UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO-MATEMATIĈKI FAKULTET DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU VANJA V. STOJANOVIĆ Efekti ekstrakta kantariona (Hypericum perfora

UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO-MATEMATIĈKI FAKULTET DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU VANJA V. STOJANOVIĆ Efekti ekstrakta kantariona (Hypericum perforatum L.) na vijabilnost i proliferaciju HeLa ćelija in vitro M A S T E R R A D Niš, 2012.

UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO-MATEMATIĈKI FAKULTET DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU Efekti ekstrakta kantariona (Hypericum perforatum L.) na vijabilnost i proliferaciju HeLa ćelija in vitro M A S T E R R A D KANDIDAT: MENTOR: Vanja V. Stojanović Prof. Dr Stevo Najman Niš, Decembar 2012.

propasti Ĉovek je roċen da radi, da trpi i da se bori, ko tako ne ĉini, mora Nikola Tesla U svoj master rad uložio sam puno rada, vremena i strpljenja, ali svakako da svoju neizmernu zahvalnost dugujem i ljudima oko sebe bez kojih ne bih mogao da realizujem svoje zamisli. Zahvaljujem se osoblju i Institutu za biologiju sa humanom genetikom, Medicinskog fakulteta u Nišu na kojem je realizovan eksperimentalni deo ovog master rada. Posebno se zahvaljujem prof. dr Stevi Najmanu, čoveku koji mi je od početka studija dosta pomogao u sticanju profesionalnih znanja, iskustava i tehnika iz oblasti molekularne biologije, citologije, genetike i radu sa laboratorijskim životinjama i koji se osim svog izuzetnog znanja i profesionalnosti ističe i izvanrednim ljudskim kvalitetima, a meni je bila čast da mi upravo on bude mentor pri izradi ovog master rada. Prof. dr Stevo Najman mi je pružio veliku podršku i ogromnu pomoć prilikom odabira teme, upućivanja u način rada, materijal i metode kao i tumačenju rezultata, ali i tokom celog procesa realizacije. Veliku zahvalnost dugujem i asistentkinji Jeleni Najdanović koja je uložila veliki deo svog vremena i pružila mi ogromnu pomoć prilikom eksperimentalnog dela rada i tumaĉenju dobijenih rezultata. Naročitu zahvalnost dugujem porodici i prijateljima koji su bili uz mene sve vreme i pružili mi veliku podršku. Ovaj rad posvećujem mojim roditeljima s ljubavlju

SAŽETAK Cilj ovog rada bio je da se utvrde efekti ekstrakta kantariona (Hypericum perforatum L.) na vijabilnost i proliferaciju HeLa ćelija in vitro. U tu svrhu uraċeno je ispitivanje delovanja razliĉitih koncentracija ekstrakta kantariona u obliku komercijalnog preparata Biosenzal -a na HeLa ćelije. Ispitivane su efektivne doze Biosenzala od 0,625, 1,25%, 2,5%, 5%, 10% i 15%. Pošto je biosenzal alkoholni ekstrakt, odgovarajuće koncentracije etanola sluţ ile su kao kontrola rastvaraĉa. Negativna kontrola su bile ćelije u ĉistom medijumu. Pozitivna kontrola citotoksiĉnosti bio je saponin, a citostatiĉnosti 5-fluorouracil. Vijabilnost ćelija na 24 sata i proliferacija ćelija na 72 sata su ispitivane pomoću MTT testa. Eksperiment je ponovljen tri puta, a u svakom eksperimentu su uzorci testirani u tetraplikatu. Ustanovljena je dozna zavisnost delovanja ekstrakta kantariona i na vijabilnost i proliferaciju HeLa ćelija.

ABSTRACT The aim of this study was to determine the effects of St. John's wort (Hipericum perforatum L.) extract on viability and proliferation of HeLa cells in vitro. For this purpose was done the examination of the effects on HeLa cells caused by different concentrations of hipericum extract in the form of commercial product of Biosenzal. The effective doses of Biosenzal which were examined are 0,625%, 1,25%, 2,5%, 5%, 10% and 15%. Since Biosenzal is an alcoholic extract, the appropriate concentrations of ethanol were used as a solvent control. Negative controls were cells in the pure medium. Positive controls of cytotoxicity were cells in saponin and positive controls of the cytostatic effect were cells in 5- Fluorouracil. Viability of cells after 24 hours and proliferation of cells after 72 hours, were investigated by using MTT test. The experiment was repeated three times, and in each experiment the samples were tested in quadruplicate. Dose dependence of effects caused by hypericum extract on viability and proliferation of HeLa cells were determined.

SADRŽAJ: 1. UVOD... 1 1.1 HIPERICUM PERFORATUM L. (KANTARION)... 1 1.2 HeLa ĆELIJSKA LINIJA... 6 1.3 PREGLED LITERATURE... 10 1.4 ĆELIJSKA KULTURA... 12 2. POSTAVLJANJE PROBLEMA I CILJ RADA... 14 3. MATERIJAL I METODE... 15 3.1 MATERIJAL... 15 3.1.1 HeLa ĆELIJE... 15 3.1.2 BIOSENZAL... 15 3.1.3 SAPONIN... 15 3.1.4 FLUOROURACIL... 15 3.1.5 ETANOL...16 3.1.6 MEDIJUM... 16 3.1.7 TRIPSIN EDTA... 16 3.1.8 PBS... 17 3.1.9 MTT... 17 3.1.10 TRIPAN PLAVO (TRYPAN BLUE)... 17 3.2 LABORATORIJSKA OPREMA... 18 3.2.1 INKUBATOR... 18 3.2.2 MIKROSKOP... 18 3.2.3 CENTRIFUGA... 19 3.2.4 VIŠEKANALNI FOTOMETAR (ELISA READER)... 19 3.3 METODOLOGIJA RADA SA ĆELIJAMA... 20 3.3.1 ZAMENA MEDIJUMA... 20 3.3.2 BROJANJE ĆELIJA... 20 3.3.3 PASAŢA ĆELIJA... 22

3.3.4 ZAMRZAVANJE ĆELIJA... 23 3.3.5 ODMRZAVANJE ĆELIJA... 23 3.3.6 PRIPREMA RASTVORA ZA TESTIRANJE... 24 3.3.7 PRAVLJENJE RADNOG RASTVORA TRYPAN BLUE... 27 3.4 MTT TEST... 27 3.4.1 ESEJ VIJABILNOSTI / CITOTOKSIĈNOSTI... 29 3.4.2 ESEJ PROLIFERATIVNOSTI / CITOSTATIĈNOSTI... 29 4. EKSPERIMENTALNI DIZAJN... 30 5. REZULTATI I DISKUSIJA... 32 5.1 CITOTOKSIĈNOST (VIJABILNOST)... 33 5.2 CITOSTATIĈNOST (PROLIFERACIJA)... 41 6. ZAKLJUĈAK... 49 7. LITERATURA...... 50 8. BIOGRAFIJA... 54 KLJUĈNA DOKUMENTACIJA FAKULTETA... 55

1. UVOD 1.1 HIPERICUM PERFORATUM L. (KANTARION) Hipericum perforatum L. (eng. St. John s wort) ili u narodu poznat pod nazivom kantarion (slika 1), ali i bogorodiĉina trava i gospino zelje je lepa biljka koja uglavnom raste na sunĉanim padinama i suvim livadama ali i po ivicama borove šume. Vrsta pripada familiji Hipericaceae. Naziv St. John's wort ili biljka Svetog Jovana pod kojim je opštepoznata dobila je zahvaljujući periodu cvetanja, oko datuma ovog praznika odnosno krajem juna i poĉetkom jula meseca. Njegovi svetlo zlatni cvetovi ĉine ga jednom od najlepših biljnih vrsta u biljnom carstvu. Dve neobiĉne karakteristike ĉine kantarion lakim za identifikaciju. Prvo, kada se lišće drţ i prema svetlu, mogu se videti providne taĉkice kao da je lišće perforirano pa otuda i latinski naziv perforatum. Inaĉe ove taĉkice predstavljaju ţ lezde sa sekretovanim etarskim luĉenjem. Drugo, stabljika ima dve oštre ivice što je vrlo znaĉajna karakteristika. Ĉeste su biljke sa okruglim ili ĉetvoroiviĉnim stabljikama dok su redje one sa dvoiviĉnim. Hipericum perforatum je jedini predstavnik svoje familije sa dvoiviĉnom stabljikom (1). Slika 1. Hipericum perforatum L. Kantarion (2,3) 1

Druge dve podvrste imaju stabljike koje izgledaju tako da imaju krilasta pojaĉanja duţ iviĉnih delova. Te podvrste su Hipericum quandrangulum odnosno ĉetvoroiviĉni Hipericum i Hipericum tetrapterum odnosno ĉetvorokrilni Hipericum. Obe vrste su manje od Hipericum perforatum-a, naseljavaju vlaţ ne livade i ne koriste se u medicinske svrhe. Drogu kantariona, ĉine osušeni vršni delovi u cvetu. PotvrĊeno je da su pupoljci cvetova najbogatiji sastojcima. Kantarion se sakuplja u poĉetnoj fazi cvetanja, preĉisti se i brzo suši na temperaturi koja ne prelazi 40ºC. Do skora se herba dobijala od samoniklih biljaka, ali poslednjih godina postoje zahtevi za gajenjem kantariona u Nemaĉkoj, Poljskoj i Juţ noj Americi. Svetle taĉke na listovima kantariona su sekretorne ţ lezde koje sadrţ e bezbojnu teĉnost sastavljenu od isparljivih ulja i smole. Brojne male crne taĉke postaju vidljive nakon boljeg pregleda ĉašiĉnih i kruniĉnih listića. Kada se protrljaju izmeċu prstiju izlazi crveni pigment. Ovaj pigment koji se nalazi kroz celu biljku je još jedna posebna osobina jer dosta sadrţ i fotosenzitivnu supstancu. Ovaj fotosenzitivni uticaj je prvi put otkriven kod goveda koja su konzumirala kantarion u velikim koliĉinama, a kod kojih se kasnije stvorila upale koţ e na pojedinim mestima nakon duţ eg izlaganja suncu. U nekim sluĉajevima su se kod goveda javile i opekotine i to ĉak i sa mehurovima. Sliĉne iritacije koţ e takoċe se mogu pojaviti i kod ljudi nakon intenzivne upotrebe kantariona i naknadne izloţe nosti intenzivnom suncu. Fotodinamiĉka supstanca koja se nalazi u kantarionu zove se hipericin (slike 2 i 3). Uĉinak hipericina je sliĉan uticaju hematoporfirina, sintetiĉkog proizvoda razgradnje hemoglobina koji ima antidepresivno delovanje (1). Slika 2. Trodimenzionalna struktura hipericina (4) Slika 3 Strukturna formula hipericina (5) 2

Osim hipericina, kantarion sadrţ i i brojne druge hemijski aktivne elemente i to: etarsko ulje (0,1%), heterozide fenolkarbonskih kiselina i flavonoida (4-5%), kvercetin, izokvercetin, rutin, hiperozid, amentoflavon, hlorogensku kiselinu, procijanidine i kondenzovane tanine (6,5-15%), naftodiantronska jedinjenja (0,1-0,5%), pseudohipericin, protohipericin, protopseduohipericin, derivate floroglucinola (hipertrofin i pseudohipertrofin), ksantonska jedinjenja magniferinskog tipa, ugljovodonike (n-alkane), alkohole (n-alkonole), triterpene i sterole. Ove supstance koje se javljaju imaju izraţ ene uĉinke u inhibiciji monoamin oksidaze (MAO). In vitro ispitivanja su pokazala da ksantoni u kantarionu imaju sliĉan efekat. Cela biljka (Hiperici herba) se priprema kao ĉaj, sveţ sok ili ekstrakt sa procentom hipericina od 0,2-1 mg (6). Farmakološka aktivnost kantariona je do danas ostala nedovoljno objašnjena uprkos brojnim sprovedenim istraţ ivanjima. Na osnovu istraţ ivanja na ţ ivotinjama za kantarion je utvrċeno da ima svojstvo inhibiotora MAO (monoamin oksidaze). Ipak, te koncentracije hipericina nisu odgovarajuće za primenu na ljudima. Istraţ ivanja su pokazala da je celokupno dejstvo ekstrakta kantariona veće je nego dejstvo samo izolovanog hipericina. Rezultati raznih eksperimenata potvrċuju da kantarion pokazuje aktivnost, ali da ipak, antidepresivni efekat kantariona podleţ e raznim diskusijama. Dokazano je da nedostatak svetlosti i smanjenje nivoa melatonina u telu uzrokuju depresiju. Ova istraţ ivanja vode ka primeni fototerapije u psihijatriji. Zbog fotosenzitivnosti, osobine koju kantarion poseduje, on bi mogao biti upotrebljen za bolje iskorišćenje svetlosti (1). Kantarion ima veliku primenu. Još su stari Grci i kasnije Paracelzijus upotrebljavali kantarion u leĉenju psihiĉkih poremećaja. U narodnoj medicini se koristi kao antidijaroik zahvljujući prisustvu tanina i diuretik zbog prisustva flavonoida. TakoĊe se koristi i za leĉenje reumatizma, gihta, noćnog mokrenja u postelji i dr (7). J. Tucakov (1971) je istakao da je kantarionov zejtin vekovni lek za ljude i ţ ivotinje i da je poslednjih godina ušao u nauĉnu medicinu, veterinu i kozmetologiju, ali i da se kantarion oduvek u narodu cenio i upotrebljavao za leĉenje opekotina, posekotina, hemoroida, zarašćivanje rana i kao antiseptik, protiv bolova jetre, ţ eluca, pojavu proliva i dr (8). Kantarionovo ulje (Oleum Hyperici) takoċe se ĉesto koristi. Ovo ulje se priprema posebnom tehnikom, a svrha je dobijanje aktivnog hipericina u što koncentrovanijem obliku. Ulje je pogodno za internu upotrebu, ali se obiĉno koristi eksterno za leĉenje trauma i mialgija. Macerat se pravi tako što se sveţ i cvetovi kantariona poliju uljem (obiĉno 3

maslinovim ili suncokretovim, slika 4). Boca u kojoj se pravi je ĉvrsto zapeĉaćena i ostavljena u umereno toplom okruţ enju u periodu od 6 nedelja, a izloţ ena je direktnoj sunĉevoj svetlosti. Proizvod, kantarionovo ulje, je lepa rubin-crvena teĉnost koja fluorescira tamno crveno do crvenkasto ţ uto pod uticajem svetlosti (1). Slika 4. Pravljenje kantarionovog ulja (9,10) U Rusiji se kantarion upotrebljava u obliku tinkture ili infuza kao antiinflamantorno i antiseptiĉno sredstvo kod katara creva, kolitisa, za ispiranje i mazanje desni i dr. Kliniĉke studije su pokazale da kantarion ima blago sedativno, antidepresivno i antianksiozno dejstvo. TakoĊe ima i antiflogistiĉno dejstvo zahvaljujući velikoj koliĉini flavonoida koje sadrţ i. Precizirane su sledeće indikacije kantariona: Unutrašnja upotreba: Psihovegetativni poremećaji. Blaga do umerena depresija. Anksioznost, nervoza i uznemirenost. Spoljašnja upotreba: Leĉenje traumatskih povreda. Leĉenje mialgija. 4

Antidepresivni efekat kantariona danas je veoma dokumentovan. Dosta modernih kliniĉkih ispitivanja su pokazala njegov antidepresivni efekat. Wagner (1995) je prikazao 26 kliniĉka ispitivanja koja su bila kompletno objavljena do sredine 1993. U ovim istraţ ivanjima kantarion je bio uporeċivan sa sintetiĉkim antidepresivima i placebo sredstvima. U odnosu na sintetiĉka sredstva, frekvencija neţ eljenih efekata bila je mnogo manja kod kantariona, dok je terapeutska efikasnost bila u nivou sintetiĉkih sredstava. U mnogim sluĉajevima kantarion je doveo do poboljšanja kognitivnih sposobnosti. Iskustva su pokazala da je potrebno minimum osam dana tretmana da bi se primetili pozitivni efekti, a uglavnom se koristi ĉetiri do šest nedelja dok se ne ostvari puna efikasnost (1). Iz svega moţ emo zakljuĉiti da kantarion (Hipericum perforatum L.) ima veoma široku medicinsku primenu a shodno tome od njega se spravljaju preparati u raznim oblicima (slika 5) koji se koriste na već opisane naĉine. Slika 5. Preparati kantariona (11, 12, 13, 14) U ispitivanjima sprovedenim u ovom radu korišćen je farmaceutski proizvod kantariona BIOSENZAL koji predstavlja kantarionov ekstrakt hipericina u alkoholnom rastvoru, a ispitivan je njegov uticaj u razliĉitim koncentracijama na vijabilnost i proliferaciju HeLa ćelija in vitro. 5

1.2 HeLa ĆELIJSKA LINIJA HeLa ćelije (slika 6) predstavljaju kancerski besmrtni tip ćelijske linije i najĉešće se koriste u nauĉnim istraţ ivanjima (15). Ime su dobile u ĉast pacijentkinje koja se zvala Henrieta Laks (Henrietta Lacks, 1920 1951) (slika 8.) iz ĉijeg su kancera grlića materice (cervical cancer) (slika 7) ćelije prvi put izolovane 8. februara 1951. (16). Henrieta Laks preminula je 4. oktobra 1951. od posledica kancera. Za razliku od mnogih drugih ćelijskih linija, HeLa ćelije su veoma izdrţ ljive i imaju veliku moć deobe (17, 18). Slika 6. HeLa ćelije (19, 20) Slika 7. Kancer grlića materice (21, 22) Ĉovek koji je uzeo i poĉeo da gaji ove ćelije bio je Dţ ordţ Oto Gej (George Otto Gey, 1899 1970) (slika 9) i to neposredno pre smrti pacijentkinje Laks. Ovo je bila prva ćelijska linija uspešno uzgojena u uslovima in vitro što je pruţ ilo veliku perspektivu budućim nauĉnim istraţ ivanjima. Oto Gej je davao ćelijske linije i metode za kultivisanje ćelija svakom nauĉniku koji je to traţ io, a sve za dobrobit nauke. Ovaj nauĉnik nije dobio odobrenje Henriete Laks i njene porodice da moţ e da uzgaja ćelije, ali u to vreme dozvola nije ni bila potrebna niti je bilo uobiĉajeno traţ iti je (23). Ćelije su potom komercijalizovane iako nikada nisu patentirane u svojoj izvornoj formi. U to vreme, kao ni sada, pacijent se ne mora obaveštavati o takvim stvarima jer materijal dobijen tokom operacija ili tretmana ostaje 6

u vlasništvu lekara ili biomedicinske ustanove (trenutno se u tu svrhu zahteva etiĉko odobrenje i saglasnost pacijenata u Velikoj Britaniji). Ovo pitanje i sluĉaj Henriete Laks je dospelo na sudu u Kaliforniji. Sud je doneo odluku da odbaĉeno tkivo i ćelije nisu više u vlasništvu pacijenta i da mogu biti komercijalizovani (24). U poĉetku je reĉeno da će ime ćelijske linije biti Helen Lane ili Helen Larson kako bi se zaštitila privatnost Henriete Laks. Uprkos tome, njeno ime poĉelo da se pominje u štampi nekoliko godina posle njene smrti. Za HeLa ćelije se kaţ e da su besmrtne, jer mogu da se u ćelijskoj kulturi pod povoljnim uslovima dele neograniĉen broj puta. Postoje mnogi sojevi HeLa ćelija i one i dalje evoluiraju u ćelijskim kulturama. Ipak, sve one, nastale su od istih tumorskih ćelija uzetih iz tela Henriete Laks. Procenjuje se da broj ćelija koji je do sada umnoţ en, daleko prevazilazi ukupan broj ćelija koji je saĉinjavao njeno telo (25). Slika 8. Henrietta Lacks (26) Slika 9. George Otto Gey (27) HeLa ćelije je pedesetih godina koristio Dţ onas Salk (Jonas Salk) radi testiranja vakcine protiv deĉje paralize. Od tada se ove ćelije koriste u istraţ ivanjima kancera, AIDS-a, efekata radijacije i toksiĉnih supstanci, mapiranju gena i u raznim drugim istraţ ivanjima (28). Prema autoru Rebeki Sklut (Rebecca Skloot) do 2009. je objavljeno više od 60 000 nauĉnih ĉlanaka raċenih na HeLa ćelijama i taj broj konstantno raste za više od 300 meseĉno (24). TakoĊe se koriste i za testiranje procesa infekcije parvovirus-om kod ljudi, pasa i maĉaka kao i za ispitivanja delovanja virusa, na primer Oropouche virus (OROV), koji izaziva poremećaj ćelija u ćelijskim kulturama i koji vrlo brzo nakon inficiranja izaziva virusnu indukciju 7

apoptoze (29, 30). HeLa ćelije se takoċe koriste u istraţ ivanjima ekspresije papiloma virusa E2 i apoptoze, ali i prouĉavanju virusa štenećaka i njegove sposobnosti da indukuje apoptozu u HeLa ćelijskim linijama (31). Sposobnost ovog virusa da indukuje apoptozu moţ e biti od kljuĉnog znaĉaja u razvoju tretmana tumorskih ćelija otpornih na radijaciju i hemoterapiju (32). HeLa ćelije su izrazito pogodne za prouĉavanje ćelija kancera jer se umnoţ avaju abnomarlno brzo ĉak i u poreċenju sa drugim ćelijama raka (33). Ove ćelije kao i druge ćelije raka, imaju aktivnu verziju telomeraze tokom ćelijske deobe što spreĉava skraćivanje telomera a time i starenje i smrt ćelija (34). Na taj naĉin, ove ćelije zaobiċu takozvani Hayflick Limit koji oznaĉava ograniĉeni broj ćelijskih deoba dok kroz taj proces prolaze sve normalne ćelije. Zahvaljujući horizontalnom transferu gena, humanog papiloma virusa 18 (HPV 18) koji je najĉešće integrisan u ćelije kancera grlića materice, genom HeLa ćelija je znatno izmenjen od genoma ćelija Henriete Laks i to na razliĉite naĉine ukljuĉujući i broj hromozoma. HeLa ćelije imaju 82 hromozoma sa po 4 kopije hromozoma 12 i po tri kopije hromozoma 6, 8 i 17. Genom HeLa ćelija je neverovatno stabilan posle toliko godina kultivacije. S toga, detektovane genetske promene verovatno su bile prisutne u prvobitnom tumoru i reflektuju dogadjaje koji su od znaĉaja za razvoj raka grlića materice (24, 26, 35). Zbog njihove dobre adaptacije u plejtovima i inkubatorima u ćelijskoj kulturi, ponekad ih je teško kontrolisati. Dokazano mogu da kontaminiraju druge ćelijske linije što istraţ ivaĉe prisiljava da mnoge rezultate proglase nevaţ ećim. Stepen kontaminacije izmeċu HeLa i ostalih tipova ćelija nije poznata jer je malo istraţ ivaĉa testiralo identitet ĉistoće već uspostavljenih ćelijskih linija. Pokazalo se da je znaĉajan deo u linijama in vitro, a procene se kreću od 10%-20%, kontaminiran HeLa ćelijama. Stenli Gartler (Stanley Gartler, 1967) i Valter Nelson Ris (Walter Nelson-Rees, 1975) su prvi objavili kontaminaciju razliĉitih ćelijskih linija od strane HeLa (36). Nauĉnik Majkl Gold (Michael Gold) pisao je o kontaminaciji HeLa ćelijama u svojoj knjzi Zavera ćelija (Conspiracy of Cells). On je to opisao kao opšti problem koji se javlja ĉak i kod najboljih nauĉnika i u najboljim laboratorijama i institutima, zbog ĉega mnogi prestaju time da se bave istraţ ivanjima u tom smeru (37). Kontaminacija HeLa ćelijama umalo nije dovela do hladnog rata izmeċu Amerike i Sovjetskog Saveza pošto su na insistiranje predsednika Riĉarda Niksona (Richard Nixon) Amerika i Sovjetski savez poĉeli da saraċuju u istraţ ivanjima u borbi protiv raka. Nelson-Ris objašnjava da je ljudski grešiti, da mnogi nauĉnici i istraţ ivaĉi nisu spremni da bace svo uloţ eno vreme u istraţ ivanja, jer su najĉešće vremenski ili materijalno uslovljeni na neki naĉin, da nauĉnici na mnogim poduhvatima prave greške i da svi imaju isti problem. 8

Umesto da se fokusiraju na rešavanje problema, mnogi nauĉnici predstavljaju problem kontaminacije jednostavno kao problem uzrokovan neljudskom greškom. Poslednji podaci ukazuju na to da je unakrsna kontaminacija HeLa ćelijama i dalje glavni problem u ćelijskim kulturama savremenih istraţ ivanja. Koliko je veliki problem kontaminacije HeLa ćelijama govori i podatak da se na stranici ICLAC-a (The International Cell Line Authentication Committee) kaţ e da je problem kontaminacije mnogo veći nego što mnogi o tome ţ ele da govore (37). Zbog svoje velike moći deobe, kao i razliĉitog broja hromozoma u odnosu na ljudske ćelije, Li Van Valen (Leigh Van Valen) je HeLa ćelije opisao kao savremeni primer nastanka nove vrste Helacyton gartleri. Ćelijska linija je nazvana po Stenliju Gartler-u (Stanley M. Gartler) koga je Van Valen povezivao sa otkrićem neverovatnog uspeha nove vrste (38). Njegov argument za specijaciju HeLa ćelija ogleda se u sledećim stavovima: Hromozomska inkopatibilnost sa ljudskim ćelijama. Ekološka niša HeLa ćelija. Njihova sposobnost da opstanu i prošire se izvan kultivatora. HeLa ćelije mogu biti definisane kao vrsta koja ima svoj liĉni klonalni kariotip. Ipak, ova Van Valen-ova definicija nije opšte prihvaćena od strane istraţ ivaĉa i nauĉnika. Van Valen je pored naziva vrste predloţ io i ime familije Helacytidae roda Helacyton. Klasifikacija HeLa ćelija prema Van Valenu mogla bi biti prikazana na sledeći naĉin (38): Carstvo Razdeo Klasa Red Familija Rod Vrsta Nepoznato Nepoznato Nepoznato Nepoznato Helacytidae Helacyton Helacyton gartleri Istraţ ivanje i rezultati predstavljeni u ovom radu baziraju se upravo na korišćenju HeLa ćelijske linije. 9

1.3 PREGLED LITERATURE Publikovana su brojna istraţ ivanja u kojima su ispitivani uticaji hipericina na vijabilnost i proliferaciju ćelija. U tu svrhu, ispitivani su i mehanizmi pomoću kojih hipericin ostvaruje svoj citotoksiĉan i citostatiĉan efekat na pojedine ćelijske linije. Novija istraţ ivanja sve više potvrċuju znaĉajno mesto hipericina u apoptozi (slika 10), zahvaljujući ĉemu bi mogao da naċe primenu u terapiji nekih tumora (39, 40). Foks i saradnici ispitivali su antiproliferativnu aktivnost hipericina na normalne, transformisane i maligne T-limfocite kao i mogućnost njegovog korišćenja u terapiji limfoproliferativnih koţ nih bolesti (41). PotvrĊeno je da je jedan od mehanizama kojim hipericin inhibira proliferaciju T-ćelija indukcija apoptoze ili programirane ćelijske smrti. TakoĊe je potvrċen dozno zavisni inhibitorni efekat na rast ćelija adenoma, koji se ostvaruje inhibicijom protein kinaze C (PKC) (42). Protein kinaza C, takoċe poznata kao PKC, je familija enzima koji kontrolišu dejstvo drugih proteina putem fosforilacije hidroksilnih grupa serinskih i treoninskih aminokiselinskih ostataka tih proteina. PKC enzimi se aktiviraju signalima poput povećanja koncentracije diacilglicerola ili Ca 2+. PKC enzimi imaju vaţ nu ulogu u nekoliko kaskada prenosa signala (43). Weller i saradnici (1997) su potvrdili da hipericin indukuje apoptozu na sedam ćelijskih linija malignog glioma, uz dozno vremensku zavisnost i fotostimulaciju (7, 44). MeĊutim, ova indukcija apoptoze iskljuĉuje kao uzrok inhibiciju sinteze RNK i proteina, a citotoksiĉnost hipericina ne dovodi u vezu sa inhibicijom protein kinaze C, niti indukcijom faktora nekroze tumora α (Tumor Necrosis Factor α TNFα) i CD95 liganada (7). Slika 10. Apoptoza - Programirana ćelijska smrt (45) 10

Sa sigurnošću se moţe reći da hipericin povećava cititoksiĉni efekat mnogih citostatika koji se koriste u terapiji tumora, meċutim, to dejstvo je tkivno specifiĉno i ne moţ e se objasniti jedinstvenim mehanizmom (7). Citotoksiĉni i citostatiĉni efekti hipericina dokazani su brojnim in vitro na ciljanim ćelijskim linijama. Vandenboegaerde i saradnici (1997) dokazali su da je citotoksiĉnost hipericina na HeLa ćelije u nanomolarnim koncentracijama direktno povezana sa fotosenzibilizacijom. To je odliĉan primer fotocitotoksiĉnosti a mehanizam kojim hipericin ostvaruje ovo dejstvo je inhibicija protein kinaze C (7, 46). Dokazano je metodom hemiluminiscencije da je hipericin antioksidans tj. da inhibira stvaranje slobodnih radikala. TakoĊe je dokazano i da deluje inhibitorno na aktivnost glutation reduktaze (7, 47, 48). Johnson i Pardini (1998) su kao kritiĉan trenutak za ispoljavanje fototoksiĉnosti hipericina predoĉili oštećenje mitohondrija. Inhibicija glutation reduktaze tj. izmena glutation pula koja pomaţ e citotoksiĉnost je još jedan od mehanizama kojim se mogu objasniti antiproliferativna svojstva hipericina i veliki znaĉaj kiseonika u ispoljavanju njegovih fototoksiĉnih efekata (48). Atsuši Vada (Atsushi Wada), Tošijuki Sakaeda (Toshiyuki Sakaeda) i saradnici (2002.) su ukazali na citotoksiĉan efekat hipericina na HeLa ćelije mehanizmom inhibicije ekspresije MDR1 gena, odnosno njegovog produkta P-glikoproteina 1 (glikoprotein permeabilnosti, P-gp, Pgp, protein otpornosti na višestruke lekove multidrug resistance protein) (slika 11). P-glikoprotein 1 je dobro poznati ABC-transporter (transportuje široki opseg supstrata kroz ćelijsku membranu). On je ĉlan MDR/TAP familije gena. Oni su takoċe dokazali uz citotoksiĉan efekat samog hipericina i povećanje citotoksiĉnog efekta citostatika, koji su u terapiji kancera korišćeni u kombinaciji sa ekstraktom kantariona, odnosno uz sudejstvo hipericina (49). Slika 11. P-glikoprotein pumpa naĉin funkcionisanja (50) 11

1.4 ĆELIJSKA KULTURA Savremena biomedicinska istraţ ivanja se sve više baziraju na korišćenju in vitro kultura ćelija, tkiva i organa. Fundamentalna istraţ ivanja u biologiji ćelije, molekularnoj biologiji, citogenetici, biohemiji, molekulrnoj genetici, fiziologiji, embriologiji, imunologiji, hematologiji, onkologiji, neurologiji i drugim nauĉnim disciplinama, široko se koriste metodama in vitro. Sliĉno je i sa raznim dijagnostiĉkim metodama, pre svega citogenetskim. In vitro metode su nezaobilazne i u mnogobrojnim farmakološkim i toksikološkim testiranjima. Prihvatanje Raselovog i Barĉovog principa 3R (smanjenje broja ţ ivotinja Reduction, usavršavanje ogledne procedure Refinement i zamena oglednih ţ ivotinja neanimalnim tehnikama Replacement) za rad sa eksperimentalnim ţ ivotinjama i zahtevi izdavaĉa nauĉnih publikacija da se poštuje etika rada sa ekperimentalnim ţ ivotinjama na ovim principima, usmerila su raznovrsna istraţ ivanja prema in vitro metodama, kao zamenu za in vivo metode (51). Ćelijska kultura predstavlja ćelije, tkiva i organe u in vitro uslovima koji traju više od 24h i gde se ispituje ponašanje ćelija u kontrolisanim uslovima, što nije sluĉaj u organizmu. In vitro metode imaju odreċene prednosti, ali i nedostatke. Prednosti metoda in vitro se ogledaju u sledećem: Ne dolazi do varijacija koje postoje u organizmu. Kontrola uslova sredine za rast ćelija unifomiše uzorak. Kakteristike ćelija mogu biti saĉuvane tokom više generacija, tako da se dobija dobra reproducibilnost eksperimenta. Ćelije mogu biti izlagane supstancama u definisanim koncentracijama, odnosno fiziĉkim agensima definisanog intenziteta. Izbegavaju se legalni, moralni i etiĉki problemi vezani za eksperimente na ţ ivotinjama. Znatno niţ i troškovi ispitivanja. Nedostaci metoda in vitro ogledaju se u sledećem: Moraju se razviti standardizovane tehnike da bi se saĉuvale reproducibilne ćelije za eksperimente. Potrebno je vreme da se usvoje aseptiĉne tehnike. 12

Male dimenzije uzorka, pa su potrebne osetljive metode za odreċivanje promena. Koliĉina materijala moţ e biti ograniĉena. Scale-up je vrlo zahtevan. In vitro uzorak ne mora biti identiĉan in vivo fenootipu ili genotipu. Moţ e doći do dediferencijacije i selekcije ćelija i mnogi originalni ćelijski mehanizmi mogu biti izgubljeni. Kako bi uopšte bilo moguće razvijati i odrţ avati ćelijsku kulturu in vitro potrebno je ispuniti odreċene zahteve u pogledu tehniĉkih uslova i okruţ enja, neophodnih suplemenata i medijuma, kao i opreme. Sve to regulisano je standardima a poznato je pod nazivom Dobra laboratorijska praksa (GLP - Good Laboratory Practice). Pod GLP-om podrazumevamo i pravila ponašanja, kao i mere predostroţ nosti koje se moraju primeniti pre, za vreme i posle rada sa ćelijskom kulturom. GLP je postignut kada se svi postupci sprovode pod standardom koji iskljuĉuje kontaminaciju bakterijama, gljivicama i mikoplazmom, kao i unakrsne kontaminacije sa drugim ćelijskim linijama. Radni prostor u radu sa ćelijama ĉine laminarni sterilni kabineti (komore), koji mogu biti horizontalni i kabineti klase II. Horizontalni laminarni protoĉni kabinet omogućuje najsterilnije uslove za ćelije, ali ne nudi zaštitu opereteru. Filtrira vazduh koji ulazi sa zadnje strane kabineta i usmerava se napred, direktno na operatera. Najdublji deo kabineta je najsterilniji. Kabineti klase II dizajnirani su da daju operateru zaštitu, kao i dobre sterilne uslove. Vazduh je usmeren sa vrha kabineta prema dnu na radnu površinu. U radu je neophodno da se nesterilni predmeti ne prenose preko sterilnih. Pošto je sterilni vazduh samo unutar kabineta, njegova prednja strana nije sterilna. U rutinskoj upotrebi su ĉešći ovakvi kabineti. Sa humanim ili primatskim ćelijama mora da se radi u ovom tipu kabineta. Ovakav kabinet korišćen je i prilikom eksperimenata sa HeLa ćelijama prilikom izrade ovog rada. Vrlo vaţ an uslov za rad u laboratoriji za ćelijsku kulturu je bezbednost lica koja rade u tom prostoru. U tom smislu treba biti veoma obazriv i drţ ati se uputstava ukoliko se radi sa kancerogenim, teratogenim, mutagenim ili bilo kojim drugim supstancama koje mogu ugroziti zdravlje, a osim toga treba voditi raĉuna i o pravilnom odlaganju biomedicinskog otpada (51). U eksperimentalnom delu ovog rada ispoštovani su svi detalji GLP-a, koji se tiĉu bezbednosti, pravilnog rada sa ćelijama, obezbeċivanja sterilnih uslova, ali i svih neophodnih materijala i primenjenih metoda. 13

2. POSTAVLJENJE PROBLEMA I CILJ RADA U današnjoj medicinskoj praksi ulaţ e se mnogo napora u pronalaţ enju novih oblika terapijskih indikacija i razvoju citostatika u borbi protiv malignih oboljenja. U tom smislu, a na osnovu ranijih iskustava, uradiće se ispitivanje delovanja ekstrakta kantariona na HeLa ćelije u kulturi in vitro. U tu svrhu koristiće se komercijalni preparat sa hipericinom (BIOSENZAL Zdravlje Leskovac), kao ekstraktom kantariona (Hypericum perforatum L.). Eksperimentalni cilj ovog rada je da se utvrde efekti razliĉitih koncentracija ekstrakta kantariona na vijabilnost i proliferaciju HeLa ćelija in vitro pomoću MTT testa. 14

3. MATERIJAL I METODE 3.1iMATERIJAL 3.1.1 HeLa ćelije HeLa ćelije su ćelije kancera grlića materice koje su prvi put ekstrahovane iz tela pacijentkinje Henriete Laks i predstavljaju besmrtni tip ćelijske linije. Njihova izvanredna sposobnost deobe omogućava nam da serijom pasaţ a dobijamo dovoljnu koliĉinu ćelija za postavljanje eksperimenata. HeLa ćelije ĉuvaju se zamrznute u teĉnom azotu odakle se odmrzavaju i kultivišu za potrebe eksperimenata (15, 33). 3.1.2 BIOSENZAL BIOSENZAL predstavlja fitopreparat u obliku biljnih kapi farmaceutske kuće Zdravlje iz Leskovca. Kao aktivnu komponentu sadrţ i teĉni alkoholni ekstrakt nadzemnog dela biljke kantariona (Extractum Hyperici herbe fluidum). Biosenzal štok sadrţ i 60% etanola, sa hipericinom u koncentraciji od 0,8 mg% kao aktivnom komponentom (7). 3.1.3 SAPONIN Saponini su posebna grupa glikozida koje u svom sastavu pored šećera imaju i triterpenska ili steroidna jedinjenja (52). U ovom radu saponin je korišćen kao pozitivna kontrola u eksperimentu citotoksiĉnosti u koncentraciji od 2 µg/ml. 3.1.4 FLUOROURACIL 5 Fluorouracil je hemoterapijski lek analog pirimidinu (53). U ovom radu korišćen je 15

kao pozitivna kontrola u eksperimentu citostatiĉnosti u koncentraciji od 1 µg/ml. 3.1.5 ETANOL Etanol je organsko hemijsko jedinjenje koje ĉine ugljenik, vodonik i jedna OH-grupa i jedan je od predstavnika alkohola. Vrlo ĉesto se koristi u laboratorijama jer je veoma dobar organski rastvaraĉ (54). U našim eksperimentima korišćen je u odgovarajućim koncentracijama kao kontrola rastvaraĉa. 3.1.6 MEDIJUM Medijum je teĉnost u kojoj ćelije rastu i on se bira na osnovu tipa ćelija. Osnovne karakteristike medijuma su: Fiziološke (ph, osmolarnost). Suprafiziološke (hormoni, hranjive supstance). Nefiziološke (boje, antibiotici). Svaka ćelijska linija koja se gaji ima svoje specifiĉne zahteve. HeLa ćelije se gaje u DMEM-u (Dulbeco s modified Eagle s medium) sa 10% FCS-a (fetalnog goveċeg seruma koji sadrţ i neophodne faktore rasta potrebne ćelijama), L-glutaminom (koji se zbog svoje nestabilnosti dodaje neposredno pre upotrebe) i kombinacijom antibiotika penicillinstreptomicin (51). 3.1.7 TRIPSIN EDTA Ćelije je u trenutku pasaţ e ili postavljanja u bunarĉiće (velove) plejta neophodno odvojiti od dna flaska u kome rastu i za ĉije su dno adherirane. Taj process odvajanja ćelija od dna flaska radi se upotrebom tripsina a sam process se po njemu naziva tripsinizacija. EDTA (eng. Ethylenediaminetetraacetic acid) je helator kalcijuma (vezuje jone kalcijuma - Ca) nakon ĉega tripsin (proteinaza) moţ e da deluje na proteine okoćelijskog matriksa koji povezuje ćelije. Tripsinizacija se radi veoma brzo i ne treba dozvoliti da Tripsin-EDTA 16

deluju duţ e od 3-5 min. Na fazno-kontrastnom mikroskopu se proverava da li su se ćelije odvojile od dna, ili još uvek nisu. Ukoliko je potrebno, flask treba i mehaniĉki blago protresti nekoliko puta kako bi se ćelije što pre odvojile i odmah nakon toga tripsinizaciju treba što pre prekinuti dodavanjem Hanks-a (51). 3.1.8 PBS Za odrţ avanje normalnih vrednosti PH u kulturama ćelija neophodno je koristiti pufere. PBS (eng. Phosphate buffer solution fosfatni pufer) se najĉešće koristi u biološkim istraţ ivanjima za odrţ avanje PH sredine. On nije toksiĉan za ćelije pa zbog toga ima mnogo namena. PBS moţ e da se upotrebljava kao rastvaraĉ nekih supstanci, kao i za ispiranje ćelija. U našem sluĉaju, PBS smo kao rastvaraĉ koristili pri pravljenju MTT-a (51). 3.1.9 MTT MTT je ţ uti prah koji se rastvara i njime deluje na ćelije u svrhu merenja njihove metaboliĉke aktivnosti. Metaboliĉki aktivne ćelije menjaju strukturu ţ utih tetrazolijumskih soli i stvaraju ljubĉasti formazan, koji se kasnije oĉitava na spektrofotometru i na osnovu toga se donosi zakljuĉak o ćelijskoj aktivnosti. U ovom radu je korišćen rastvor od 5mg MTT/ml PBS-a. Rastvor MTT-a se zamrzava, a neposredno pre MTT testa odmrzne. U velove za izvoċenje MTT testa se dodaje 20 mikrolitara MTT-a i 100 mikrolitara PBS-a (51). 3.1.10 TRIPAN PLAVO (TRYPAN BLUE) Tripan plavo (eng. Trypan blue) je boja koja se u radu sa ćelijskim kulturama koristi za selektivno bojenje ćelija. Prilikom pasaţ e ćelija neophodno je znati njihov broj u 1 ml kako bi se znalo koja koliĉina suspenzije treba da se zaseje u novi flask ili postavi u bunarĉiće plejta. Zbog toga se pravi preparat sa ćelijama koje se broje pod mikroskopom. Kako je ćelijska membrana selektivno propustljiva, ţ ive ćelije ne usvajaju ovu boju. 17

MeĊutim, kod mrtvih ćelija integritet membrane je narušen zahvaljujući ĉemu boja prodire u ćelije i boji ih u plavo. Boja Tripan plavo je dobila naziv po osobini da ubija tripanozome, parazite koji izazivaju bolst spavanja. Zahvaljujući ovoj boji na precizan naĉin moţ emo da odredimo broj ćelija koje ispitujemo, a boja se sa sadrţ ajem u kojem su ćelije meša u odnosu 1:1, a zatim nanosi na ploĉicu koja se potom posmatra pod mikroskopom (51). 3.2 LABORATORIJSKA OPREMA 3.2.1 INKUBATOR Savremene biološke laboratorije su opremljene najraznovrsnijom laboratorijskom opremom. Jedan od ureċaja koji predstavlja standardnu opremu za rad sa ţ ivim ćelijama u kulturi in vitro je inkubator. Inkubator je ureċaj koji se koristi za rast i odrţ avanje mikrobioloških i ćelijskih kultura. Inkubator odrţ ava optimalnu temperaturu, vlaţ nost i druge uslove kao što je ugljen dioksid (CO 2) i kiseonik (O 2 ). U laboratoji za ćelijsku kulturu koriste se takozvani CO 2 i O 2 inkubatori, u zavisnosti od toga koji gas se kontroliše u njemu. Postoje i kombinovani inkubatori (51). 3.2.2 MIKROSKOP Mikroskop je instrument koji uvećava prostom oku nevidljive ili slabo vidljive objekte i razdvaja bliske taĉke na njima koristeći elektromagnetna talasna zraĉenja razliĉitih talasnih duţ ina. Mikroskopom moţ emo videti sliku predmeta pod mnogo većim uglom od onog kojim bi ga videli golim okom u normalnoj vidnoj daljini. Nauka istraţ ivanja malih predmeta koja koristi ovakve instrumente naziva se mikroskopija, a termin mikroskopski ima znaĉenje veoma mali odnosno slabo vidljiv golim okom (55). Neizbeţ an u svakoj laboratoriji je svetlosni mikroskop (slika 12). Njega koristimo za najjednostavnija posmatranja obojenih preparata, posmatranje struktura, brojanje ćelija itd. 18

Njegova mana je osim slabijeg uvećanja i nemogućnost da se posmatraju neobojeni preparati, a samim tim i ţ ive eukariotske ćelije - u našem sluĉaju HeLa ćelije. Instrument zahvaljujući kome moţ emo da posmatramo ţ ive ćelije bez bojenja i pratimo njihovu aktivnost, pokrovnost flaska itd. je faznokontrastni mikroskop (slika 13). Faznokontrastni (FK) mikroskop koristi se prvenstveno za jednostavne mikroskopije histoloških iseĉaka debljine 5-20μm, dobijenih rezanjem mikrotomom. (51,56). Slika 12 Svetlosni mikroskop (56) Slika 13 Fazno-kontrastni mikroskop 3.2.3 CENTRIFUGA Za razdvajanje bioloških ĉestica razliĉitih veliĉina koristi se centrifuga. U radu sa ćelijama, neophodno je prilikom pasaţ iranja ćelije odvojiti (u našem sluĉaju HeLa ćelije) od suspenzije nakon tripsinizacije. U tu svrhu koristi se centrifuga koja se podešava na 1200 rpm u periodu od 10 min. Nakon centrifugiranja ćelije se izdvajaju na dno epruvete dok se iznad nalazi supernatant (slika 23) koji se potom izbacuje pipetom (51, 57). 3.2.4 VIŠEKANALNI FOTOMETAR (ELISA READER) Višekanalni fotometar (eng. Elisa reader - Enzyme-linked immunosorbent assay reader) je ureċaj koji nam omogućuje ĉitanje apsorbanci formazana dobijenog u MTT testu. Višekanalni fotometar koristi antitela i promenu boje za identifikaciju supstance. U našim eksperimentima je raċeno spektrofotometrijsko merenje redukcije MTT-a na talasnoj duţ ini od 540 nm. Povećani intenzitet boje, odnosno veće vrednosti merenja ukazuju na veću aktivnost ćelija (51, 58). 19

3.3 METODOLOGIJA RADA SA ĆELIJAMA 3.3.1 ZAMENA MEDIJUMA U manipulisanju ćelijskim kulturama, izmeċu ostalog i kod odrţ avanja HeLa ćelija, uobiĉajeni postupak predstavlja zamena starog medijuma. Na taj naĉin uklanja se istrošeni medijum i izbacuju mrtve ćelije, a ista koliĉina se dodaje na njegovo mesto kako bi se obezbedili svi neophodni sastojci za normalno funkcionisanje i rast ćelija u flasku. Zamena medijuma vrši se nakon 3-4 dana, a obavlja se u laminaru u sterilnim uslovima. Celokupan postupak prilikom zamene medijuma radi se u blizini plamenika i što brţ e, kako se ćelije ne bi predugo izlagale promenama uslova okruţ enja, a zatim se što pre vraćaju u inkubator (51). 3.3.2 BROJANJE ĆELIJA Kako bismo znali koju koliĉinu suspenzije treba uzeti i zasejati u flask ili u bunarĉiće, moramo znati sa koliko ćelija raspolaţ emo. Iz tog razloga neophodno je brojanje ćelija pod mikroskopom i odreċivanje gustine ćelija u suspenziji (51). POSTUPAK: 1. Odmeriti 50 μl ćelijske suspenzije i 50 μl boje Trypan blue i saĉekati 5 minuta (zbog dezintegrisane ćelijske membrane kod mrtvih ćelija, boja ulazi u njih i boji ih plavo, dok se ţ ive ćelije ne boje i one ostaju ţ ućkaste). 2. Suspenzija ćelija u boji se nanosi na ivicu hemocitometarske komore (slika 14) u kojoj se uzorak razliva i na taj naĉin sprema za brojanje u odgovarajućim poljima. Mi smo brojanje vršili u Malassez komori. 3. U zavisnosti od gustine ćelija, bronjanje se vrši na svih 100 kavadrata ili na delu te površine. Ako se broji na 10 kvadrata, brojanje se vrši po dijagonali kvadratne meţ ice. Broje se samo samo ţ ive ćelije (slika 15). Na taj naĉin se dobija broj ćelija u 10 kvadrata. Dalje preraĉunavanje broja ćelija vrši se na sledeći naĉin: 20

Dobijeni broj ćelija u 10 kvadrata x 10 x 2 x 1000 = Ukupan broj ćelija u 1 ml Opšta formula za izraĉunavanje boja ćelija bi izgledala ovako: Broj ćelija/ml = n x P x R x 1000 n broj ćelija u P površini, P deo površine koja se broji (100 kvadrata/broj kvadrata za brojanje), R razblaţ enje, Sa 1000 se mnoţ i da bi se dobio broj ćelija u 1 ml. Uobiĉajeno je da se u 1 manji, T25 flask, zasejava 10 6, odnosno milion ćelija. Primer: Ako se u 5 ml nalazi 5 miliona ćelija, onda se po 1 ml sadrţ aja stavi u 5 flaska i u svaki doda još po 4 ml medijuma da bi ukupan sadrţ aj u flasku bio 5 ml. Slika 14. Hemocitometarska komora (59) Slika 15. Ţive ćelije (neobojene) i mrtve ćelije (plavo obojene) (60) 21

3.3.3iPASAŢA ĆELIJA Proces subkultivacije ćelija u ćelijskoj kulturi naziva se pasaţ a ćelija. Prilikom ovog procesa u flaskove se presaċuje manji broj ćelija zahvaljujući ĉemu im se obezbedjuju resursi za deobu i rast (51). POSTUPAK: 1. Uzeti 1-2 ml TRIPSIN+EDTA rastvora i dodati u flask kako bi se ćelije odvojile sa njegovog dna. 2. Flask postaviti pod fazno-kontrastni mikroskop i proveriti da li su se ćelije odvojile od dna. Ukoliko nisu saĉekati još 2-3 min da TRIPSIN EDTA još malo deluje. Ako se ćelije ne odvoje ni posle toga, flask malo protresti i u većini sluĉajeva to je dovoljno da se ćelije odvoje. Kada se ni posle toga ćelije ne odvoje postupak se ponavlja. 3. Kada su se ćelije odvojile sa dna flaska tripsinizaciju prekinuti dodavanjem HANKS-a. 4. Nakon toga treba izvući sav sadrţ aj iz flaska: ćelije + HANKS + TRPSIN EDTA i staviti ga u sterilnu epruvetu gde se sadrţ aj resuspenduje. 5. Epruvetu zatim staviti na centrifugiranje i to na +4ᵒC kako se ćelije ne bi zalepile za zid epruvete i centrifugiranje se vrši 10 min na 1200 obrtaja/min. 6. Nakon centrifugiranja izdvoje se 2 sloja - ćelije na dnu epruvete i supernatant koji se odbacuje. 7. U epruvetu sa ćelijama dodati 2ml DMEM-a i to dobro resuspendovati. 8. Nakon toga pristupa se bojenju i brojanju i zasejavanju ćelija 9. Rezultat pasaţ e su prenešene i zasadjene ćelije u nekoliko flaskova ili plejtova ukoliko se radi eksperiment, ili se pak ćelije spremaju za zamrzavanje. 3.3.4iZAMRZAVANJE ĆELIJA Ponekad je potrebno ćelije skladištiti, odnosno odloţ iti ih za neku dalju upotrebu. To se radi zamrzavanjem u teĉnom azotu, a ćelije se odlaţ u u kriovajlama sa specijalno napravljenim medijumom za tu priliku. Za razliku od standardnog medijuma za kultivaciju ćelija, takozvani freezing medijum, osim DMEM-a, seruma (FCS) i antibiotika sadrţ i i 22

DMSO (Dimethyl sulfoxide) koji ima ulogu antifriz preparata koji štiti ćelije od izmrzavanja, odnosno spreĉava izgradnju kristalića leda koji mehaniĉki razaraju ćelije (51-50). POSTUPAK: 1. Odmeriti 5 ml (10%) DMSO, 25ml (50%) FCS, 20ml DMEM-a i 0,5 ml antibiotika penicillin/streptomycin (5000 IU/ml penicilin, 5000GU/ml streptomicin). 2. Uraditi standardnu pasaţ u ćelija završno sa centrifugiranjem. Ćelije se centrifugiraju 2 puta u standardnom medijumu. 3. Ukloniti supernatant i dodati 2 ml standardnog medijuma. 4. Prebrojati ćelije (toku brojanja ostatak ćelija se ĉuva na ledu). 5. Staviti 5x10 6 ćelija u kriovajlu na ledu i dopuniti do 2ml hladnim freezing medijumom. 6. Kriovajle drţ ati u gradulno sniţ anim temperaturama (-20 o C i -80 o C), pa staviti u kontejner sa teĉnim azotom. 3.3.5iODMRZAVANJE ĆELIJA Odmrzavanje ćelija iz teĉnog azota zahteva odreċenu pripremu, odnosno poštovanje zadatih koraka kako bi se ćelije iz stanja dubokog zamrzavanja mogle oţ iveti i kako bi se mogle koristiti u daljem radu (51). POSTUPAK: 1. U epruvetu sipati 10-15 ml hladnog medijuma sa 20% FCS (duplo više nego u standardnom medijumu za ĉuvanje ćelija). Posebno sipati još 20 ml standardnog medijuma za ispiranje. Sve mora biti na hladnom, jer je DMSO toksiĉan na sobnoj temperaturi. Spremiti sve što je potrebno: ĉašu sa ledom, 70% alkohol, papir za brisanje, pipete i dr. 2. Izvaditi kriovajlu iz teĉnog azota, koristeći rukavice i štitnik za lice. 3. Raditi brzo odmrzavanje u vodenom kupatilu na 37ºC okrećući vajlu u krug kroz vodu dok se ne odmrzne oko pola suspenzije. 23

4. Izvaditi vajlu iz vodenog kupatila, ali nastaviti sa trešenjem dok se potpuno ne otopi. 5. Paţ ljivo otvoriti vajlu na ledu, sadrţ aj uvući sterilnom pipetom i sipati preko hladnog medijuma. 6. Sadrţ aj centrifugirati na 1000 rpm/min i temperaturi od 4ºC tokom od 5 minuta. 7. Isprati još jednom sa 10 ml medijuma, kako bi se uklonio sav DMSO i centrifugirati. Lagano rasuspendovati. 8. Zasaditi ćelije u mali T25 ili veliki T75 flask sa odgovarajućom koliĉinom medijuma koji sadrţ i duplu koliĉinu FCS i uobiĉajenu koliĉinu glutamina i antibiotika. Saditi trostruko veći broj ćelija nego obiĉno. 9. Sledećeg dana promeniti medijum kao bi mrtve ćelije bile otklonjene. 10. U periodu od 1-4 dana, u odnosu na pokrivenost dna flaska, ćelije treba pasaţ irati po uobiĉajenoj proceduri. 3.3.6 PRIPREMA RASTVORA ZA TESTIRANJE U ovom eksperimentu korišćene su razliĉite koncentracije Biosenzala i alkohola. Kako su ispitivane efektivne doze Biosenzala od 0,625%, 1,25%, 2,5%, 5%, 10% i 15%, bilo je potrebno napraviti odgovarajuća razblaţ enja Biosenzala od štok rastvora. Razblaţ enje je pravljeno medijumom, a pravljene doze su morale biti u duplo većim koncentracijama, jer su ćelije već sadrţ ale 100 μl medijuma po velu što smanjuje efekat Biosenzala za polovinu. Ista koliĉina od 100μl pravljene doze hipericina stavljana je u velove plejta, a razblaţ enja su pravljena po šemi 1. Tabela 1 Prikaz koncentracija Biosenzala, njihove efektvivne doze (desno) i procenat etanola 100% Štok Biosenzal = 60% etanol 50% Biosenzal = 30% etanol 30% Biosenzal = 18% etanol 15% Biosenzal = 9% etanol 20% Biosenzal = 12% etanol 10% Biosenzal = 6% etanol 10% Biosenzal = 6% etanol 5% Biosenzal = 3% etanol 5% Biosenzal = 3% etanol 2,5% Biosenzal = 1,5% etanol 2,5% Biosenzal = 1,5 % etanol 1,25 Biosenzal = 0,75% etanol 1,25% Biosenzal = 0,75% etanol 0,625% Biosenzal = 0,375% etanol 24

0. 100% B I O S E N Z A L ŠTOK 1. 300μl Biosenzal 0 + 700 μl Medijum = 1 ml 30% Biosenzal / alkohol 18% 2. 667μl Biosenzal 1. + 333μl Medijum = 1 ml 20% Biosenzal / alkohol 12% 1ml 3. 500 μl Biosenzal 2.+ 500 μl Medijum = 1 ml 10% Biosenzal / alkohol 6% 4. 500 μl Biosenzal 3. + 500 μl Medijum = 1 ml 5% Biosenzal / alkohol 3% 5. 500 μl Biosenzal 4. + 500 μl Medijum = 1ml 2,5% Biosenzal / alkohol 1,5% 6. 500 μl Biosenzal 5. + 500 μl Medijum = 1 ml 1,25% Biosenzal / alkohol 0,75% 7. 500 μl Biosenzal 6. + 500 μl Medijum = 1 ml 1,25% Biosenzal / alkohol 0,75% Šema 1. Postupak pravljenja razliĉitih koncentracija Biosenzal-a Kako je Biosenzal alkoholni ekstrakt, ekvivalentne koncentracije etanola sluţ ile su kao kontrola rastvaraĉa. U eksperimentu je 60%-ni etanol sluţ io kao osnova za pravljenje manjih koncentracija dodavanjem odgovarajućih koliĉina medijuma i to po šemi 2. 25

0. 60% E T A N O L 1. 300μl Etanol 0 + 700 μl Medijum = 1ml Kontrola rastvaraĉa / Alkohol 18% 2. 667μl Etanol 1. + 333μl Medijum = 1ml Kontrola rastvaraĉa / Alkohol 12% 3. 500 μl Etanol 2. + 500 μl Medijum = 1ml Kontrola rastvaraĉa / Alkohol 6% 4. 500 μl Etanol 3. + 500 μl Medijum = 1ml Kontrola rastvaraĉa / Alkohol 3% 5. 500 μl Etanol 4.+ 500 μl Medijum = 1ml Kontrola rastvaraĉa / Alkohol 1,5% 6. 500 μl Etanol 5. + 500 μl Medijum = 1ml Kontrola rastvaraĉa /Alkohol0,75% 7. 500 μl Etanol 6. + 500 μl Medijum = 1ml Kontrola rastvaraĉa / Alkohol0,375% Šema 2. Postupak pravljenja razliĉitih koncentracija etanola Zahvaljujući ovako pravljenim koncentracijama, na veoma precizan naĉin se moglo odrediti dejstvo ekstrakta kantariona, kao i samog alkohola kao rastvaraĉa. UporeĊivanjem delovanja razliĉitih koncentracija Biosenzala i alkohola mogla se utvrditi dozna zavisnost ukoliko je prisutna. Negativna kontrola su bile HeLa ćelije u ĉistom medijumu. Pozitivna kontrola citotoksiĉnosti bio je saponin. Pozitivna kontrola citostatiĉnosti bio je 5 Fluorouracil (5 FU). 26

3.3.7iPRAVLJENJE RADNOG RASTVORA TRYPAN BLUE POSTUPAK: 1. Priprermriti štok TRYPAN BLUE mešanjem 0,3 g boje i 100 ml destilovane vode. 2. Napraviti hipertoniĉni HANKS mešanjem HANKS-a i 2,5g NaCl-a. 3. Radni rastvor TRIPAN BLUE se pravi mešanjem hipertoniĉnog HANKS-a i štok TRYPAN BLUE-a u odnosu 1:3. 3.4 MTT TEST MTT Test je jedna od najprimenjivanijih metoda in vitro za ispitivanje vijabilnosti i proliferacije ćelija. Test je zasnovan na redukciji tetrazolijumskih soli gde ţ uti tetrazolijum MTT redukuju mitohondrijalne dehidrogenaze metaboliĉki aktivnih ćelija i stvaraju ljubiĉasti formazan (slike 16 i 17). Rezultujući ljubiĉasti unutarćelijski formazan moţ e biti rastvoren izoprpanolom, DMSO-om ili nekim drugim organskim rastvaraĉem. Nakon rastvaranja formazana, apsorbanca boje moţ e se oĉitati spektrofotometrijskom metodom. Apsorbanca obojenog rastvora se meri na talasnoj duţ ini od 550 nm. Redukcija je moguća samo kada su enzimi reduktaze aktivni, tako da se ovim testom meri aktivnost ţ ivih ćelija. Na ovaj naĉin moţ e se odreċivati citotoksiĉnost razliĉitih medikamenata i materijala (51). Slika 16. Izgled velova u plejtu pre i posle redukcije ţ ute soli i stvaranja formazana 27

Slika 17. Promena strukture ţ utih tetrazolijumskih soli i stvaranje ljubiĉastog formazana (61) POSTUPAK: 1. Zasejati ćelije u plejt i nakon 24h tretirati, u našem sluĉaju Biosenzalom, uz odgovarajuće kontrole. 2. Nakon inkubacije ćelija pod dejstvom odreċenih koncentracija Biosenzala i kontrolnih rastvora, iz svakog vela izvaditi celokupnu teĉnost i dodati 100 μl radnog rastvora PBS-a i 30 μl MTT-a, a koji su prethodno zagrejani do 37 ºC. 3. Inkubacija u periodu od 4h. 4. Nakon perioda inkubacije pod dejstvom PBS-a i MTT-a, iz velova izvući svih 130 μl sadrţ aja i dodati po 100 μl izopropanola koji prethodno treba zagrejati do 37ºC. 5. Nakon dodavanja izopropanola plejt blago pomerati na tvrdoj podlozi kruţ nim pokretima, kako bi se kristali formazana rastvorili i sadrţ aj potpuno homogenizovao. 6. Nakon toga se na ELISA fotometru, oĉitava apsorbanca na 550 nm i potom analiziraju dobijene tabelarne vrednosti. 28

3.4.1iESEJ VIJABILNOSTI / CITOTOKSIĈNOSTI Termin citotoksiĉnost se koristi da se opiše kaskada molekularnih dešavanja koji onemogućavaju sintezu molekula i na taj naĉin uzrokuju funkcionalno i strukturno oštećenje ćelija. Primena citotoksiĉnih medikamenata moţ e da izazove nekrozu ćelija gde se narušava integritet ćelijske membrane i one umiru kao rezultat lize ćelija. TakoĊe, moţ e doći do smanjenja ćelijske proliferacije (deoba i normalan rast) ili pojave apoptopze (genetski programirana ćelijska smrt) (51). Citotoksiĉne supstance mogu biti upotrebljene u terapeutske svrhe pri tretiranju kancera u hemoterapiji (39, 40). Citotoksiĉnost se moţ e meriti na više naĉina: 1. TBE (Trypan Blue Exclusion) test vijabilnosti na osnovu koga se procenjuje integrite integritet ćelijske membrane gde boja Tripan blue ulazi samo u oštećene ćelije ćelije i boji ih, dok ţ ive ćelije ostaju neobojene. 2. Merenje ATP-a u testu koji je zasnovan na luciferaznoj reakciji. 3. MTT testom, koji je korišćen za ispitivanje citotoksiĉnosti u ovom radu U ovom radu vršeno je ispitivanje citotoksiĉnosti (vijabilnosti) na HeLa ćelije pod uticajem hipericina. ZasaĊeno je 2x10 4 ćelija po velu i nakon 24h je raċen MTT test. 3.4.2iESEJ PROLIFERATIVNOSTI / CITOSTATIĈNOSTI Citostatiĉnost oznaĉava delovanje medikamenata i drugih materija na ćelije gde se vrši supresija ili zaustavljanje njihovog rasta i deobe, odnosno razmnoţ avanja. Ispitivanjem i merenjem citostatiĉnosti odredjenih materijala i ekstrakata se u stvari meri njihov uticaj na rast i deobu ćelija. Vrši se delovanje na ćelije i onda se nakon perioda inkubacije sprovodi MTT test. Na osnovu dobijenih vrednosti donosi se zakljuĉak o tome da li odredjeni ekstrakt ili materijal ima citostatiĉan efekat na ćelije. (51) U ovom radu vršeno je ispitivanje citostatiĉnosti (vijabilnosti) na HeLa ćelije pod uticajem hipericina. ZasaĊeno je 0,5 x10 4 ćelija po velu i nakon 72h je raċen MTT test. 29

4. EKSPERIMENTALNI DIZAJN U ovom radu je vršeno ispitivanje ekstrakta kantariona koji kao aktivnu supstancu sadrţ i hipericin u koncentraciji od 0,8mg%, na citotoksiĉnost (vijabilnost) i citostatiĉnost (proliferaciju) HeLa ćelija in vitro. U tu svrhu korišćen je komercijalni proizvod BIOSENZAL farmaceutske kuće Zdravlje iz Leskovca koji predstavlja alkoholni rastvor (7). UraĊena su 3 dozno zavisna eksperimenta. TOK EKSPERIMENTA: CITOTOKSIĈNOST (VIJABILNOST) 1. Odmrzavanje HeLa ćelija iz kriovajli. 2. Zasejavanje ćelija u flask. 3. Zamena medijuma do dostizanja ţ eljene pokrivenosti dna, obiĉno posle 24h. 4. Pasaţ a ćelija i zasejavanje 2x10 4 ćelija po velu u plejt. 5. Inkubiranje sa razliĉitim dozama Biosenzala i kontrolnim dozama. 6. Nakon inkubacije sprovoċenje MTT testa. 7. Oĉitavanje apsorbanci formazana na fotometru. 8. Tumaĉenje i analiza dobijenih rezultata. CITOSTATIĈNOST (PROLIFERACIJA) 1. Odmrzavanje HeLa ćelija iz kriovajli. 2. Zasejavanje ćelija u flask. 3. Zamena medijuma do dostizanja ţ eljene pokrivenosti dna, obiĉno posle 24h. 4. Pasaţ a ćelija i zasejavanje 0,5x10 4 ćelija po velu u plejt. 5. Inkubiranje sa razliĉitim dozama Biosenzal-a i kontrolnim dozama. 6. Nakon inkubacije sprovoċenje MTT testa. 7. Oĉitavanje apsorbanci formazana na ELISA reader-u. 8. Tumaĉenje i analiza dobijenih rezultata. NAPOMENA: Prilikom eksperimenata korišćen je plejt sa 96 velova. Raspored velova u plejtu prikazan je prema šemi 3. 30

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G H Šema 3. Plejt sa 96 velova Eksperimentalne doze Biosenzala od 0,625, 1,25%, 2,5%, 5%, 10% i 15%, zatim kontrole rastvaraĉa odnosno etanol u koncentracijama od 0,375%, 0,75%, 1,5%, 3%, 6%, i 9%, negativne kontrole u ĉistom medijumu, kao i pozitivne kontrole citotoksiĉnosti u 5FU i citostatiĉnosti u SAP, postavljane su u tetraplikatu prema rasporedu prikazanom u šemi 4. K oznaĉava kontrolu (negativnu) odnosno ĉist medijum, BS oznaĉava Biosenzal, A oznaĉava alcohol odnosno etanol u odreċenoj koncentraciji biosenzala, SAP oznaĉava saponin i 5 FU oznaĉava 5 Fluorouracil. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A K K K K B C BS- 10% BS- 2,5% BS- 5% BS- 1,25% BS- 5% BS- 1,25% BS- 5% BS- 1,25% BS- 5% BS- 1,25% BS- 15% BS- 15% BS- 15% BS- 15% SAP SAP SAP SAP BS- 0,625% BS- 0,625% BS- 0,625% BS- 0,625% BS- 10% BS- 2,5% BS- 10% BS- 2,5% BS- 10% BS- 2,5% K K K K D A-9% A-9% A-9% A-9% K K K K A-6% A-6% A-6% A-6% E K K K K A-3% A-3% A-3% A-3% A-1,5% A-1,5% A-1,5% A-1,5% F G H A- 0,75% A- 0,75% A- 0,75% A- 0,75% 5FU 5FU 5FU 5FU A- 0,375% A- 0,375% A- 0,375% A- 0,375% Šema 4. Raspored tetraplikata u plejtu 31

5. REZULTATI I DISKUSIJA Posle inkubacije HeLa ćelija sa hipericinom uraċen je MTT test. Nakon oĉitavanja na fotometru dobijeni su tabelarni podaci koji su sluţ ili kao osnova za izradu grafikona i poreċenje dobijenih vrednosti. Na osnovu podataka 3 eksperimenta citotoksiĉnosti i 3 eksperimenta citostatiĉnosti napravljeni su grafikoni koji prikazuju srednje vrednosti eksperimenata. Ovi grafikoni daju pogled na proseĉne vrednosti vijabilnosti i proliferacije HeLa ćelija pod dejstvom Biosenzala, odnosno njegove aktivne komponente hipericina. U ovom poglavlju su korišćene sledeće skraćenice i znakovi u grafikonima: K - Negativna kontrola, odnosno ĉist medijum BS - Biosenzal u odgovarajućoj koncentraciji SAP - Pozitivna kontrola citotoksiĉnosti, odnosno saponin 5FU - Pozitivna kontrola citostatiĉnosti, odnosno 5 Fluorouracil ZELENA BOJA - Nivo ćelijske aktivnosti u kontrolnim uzorcima (posmatrano kao 100%-na vrednost) PLAVA BOJA - Efekat Biosenzala CRVENA BOJA - Efekat doze alkohola ekvivalentne datoj koncentraciji Biosenzala LJUBIĈASTA BOJA - Efekat saponina / 5 Fluorouracil-a Istraţ ivanja u ovom radu bazirala su se na ispitivanju citotoksiĉnosti (vijabilnosti) i citostatiĉnosti (proliferacije) HeLa ćelija in vitro, pod uticajem ekstrakta kantariona (Hipericum perforatum L.) koji kao aktivnu materiju sadrţ i hipericin u koncentraciji od 0,8mg%. Kao ekstrakt kantariona korišćen je Biosenzal, komercijalni proizvod farmaceutske kuće Zdravlje iz Leskovca, a HeLa ćelijska linija odmrznuta je iz teĉnog azota. UraĊena su 3 dozno-zavisna eksperimenta gde su HeLa ćelije inkubirane u razliĉitim koncentracijama Biosenzala i to u koncentracijama od 0,625%, 1,25%, 2,5%, 5%, 10% i 15%. Kako je Biosenzal alkoholni ekstrakt, ispitivane su kontrole rastvaraĉa, odnosno ekvivalentne koliĉine alkohola u koncentracijama od 0,375%, 0,75%, 1,5%, 3%, 6%, i 9%. Kao negativne kontrole zasejavane su HeLa ćelije u ĉistom medijumu. Pozitivne kontrole citotoksiĉnosti, odnosno citostatiĉnosti bile su saponin i 5 Fluorouracil. Svaka od koncentracija kao i kontrole raċene su u tetraplikatu. 32

5.1 CITOTOKSIĈNOST (VIJABILNOST) Grafik 1. Grafiĉki prikaz vijabilnosti HeLa ćelija u eksperimentu citotoksiĉnosti Na grafiku 1 uoĉava se smanjenje vijabilnosti HeLa ćelija sa povećanjem koncentracija Biosenzala, odnosno rast citotoksiĉnosti Biosenzala sa povećanjem koncentracija. Neposredno pre dodavanja MTT-a, HeLa ćelije su posmatrane i fotografisane na invertnom svetlosnom mikroskopu u softveru Axiocam. U cilju ispitivanja uticaja Biosenzala na vijabilnost HeLa ćelija, ćelije su saċene u gustini 2x10 4 po jednom bunaru sterilne ploĉe za kultivaciju ćelija. Na slici 18, prikazan je izgled HeLa ćelija u negativnoj kontroli (Hela ćelije kultivisane u DMEM-u sa 10% FCS-a). Uoĉava se epitelni fenotip ćelija koje nakon deobe ostaju blizu jedne drugima tako da obrazuju karakteristiĉne epitelne ploĉe. Konfluentnost, odnosno prektivenost dna bunara ćelijama je oko 90%. 33

Slika 18. HeLa ćelije nakon 24h u ĉistom medijumu (negativna kontrola), PH 10x10 Ćelije koje su inkubirane 24h u 0,625%-tnom rastvoru Biosenzala, zadrţ ale su epitelni fenotip i takoċe prekrivaju oko 90% dna bunara deleći se tako da kćeri ćelije postepeno obrazuju epitelne ploĉe (slika 19). PoreĊenjem izgleda HeLa ćelija u negativnoj kontroli i nakon jednodnevne inkubacije u najblaţ em ekstraktu Biosenzala, mogli bismo da zakljuĉimo da se ne uoĉavaju razlike u vijabilnosti ćelija u 0,625%-tnom ekstraktu u odnosu na kontrolu što je u skladu sa podacima kasnije dobijenim oĉitavanjem vrednosti apsorbance (89.9% u odnosu na kontrolu) (grafik 1). Slika 19. HeLa ćelije nakon 24h u BS-u 0,625%, PH 10x10 U skladu sa vrednostima apsorbance za ekstrakte, u odnosu na negativnu kontrolu (79.6% od kontrole) (grafik 7) je izgled ćelija u 1,25%-tnom rastvoru Biosenzala. Oĉuvan je 34

epitelni fenotip i karakteristiĉan rast HeLa ćelija (slika 20) uz neznatno smanjenje konfluentnosti na oko 80%. Slika 20. HeLa ćelije nakon 24h u BS-u 1,25%, PH 10x10 Uoĉljivije morfološke razlike primećene su na HeLa ćelijama kultivisanim u koncentraciji Biosenzala od 2.5% u odnosu na komercijalni proizvod. Epitelni fenotip je oĉuvan, ali su velike epitelne ploĉe razbijene na manje te je meċućelijski prostor širi no pri inkubaciji ćelija u bunarima sa niţ im koncentracijama ispitivanog ekstrakta (slika 21). Slika 21. HeLa ćelije nakon 24h u BS-u 2,5%, PH 10x10 35

Pri inkubaciji HeLa ćelija sa 5%-tnim rastvorom Biosenzala, mikroskopiranjem su utvrċene još oĉiglednije promene u odnosu na kontrolu (slika 18). U svakom vidnom polju primećen je znaĉajno manji broj ćelija nego u svim niţ im koncentracijama. Osim ćelija epitelnog fenotipa, uoĉene su i mrtve, zaokrugljene ćelije, usled ĉega je procenjeno da je konfluentnost bila oko 50% (slika 22). U saglasnosti sa ovim rezultatima su i vrednosti apsorbance oĉitane na fotometru. Slika 22. HeLa ćelije nakon 24h u BS-u 5%, PH 10x10 Na slici 23 prikazan je izgled ćelija nakon inkubacije sa 10%-tnim rastvorom Biosenzala. Retke su ćelije epitelnog tipa, dominiraju mrtve i apoptiĉne ćelije što potvrċuje i vrednost apsorbance redukovanog MTT-a (39.2%, grafik 1). Uoĉeni su i kristali hipericina (slika 23). Slika 23. HeLa ćelije nakon 24h u BS-u 10%, PH 10x10 36

Konaĉno, najkoncentrovaniji rastvor Biosenzala spušta vrednost aporbance na 16.1% u odnosu na kontrolu. Naše fotografije potvrċuju citotoksiĉno dejstvo ovog tipa rastvora na HeLa ćelije. Nisu uoĉene ili su bile retke (do 5 po vidnom polju) vijabilne ćelije epitelnog tipa, retke su apoptiĉne ćelije, a dominiraju okrugle, mrtve ćelije (slika 24). Slika 24. HeLa ćelije nakon 24h u BS-u 15%, PH 10x10 Budući da sam preparat Biosenzal sadrţ i 60% etanola, ćelije su inkubirane i sa razliĉitim koncentracijama etanola. Efektivne koncentracije etanola u bunarima odgovarale su efektivnim koncentracijama etanola u razliĉitim razblaţ enjima rastvora Biosenzala. Ovakvi bunari predstavljali su kontrolu rastvaraĉa. PoreĊenjem morfologije HeLa ćelija koje su rasle u 0,375% (slika 25), 0,75% (slika 26), 1,5% (slika 27) i 3%-tnom etanolu (slika 28) sa morfologijom HeLa ćelija u koje inkubirane u medijumu (slika 18), nisu uoĉene znaĉajne razlike u gustini ćelija. Epitelni fenotip je zadrţ an, a jedino delimiĉno izĉezava karakteristiĉan epitelni rast te nema obrazovanja epitelnih ploĉa ili se formiraju manje epitelne ploĉe. Rezultati MTT testa u skladu su sa našim zakljuĉcima izvedenim na osnovu mikroskopiranja HeLa ćelija u sterilnim ploĉama za kultivaciju ćelija (grafik 1). 37

Slika 25. HeLa ćelije nakon 24h u etanolu 0,375% (kontrola rastvaraĉa), PH 10x10 Slika 26. HeLa ćelije nakon 24h u etanolu 0,75% (kontrola rastvaraĉa), PH 10x10 Slika 27. HeLa ćelije nakon 24h u etanolu 1,5% (kontrola rastvaraĉa), PH 10x10 38

Slika 28. HeLa ćelije nakon 24h u etanolu 3% (kontrola rastvaraĉa), PH 10x10 Prve uoĉljive razlike uoĉene su pri posmatranju bunara u kojima je ćelijama dodavan 6%-tni etanol. Retke su adherirane epitelolike ćelije, konfluentnost smanjena na oko 50%, a dominiraju apoptiĉne i mrtve ćelije (slika 29). MeĊutim, veća je gustina ćelija u ovim bunarima no u onim gde su ćelije rasle u 10%-tnom rastvoru Biosenzala (slika 23) što bi znaĉilo da sam Biosenzal u 10%-noj koncentraciji ima citotoksiĉno dejstvo. Slika 29. HeLa ćelije nakon 24h u etanolu 6% (kontrola rastvaraĉa), PH 10x10 Budući da nema ţ ivih ćelija nakon jednodnevne inkubacje u 9%-tnom etanolu (slika 30), kao ni pri inkubaciji u 15%-tnom Biosenzalu, zakljuĉujemo da se citotoksiĉno 39

dejstvo Biosenzala u ovoj koncentraciji pripisuje samom efektu alkohola zbog ĉega ova i više koncentracije Biosenzala nemaju komercijalnu primenu. Slika 30. HeLa ćelije nakon 24h u etanolu 9% (kontrola rastvaraĉa), PH 10x10 Kao pozitivna kontrola za ispitivanje uticaja citotoksiĉnosti Biosenzala korišćen je saponin u koncentraciji od 2 µg/ml. Dobijena je vrednost apsorbance 11,74% u odnosu na kontrolu. Na fotografijama bunara sa saponinom (slika 31) uoĉavaju se iskljuĉivo mrtve ćelije kao i u bunarima gde su inkubirane ćelije u 15%-tnom rastvoru Biosenzala (slika 24). Slika 31. HeLa ćelije nakon 24h u Saponinu 2 µg/ml (pozitivna kontrola), PH 10x10 40

5.2 CITOSTATIĈNOST (PROLIFERACIJA) Grafik 2. Grafiĉki prikaz proliferacije HeLa ćelija u eksperimentu citostatiĉnosti Na grafiku 2 uoĉava se smanjenje proliferacije HeLa ćelija sa povećanjem koncentracija Biosenzala, odnosno rast citotoksiĉnosti Biosenzala sa povećanjem koncentracija. Nakon 72-ĉasovne inkubacije ćelija u rastvorima Biosenzala razliĉite koncentracije, pod mikroskopom je posmatran efekat Biosenzala na proliferaciju HeLa ćelija, te je i u ovom sluĉaju naċena analogija izmeċu rezulata dobijenih nakon primenjenog MTT testa i morfologije ćelija. Nakon 3 dana rasta ćelija u medijumu (slika 32), budući da su ćelije sejane u gustini 0,5x10 4 po bunaru, konfluentnost ćelija je bila oko 50%. Uoĉene su manje epitelne ploĉe i karakteristiĉna morfologija HeLa ćelija. 41

Slika 32. HeLa ćelije nakon 72h u ĉistom medijumu (negativna kontrola), PH 10x10 Posmatranjem izgleda ćelija koje su rasle u 0,625% (slika 33), 1,25% (slika 34) i 2,5%-tnom (slika 35) rastvoru Biosenzala, takoċe su uoĉeni karakteristiĉan rast i morfologija HeLa ćelija. Kada je konfluentnost u pitanju, uoĉeno je dozno zavisno smanjenje konfluentnosti-sa porastom koncentracije Biosenzala, smanjuje se konfluentnost HeLa ćelija u svakom bunaru. Slika 33. HeLa ćelije nakon 72h u BS-u 0,625%, PH 10x10 42

Slika 34. HeLa ćelije nakon 72h u BS-u 1,25%, PH 10x10 Slika 35. HeLa ćelije nakon 72h u BS-u 2,5%, PH 10x10 Prve jasnije morfološke razlike u poreċenju na negativnu kontrolu (slika 32) uoĉenu se u bunarima sa 5%-tnim rastvorom Biosenzala (slika 36). Ćelije prekrivaju tek oko 30% dna bunara, retke su adherirane ćelije epitelnog tipa, najbrojnije su apoptotiĉne i mrtve ćelije. Uoĉljivi su i kristali Biosenzala kao i mrke nakupine koje potiĉu od boje rastvorenog Biosenzala. Ova koncentracija ima vrednost apsorbance 47.5% u odnosu na kontrolu (grafik 2) što je u skladu sa rezultatima dobijenim posatranjem morfologije HeLa ćelija. 43

Slika 36. HeLa ćelije nakon 72h u BS-u 5%, PH 10x10 Biosenzal u 10%-tnoj koncentraciji dalje inhibira proliferaciju HeLa ćelija te se opaţ a konfluetnost od oko 30% pri ĉemu su ćelije uglavnom apoptotiĉne ili mrtve (slika 37). Slika 37. HeLa ćelije nakon 72h u BS-u 10%, PH 10x10 Najkoncentrovaniji rastvor Biosenzala potpuno zaustavlja proliferaciju ćelija te nakon tri dana rasta ćelija u 15%-tnoj koncentraciji nisu uoĉene vijabilne već samo mrtve ćelije u bunarima (slika 38). 44

Slika 38. HeLa ćelije nakon 72h u BS-u 15%, PH 10x10 Na slikama 39, 40 i 41 (etanol 0,375%, 0,75% i 1,5%) ne uoĉavaju se znaĉajne razlike u rastu HeLa ćelija u odnosu na kontrolu (slika 32). Prve znaĉajne razlike uoĉene su pri rastu ćelija u 3%-tnom etanolu gde su pre svega u centru vidnog polja razbijene epitelne ploĉe, smanjena konfluentnost, retke adherirane ćelije, dominiraju apoptiĉne, a oko 20% je mrtvih ćelija (slika 42). Slika 39. HeLa ćelije nakon 72h u etanolu 0,375% (kontrola rastvaraĉa), PH 10x10 45

Slika 40. HeLa ćelije nakon 72h u etanolu 0,75% (kontrola rastvaraĉa), PH 10x10 Slika 41. HeLa ćelije nakon 72h u etanolu 1,5% (kontrola rastvaraĉa), PH 10x10 Slika 42. HeLa ćelije nakon 72h u etanolu 3% (kontrola rastvaraĉa), PH 10x10 46

U bunarima u kojima su zasejane ćelije rasle u prisustvu 6%-tnog alkohola ţ ivih ćelija nema, dominiraju apoptiĉne i mrtve ćelije (slika 43). 9% alkohol potpuno zaustavlja proliferaciju ćelija te se uoĉavaju samo mrtve ćelije (slika 44). Slika 43. HeLa ćelije nakon 72h u etanolu 6% (kontrola rastvaraĉa), PH 10x10 Slika 44. HeLa ćelije nakon 72h u Alkoholu 9% (kontrola rastvaraĉa), PH 10x10 Pozitivna kontrola za citostatiĉnost bio je 5 Fluorouracil (5 FU) u koncentraciji od 1µg/ml. ĉija je vrednost apsorbance u odnosu na kontrolu bila 42.2%. Fotografija ćelija inkubiranih u 5 FU potvrċuju inhibitorno dejstvo 5 FU-a na proliferaciju HeLa ćelija (slika 45). 47

Slika 45. HeLa ćelije nakon 72h u 5 FU 1 µg/ml (pozitivna kontrola), PH 10x10 U savremenim biomedicinskim istraţ ivanjima svakodnevno se ulaţ u napori u razvoju novih metoda i medikamenata koji bi mogli biti upotrebljeni u leĉenju malignih oboljenja. Već smo naglasili da je potvrċeno dejstvo kantariona (Hipericum perforatum L.) kao antidepresiva. Ipak osim u toj primeni mogu se naći i brojni literaturni podaci o ispitivanjima njegovog citotoksiĉnog i citostatiĉnog dejstva, na ĉemu je bilo bazirano i ovo istraţ ivanje. 48