Letopis naučnih radova Godina 35 (2011), broj I, strana 104-109 UDK:636.09 Originalni naučni rad Original scientific paper KONCENTRACIJA IMUNOGLOBULINA U MLEČNOM I KRVNOM SERUMU HRONIČNO INFICIRANIH KRAVA SA COXIELLA BURNETII Miodrag Radinović, Stanko Boboš, Ivana Davidov, Mihajlo Erdeljan, Marija Pajić 1 REZIME Infekcija krava sa Coxiella burnetii najčešće protiče inaparentno, jedini klinički simptom može biti pojava abortusa i poremećaj reprodukcije. U oglednoj grupi krava sa serološki dokazanom Q groznicom uzimani su uzorci krvi i mleka radi kontrole nivoa imunoglobulina G. Svi uzorci su podeljeni po fazama laktacije. Najviša vrdenost imunoglobulina u mlečnom serumu je bila za vreme kolostralne faze kada je iznosila 153,1 g/l. U krvnom serumu je izmerena najveća vrednost u uzrocima uzetim u vreme treće faze laktacije i iznosila je 95,4 g/l. Iz rezultata se uočava da postoje izražene varijacije u nivou imunoglobulina u mlečnom serumu dok je u krvnom serumu koncentracija imunoglobulina stabilna. Ključne reči: Coxiella burnetii, imunoglobulin, mlečni serum, krvni serum UVOD Coxiella burnetii je uzročnik jedne od najznačajnijih rikecioza koja je po učestalosti na prvom mestu u svetu i kod nas. Obilno i dugotrajno izlučivanje uzročnika od strane inficiranih životinja, dugotrajno preživljavanje uzročnika u prirodi i veoma mala infektivna doza za čoveka dodatno ističu značaj ove infekcije. Coxiella burnetii ima veoma širok spektar vektora i domaćina i dokazana je kod mnogih domaćih i divljih životinja, ptica i artropoda. U nastajanju infekcije ljudi primarnu ulogu imaju domaće životinje i njihovi produkti. Poseban značaj se pripisuje govedima,ovcama i kozama ali ne treba zaboraviti da i druge domaće životinje kao konji, psi i mačke mogu imati važnu ulogu u prenošenju infekcije na ljude. Kod pojave bolesti kod ljudi treba posebno ispitati da li je bilo kon- 1 1mr Miodrag Radinović, Teaching Assistant, dr Stanko Boboš*, Professor, mr Ivana Davidov, Teaching Assistant, Marija Pajić, DVM, Teaching Assistant, Mihajlo Erdeljan DVM, Teaching Assistant University of Novi Sad, Faculty of Agriculture, Novi Sad, corresponding author:miodrag Radinović, Faculty of Agriculture, Dositeja Obradovica 8, 21000 Novi Sad, tel.:021 485 3464, E-mail:radinovic@polj. uns.ac.rs 104
takta sa životinjama u vreme porođaja ali i sa novorođenim životinjama. Za nastajanje infekcije kod domaćih životinja značajan je primarni ciklus u prirodi te oboljevaju pre svih ovce, goveda i koze. Bolest kod njih često protiče asimptomatski a jedini simptom koji može da ukaže na ovu infekciju je pojava abortusa( Radinović et al, 2011). Inficirane životinje mogu izlučivati velike količine uzročnika u spoljnu sredinu mlekom, kolostrumom, urinom, fecesom i postpartalnim produktima(guateo et al, 2006). U životinjskim sekretima i ekskretima Coxiella burnetii može ostati infektivno sposobna mesecima pa i preko godinu dana. MATERIJAL I METOD Na farmi muznih krava urađen je serološki skrining na prisustvo antitela na Coxiella burnetii. Od svih krava su uzeti uzorci krvi venepunkcijom na veni jugularis uz primenu vakutajnera proizvođača BD Vacutainer Systems UK. Nakon uzorkovanja uzorci krvi su čuvani na sobnoj temperaturi da bi se izdvojio serum, a zatim su centrifugovani. Cenrtifugovanje uzoraka je vršeno na 2000 obrtaja u minutu u trajanju od 5 minuta. Posle centrifugovanja kada se serum jasno izdvojio urađeno je odlivanje seruma u epruvete pa su zatim uzorci ostavljeni na čuvanje u frižideru na temperaturi 2-8ºC. Uzorci mleka su uzimani za vreme jutarnje muže krava postavljanjem trutestera na muznu jedinicu prilikom muže inficiranih krava. Trutesteri se koriste da bi se od svake životinje uzeo prosečan uzorak mleka koji predstavlja reprezentativan uzorak za određivanje broja somatskih ćelija u mleku. Pomoću trutestera uzima se jednaka količina mleka u uzorak za sve vreme trajanja muže, a kako postoje oscilacije u broju somatskih ćelija na početku i na kraju muže ovakav način uzorkovanja je neophodan da bi se dobio adekvatan uzorak. Slika 1 trutester postavljen na muznu jedinicu Picture 1 treutester set on milking unit 105
Po dospeću u laboratoriju uzorci mleka se stavljaju u inkubator na inkubaciju u trajanju od 24-48 sati. Inkubacija se vrši na temperaturi od 38ºC a sa ciljem da se formira gruš i izdvoji mlečni serum. U one uzorke u kojima se posle inkubacije od 24 sata nije izdvojio mlečni serum dodaje se sirilo u količini od 0,1ml i oni se ostavljaju na dodatnu inkubaciju narednih 24 sata. Po završenoj inkubaciji kada dođe do izdvajanja gruša i mlečnog seruma, serum se odliva u epruvete. Zatima se stavlja na čuvanje na temperaturi od -20 ºC. Za određivanje koncentracije imunoglobulina u serumu korišćene su RID ploče proizvođača INEP Beograd. U RID pločama se nalazi monospecifičan antiserum prema goveđem IgG. Kao konzervans sadrže natrijum azid i mertiolat. Krvni i mlečni serumi su pre postupka stavljeni na sobnu temperaturu da bi se otopili i zagrejali na sobnu temperaturu. Nakon toga svaki serum je stavljan u električnu mućkalicu da bi se homogenizovao. Za pravljenje razređenja seruma korišćene su staklene epruvete zapremine 5 ml. U svaku epruvetu je naliveno 2,9 ml fiziološkog rastvora i 0,1 ml seruma da bi se dobilo razređenje od 1/30. Nakon pravljenja razređenja svaka epruveta je stavljena u električnu mućkalicu da bi se rastvor homogenizovao. Pomoću pipete uzeto je 5μl svakog seruma i ta količina je ukapana u bazenčiće na RID pločama. Nakon ukapavanja ispitujućeg seruma ploče su ostavljene na sobnoj temperaturi u horizontalnom položaju na inkubaciju. Očitavanju se pristupilo posle 48 časova. Očitavanje se vrši merenjem prečnika precipitinskog prstena. Prečnik se meri pomoći RID metra sa preciznošću od 0,1 mm. Dobijena vrednost se pomoću formule preračunava u koncentraciju imunoglobulina u ispitivanom serumu. Formula za izračunavanje glasi: C= ((R 2 -b)/a) x 30, gde je R prečnik precipitinskog prstena, b je konstanta čija je vrednost 8,69, a je konstanta čija je vrednost 47,48. Dobijena vrednost predstavlja koncentraciju IgG u serumu. Slika 2 Izgled RID ploče nakon inkubacije Picture 2 RID plate after incubation 106
REZULTATI ISTRAŽIVANJA I DISKUSIJA Koncentracija imunoglobulina G u krvnom serumu hronično inficiranih krava imala je stabilnu vrednost tokom celog proizvodnog ciklusa. Određivanje koncentracije imunoglobulina je vršeno tokom laktacije i u periodu zasušenja. Podaci o izmerenim vrednostima koncentracije imunoglobulina u krvno serumu su prikazani u tabeli 1. Tabela 1 Koncentracija imunoglobulina u krvnim serumuma Table 1 Immunoglobulin concentration in blood serums Faza laktacije I faza II faza III faza zasušenje Broj uzoraka 7 21 38 6 Koncentracija IgG 80,2 82,0 95,4 76,1 Koncentracija imunoglobulina G u serumu ispitivanih krava je bila tokom celog proizvodnog ciklusa povišena u odnosu na životinje slobodne od infekcije (Murphy et al, 2005). Smanjenje koncentracije imunoglobulina u fazi zasušenja je najverovatnije posledica imunosupresije u završnoj fazi graviditeta. Analizom uzoraka mlečnog seruma ispitivanih krava zapazili smo izraženu oscilacije između pojedinih faza laktacije. Podaci o koncentraciji imunoglobulina u mlečnom serumu prikazani su u tabeli 2. Tabeli 2 Koncentracija imunoglobulina u mlečnim serumuma Table 1 Immunoglobulin concentration in milk serums Faza laktacije Kolostralna faza I faza II faza III faza Broj uzoraka 4 6 10 33 Koncentracija IgG 153,1g/L 5,0 g/l 4,0 g/l 8,4 g/l Koncentracija imunoglobulina u kolostrumu je povišena u odnosu na vrednosti kod neinficiranih krava (Muller, and Ellinger, 1981). U uzrocima mlečnog seruma uzetim tokom laktacije izmerena koncentracija imunoglobulina G je u okvirima koji odgovaraju vrednostima kod neinficiranih krava (Boboš, 2005). Izraženo povećanje koncentracije imunoglobulina u kolostrumu kod inficiranih krava može se dovesti u vezu sa početkom izlučivanja uzročnika putem kolostruma nakon partusa. 107
ZAKLJUČAK Analizom uzoraka mlečnog i krvno seruma od hronično inficiranih krava može se zaključiti da postoje određena odstupanja u odnosu na vrednosti kod neinficiranih krava. Kod hronično inficiranih životinja prisutno je stalno povećanje koncentracije imunoglobulina u krvnom serumu. Ostaje da se u daljim istraživanjima ispita da li se i u hroničnom toku može dokazati prisustvo uzročnika u krvnom serumu. U mlečnom serumu, vrednosti koncentracije imunoglobulina su u okvirima fizioloških vrdnosti a jedino u kolostralnoj fazi se zapaža povišena vrednost. U daljim istraživanjima potrebno je ispitati dinamiku izlučivanja uzročnika mlekom tokom pojedinih faza laktacije. LITERATURA 1. BOBOŠ, S., VIDIĆ, B.: Mlečna žlezda preživara-morfologija-patologija-terapija. Novi Sad, 2005. 2. Guateo, R., Beaudeau, F., Beri, M., Rodolakis, A., Joly, A., Seegers, H.: Shedding routes of Coxiella burnetii in dairy cows: implications for detection and control. Vet. Res, 37: 827-833, 2006. 3. RADINOVIĆ, M., BOBOŠ, S., DAVIDOV, I., PAJIĆ,M., ERDELJAN,M., ĆUTUK, R.: The influence of chronic Coxiella burnetii infection on changes in blood screen in cows. 22nd International symposium Food safety production Trebinje, 2011. 4. Muller, L.D. and Ellinger, D.K.. Colostral immunoglobulin concentrations among breeds of dairy cattle. Journal of Dairy Science,1981 5. Murphy, B.M., Drennan, M.J., O Mara and, F., Earley, B.: Cow serum and colostrum immunoglobulin 6. (IgG1) concentration of five suckler cow breed types and subsequent immune status of their calves, Irish Journal of Agricultural and Food Research 44: 205 213, 2005 108
CONCENTRATION OF IMMUNOGLOBULIN IN MILK AND BLOOD SERUM OF CHRONICALLY INFECTED COWS WITH COXIELLA BURNETII by Miodrag Radinović, Stanko Boboš, Ivana Davidov, Mihajlo Erdeljan, Marija Pajić SUMMARY Infection with Coxiella burnetii in cows usually flows inapparent, the only clinical symptom may be the occurrence of abortion and reproduction disorders. In the experimental group of cows with serologically proven Q fever were taken samples of blood and milk for the control of immunoglobulin G. All samples were divided in stages of lactation. The highest value of immunoglobulin was in colostral phase and it was 153,1 g/l. The blood serum was measured in the cause of the greatest value taken during the third stage of lactation and amounted to 95.4 g / L. The results are evident that there are marked variations in the level of serum immunoglobulins in milk serum while in blood serum immunoglobulin concentration is stable. Keywords: Coxiella burnetii, immunoglobulin, milk serum, blood Prihvaćeno: 30.10.2011. Primljeno: 12.11.2011. 109