice masti, eritrociti i neadherentni tipovi ćelija su potpuno odstranjeni (Slika 7B). 22

31 Slika 7: A) ADSCs 5. dan od izolacije, 100x fazni kontrast; B) ADSCs I pasaž, 1.dan, 100x fazni kontrast Kada su ćelije iz ovih flaskova bile supkonfluentne, pasažirane su po drugi put (P02) (Slika 8A). Nakon drugog pasaža, fibroblastolike ćelije su rasle u snopovima, bile su krupnije i izduženije no nakon prethodnog pasaža kao i nakon izolacije (Slika 8B). Slika 8: A) ADSCs I pasaž, 2.dan, 100x, fazni kontrast; B) ADSCs II pasaž, 5.dan, 100x, fazni kontrast 23

32 Morfologija ćelija održana je i nakon trećeg pasaža (P03) (Slika 9A). Ćelije nalik na epitelne su mogle biti uoĉene samo na retkim mestima, što bi znaĉilo da su supkultivacijom odstranjene mikrovaskularne endotelske ćelije (Slika 9B). TakoĊe je zapaženo da je nakon trećeg pasaža proliferativna moć ovih ćelija bila maksimalna. Slika 9: A) ADSCs III pasaž, 1.dan, 100x, fazni kontrast; B) ADSCs III pasaž, 7.dan, 100x, fazni kontrast Nakon ĉetvrtog pasaža (P04), ćelije su se delile sporije. Osim fibroblastolikih ćelija, nakon P04, zapažene su i ćelije izmenjene morfologije (Slika 10A). Ove ćelije imale su krpast izgled i duge produžetke ćelijske membrane koje su nalikovale lamelipodijama (Slika 10B). Slika 10: A) ADSCs IV pasaž, 1.dan, 100x, fazni kontrast; B) ADSCs IV pasaž, 5.dan, 100x, fazni kontrast 24

33 Nakon petog pasaža bilo je krupnih, višejedarnih ćelija, sa lamelipodiĉnim nastavcima, ali je najveći broj ćelija ušao u apoptozu (Slike 11A i 11B). Slika 11: A) ADSCs V pasaž, 1.dan, 100x fazni kontrast; B) ADSCs V pasaž, 3.dan, 100x, fazni kontrast Adherirane ćelije zasejane iz supernatanta inicijalnog flaska su nakon 24h kultivacije bile uglavnom epitelolike, a fibroblastolike ćelije su bile pojedinaĉne i retke (Slika 12A). Neadherirane ćelije u klampovima su plivale u medijumu (Slika 12A). Epitelolike ćelije su se delile intenzivno, pa su se ĉetiri dana nakon zasejavanja grupisale formirajući strukture koje su podsećale na epitelne ploĉe (Slika 12B). 25

34 Slika 12: A) ADSCs 24 h od zasejavanja iz supernatanta, 100x, fazni kontrast; B) ADSCs 4 dana od od zasejavanja iz supernatanta, 100x, fazni kontrast Sedmog dana od zasejavanja, ADSCs iz supernatanta su postigle punu konfluentnost (Slika 13A) te su pasažirane. Jedan dan posle prve pasaže, i epitelolike i fibroblastolike ćelije su bile retke (Slika 13B). Slika 13: A) ADSCs 7 dana od od zasejavanja iz supernatanta, 100x, fazni kontrast; B) ADSCs 24h od prvog pasaža supernatanta, 100x, fazni kontrast 26

35 Proliferativna moć ćelija iz supernatanta održana je do sedmog dana nakon prve pasaže, kada je izvestan broj ćelija ušao u apoptozu (Slika 14A). Do ĉetrnaestog dana posle P01, ćelije iz supernatanta su ili postale krpaste ili podlegle apoptozi (Slika 14B). Slika 14: A) ADSCs 7 dana od prvog pasaža supernatanta, 100x, fazni kontrast; B) ADSCs 14 dana od prvog pasaža supernatanta, 100x, fazni kontrast Nakon May-Grunwald-Gimsa bojenja, potvrċene su morfološke razlike izmeċu ćelija kultivisanih u inicijalnom flasku i ćelija kultivisanih iz supernatanta (slike 15A i 15B). Slika 15: A) ADSCs, 1 dan od prvog pasaža supernatanta, bojenje MGG, 100x, BF; B) ADSCs 1 dan od prvog pasaža inicijalnog flaska, bojenje MGG, 100x, BF 27

36 6. DISKUSIJA Izolacija, kultivacija kao i naĉin pripreme mezenhimskih ćelija masnog tkiva kljuĉni su za njihovu primenu u terapijske svrhe. ADSCs su danas od znaĉaja u pretkliniĉkim istraživanjima, a takoċe imaju i veliku komercijalnu primenu (Bourin et al., 2013). Kliniĉku primenu imaju od godine u leĉenju nekoliko bolesti (Van Pham et al., 2014). Masno tkivo atraktivnim ĉine relativno jednostavan postupak izolacije, gajenja i umnožavanja, ali i potencijal diferencijacije u razliĉite tipove ćelija in vitro (Minguell et al., 2001). Veliki broj radova bavi se ispitivanjem potencijalne primene sveže izolovanih (Pak et al., 2013) ili kultivisanih ADSCs (Najdanović et al., 2015; Cvetković et al., 2015) u terapijske svrhe. Ukoliko je primena kultivisanih ADSCs metoda izbora, od znaĉaja je ispitivanje na temu uticaja uslova kultivacije na morfologiju i fenotip ADSCs. Važno je koliko dugo i kroz koliko pasaža kultivisati ove ćelije, a da one zadrže fenotip mezenhimskih ćelija. Imajući u vidu znaĉaj ovog tipa pretkliniĉkih istraživanja, cilj našeg rada je bilo ispitivanje uslova za in vitro kultivaciju i propagaciju mezenhimskih matiĉnih ćelija iz masnog tkiva koje okružuje epididimis miša. ADSCs mogu biti izolovane iz miševa mehaniĉkim i enzimskim putem, što se pokazalo kao pouzdan i efektan metod (Luna et al., 2014). U našem eksperimentu korišćena je enzimska digestija masnog tkiva kolagenazom. Izbor odreċenog soja miša kao i tkiva koje bi bilo izvor matiĉnih ćelija, od kljuĉnog su znaĉaja za eksperimentalnu primenu MSCs (Sung et al., 2008). U zavisnosti od lokalizacije masnog tkiva, kao i pola životinje, postoje varijacije u metaboliĉkoj aktivnosti, ali i u sposobnosti tj. kapacitetu diferencijacije (Tholpady et al., 2006). Naš izbor bili su mladi Balb/c miševi, starosti 8-10 nedelja i masno tkivo koje okružuje epididimise ovih miševa. Nakon zasejavanja ćelija stromalne vaskularne frakcije, ćelije koje adheriraju za dno flaskova se izdužuju i imaju fibroblastolik izgled (Bourin et al., 2013). U našem radu, sveže izolovane ćelije su bile takoċe nalik fibroblastima, adherirale su za plastiku u ćelijskoj kulturi i brzo su se delile. Na osnovu toga, moglo bi se zakljuĉiti da su ostvareni dobri poĉetni uslovi za kultivaciju ćelija. Budući da je SVF sadržala i populacije ćelija, poput hematopoetskih, koje nisu adherirale za plastiku u kulturi, kulture smo ispiranjima i kroz supkultivacije (pasaže) preĉistili 28

37 od ovakvih tipova ćelija. Prema Bourinu i njegovim saradnicima, na ovaj naĉin se favorizuje rast mezenhimskih ćelija iz SVF-a (Bourin et al., 2013). Adherentne ćelije dobijene iz masnog tkiva zadržale su fibroblastni fenotip i proliferativnu moć u periodu od prve do treće pasaže. Iz tih razloga, ove ćelije mogu se dalje koristiti za diferencijaciju u razliĉite tipove ćelija, ali i kultivisati bez dodavanja induktivnih faktora za diferenciju ka razliĉitim ćelijskim linijama. Basu i saradnici su ćelije SVF-a bez podvrgavanju pasažama kultivisali u standardnom hranljivom medijumu koji nije sadržao citokine i faktore rasta za usmeravanje ćelija ka odreċenoj ćelijskoj liniji. Ćelije umnožavane pod ovakvim uslovima su opisane kao glatkomišićne ćelije poreklom iz masnog tkiva i subpopulacija su ćelija adipozne stromalne vaskularne frakcije, koja se razlikuje od drugih tipova ćelija koje mogu biti izolovane iz masnog tkiva (Basu et al., 2011). Poĉevši od ĉetvrte pasaže, ADSCs su poĉele da se morfološki menjaju. Ove ćelije su se spljoštavale i obrazovale produžetke ćelijske membrane nalik na lamelipodije. Posle pete pasaže, ćelije više nisu imale izgled mezenhimskih, dok je krupne ćelije sa lamelipodiĉnim nastavcima bilo teško odvojiti od podloge. Ćelije koje su se zalepile za plastiku u ćelijskoj kulturi posle poslednjeg pasaža u eksperimentu su ušle u apoptozu. Ćelije koje su dobijene iz supernatanta inicijalnih flaskova su bile epitelolike i verovatno su pripadale mikrovaskularnoj endotelskoj frakciji SVF-a. Njihova proliferativna moć bila je ograniĉena na period od dve nedelje posle prve pasaže. Moglo bi se zakljuĉiti da ćelije supernatanta nisu pogodan model za kultivaciju i dalju potencijalnu primenu jer meċu njima je bilo malo ćelija ĉiji fenotip odgovara mezenhimskim ćelijama. 29

38 7. ZAKLJUĈAK Na osnovu rezultata koje smo dobili praćenjem morfoloških promena ADSCs kultivisanih iz inicijalnog flaska i ADSCs dobijenih iz supernatanta inicijalnog flaska, izvedeni su sledeći zakljuĉci: 1. Fibroblastolike ćelije iz stromalne vaskularne frakcije pokazale su dobru adherenciju za plastiku u ćelijskoj kulturi i oĉuvale su proliferativnu moć do ĉetvrte pasaže. 2. Fibroblastni fenotip ćelija gubi se tokom in vitro propagacije nakon ĉetvrte pasaže, kada se ćelije spljoštavaju, dobijaju lamelipodiĉne nastavke i ulaze u apoptozu. 3. Epitelolike ćelije dobijene iz supernatanta inicijalnih flaskova imaju ograniĉenu proliferativnu moć do perioda nakon prve pasaže, te nisu pogodan model za kultivaciju i nemaju potencijalnu primenu u regenerativnoj medicini. 4. ADSCs kultivisane i propagirane kroz manji broj pasaža (P01-P03) mogu imati potencijalnu terapijsku primenu. 30

39 8. LITERATURA Barba M., Cicione C., Bernardini C., Michetti F., Lattanzi W., 2013: Adipose-Derived Mesenchymal Cells for Bone Regeneration: State of the Art BioMed Research International Basu J., et al., 2011: Expansion of the human adipose-derived stromal vascular cell fraction yields a population of smooth muscle-like cells with markedly distinct phenotypic and functional properties relative to mesenchymal stem cells - Tissue Eng Part C Methods. 17(8): Bobis, S., Jarocha, D., Majka, M., 2006: Mesenchymal stem cells: characteristic and clinical applications. World Journal of Stem Cells 44: Bourin P., et al. 2013: Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: A joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy 15: Cvetković J. V., Najdanović G. J., Vukelić-Nikolić Đ. M., Stojanović S., Najman J. S., 2015: Osteogenic potential of in vitro osteo-induced adipose-derived mesenchymal stem cells combined with platelet-rich plasma in an ectopic model - International Orthopaedics 39(11): , DOI /s x. Fontijn R. D., et al., 2014: Adipose tissue-derived stromal cells acquire endothelial-like features upon reprogramming with SOX18 Stem Cell Research (13): Freshney R. I., Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications, 6 th edition Gimble J., Guilak F., 2003: Adipose-derived adult stem cells: isolation, characterization and differentiation potential - Cytotherapy 5: Junquieira, L. C., Carneiro, J., 2005: Osnovi histologije. Data status, Beograd. Langer R., Vacanti J. P., 1993: Tissue engineering - Science 260(5110):

40 Luna et al., 2014: Characterization of adipose-derived stem cells of anatomical region from mice - BMC Research Notes 7:552 Minguell J. J., Erices A., Conget P., 2001: Mesenchymal stem cells Exp Biol Med 226(6): Najdanović G. J., et al., 2015: The Influence of Adipose-Derived Stem Cells Induced into Endothelial Cells on Ectopic Vasculogenesis and Osteogenesis - Cellular and Molecular Bioengineering 8(4): , DOI /s x. Nikolić, R. I., et al., 2007: Embriologija ĉoveka. Data status, Beograd. Ogawa R., 2006: The Importance of Adipose-Derived Stem Cells and Vascularized Tissue Regeneration in the Field of Tissue Transplantation - Current Stem Cell Research & Therapy 1:13-20 Pak J., Chang J. J., Lee J. H., Lee S. H., 2013: Safety reporting on implantation of autologous adipose tissue-derived stem cells with platelet-rich plasma into human articular joints - BMC Musculoskelet Disord 14:337 Sandhaanam S. D., Pathalam G., Dorairaj S., Savariar V., 2013: Mesenchymal stem cells (MSC): Identification, Proliferation and Differentiation A Review Article Stojanović V., 2012: Efekti ekstrakata kantariona (Hypericum perforatum L.) na vijabilnost i proliferaciju HeLa ćelija in vitro, Master thesis, Niš Sung J. H., et al., 2008: Isolation and characterization of mouse mesenchymal stem cells - Transplant Proc. 40(8): Tap H., et al., 2009: Adipose-Derived Stem Cells: Characterization and Current Aplication in Orthopedic Tissue Repair - Exp Biol. Med 234: 1-9 Tholpady S. S.,et al., 2006: Adipose tissue: stem cells and beyond Clin Plast Surg 33(1): Torio-Padron N., Huotari A.M., Eisenhardt S. U., Borges J., Stark G. B., 2010: Comparison of pre-adipocyte yield, growth and differentiation characteristics from excised versus aspirated adipose tissue Cells Tissues Organs 191(5):

41 Tremp M., Salemi S., Gobet R., Sulser T., Eberli D., 2011: Adipose-Derived Stem Cells (ASCs) for Tissue Engineering - Regenerative Medicine and Tissue Engineering, Cells and Biomaterials Van Pham P., Kim Phan N., 2014: Production of Good Manufacturing Practice-Grade Human Umbilical Cord Blood-Derived Mesenchymal Stem Cells for Therapeutic Use - Methods in molecular biology (Clifton, NJ) /7651_2014_125. Vuĉković A. I., 2013: Regenerativni potencijal masnog tkiva u nadoknadi defekata kostiju na eksperimentalnom modelu kalvarije kunića, PhD Dissertation Medicinski fakultet, Univerzitet u Nišu Wang, S., Qu, X., Zhao, Ch. R., 2012: Clinical applications of mesenchymal stem cells - Journal of Hematology & Oncology 5:19 Zuk P. A., et al., 2002: Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells Mol Biol Cell 13(12): Monolayers%20Using%20Trypsin.pdf gate.net/file.postfileloader.html%3fid%3d5485e0f3d039b16a2e8b462e%26assetkey% 3DAS%253A % &cd=1&hl=en&ct=clnk&gl=rs