Биолошки факултет Број захтева:33/43-1 Датум: 11.03.2016. УНИВЕРЗИТЕТ У БЕОГРАДУ ВЕЋУ НАУЧНИХ ОБЛАСТИ ПРИРОДНИХ НАУКА З А Х Т Е В за давање сагласности на предлог теме докторске дисертације за кандидата на докторским студијама Молимо да, сходно члану 47. ст. 5. тач. 3. Статута Универзитета у Београду ("Гласник Универзитета", број 162/11-пречишћени текст, 167/12, 172/13 и 178/14), дате сагласност на предлог теме докторске дисертације: Eфекти анестезије индуковане пропофолом на синаптичку пластичност, активност допаминског система и понашање јувенилних пацова НАУЧНА ОБЛАСТ: Биолошке науке. ПОДАЦИ О КАНДИДАТУ: 1. Име, име једног родитеља и презиме кандидата: Жељко З. Павковић 2. Претходно образовање (назив и седиште факултета, студијски програм): Универзитет у Београду Биолошки факултет 3. Година дипломирања: 2010. 4. Година уписа на докторске студије: 2011/2012. Универзитет у Београду-Биолошки факултет 5. Назив студијског програма докторских студија: Молекуларна биологија, модул: Молекуларна биологија еукариота.
ПОДАЦИ О МЕНТОРУ А: Име и презиме: др Весна Пешић Звање: виши научни сарадник, Универзитет у Београду-Институт за биолошка истраживања Синиша Станковић Списак радова који квалификују ментора за вођење докторске дисертације: 1. Pešić V, Milanović D, Popić J, Smiljanić K, Tešić V, Kanazir S, Jevtović-Todorović V, Ruždijić S. Neonatal propofol anesthesia modifies activity-dependent processes and induces transient hyperlocomotor response to d-amphetamine during adolescence in rats. INTERNATIONAL JOURNAL OF DEVELOPMENTAL NEUROSCIENCE, 47:266-277, 2015. 2. Popić J, Pešić V, Milanović D, Todorović S, Kanazir S, Jevtović-Todorović V, Ruždijić S. Propofol-induced changes in neurotrophic signaling in the developing nervous system in vivo. PLoS One. 7(4):e34396, 2012. 3. Pešić V, Popić J, Milanović D, Lončarević-Vasiljković N, Rakić Lj, Kanazir S, Ruždijić S. The effect of MK-801 on motor activity and c-fos protein expression in the brain of adolescent Wistar rats. BRAIN RESEARCH 1321: 96-104, 2010. 4. Pešić V, Milanović D, Tanić N, Popić J, Kanazir S, Jevtović-Todorović V, Ruzdijić S. Potential mechanism of cell death in the developing rat brain induced by propofol anesthesia. INTERNATIONAL YOURNAL OF DEVELOPMENTAL NEUROSCIENCE, 27(3): 279-287, 2009. 5. Milanović D, Pešić V, Rakić Lj, Kanazir S, Ruzdijić S. Enhancement of AP-1 DNA-binding activity during amphetamine- and phencyclidine-mediated behaviour in rats. NEUROPHARMACOLOGY, 50(8): 924-933, 2006.
У случају менторства дисертације на докторским студијама у групацији техничкотехнолошких, природно-математичких и медицинских наука ментор треба да има најмање три рада са SCI, SSCI, AHCI или SCIе листе, као и Math-Net.Ru листе. У случају менторства дисертације на докторским студијама у групацији друштвенохуманистичких наука ментор треба да има најмање три рада са релеватне листе научних часописа (Релевантна листа научних часописа обухвата SCI, SSCI, AHCI и SCIе листе, као и ERIH листу, листу часописа које је Министарство за науку класификовало као М24 и додатну листу часописа, коју ће на предлог Универзитета донети Национални савет за високо образовање. Посебно се вреднују и монографије које Министарство науке класификује као М11, М12, М13, М14, М41, и М51.) Обавештамо вас да је Наставно-научно веће Универзитета у Београду-Биолошког факултета, на седници одржаној 11.03.2016. год. размотрило предложену тему и закључило да је тема подобна за израду докторске дисертације јер садржи оригиналну идеју и да је од значаја за развој науке, примену њених резултата, односно развој научне мисли уопште. Декан Биолошког факултета Проф. др Жељко Томановић Прилог: 1. Предлог теме докторске дисертације са образложењем. 2. Акт надлежног тела факултета о подобности теме за израду докторске дисертације. 3. Електронска верзија. 4. Потврда етичке комисије
33/43-11.03.2016. На основу члана 128. Закона о високом образовању и члана 59. став 1. тачка 12. Статута Биолошког факултета Универзитета у Београду, Наставно-научно веће Факултета, на V редовној седници одржаној 11.03.2016. године, донело је О Д Л У К У Прихвата се Извештај Комисије за оцену испуњености услова и научне заснованости теме докторске дисертације кандидата: Жељка З. Павковића, дипломирани биолог, студента докторских студија, студијски програм Молекуларна биологија, модул: Молекуларна биологија еукариота, под називом: Eфекти анестезије индуковане пропофолом на синаптичку пластичност, активност допаминског система и понашање јувенилних пацова За менторе се именују: 1. др Весна Пешић, виши научни сарадник, Универзитет у Београду- Институт за биолошка истраживања Синиша Станковић. Декан Биолошког факултета Доставити: - Универзитету у Београду, - докторанту, - ментору; - Стручној служби Факултета. Проф. др Жељко Томановић
НАСТАВНО НАУЧНОМ ВЕЋУ БИОЛОШКОГ ФАКУЛТЕТА УНИВЕРЗИТЕТА У БЕОГРАДУ На IV редовној седници Наставно-научног већа Биолошког факултета Универзитета у Београду одржаној 29. 01. 2016. године, одређени смо у Комисију за оцену испуњености услова и научне заснованости предложене теме за израду докторске дисертације Жељка З. Павковића, под насловом: Молекуларни и бихејвиорални ефекти примене анестетика пропофола у периоду адолесценције код пацова. На основу поднете документације и увида у досадашњи рад Жељка Павковића, Комисија подноси Наставно-научном већу Биолошког факултета Универзитета у Београду следећи: А. Биографија: Општи подаци: И З В Е Ш Т А Ј Име, средње слово и презиме: Жељко Зоран Павковић Датум и место рођења: 20.10.1986., Београд Образовање: Дипломирани биолог Запослење: 2014- Истраживач сарадник у Лабораторији за молекуларну неуробиологију, Одељење за неуробиологију Института за биолошка истраживања Синиша Станковић Универзитета у Београду 2012-2014. 2011.- 2012. Истраживач приправник у Лабораторији за молекуларну неуробиологију, Одељење за неуробиологију Института за биолошка истраживања Синиша Станковић Универзитета у Београду Истраживач приправник у Лабораторији за хуману молекуларну генетику, Института за молекуларну генетику и генетичкo инжењерство, Универзитета у Београду Курсеви: 1. Практични курс из Неуробиологије на Биолошком факултету у Лајпцигу; 4-22. 11. 2013. Лајпциг, Немачка. 2. ИБРО-НЕРКА школа Неурофотонике; 28.11.-05.12.2014. Београд, Србија. 3. ДААД радионица Неуронауке: Друга перспектива: од лаких вештина и статистике до етичких питања ; 5-6.12.2014. Београд, Србија. 1
Пројекти: Пластичност мозга током старења: утицај дијеталне рестрикције и анестезије, Програм основних истраживања, Министарство за науку и технолошки развој Републике Србије, eв. бр. 173056; Руководилац пројекта: др Селма Каназир. Чланство у научним друштвима: Друштво за неуронауке Србије (ДНС) Federation of European Neuroscience Societies (FENS) Страни језици: Енглески Посебне активности и награде: Б. Библиографија: Радови и конгресна саопштења из уже научне области: Б1. Радови у часописима међународног значаја 1. M22 Smiljanic K, Pesic V, Mladenovic Djordjevic A, Pavkovic Z, Brkic M, Ruzdijic S, Kanazir S (2015) Long-term dietary restriction differentially affects the expression of BDNF and its receptors in the cortex and hippocampus of middle-aged and aged male rats. Biogerontology. 16(1): 71-83. 2. M23 A. Klajn, D. Drakulic, M. Tosic, Z. Pavkovic, M. Schwirtlich, and M. Stevanovic (2014) SOX2 overexpression effects neural differentiation of human pluripotent NT2/D1 cells. Biochemistry (Moscow). 79(11): 1172-82. Б2. Радови у часописима домаћег значаја 1. 2. Б3. Конгресна саопштења на скуповима међународног значаја 1. M34 Pavković Ž, Pešić V, Milanović D, Tešić V, Rakić Lj, Kanazir S, Ruždijić S. Propofol anesthesia induces transient changes in the expression of CaMKII, PSD95 and β-actin in adolescent rat brain. FENS Featured Regional Meeting 7-10 October 2015, Thessaloniki, Greece, Poster MO142. 2. М34 Smiljanić K, Pešić V, Mladenović Đorđević A, Pavković Ž, Brkić M, Rakić Lj, Ruždijić S, Kanazir S. Influence of long-term dietary restriction on probdnf/p75ntr and BDNF/TrkB systems in the rat cortex and hippocampus during aging. FENS Featured Regional Meeting 7-10 October 2015, Thessaloniki, Greece, Poster MO133. 2
Б4. Конгресна саопштења на скуповима домаћег значаја 1. M64 Klajn A, Drakulić D, Pavković Ž, Marjanović J, Tošić M, Stevanović M. Constitutive SOX2 overexpression delays the process of neural differentiation of NT2/D1 cells. VI Congress Of The Serbian Neuroscience Society, Belgrade, 14-16. november 2013., page 40. 2. М64 Pavković Ž, Smiljanić K, Perović M, Pešić V, Mladenović-Đorđević A, Rakić Lj, Ruždijić S, Kanazir S. BDNF mrna Transcripts in the cortex and hippocampus of rats during aging the effects of food. VI Congress Of The Serbian Neuroscience Society, Belgrade, 14-16. november 2013., page 53. В. Тема докторске дисертације: Наслов дисертације: На основу мишљења чланова комисије предложени наслов је коригован и гласи: Eфекти анестезије индуковане пропофолом на синаптичку пластичност, активност допаминског система и понашање јувенилних пацова Полазне основе: Адолесценција се карактерише бројним неуробиолошким адаптацијама, које се заснивају на измењеној експресији и просторном реаранжману синаптичких протеина и протеина цитоскелета, што је основа за специфична функционална стања уочена код младих јединки. 1 Промене у нервном систему адолесцената изазване применом различитих фармаколошки активних супстанци, међу којима су и општи анестетици, нису довољно испитане. Општи анестетици се примењују интравенски и инхалационо, са циљем да се изазове реверзибилно стање слично коми (губитак свести, болних надражаја, гашење одбрамбених рефлекса, релаксација скелетних мишића). 2 Пропофол је један од најчешће коришћених анестетика у хируршкој пракси, због брзог деловања и кратког времена опоравка пацијента. Анестетски ефекат остварује појачавањем инхибиције посредоване рецепторима типа А за гама-амино-бутерну киселину (енгл. Gammaaminobutyric acid - GABA). Последице примене општих анестетика су у досадашњој литератури интензивно праћене на веома младим експерименталним јединкама, сходно претпоставци да је функционална и морфолошка незрелост нервног система значајан предуслов за остваривање нежељених ефеката различитих срединских фактора. Резултати из области су указали да третман анестетском дозом прoпофола код пацова старих 7 дана (ПНД7) изазива дисбаланс у експресији неуротрофина и цитокина у кортексу и таламусу, можданим регионима који су од непосредног значаја за изазивање стања анестезије. 3 То за последицу има развојно регулисану неуротоксичност, у смислу да се након примене анестезије појачана неуродегенерација уочава код ПНД7 али не и код ПНД14 животиња. 3, 4 Досадашња истраживања су такође показала да се након краткотрајног излагања пропофолу у неонаталном мозгу изазивају комплексне регион-специфичне промене у активности сигналних путева регулисаних калцијумом (Ca 2+ ), као и промене у експресији 3
пре- и пост-синаптичких протеина. 5 Међутим, ова феноменологија у другим развојним периодима, укључујући адолесценцију, није испитивана. Добар индикатор промена у количини калцијума у пост-синаптичким елементима је калцијум киназа II (енгл. Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II - CaMKII), чија се активација, тј. фосфорилација, изазива повећањем концентрације унутарћелијског калцијума. То води њеном ослобађању од филаментозне форме актина (структурног елемента заступљеног у дентритским трновима), као и активацији RhoA i Ras/Rac1 сигналног пута, услед чега долази до реорганизације молекула постсинаптичких густина (енгл. Post-synaptic density - PSD). 6,7 То је високо организована субћелијска фракција карактеристична за ексцитаторне синапсе, у којој се налази велики број рецептора и синаптичких протеина оговорних за функционалну и структурну синаптичку пластичост, као што су CaMKII, PSD95, дребрин (енгл. drebrin), актин (енгл. actin), НМДА рецептор (енгл. N-methyl-D-aspartate receptor - NМDA), допамински (D) рецептор типа 1 и Н- кадхерин (енгл. Neural Ca ++ -dependent cell-cell adhesion molecule N-cadherin). Током адолесценције се смањује број ексцитаторних синапси, a очување временске динамике овог процеса је од великог значаја за функционалну стабилност система 1. Од посебног значаја су промене у допаминском систему, чија је активност најинтензивнија у адолесценцији, због чега је ово период највећег ризика за појаву зависничког и ризичног понашања, као и младалачке схизофреније. Најновија истраживања указују да је активност А10 групе допаминских неурона у оквиру VTA (енгл. Ventral tegmental area - VTA) значајна за буђење из анестезије. Због својства да активира VTA, пропофол се сврстава у групу супстанци са адиктивним потенцијалом. 8,9 Активација допаминског система се може пратити посредством фосфорилације протеина Darpp32 (енгл. Dopamineand camp-regulated neuronal phosphoprotein - DARPP-32). Он је кључни молекул за интеракцију допаминске и сигнализације других трансмитерских система у неуронима, а са Еrk1/2 (енгл. еxtracellular signal-regulated kinase 1/2 Еrк1/2) се интензивно проучава са аспекта адиктивног понашања 10. Непосредне функционалне последице (учење и меморисање, анксиозност, реакција на психостимулансе) изазване излагањем адолесцентних јединки пропофолској анестезији нису реферисане у литератури. Предмет докторске дисертације: Предмет предложене докторске тезе јесте испитивање утицаја анестезије индуковане пропофолом на синаптичку пластичност, активност допаминског система и понашање младих пацова (старости 35 дана, рана адолесценција) Wistar соја у различитим временским тачкама (4, 24 и 48 сати) након третмана. За анализе на молекуларном нивоу мождани региони од интереса су фронтални кортекс, таламус, стријатум и хипокампус. Предлог докторске тезе обухвата анализу: промена експресије специфичних синаптичких елемената који контролишу или су укључени у ексцитаторни синаптички пут, синаптичку пластичност и стабилност, међу којима су CaMKII, PSD95, Н-кадхерин, синаптофизин (енгл. Synaptophysin), синуклеин-1 (енгл. Synuclein) i GAP-43 (енгл. Growth Associated Protein 43 - GAP43) ; промена активности каспазе-3 (енгл. caspase-3), која је ефекторски молекул у процесу апоптозе, али је од значаја у процесу синаптичког моделовања и дендритског орезивања; промена активности допаминског трансмитерског система, који је значајан за буђење из анестезије, као и последица ове активације. Активација ће се пратити на 4
нивоу D1 рецептора и кључних молекула сигналног пута у којем овај рецептор посредује, тј. фосфорилације Darpp32 (Thr34) i фосфорилације ERK1/2; промена на функционалном нивоу, тј. промене понашања (учење и меморисање, анксиозност, реакција на психостимулансе) јединки које су биле изложене пропофолској анестезији. Научни циљ докторске дисертације: Циљ нашег истраживања је да по први пут укаже како примена анестезије индуковане пропофолом у периоду ране адолесценције утиче на синаптичку пластичност, као и да испита да ли и у којој мери третман изазива неуродегенеративне промене у одређеним деловима мозга (фронтални кортекс, таламус, стријатум, хипокампус). Први пут ће бити испитане последице примене опште анестезије на стабилност допаминског система младих пацова, кроз промене у експресији молекулских маркера активности овог система. Карактеризација понашања адолесцентних животиња након третмана је од значаја за разјашњавање непосредних функционалних последица измењене неуралне пластичности и допаминске активности. Материјал и методе: У студији ће бити коришћени мужјаци пацова Wistar соја старости 35 дана (период ране адолесценције код пацова). Животиње ће пропофолом бити третиране једнократно, интраперитонеалним ињецирањем. Ефекти третмана пропофолом ће бити упоређени са контролном групом третираном растварачем активне супстанце (емулзија комерцијално доступна под називом Интралипид). Ефекти изазвани ињецирањем емулзије, који могу утицати на тумачење резултата, биће проверени упоређивањем са подацима добијеним на групи животиња које су ињециране физиолошким раствором. Ефекат ће се пратити 4, 24 и 48 сати након ињецирања. Анализом ће бити обухваћене четири мождане структуре (фронтални кортекс, таламус, стријатум и хипокампус). Из ткива ће даље бити изолована ирнк и протеини. Концентрација и чистоћа ирнк биће одређена спектофотометријски а квалитет изоловане ирнк биће проверен електрофоретским раздвајањем узорака на агарозном гелу. Промене у релативном нивоу експресије испитиваних гена биће испраћене методом PCR-а. Концентрација укупних протеина биће одређена колориметријском методом по Pirce-у, а промене у заступљености и степену фосфорилације испитиваних протеина методом Western Blot-a. Промене у локализацији/експресији протеина у оквиру региона од интереса биће детектоване методом имунохистохемије, а обележавање неурона који су ушли у процес неуродегенерације методом Флуоро Жад Б бојења. Функционалне последице излагања младих јединки пропофолу ће бити праћене и тестовима понашања (тест отвореног поља психомоторна активност; тест црно - беле кутије анксиозност; тест поновљеног излагања отвореном пољу хабитуација; тест препознавања новог објекта учење и меморија). Сви добијени резултати биће обрађени одговарајућим статистичким програмским пакетима (Статистика 6.0). Етички комитет Института за биолошка истраживања ''Синиша Станковић'' дао је позитивно мишљење о неопходности употребе експерименталних животиња у овим истраживањима. 5
Методолошки приступ истраживањима: Током израде ове докторске тезе, као полазни материјал користиће се фронтални кортекс, стријатум, таламус и хипокампус пацова старости 35 дана и то контролних група (физиолошка контрола и интралипид контрола) и животиња које су биле подвргнуте третману пропофолом. Тачна анестетска доза за дату старосну групу јединки није дефинисана и избор дозе је део експерименталне процедуре. С обзиром на то да се могу очекивати индивидуалне варијације у одговору на третман посебна пажња ће бити обраћена на број експерименталних животиња по групи, која ће у овој студији бити н=9. У делу који се односи на молекуларну анализу ефеката прибећиће се пуловању узорака тако да ће се одговарајуће структуре 3 различите животиње спојити у један биолошки узорак, што ће бити поновљено три пута. Сваки од 3 добијена комплексна биолошка репликата ће бити анализиран кроз најмање 2 техничка репликата. Коришћењем различитих молекуларних техника и тестова понашања биће анализирани ефекти примене анестетика пропофола праћењем: промена у нивоу ирнк и протеина присутних у синапси (енгл. PSD95, N-cadherin, synaptophysin, synuclein-1, GAP-43), са циљем да се утврди утицај третмана на синаптичку стабилност и заступљеност различитих пресинаптичких и постсинаптичких елемената; експресионог профила укупне ирнк и протеина каспазе-3, са циљем да се детектује активација апоптотских путева. Активација процеса неуродегенерације биће испраћена методом Флуоро Жад бојења. На основу ових резултата ће се видети да ли је евентуално повећање експресије активног фрагмента каспазе-3 повезано са неуродегенерацијом или са синаптичком пластичношћу; активности допаминског система биће праћена кроз заступљеност допаминског D1 рецептора на нивоу ирнк и протеина, као и кључних молекула сигналног пута у којем овај рецептор посредује, тј. праћењем фосфорилације Darp32 (Thr34) i фосфорилације ERK1/2. утицаја третмана на психомоторну активност и анксиозност јувенилних јединки коришћењем адекватних тестова понашања. Најважнији литературни подаци који подржавају тему (до 10 референци): 1. Selemon LD. A role for synaptic plasticity in the adolescent development of executive function. Transl Psychiatry. 2013 Mar 5;3:e238. 2. Emery N. Brown, M.D., Ph.D., Ralph Lydic, Ph.D., and Nicholas D. Schiff, M.D. General Anesthesia, Sleep, and Coma. N Engl J Med. 363(27): 2638 2650, 2010. 3. Pesić V, Milanović D, Tanić N, Popić J, Kanazir S, Jevtović-Todorović V, Ruzdijić S. Potential mechanism of cell death in the developing rat brain induced by propofol anesthesia. Int J Dev Neurosci. 27(3):279-87, 2009. 4. Popić J, Pešić V, Milanović D, Todorović S, Kanazir S, Jevtović-Todorović V, Ruždijić S. Propofol-induced changes in neurotrophic signaling in the developing nervous system in vivo. PLoS One. 7(4):e34396, 2012. 5. Pešić V, Milanović D, Popić J, Smiljanić K, Tešić V, Kanazir S, Jevtović-Todorović V, Ruždijić S. Neonatal propofol anesthesia modifies activity-dependent processes and induces transient hyperlocomotor response to d-amphetamine during adolescence in rats. Int J Dev Neurosci 47:266-77, 2015. 6
6. Okamoto K, Bosch M, Hayashi Y. The roles of CaMKII and F-actin in the structural plasticity of dendritic spines: a potential molecular identity of a synaptic tag? Physiology (Bethesda). 2009 Dec;24:357-66. 7. Koleske AJ. Molecular mechanisms of dendrite stability. Nat Rev Neurosci. 2013 Aug;14(8):536-50 8. Benveniste H, Volkow ND. Dopamine-enhancing medications to accelerate emergence from general anesthesia. Anesthesiology. 2013 Jan;118(1):5-6. 9. Solt K, Van Dort CJ, Chemali JJ, Taylor NE, Kenny JD, Brown EN. Electrical stimulation of the ventral tegmental area induces reanimation from general anesthesia. Anesthesiology. 2014 Aug;121(2):311-9. 10. Baik JH. Dopamine signaling in reward-related behaviors. Front Neural Circuits. 2013 Oct 11;7:152. 7
Г. Закључак и предлог: Полазећи од предмета и циљева тезе, као и методолошких и експерименталних приступа који ће бити коришћени током израде, Комисија сматра да предложена тема докторске тезе кандидата Жељка Павковића представља битан допринос карактеризацији последица примене опште анестезије индуковане пропофолом у периоду адолесценције. Захваљујући вишестепеној анализи одговора на дати третман, предложена теза ће разјаснити утицај пропофолске анестезије на синаптичку пластичност, допаминску активност и понашање јединки. Разумевање утицаја опште анестезије на биолошки систем у адолесценцији, као фази динамичке матурације која значајно одређује психомоторно функционисање у каснијим фазама живота, има потенцијални клинички значај. Након комплетног сагледавања и анализе приложеног материјала, Комисија сматра да су резултати предвиђени овом докторском тезом научно оправдани и предлаже Наставнонаучном већу Биолошког факултета да одобри израду докторске тезе кандидата Жељка Павковића, под насловом: Eфекти анестезије индуковане пропофолом на синаптичку пластичност, активност допаминског система и понашање јувенилних пацова. Београд, (датум) године Комисија: Др Весна Пешић, виши научни сарадник, Универзитет у Београду - Институт за биолошка истраживања Синиша Станковић др Др Надежда Недељковић, редовни професор, Универзитет у Београду - Биолошки факултет др Др Селма Каназир, научни саветник, Универзитет у Београду - Институт за биолошка истраживања Синиша Станковић др 8