Microsoft Word GEENIUS HIV 1-2 CONFIRMATORY ASSAY (883601) CROATE.doc

Транскрипт

1 Geenius HIV 1/2 Confirmatory Assay KVALITATIVNI TEST ZA POTVRDU I DIFERENCIJACIJU POJEDINAČNIH ANTITIJELA ZA HIV-1 I HIV-2 U UZORCIMA KRVI, SERUMA ILI PLAZME /01

2 Sadržaj 1. NAMJENA SAŽETAK I OBJAŠNJENJE TESTA NAČELA POSTUPKA REAGENSI UPOZORENJA I MJERE OPREZA UZORCI PROCEDURA OGRANIČENJE TESTA KARAKTERISTIKE PERFORMANSI BIBLIOGRAFSKE REFERENCE

3 1. NAMJENA Bio-Rad Geenius HIV 1/2 Confirmatory Assay je jednokratni imunokromatografski test za potvrdu i diferencijaciju pojedinačnih antitijela na virus humane imunodeficijencije tipa 1 i 2 (HIV-1 i HIV-2) iz krvi izvađene iz vrha prsta, venske krvi te uzoraka seruma ili plazme. Namjena Geenius HIV 1/2 Confirmatory Assay je koristiti ga kao dodatni test za potvrdu postojanja antitijela za HIV-1 i HIV-2 u uzorcima koji su uzastopno reaktivni u postupcima probira. 2. SAŽETAK I OBJAŠNJENJE TESTA Otkriven godine, virus humane imunodeficijencije (HIV) je retrovirus identificiran kao etiološki agens za Sindrom stečene imunodeficijencije (Acquired Immunodeficiency Syndrome - AIDS). AIDS karakteriziraju promjene u količini T limfocita, koji igraju ključnu ulogu u obrani imunog sustava. Kod zaraženih pojedinaca, virus izaziva smanjenje subpopulacije T limfocita, koji se nazivaju T-pomagački limfociti, što ove oboljele čini podložnim oportunističkim infekcijama i određenim zloćudnim bolestima. Najčešći način prijenosa je seksualnim kontaktom, krvlju ili krvnih pripravaka te prijenos s majke na dijete tijekom trudnoće, poroda ili dojenja. Na kraju godine diljem svijeta otprilike 24 milijuna ljudi živjelo je s HIV-om/AIDS-om, što je povećanje od 17% od godine. U bilo je 2,7 milijuna [ ] novo zaraženih HIV-om uključujući i procijenjenih [ ] djece. Što je 15% manje nego u 2001., a 21% ispod broja novo zaraženih kad je epidemija bila na vrhuncu godine. Dok se virus HIV-a sastoji od genomske RNA molekule zaštićene kapsidom i ovojnicom, HIV omotnica je glavna meta humoralne imunoške reakcije. Prisutnost virusa kod oboljelih izaziva imuni sustav na proizvodu HIV antitijela. Otkrivanje ovih antitijela može se koristiti kao dijagnostičko sredstvo. Geenius HIV 1/2 Confirmatory Assay je brzi imunokromatografski test, jednostavan i lak za uporabu. Geenius HIV 1/2 Confirmatory Assay koristi imobilizirane antigene za otkrivanje HIV antitijela u uzorcima seruma, plazme i krvi. 3. NAČELA POSTUPKA Geenius HIV 1/2 Confirmatory Assay aktivira vezujući protein A antitijela, koji je konjugirana na čestice boje koloidnog zlata kao konjugata, a HIV-1 (p31, gp160, p24, gp41) i HIV-2 antigeni gp36, gp140), ograničeni su membranom čvrste faze. Uzorak je primijenjen na otvor SAMPLE + BUFFER. Nakon što se uzorak i pufer prebace na testu traku, dodatni pufer je dodan na otvor za BUFFER. Pufer olakšava lateralni tijek oslobođenih produkata i omogućuje vezivanje antitijela na antigene. Kod reaktivnog uzorka, antigeni su uhvatili anit-hiv anitijela imobilizirana u TEST području (polja 1 do 6): koloidni zlatni protein A veže se za uhvaćena antitijela, stvarajući ružičaste/ljubičaste crte. Kad su HIV antitijela odsutna, tada nema ružičastih/ljubičastih crta u TEST području. U oba slučaja testni uzorak pomiče se uzduž membrane i stvara ružičaste/ljubičaste crte u području CONTROL (C) gdje se imobilizira protein A. Imunoglobulin G iz uzorka veže se na protein A, koji je imobiliziran u (C) zoni membrane čvrste faze i stvara ružičaste/ljubičaste crte. Kontrolna crta služi kao ilustracija da su uzorak i reagens ispravno primijenjeni i da se pomiču kroz uređaj. 1

4 Kaseta Geenius HIV 1/2 Confirmatory Assay sadrži kontrolni pojas (C) i šest (6) testnih crta koje su označene brojem na kaseti koji odgovara sljedećem: Pojas 1: gp36 (HIV-2, peptidna ovojnica) HIV- 1 ENV Pojas 2: gp140 (HIV-2, ovojnica peptida) HIV- 1 ENV Pojas 3: p31 (HIV- 1, polimeraza peptida) HIV-1 POL Pojas 4: gp160 (HIV-1, ovojnica rekombiniranog proteina) HIV- 1 ENV Pojas 5: p24 (HIV-1, jezgra rekombiniranog proteina) HIV-1 GAG Pojas 6: gp41 (grupa M i O) (HIV-1, ovojnica peptida) HIV- 1 ENV CTRL pojas: Protein A 4. REAGENSI 4.1 Opis Tekst na oznaci Opis Prezentacija Device Nitrocelulozna membrana sadrži HIV-1 i HIV-2 antigene u TEST području, protein A u CONTROL području i koloidni zlatni protein A u području otvora BUFFER. 20 x 1 Spremno uporabu Buffer Kapaljka pufera sa sredstvom zaštite (natrijev azid < 1 x 5 ml 0.1%, gentamicin sulfat 0.125%, streptomicin sulfat Spremno 0.125%) uporabu Microtubes 15 µl 15 µl Mikroepruvete plastične kapilarne pipete (ne antikoagulant, 1 x 20 za protokol vađenja krvi iz prsta) Spremno uporabu za za za 4.2 Skladištenje i rukovanje Geenius HIV 1/2 Confirmatory Assay (uređaj i pufer) treba se čuvati na temperaturi od 2 C do 30 C, do isteka roka trajanja naznačenog na kompletu. Ne zamrzavati. Ne otvarajte vrećicu dok sve dok ne budete vršili testiranje. Pufer je stabilan do datuma isteka roka trajanja nakon prve rutinske uporabe. 2

5 5. UPOZORENJA I MJERE OPREZA Za in vitro dijagnostiku. Za profesionalnu liječničku uporabu Mjere zdravlja i sigurnosti: Testnim kompletom treba rukovati samo osoblje s odgovarajućom obukom. Nosite odgovarajuću zaštitnu odjeću, naočale te zaštitu za oči/lice te rukujte na odgovarajući način s potrebnom primjenom dobre laboratorijske prakse. Testni komplet sadrži sastojke ljudske krvi. Niti jedna poznata metoda testiranja ne može ponuditi potpunu sigurnost kad je riječ o nepostojanju agensa infekcije. Zato se svi derivati ljudske krivi, reagensi i ljudski uzorci trebaju se tretirati kao da mogu prenijeti zarazne bolesti, te slijediti preporučene mjere opreza definirane od strane lokalnih, regionalnih i nacionalnih organa vlasti. Proliveni biološki materijali: Proliveni ljudski polazni materijal treba se tretirati kao potencijalno zarazan. Proliveni sadržaji koji ne sadrže kiseline treba odmah dekontaminirati, uključujući i mjesto na kojem su proliveni, kao i kontaminirano površinu i opremu, s odgovarajućim kemijskim dezinficijensom koji je učinkovit protiv potencijalnih biološki opasnih tvari na temelju vrste prolivenih uzoraka (obično 1:10 razrijeđeni kućni izbjeljivač, 70-80% etanol ili isopropanol, iodofor [kao npr. 0,05% Wescodyne Plus, itd.) te dobro obrisati. NAPOMENA: Ne stavljajte otopinu koja sadrži izbjeljivač u autoklav Sve uzorke i materijale korištene prilikom izvođenja testa zbrinite na odgovarajući način, jer mogu sadržavati zarazni agens. S laboratorijskim, kemijskim ili biološki opasnim otpadom mora se rukovati i zbrinuti ga u skladu s lokalnim, regionalnim i nacionalnim zakonima. Za preporuke o rizicima i mjerama opreza povezanim s nekim kemijskim spojevima u ovom testnom kompletu, molimo pogledajte piktogram(e) na naljepnici te dostavljene informacije na kraju uputa za upotrebu. Sigurnosno-tehnički list dostupan je na Mjere opreza povezane s procedurom Priprema Pročitajte ove upute u potpunosti prije korištenja testa. Pažljivo se pridržavajte uputa neće biti neispravnih rezultata testa. Korištenje ovog kompleta za testiranje s tipovima uzoraka različitim od onih koji su izričito odobreni za uporabu s ovim uređajem može dovesti to netočnih rezultata. Ovaj test treba se vršiti pri temperaturi od 18 C do 30 C. Ako se čuva u hladnjaku, prije uporabe treba pričekati barem 30 minuta kako bi se reagensi stabilizirali na sobnoj temperaturi. NE KORISTITE uređaj za testiranje ako nema pakiranja desikanta u vrećici uređaja. Uklonite uređaj za testiranje i koristite novi uređaj iz vrećice koja sadrži desikant. NE KORISTITE uređaj za testiranje ako je vrećica uređaja oštećena. Svaki uređaj za testiranje namijenjen je jednoj uporabi. Ne koristite uređaj za testiranje ili komplet reagensa nakon isteka roka trajanja. Prije testiranja uvijek provjerite rok trajanja. Ne miješajte reagense iz različitih grupa brojeva kompleta. 3

6 Odgovarajuća rasvjeta je potrebna prilikom očitavanja rezultata testa. Ako se komplet za testiranje čuva na temperaturama izvan raspona temperature za čuvanje od 2 C do 30 C, ili izvan raspona radne temperature od 18 C do 30 C, koristite Geenius HIV 1/2 Confirmatory Controls, ref: 72329, kako bi se osiguralo ispravno provođenje testa Obrada Nakon što je zatvorena vrećica otvorena, uređaj se mora koristiti u roku od 60 min. Ne mijenjajte proceduru testa. 6. UZORCI Geenius HIV 1/2 Confirmatory Assay može se izvršiti na venskoj ili krvi izvađenoj iz prsta, uzorcima seruma ili plazme Tipovi uzoraka Venska krv Izvadite krv pridržavajući se laboratorijske procedure za vađenje venske krvi. Prikupite uzorak u epruveti koja sadrži citrat, heparin ili EDTA. Provjerite kako je krv u epruveti dobro izmiješana prije ispitivanja. Koristite laboratorijsku pipetu za izvlačenje 15 µl krvi. Odmah testirajte, pridržavajući se uputa navedenih u testnoj proceduri. Krv izvađena iz vrha prsta Očistite prst osobe koja će se testirati s antiseptičkom maramicom. Neka se prst potpuno osuši ili ga obrišite sa sterilnom gazom. Koristite sterilnu lancetu, ubodite u kožu malo dalje od središta vrha prsta i obrišite prvu kap sterilnom gazom te izbjegavajte stiskanje vrha prsta za ubrzavanje krvarenja jer to može razrijediti krv viškom tkivne tekućine. Prikupite 15 µl za uzorak iz druge kapi dodirivanjem pipete mikroepruvete za jednokratnu uporabu tako da se pipeta potpuno napuni krvlju iz te kapi, slijedite donju proceduru. Odmah testirajte, pridržavajući se uputa navedenih u testnoj proceduri. Serum ili plazma Izvadite krv pridržavajući se laboratorijske procedure za prikupljanje uzoraka seruma ili plazme. Prikupite uzorke seruma u epruvete koje sadržavaju agens za zgrušavanje koji ne sadrže antikoagulant (serum). Prikupite uzorak plazme u epruveti koja sadrži citrat, heparin ili EDTA antikoagulante. Uzorak prikupite u čisti spremnik pridržavajući se standardnih laboratorijskih procedura. Provjerite kako su serum ili plazma u epruveti dobro izmiješani prije ispitivanja. Koristite laboratorijsku pipetu za izvlačenje 5 µl uzorka. Odmah testirajte pridržavajući se uputa navedenih u testnoj proceduri Rukovanje uzorkom Krv izvađena iz vrha prsta treba se testirati odmah nakon vađenja. Venska krv, uzorci mogu se testirati odmah ili se čuvati na temperaturi od 2 C do 8 C najviše 3 dana nakon prikupljanja za potrebe testiranja. NE ZAMRZAVAJTE KRV Uzroci seruma i plazme mogu se testirati odmah ili se čuvati na temperaturi od 2 C do 8 C najviše 7 dana nakon prikupljanja za potrebe testiranja. Za dugotrajno čuvanje, uzorci seruma ili plazme trebaju se zamrznuti (na temperaturu od -20 C ili još nižu). Uzroci se ne bi smjeli koristiti ako su prošli više od 5 ciklusa zamrzavanja-odmrzavanja. Dobro i nježno promiješajte uzorke nakon odmrzavanja, i ostavite ih na sobnoj temperaturi. 4

7 Interferencija nije primijećena u uzrocima koji sadrže 200 mg/l bilirubina ili u limpemičnim uzorcima koji sadržavaju do 33 g/l trioleina ili kod hemolize uzoraka koji sadrže do 2 g/l hemoglobina. Abnormalno velika albuminemija ili proteinemija (120 g/l), također, nije pokazala nikakvu interferenciju Otprema uzorka Ako se uzorci trebaju otpremiti, treba ih pakirati u skladu s odredbama vezanih za prijevoz etioloških agensa. Venska krv, uzorci trebaju se otpremiti ohlađeni u hladnim pakiranjima ili s mokrim ledom. Uzroci seruma i plazme trebaju se otpremiti zamrznuti na suhom ledu. 7. PROCEDURA 7.1 Potrebni materijali Dostavljeni materijali Uređaj (20 jedinica), kapaljka pufera (1 X 5 ml) i mikroepruvete 15 µl (1 x 20) u jednom kompletu. Vidi 4.1 Opis. Potreban materijal dostavljen je zasebno Geenius HIV 1/2 Confirmatory Controls, ref: Potrebni materijal koji nije dostavljen Sat, štoperica ili drugi uređaj za mjerenje vremena. Pipetor koji može obuhvatiti 5 µl (seruma/plazme) i 15 µl (venske krvi) za uzorak. Rukavice za jednokratnu uporabu. Spremnici za odlaganje biološki opasnih tvari. 7.2 Priprema reagensa Svi elementi Geenius HIV 1/2 Confirmatory Assay dostavljeni su spremni za uporabu. 7.3 Postupak analize PROCEDURA za krv 1. Izvadite uređaj Geenius HIV 1/2 Confirmatory Assay iz vrećice i stavite ga na ravnu površinu (iz vrećice ne treba izvaditi i desikant). NAPOMENA: NE KORISTITE ako paket desikanta nedostaje iz vrećice. Uklonite uređaj za testiranje i koristite novi uređaj. Označite uređaj za testiranje s ID-em pacijenta ili identifikacijskim brojem (vidi sliku 1 dolje). Upamtite kako uređaj Geenius HIV 1/2 Confirmatory Assay ima šest (6) plavo obojenih crta u testnom području (ne plavih crta u kontrolnom području); ako bilo koja od tih 6 obojenih crta nedostaje NE KORISTITE ga. Uklonite uređaj za testiranje i koristite novi uređaj. Slika 1 5

8 Venska krv Vidi priprema uzorka u 6.1 Tipovi uzorka. Krv izvađena iz vrha prsta Vidi priprema uzorka u 6.1 Tipovi uzorka. Korak 1: Vodoravno držite 15µL mikroepruvetu i dodirnite kap krvi s njenim vrhom. Kapilarna aktivnost automatski će povući uzorak do potrebne razine napunjenosti i stati. Korak 2: Za izbacivanje uzroka, poravnajte vrh epruvete s ciljanim uzorkom i stisnite epruvetu. Ako uzorak ne izlazi, držite epruvetu uspravno i pređite prstom preko otvora. Zatim poravnajte vrh sa ciljanim uzorkom i stisnite epruvetu. 2. Ispustite 15 µl krvi u središte SAMPLE + BUFFER otvor 1 na uređaju (vidi sliku 2 dolje). Za vensku krv koristite laboratorijsku pipetu. Za krv izvađenu iz vrha prsta, pridržavajte se protokola za korištenje mikroepruvete 15 µl iz komplete (vidi korak 1 i 2 gore). 3 Odmah nakon uzimanja uzorka, uzmite kapaljku pufera i dodajte 2 kapi s pufera na SAMPLE + BUFFER otvor 1 (vidi sliku 3 dolje). Slika 2 Slika 3 6

9 4. Pričekajte 5-7 minuta 6 plavo obojenih TESTNIH crta treba nestati iz pravokutnog TEST područja. Ako ne nestanu, uklonite uređaj i ponovite postupak s novim uređajem za testiranje. NAPOMENA: Svijetla plavo-zelena boja može se zadržati na membrani, ali niti jedna obojena crta ne bi se trebala vidjeti u ovom trenutku. Slika 4 Koristite kapaljku pufera i dodajte 5 kapi na pufer (bijeli poklopac) na BUFFER otvor 2 (vidi sliku 4 dolje). 5. Očitajte rezultate testa 20 do 30 minuta nakon dodavanja pufera na BUFFER otvor 2. Rezultate nemojte očitavati ako je prošlo 30 minuta Rezultate očitavajte u dobro osvijetljenom prostoru. NAPOMENA: Uklonite korištene vrhove pipeta, uređaj za testiranje i ostali testirani materijal u spremnik za odlaganje biološki opasnih tvari. Procedura za serum ili plazmu Vidi priprema uzorka u 6.1 Tipovi uzorka. 1. Izvadite uređaj Geenius HIV 1/2 Confirmatory Assay iz vrećice i stavite ga na ravnu površinu (iz vrećice ne treba izvaditi i desikant). NAPOMENA: NE KORISTITE ako paket desikanta nedostaje iz vrećice. Uklonite uređaj za testiranje i koristite novi uređaj. Označite uređaj za testiranje s ID-em pacijenta ili identifikacijskim brojem (vidi sliku 1 dolje). Upamtite kako uređaj Geenius HIV 1/2 Confirmatory Assay ima šest (6) plavo obojenih crta u testnom području (ne plavih crta u kontrolnom području); ako bilo koja od tih 6 obojenih crta nedostaje NE KORISTITE ga. Uklonite uređaj za testiranje i koristite novi uređaj. Slika 1 7

10 2. Koristite laboratorijsku pipetu i ispustite 5 µl seruma/plazme središte SAMPLE + BUFFER otvor 1 na uređaju (vidi sliku 2 dolje). 3 Odmah nakon uzimanja uzoraka, uzmite bocu s kapaljkom razrjeđivača i dodajte 2 kapi s kapaljke pufera na SAMPLE + BUFFER otvor 1 (vidi sliku 3 dolje). Slika 2 Slika 3 4. Pričekajte 5-7 minuta. Svih 5 plavo obojenih TESTNIH crta treba nestati iz pravokutnog TEST područja. Ako ne nestanu, uklonite uređaj i ponovite postupak s novim uređajem za testiranje. NAPOMENA: Svijetla plavo-zelena boja može se zadržati na membrani, ali niti jedna obojena crta ne bi se trebala vidjeti u ovom trenutku. Koristite bocu s kapaljkom razrjeđivača i dodajte 5 kapi na pufer (zeleni poklopac) na BUFFER otvor 2 (vidi sliku 4 dolje). Slika 4 Očitajte rezultate testa 20 do 30 minuta nakon dodavanja pufera na BUFFER otvor Rezultate nemojte očitavati ako je prošlo 30 minuta Rezultate očitavajte u dobro osvijetljenom prostoru. NAPOMENA: Uklonite korištene vrhove pipeta, uređaje za testiranje i ostali testirani materijal u spremnik za odlaganje biološki opasnih tvari. 7.4 Kontrola kvalitete Ugrađene kontrolne funkcije Kontrolna crta služi kao ugrađena interna kontrola i pruža potvrdu dodanog uzorka i ispravnog provođenja testa. Ružičasta/ljubičasta crta pojavit će se u CONTROL (C) području, ako se test točno izvršio i ako uređaj ispravno radi (molimo vidjeti: Interpretacija rezultata testa) Vanjska kontrola kvalitete Geenius HIV 1/2 Confirmatory Controls, ref: je dostupan odvojeno za uporabu s Geenius HIV 1/2 Confirmatory Assay. Preporuka je izvršiti Geenius HIV 1/2 Confirmatory Controls kod sljedećih okolnosti: Prilikom otvaranja novog dijela kompleta za testiranje. 8

11 Uvijek kad se zaprime novo dopremljeni kompleti za testiranje. Ako temperatura područja za čuvanje testa prelazi raspon od 2 C do 30 C. Ako temperatura područja za vršenje testa prelazi raspon od 18 do 30 C. U periodičnim razmacima kako je to naznačila institucija korisnika. 7.5 Kriterij za validaciju testa Reaktivnost pojasa Svaki vidljivi pojas čak i slabi mora se smatrati reaktivnim. Kriterij validacije ISPRAVAN: Test je ispravan samo ako se ružičasta/ljubičasta linija pojavi u CONTROL (C) području, bilo da e ili nije pojavila crta u području TEST crte. (Kontrolni pojas mora biti jak: slabi pojas nije prihvatljiv za kontrolu pojasa) NEISPRAVAN: Ako izrazito ružičasta/ljubičasta crta nije vidljiva (uključujući i slabi pojas) u CONTROL (C) području, test je neispravan. NEISPRAVAN test se ne može interpretirati. Potrebno je ponoviti testiranje uzorka s novim uređajem. 7.6 Interpretacija rezultata Sljedeće definicije opisuju kriterije koje koristi Geenius HIV 1/2 Confirmatory Assay za utvrđivanje prisutnosti ili odsutnosti antitijela za HIV-1 i/ili HIV-2. Korisnik naknadno analizira kombinirani tip određenih profila pojasa za svaki test u skladu s kriterijima navedenim u donjoj tabeli za interpretaciju rezultata Kriterij za interpretaciju Kriterij za interpretaciju HIV-1 Interpretacija POZITIVNI NEGATIVNI NEODREĐENO Bio-Rad kriterij Bilo koja 2 pojasa za 4 crte HIV-1 testa s barem 1 ENV - gp160 (pojas 4) ili gp41 (pojas 6) Nema pojasa 1ENV (pojas 4 ili 6) 1GAG (pojas 5) 1POL (pojas 3) 1 GAG i 1 POL (pojasevi 5 i 3) Kriterij za interpretaciju HIV- 2 Interpretacija POZITIVNI NEGATIVNI NEODREĐENO Bio-Rad kriterij 2 HIV-2 pojasa moraju biti prisutna: gp36 i gp140 (pojas 1 i 2) Nema pojasa 1 ENV: gp36 (pojas 1) ili gp140 (pojas 2) samo gp36 (pojas 1) samo gp140 (pojas 2) 9

12 GLOBALNI kriterij za interpretaciju HIV-1/HIV-2 Sljedeća tablica za interpretaciju rezultata opisuje kriterije koje koristi Geenius HIV 1/2 Confirmatory Assay za interpretaciju kombiniranog tipa određenih uzoraka pojasa primijećenih kod pojedinog testa. HIV-2 REZULTAT HIV- 1 REZULTAT GLOBALNA TESTA INTERPRETACIJA Negativno Negativno HIV NEGATIVNO Neodređeno Negativno HIV-2 NEODREĐENO Negativno Neodređeno HIV- 1 NEODREĐENO Neodređeno Neodređeno HIV NEODREĐENO Negativno Pozitivno HIV-1 POZITIVNO Neodređeno Pozitivno HIV-1 POZITIVNO Pozitivno Negativno HIV- 2 POZITIVNO Pozitivno Neodređeno HIV- 2 POZITIVNO Pozitivno Pozitivno slučaj 1 = 1 ENV HIV-1 (gp 160 ili gp41) + GAG ili POL slučaj 2 = 2 ENV HIV-1 (gp 160 ili gp41) +/- GAG i/ili +/-POL HIV- 2 POZITIVNO (s HIV-1 križna reaktivnost) HIV NETIPIZIRANO POZITIVNO 10

13 8. OGRANIČENJE TESTA 8.1 Općenita ograničenja 1. Vizualna očitanja prezentirati neke razlike kod konačnog zaključivanja kad je riječ o dva različita tehničara ili dva različita testa: ova razlika može biti povezana sa subjektivnošću vizualne interpretacija. 2. Za reaktivne rezultate, intenzitet testnih crta nužno nije u korelaciji s titarom antitijela u uzorku. 3. Osoba koja je potvrđeno HIV-1 ili HIV-2 pozitivna smatra se kako je zaražena virusom, s tim da osoba koja je sudjelovala u ispitivanju HIV cjepiva mogla je razviti antitijela na cjepivo i može, ali i ne mora, biti zaražena HIV-om. 4. Pojedinci zaraženi HIV-1 i/ili HIV-2 koji primaju visoko aktivnu antiretrovirusnu terapiju (HAART) mogu dati lažne negativne rezultate. 5. Raznolikost HIV-1 (grupa M i grupa O) i HIV-2 virusa ne isključuju mogućnost lažnih negativnih rezultata. Niti jedna poznata metoda testiranja ne može ponuditi potpunu sigurnost kad je riječ o nepostojanju HIV virusa. 6. Nereaktivni rezultat ne isključuje mogućnost izloženosti HIV-u ili zaraženosti HIV-om. Stvaranje antitijela nakon nedavne izloženost može trajati i nekoliko mjeseci dok se ne dosegnu razine koje se mogu otkriti. Pozitivni test probira povezan s negativnim potvrdnim testom može se javiti tijekom prve faze infekcije; međutim, negativni rezultat znači kako testni uzorak ne sadrži anti-hiv antitijela koja se mogu otkriti Geenius HIV 1/2 Confirmatory Assay. Takav rezultat, naime, ne isključuje mogućnost nedavne HIV-1/HIV-2 infekcije. Novi uzorak treba kasnije testirati. 7. Neodređeni rezultat ne isključuje mogućnost izloženosti HIV-u ili zaraženosti HIV-om. Stvaranje antitijela nakon nedavne izloženost može trajati i nekoliko mjeseci dok se ne dosegnu razine koje se mogu otkriti. Pozitivni test probira povezan s neodređenim potvrdnim testom može se javiti tijekom prve faze infekcije; međutim, neodređeni rezultat znači kako testni uzorak može sadržavati anti-hiv antitijela koja se mogu otkriti Geenius HIV 1/2 Confirmatory Assay. Takav rezultat, naime, ne isključuje mogućnost nedavne HIV-1/HIV-2 infekcije. Novi uzorak treba kasnije testirati. 8. Geenius HIV 1/2 Confirmatory Assay namijenjen je služiti kao pomoć kod dijagnoze zaraženosti s HIV-1 i/ili HIV-2. Stanja povezana s HIV-om i AIDS-om su klinički sindromi i njihova dijagnoza može se samo klinički potvrditi. 9. Geenius HIV 1/2 Confirmatory Assay mora se koristiti SAMO za kapilarnu krv, vensku krv, serum ili plazmu. Korištenje drugih tipova uzoraka ili testiranje uzoraka venipunkcijske krvi prikupljenih putem epruveta koje sadrže antikoagulant različiti od citrata, heparina ili EDTA možda neće dati točne rezultate. 10. Geenius HIV 1/2 Confirmatory Assay mora se koristiti u skladu s ovdje naznačenim uputama kako bi se dobili točni rezultati. 11. Očitavanje rezultata testa prije nego je prošlo 20 minuta i nakon 30 minuta od stavljanja korištenog pufera u BUFFER otvor 2 može dati pogrešne rezultate. 8.2 Ograničenja u interpretaciji testa Profil "neodređeno" ne isključuje jednu od sljedećih situacija: serokonverziju ili križnu reaktivnost s drugim retrovirusima. Homologija između HIV-1 i HIV-2 virusa može voditi do kroz reaktivnosti između i anti-hiv-1 i anti-hiv-2 antitijela protiv HIV-2 i HIV-1 virusa. Uzorci koji su u skladu s HIV-1 pozitivnim kriterijem pokazuju, u pojedinim rijetkim slučajevima, križnu reaktivnost na jednom pojasa HIV-2 ovojnice. U većini slučajeva, takav profil koji potvrđuje pojedinačnu HIV-1 infekciju ne isključuje, u jako rijetkim slučajevima, mogućnost sekundarne HIV-2 serokonverzije (surinfekcije). Uzorci koji su u skladu s HIV-2 pozitivnim kriterijem mogu pokazati križnu reaktivnost na jednom ili više HIV-1 pojasa. U većini slučajeva, HIV-1 neodređeni profil povezan je s HIV-1 pozitivnim profilom koji potvrđuje pojedinačnu HIV-2 infekciju. Međutim, to ne isključuje mogućnost sekundarne HIV-1 serokonverzije (surinfekcije). 11

14 uzorci koji su u skladu s i HIV-1 i HIV-2 pozitivnim kriterijem su generalno HIV-2 pozitivni uzorci koji pokazuju HIV-1 križnu reaktivnost kad imaju otkrivenu samo jednu ovojnicu pojasa (gp160 ili gp41). Takvi profili ne isključuju rijetku mogućnost HIV-1-HIV-2 koinfekcije. HIV netipizirani uzorci s otkrivenih svih 4 ovojnica pojasa (svi HIV 1 env i HIV-2 env) u većini slučajeva su HIV-2 pozitivni uzorci s HIV2 reaktivnošću koje se ne može vizualno razlikovati od HIV-1 reaktivnosti. Takvi profili ne isključuju mogućnost HIV 1/2 koinfekcije. Uzorci koji su u skladu s i HIV-1 i HIV-2 pozitivnim kriterijem u jako rijetkim slučajevima su HIV- 1 pozitivni uzroci koji pokazuju HIV-2 križnu reaktivnost. 9. KARAKTERISTIKE PERFORMANSI 9.1 Preciznost nalaza Precizni panel (N=6) izrađen od 3 seruma i 3 krvna uzorka različitih HIV statua (HIV negativan, HIV-1 pozitivan, HIV-2 pozitivan) bio je testiran. Za svaki precizni nalaz i člana panela, određen je postotak podudaranja kao broj točno identificiranih odgovora u usporedbi sa statusom uzorka Ponovljivost Precizni panel testiran je u 10 ponavljanja tijekom istog postupka. Uzastopna mjerenja potvrdila su usklađenost s 100% za HIV negativnim, HIV-1 pozitivnim i HIV-2 pozitivnim uzorkom. Član panela Ponovljivost rezultata za serum Ponovljivost rezultata za krv N NEG NEO POZ sporazum N NEG NEO POZ sporazum HIV NEG % % HIV-1 POZ % % HIV- 2 POZ % % Srednja preciznost Izvršna i dnevne preciznost Preciznost serumskog panela testirana je dvostruko testiranju, s 2 testiranja po danu tijekom 10 dana, a preciznost krvnog panela s 3 puta po testiranja, s 2 testiranja po danu tijekom 3 dana. Preciznost iz testiranja u testiranje i iz dana u dan potvrdila je 100% usklađenost s HIV negativnim, HIV-1 pozitivnim i HIV-2 pozitivnim uzorcima. Rezultati izvršne i dnevne preciznosti za serum Rezultati izvršne i dnevne preciznosti za krv Član panela N NEG NEO POZ sporazum N NEG NEO POZ sporazum HIV NEG % % HIV-1 POZ % % HIV- 2 POZ % % Preciznost grupe i izvršitelja Preciznost panela testirana je dvostruko na 2 grupe reagensa i to s 3 izvršitelja s 1 testiranjem po danu tijekom 3 dana. Preciznost između izvršiteljima i između grupa potvrdila je 100% usklađenost s HIV negativnim, HIV-1 pozitivnim i HIV-2 pozitivnim uzorcima. Član panela Rezultati preciznosti grupe i izvršitelja za Rezultati preciznosti grupe i izvršitelja za krv serum N NEG NEO POZ Sporazum N NEG NEO POZ Sporazum HIV NEG % % HIV-1 POZ % % HIV- 2 POZ * 100% % * 2 ponavljanja dala su HIV-1 križnu reaktivnost 12

15 9.2. Klinička učinkovitost Dijagnostičke specifičnosti Davatelji krvi Ukupno 400 uzoraka (serum, plazma i venska krv) dobiveno je iz 300 neselektiranih poznatih i onih koji su po prvi put davali krv, te je testirano s Geenius TM HIV 1/2 Confirmatory Assay na lokaciji banke krvi. 398 testiranih uzoraka bili su negativi, a 2 testirana bila su neodređena Kako niti jedan uzorak nije bio pozitivan, ukupna specifičnost 400 uzoraka bila je % (400/400) s intervalom pouzdanosti od 95% od [99,1-] i 0,05% (2/400) neodređenih rezultata. Specifičnosti za davatelje krvi Serum (SSTII Gel sep) Plazma (*) (EDTA-K2) Venska krv (EDTA-K2) UKUPNO 300 davatelja Ukupan broj uzoraka Negativno Neodređeno Pozitivno (*) uzroci plazme i uzorci venske krvi dobiveni od istih 100 davatelja Specifičnosti (100/100) (100/100) (200/200) (400/400) 95 CI [96,4 - ] [96,4 - ] [98,2 - ] [99,1 - ] Hospitalizirani pacijenti i trudnice Ukupno 508 uzoraka od 326 hospitaliziranih pacijenata testirano je s Geenius TM HIV 1/2 Confirmatory Assay na 2 različite lokacije. Između tih pacijenata, bilo je 99 uzoraka samog seruma, 100 samo krvnih uzoraka, 72 uzoraka i seruma i krvi, 30 pacijenata dalo je uzroke seruma, plazme i krvi, a 25 dalo je uzorke seruma, plazme i kapilarne krvi. također, testirano je 30 seruma trudnica na 2 lokacije. Uzorci venske krvi i plazme prikupljeni su u EDTA-K2 epruvetama, a serum u SSTII u epruvetama s gel separatorom. Kod prikupljene kapilarne krvi nije korišten atnikoagulant. 529 testiranih uzoraka bilo je negativno,a 9 neodređeno. Kako niti jedan testirani uzorak nije bio pozitivan, ukupna specifičnost 538 uzorka bila je % (538/538) s intervalom pouzdanosti od 95% od [99,3-] i 1,7% (9/538) neodređenih rezultata. Kako su isti rezultati dobiveni i kod pacijenata koji su imali i po 2 ili 3 vađenja krvi, specifičnost pacijenata vila je 356/356 s 7 neodređenih rezultata. Lokacije Pacijenti Svježi serum (SSTII Gel) Svježa plazma (EDTA-K2) Svježa venska krv (EDTA-K2) Svježa kapilarna krv Ukupno uzoraka Lokacija / / / 99 Lokacija / / 100 / / 72 / / / Ukupno Negativno Neodređeno 5(*) 1(*) 1(*) 0 Pozitivno Specifičnosti 95 CI (226/226) Trudnice Zamrznuti serum Ukupno Negativno 28 Neodređeno 2 Pozitivno 0 Specifičnosti 95 CI (55/55) (202/202) (25/25) (508/508) [98,6 - ] [93,5 - ] [98,2 -] N/A(**) [99,4 - ] (30/30) N/A(**) 13

16 (*) 1 pacijent imao je 1 neodređeni rezultat i za serum i vensku krv i plazmu. (**) nije primjenjivo kod N<30 populacije Davatelji krvi s lažnim pozitivnim rezultatom na probiru Ukupno je bilo 275 uzoraka seruma dobivenih od davatelja krvi dali su lažne pozitivne rezultate s HIV ELISA testom probira, testirano je s Geenius TM HIV 1/2 Confirmatory Assay na dvije kliničke lokacije. 258 testiranih uzoraka bilo je negativno,a 17 neodređeno. Kako niti jedan testirani uzorak nije bio pozitivan, ukupna specifičnost 275 uzorka bila je % (275/275) s intervalom pouzdanosti od 95% od [98,7-] i 6,2% (17/275) neodređenih rezultata. Specifičnosti za davatelje krvi UKUPNO 275 davatelja Ukupan broj uzoraka Negativno Neodređeno Pozitivno Specifičnosti (275/275) 95 CI [98,7 - ] Dijagnostička osjetljivost Pacijenti zaraženi HIV-1 virusom Ukupno je 599 uzoraka dobivenih od 263 pacijenata koji su potvrđeno zaraženi HIV-1 virusom s 2 lokacije (155 pacijenata s lokacije 1 i 108 pacijenata s lokacije 2) testirano je s Geenius TM HIV 1/2 Confirmatory Assay. Na lokaciji 1, 108 svježi serum i odgovarajuća plazma, 5 svježih seruma i 50 g genotipiziranih HIV-1 sojeva (2 CRF01, 5 CRF02, 1 CRF05, 1 CRF06, 2 CRF09, 1 CRF11, 1 CRF12, 1 CRF13, 1 CRF14, 1 CRF15, 1 CRF18, 1 CRF19, 1 CRF22, 1 CRF27, 1 CRF30, 1 CRF36, 1 CRF42, 4 podtipa A, 5 podtipova B, 2 podtipa C, 2 podtipa D, 2 podtipa F, 2 podtipa G, 2 podtipa H, 2 podtipa J, 1 podtipa K, 5 grupa O). Na drugoj lokaciji, između 108 pacijenta, 82 je dalo uzorke krvi, seruma i plazme, 20 je dalo uzorke krvi, kapilarne krvi, seruma i plazme, a 6 je dalo uzorke kapilarne krvi, seruma i plazme. Uzorci venske krvi i plazme prikupljeni su u EDTA-K2 epruvetama, a uzorci seruma u SSTII u epruvetama s gel separatorom. Svih 599 testiranih uzoraka bilo je HIV-1 pozitivno, što je dovelo do ukupne osjetljivosti od % (599/599) s intervalom pouzdanosti od 95% od [99,4-]. HIV-1 osjetljivost kod pacijenata vila je 100% (263/263). Kod ukupno 599 uzoraka, 3 uzorka bila su HIV netipizirani umjesto HIV-1 pozitivni, stoga je kapacitet diferencijacije HIV-1 Geenius TM HIV 1/2 Confirmatory Assay bio 99,5% (596/599) s intervalom pouzdanosti od 95% od [98,5-99,9]. Lokacije Pacijenti Svježi serum (SSTII Gel) Genotipizirani serum Svježa plazma (EDTA-K2) Svježa venska krv (EDTA-K2) Svježa kapilarna krv Ukupno uzoraka Lokacija / / / 200 N= / / / / 5 50 / 50 / / / 50 Lokacija / / 246 N= / / 6 / 6 18 Ukupno HIV-1 Pozitivno HIV netipizirano Senzitivnost 95 CI (*) 1(*) 0 (113/113) (50/50) (208/208) (202/202) (26/26) (599/599) [97,8 - ] [98,2 - ] [98,2 -] N/A(**) [99,4 - ] (*) uzroci plazme i uzorci venske krvi dobiveni od istog pacijenta zaraženog s HIV-1 (**) nije primjenjivo kod N<30 populacije 14

17 Pacijenti zaraženi HIV- 2 virusom Ukupno 283 uzorka dobiveno je od 172 pacijenata koji su potvrđeno zaraženi HIV-2 virusom (serum, plazma, venska krv i kapilarna krv, a neki skupni uzorci dobiveni su u od istih pacijenata) testirano je s Geenius TM HIV 1/2 Confirmatory Assay na tri kliničke lokacije. 66 uzoraka seruma dobiveno je prikupljanjem uzoraka na dvije kliničke lokacije. Svi ostali uzorci svježe se prikupljeni od pacijenata. Uzorci venske krvi i plazme prikupljeni su u EDTA-K2 ili EDTA-K3 epruvetama, a prikupljeni uzorci seruma u SSTII u epruvetama s gel separatorom ili u suhim epruvetama. Svih 281 testiranih uzoraka bilo je HIV pozitivno, a 2 su bila HIV-2 neodređeno, što je dovelo do ukupne osjetljivosti od 99,3% (281/283) s intervalom pouzdanosti od 95% od [97,5-]. Dva HIV-2 neodređena rezultata (gp 140 nije otkriveno) dobivena su iz seruma i krvi dobivenih od istog pacijenta s potvrđenim gp105 negativno i CE-oznakom HIV I/II potvrdnim testom. 172 od 283 uzoraka bilo je ispravno potvrđeno kao HIV-2 pozitivno (sa ili bez HIV-1 križne reaktivnosti) ili HIV-2 neodređeno, a 111 HIV netipizirano, stoga je HIV-2 kapacitet diferencijacije Geenius TM HIV 1/2 Confirmatory Assay bio 60,8% (172/283) s intervalom pouzdanosti od 95% od [54,8-66,5]. Lokacije Pacijenti Svježi serum (SSTII Gel) Zamrznuti serum Svježa plazma (EDTA-K2) Svježa venska krv (EDTA-K2 ili K3) Svježa kapilarna krv Ukupno uzoraka Lokacija / / 16 / / / 16 Lokacija 2 50 / 50 / / / 50 Lokacija / / 101 / 202 Ukupno HIV- 2 Pozitivno HIV-2 pozitivno s HIV reaktivnošću HIV netipizirano Neodređeno 1* 0 0 1* 0 Senzitivnost 99,4 (171/172) (5/5) 99,0 (102/103) (3/3) 99,3 (281/283) 95 CI [96,8 - ] N/A** [94,7 - ] N/A** [97,5-99,9] (*) uzroci plazme i uzorci venske krvi dobiveni od istog pacijenta zaraženog s HIV- 2 (**) nije primjenjivo kod N<30 populacije HIV-1/HIV-2 koinficirani pacijenti Ukupno 22 uzorka dobivena od 15 pacijenta potvrdila su HIV-1/ HIV-2 koinfekciju (13 seruma, 2 plazmi i 7 ukupne venske krvi dobiveno je od istih 7 pacijenata) testirano je s Geenius TM HIV 1/2 Confirmatory Assay na dvije kliničke lokacije. Šest uzoraka seruma i 2 uzorka plazme dobiveni su s jedne kliničke lokacije za prikupljanje uzoraka, a sedam skupnih uzoraka seruma-venske krvi svježe je dobiveno od pacijenata s druge kliničke lokacije. Ukupna osjetljivost bila je 100% (22/22) (serum i venska krv) bez neodređenih rezultata. Kod prvog pokušaja, svi uzorci točno su potvrdili HIV netipiziranost (HIV-1 pozitivan s otkrivene dvije ovojnice i HIV-2 pozitivno), osim jednog uzorka krvi i seruma. Uzorak krvi netočno je potvrdio HIV-2 pozitivno zbog nedavne surinfekcije. Nakon ponavljanja poslije nekoliko tjedana, za pacijenta je točno potvrđena HIV netipiziranost. Serum je netočno potvrđen kao HIV-2 pozitivan s HIV-1 reaktivnošću umjesto HIV netipiziranosti, uz to netočno je potvrđen kao HIV-2 pozitivan (bez HIV-1 reaktivnosti) na nekoliko CE-oznaka HIV diferencijacijskih testova. 21 od 22 uzorka točno su potvrđeni kao HIV netipizirani nakon ponovljenog testiranja jednog pacijenta. Stoga je HIV-1+2 kapacitet diferencijacije Geenius TM HIV 1/2 Confirmatory Assay bio 95,5% (21/22). 15

18 HIV-1 serokonverzijski uzorci Osjetljivost Geenius TM HIV1/2 Confirmatory Assay procijenjena je na 32 serokonverzijskih panela (154 uzoraka). 41,6% (64/154) bilo je pozitivno na Geenius TM HIV1/2 Confirmatory Assay, dok je 12,3% (19/154) bilo pozitivno na CE-oznake Western Blot testa. Otkrivanje prve pozitivne točke krvarenja bilo je u prosjeku 1,4 (44/32) vremenske točke po panelu ranije kod Geenius TM HIV 1/2 Confirmatory Assay. Kod testiranja 83 rana-serokonverzijska uzorka (negativna ili neodređena po Western Blotu), 10,8% (9/83) bilo je pozitivno kod Geenius HIV1/2 Confirmatory Assay. Temeljeno na 10 serokonverzijska uzorka testirana na kliničkim lokacijama i u usporedbi s istim referencama Western blot testa, Geenius HIV1/2 Confirmatory Assay bio je osjetljiviji na otkrivanje antitijela za gp41 te je imao sličnu osjetljivost na otkrivanje antitijela za gp160. Geenius HIV1/2 Confirmatory Assay u skladu je s vrhunski uvjetima osjetljivosti procijenjenim s HIV serokonverzijskim panelima Analitičke specifičnosti Križna reaktivnost 251uzorak s potencijalnom križnom reaktivnošću predstavlja 29 različitih bolesti/ stanja bilo je pozitivno za sljedeće oznake, bilo je testirano Geenius TM HIV 1/2 Confirmatory Assay na različitim kliničkim lokacijama. HTLV I/ II (20), Hepatitis C (10 HCV), Hepatitis B (10 anti-hbs) i Hepatitis A (10 HAV IgG); Citomegalovirus (10 CMV IgG), Epstein-Barr (10 EBV IgG),Herpes Simpleks (10 HSV), Rubella IgG (10), Toksoplazmoza IgG (5), Sifilis IgG (10), Kandida (10), Malarija (26), Dengue (2), Lišmanioza (2), Vakcinija (10), Cjepivo protiv gripe (5 Flu), Dijaliza (10), HAMA (10), Reumatoidni faktor (10), Multitransfuzija (10), Mijelom (5) Hemofilija (10),Autoimuni kao sistemski eritemski lupus (12 SLE), Skleroderma (2), Sjogrens (2), Miješana bolest vezivnog tikava (2 MCTD), Antinuklearna antitijela (3 ANA), Rak(5), Ciroza (5) i Višerotkinje (5). Preko ukupno 251 kompliciranih uzoraka, 245 testirana uzoraka bili su negativni, a 6 uzoraka je na testu bilo neodređeno (bili su neodređeni za HIV-1 Western-Blot i pozitivni na malariju). Specifičnost je bila % (251/251) s intervalom pouzdanosti od 95% od [98,5-] i 2,4% (6/251) neodređenih rezultata. 9.4 Prozonski učinak (hook efekt) Mogući prozonski učinak priučavan je testiranjem 2 HIV-1 i 2 HIV-2 uzoraka s visokim titrom, čisti i razrijeđeni. Nisu primijećeni ni negativni, kao ni rezultati niskog intenziteta s čistim visokim titrom za HIV-1 i HIV-2 pozitivne uzorke, kad ih se usporedi s razrijeđenijim oblikom (1:10 do 1:100000). Ujednačenost rezultata kod ne razrijeđenih i razrijeđenih uzoraka ukazuje na odsustvo prozonskog učinka. 10. Bibliografske reference. 1. Barre-Sinoussi, F., Chermann, J.C., Rey, F., et al.: Isolation of T-lymphotropic retroviruses from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS). Science 1983, 220: Gallo, R.C., Salahuddin, S.Z., Popovic, M., et al.: Frequent detection and isolation of cytophatic retrovirus (HTLV-III) from patients with AIDS and at risk for AIDS. Science 1984, 224: Clavel, F., Guetard, D., Brun-Vézinet, F.: Isolation of a new human retrovirus from West African patients with AIDS. Science 1986, 233: Rey, F., Salaun, D., Lesbordes, J.L. et al.: Evidence for HIV-1 and HIV-2 double infection in Central African Republic. Lancet, II, 1986, Gnann, J., McCormick, J.B., Mitchell, S., Nelson, J., Oldstone, M.: Synthetic peptide Immunoassay distinguishes HIV Type 1 and HIV Type 2 Infections. Science 1987, 237:

19 6. De Cock, K.M., Brun-Vézinet, F., Soro, B: HIV-1 and HIV-2 infections and AIDS in West Africa. AIDS 1991, 5(Suppl 1):S Simon, F., Souquiere, S., Damond, F., Kfutwah, A., Makuwa, M., et al.: Synthetic peptide strategy for the detection of and discrimination among highly divergent primate lentiviruses. AIDS Res Hum Retroviruses 2001, 17: Rouet, F., Ekouevi, D.K., Inwoley, A., Chaix, M.L., Burgard, M., et al.: Field evaluation of a rapid human immunodeficiency virus (HIV) serail serologic testing algorithm for diagnosis and differentiation of HIV type 1 (HIV-1), HIV-2, and dual HIV-1-HIV-2 infections in West African pregnant women. J Clin Microbiol 2004, 42: HIV-2 Infection surveillance-united States, MMWR 2011, 60(29): Ciccaglione, A.R., Miceli, M., Pisani, G., et al.:i mproving HIV-2 detection by a combination of serological and nucleic acid amplification tests assays. J Clin Microbiol 2010, 48(8): Association of Public Health Laboratories, HIV testing algorithms: A status report. Accessed 4 August Update on HIV Diagnostic Testing Algorithms. J Clin Virol 2011, 52(1). 17

20 EUH 208: Sadrži gentamicin. Može izazvati alergijsku reakciju. 18

21 Bio-Rad 3, Boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette Francuska Tel. : +33 (0) Fax : +33 (0) /