MAX Enteric Viral Panel Za in vitro dijagnostičku upotrebu P0231(03) Koristiti sa sistemom BD MAX Srpski NAMENA BD MAX Enteric Viral Pa

Транскрипт

1 MAX Enteric Viral Panel Za in vitro dijagnostičku upotrebu P0231(03) Koristiti sa sistemom BD MAX Srpski NAMENA BD MAX Enteric Viral Panel (panel pretraga na enterične viruse), koji se sprovodi na sistemu BD MAX, je automatizovani in vitro dijagnostički test za direktno kvalitativno otkrivanje i diferencijaciju enteričnih virusnih patogena. Test BD MAX Enteric Viral Panel otkriva nukleinske kiseline: norovirusa GI i GII rotavirusa A adenovirusa F40/41 sapovirusa (genogrupe I, II, IV, V) humanog astrovirusa (hastro). Testiranje se obavlja na uzorcima nekonzervisane mekane do dijarealne stolice ili konzervisane stolice na transportnoj podlozi Cary-Blair dobijenim od simptomatskih bolesnika za koje se sumnja da boluju od akutnog gastroenteritisa, enteritisa ili kolitisa. Test se obavlja direktno na uzorku, uz upotrebu lančane reakcije polimerazom (polymerase chain reaction, PCR) u stvarnom vremenu za pojačavanje ciljnog DNK/RNK relevantnog gena. Test koristi fluorogene hibridizacijske probe specifične za gen radi otkrivanja pojačanog DNK. Ovaj test, zajedno sa kliničkom slikom, laboratorijskim rezultatima i epidemiološkim informacijama, služi kao pomoć pri diferencijalnoj dijagnozi norovirusa GI i GII, rotavirusa A, adenovirusa F40/41, sapovirusa (genogrupe I, II, IV, V) i zaraza humanim astrovirusom. Rezultati ovog testa ne smeju biti isključiv osnov za dijagnostiku, lečenje ili druge terapijske odluke koje se odnose na pacijenta. Pozitivni rezultati ne isključuju koinfekciju ostalim organizmima koje ovaj test nije otkrio i oni ne moraju ukazivati na jedini ili definitivni uzrok oboljenja pacijenta. Negativni rezultati u okviru kliničkog oboljenja koje odgovara gastroenteritisu mogući su usled zaraze patogenima koje ovaj test ne otkriva ili usled neinfektivnih uzroka poput ulceroznog kolitisa, sindroma iritabilnog creva ili Hronove bolesti. SAŽETAK I OBJAŠNJENJE POSTUPKA Organizmi koji izazivaju enterične bolesti predstavljaju značajan uzrok oboljevanja i smrtnosti širom sveta. Enterični patogeni ulaze u telo putem gastrointestinalnog trakta i obično se šire putem kontaminirane hrane i vode ili dodira sa povraćenim sadržajem ili izmetom. Centri za kontrolu i sprečavanje bolesti (Centers for Disease Control and Prevention, CDC) procenjuju da je svake godine u Sjedinjenim Državama prisutno 48 miliona slučajeva bolesti uzrokovanih hranom, koji za posledicu imaju hospitalizacija i 3000 smrtnih slučajeva. 1 U zemljama u razvoju, te bolesti uzrokuju približno 2 miliona smrtnih slučajeva male dece godišnje. 2 Svaki od uzročnika može izazvati neznatno drukčiju simptomatologiju, uključujući abdominalne grčeve ili bolove, gubitak apetita, mučninu ili povraćanje, međutim svi za posledicu imaju dijareju. 3 Ponovljeni napadi dijareje i trajna dijarealna bolest narušavaju crevnu funkciju i apsorpciju, potencijalno vodeći do dečje pothranjenosti i usporavanja rasta. 4 Test BD MAX Enteric Viral Panel sproveden na sistemu BD MAX, može dati rezultate ciljeva testa BD MAX Enteric Viral Panel za 24 uzorka u razdoblju od oko 3 sata. Test BD MAX Enteric Viral Panel istovremeno otkriva patogene odgovorne za gastroenteritis uzrokovan norovirusom GI i GII, rotavirusom A, adenovirusom F40/41, sapovirusom (genogrupe I, II, IV, V) i humanim astrovirusom. Analiza uključuje internu kontrolu obrade uzoraka. Test BD MAX Enteric Viral Panel automatizuje postupak testiranja i na najmanju meru smanjuje potrebu za intervencijom rukovaoca od trenutka kad se uzorak stavi u sistem BD MAX pa dok se ne dobiju rezultati. 1

2 Homogenizovani uzorak mekane do dijarealne stolice, vrhom prenet u BD MAX Enteric Viral Panel Sample Buffer Tube (epruvetu sa puferom za uzorak panela pretraga na enterične bakterije), prikuplja se i prenosi do laboratorije. Epruveta sa puferom za uzorak se stavlja u sistem BD MAX, gde se odvijaju sledeći automatizovani postupci: virusne kapside se liziraju, DNK/RNK se izdvaja na magnetne kuglice i koncentriše se, a zatim se alikvot eluiranog DNK/RNK dodaje reagensima za PCR, koji sadrže prajmere specifične za gen koji pojačavaju genetičke ciljeve u patroni BD MAX PCR, ako su oni prisutni. Analiza uključuje i kontrolu obrade uzoraka. Kontrola obrade uzoraka nalazi se u epruveti za ekstrakciju i podvrgava se ekstrakciji, koncentrisanju i pojačavanju u svrhu nadzora inhibitorskih supstanci, neispravnosti instrumenta ili reagensa. Nakon što se klinički uzorak, unificirana reagens traka BD MAX i BD MAX PCR patrona umetnu u sistem BD MAX, rukovalac ne mora ništa da radi. Sistem BD MAX automatski lizira uzorke, izdvaja i koncentriše DNK/RNK, rehidratizuje reagens i pojačava i otkriva nukleinske kiseline ciljne sekvence pomoću lančane reakcije polimerazom (PCR) u stvarnom vremenu. Pojačani ciljevi otkrivaju se probama za hidrolizu označenim prigušenim fluoroforima. Pojačavanje, otkrivanje i tumačenje signala sistem BD MAX obavlja automatski. PRINCIPI PROCEDURE Uzorci stolice prikupljeni su od pacijenata i preneti u laboratoriju nekonzervisani u čistom kontejneru ili konzervisani u transportnoj podlozi Cary-Blair. Omča od 10 µl se umeće čitavom svojom dubinom u uzorak i istiskuje se vrtložnim pokretom u epruvetu BD MAX Sample Buffer Tube koja se nalazi u kompletu BD MAX Enteric Viral Panel. Epruveta sa puferom za uzorak se zatvara opnastim čepom, meša vorteks mešalicom i prenosi u sistem BD MAX. U trenutku kad je radna lista generisana i uzorak stavljen u instrument BD MAX, zajedno sa trakom BD MAX Enteric Viral Panel Unitized Reagent Strip (unificirana reagens traka panela pretraga na enterične bakterije) i patronom PCR, obrada je pokrenuta i nije potrebna nikakva dalja intervencija rukovaoca. Sistem BD MAX automatski priprema uzorke, uključujući liziranje ciljnog organizma, izdvajanje i koncentraciju DNK/RNK, rehidrataciju reagensa, kao i pojačavanje i otkrivanje ciljnih nizova nukleinske kiseline pomoću PCR-a u stvarnom vremenu. Tumačenje signala sistem BD MAX obavlja automatski. Analiza uključuje i kontrolu obrade uzoraka koja se nalazi u epruveti za ekstrakciju i podvrgava se koracima ekstrakcije, koncentrisanja i pojačavanja. Kontrola obrade uzoraka prati prisutnost potencijalnih inhibitornih supstanci, kao i grešaka u sistemu ili reagensima. Nakon enzimske lize virusa na povišenoj temperaturi, otpuštene nukleinske kiseline se zadržavaju na magnetnim prianjajućim kuglicama. Kuglice koje vežu nukleinske kiseline se peru, a nukleinske kiseline se ispiru. Isprana DNK/RNK se neutralizuje i prenosi se u epruvete sa glavnom mešavinu kako bi rehidratizovala PCR reagense. Nakon rehidratacije, sistem BD MAX uliva fiksnu količinu rastvora spremnog za PCR u patronu BD MAX PCR. Sistem zapečaćuje mikroventile u patroni BD MAX PCR kako bi sprečio isparavanje i kontaminaciju amplikona pre pokretanja PCR-a inverzne transkriptaze za konverziju RNK u cdnk i narednog PCR-a u stvarnom vremenu. Pojačana DNK otkriva se pomoću proba (TaqMan) za hidrolizu, označenim na jednom kraju fluorescentnom bojom (fluorofor), a na drugom kraju fluoroscentnim apsorberom. Probe označene različitim fluoroforima služe za otkrivanje amplikona virusnih ciljeva (norovirus GI i GII, rotavirus A, adenovirus F40/41, sapovirus (genogrupe I, II, IV, V) i humani astrovirus) i amplikona za kontrolu obrade uzoraka u četiri različita optička kanala sistema BD MAX. Kada su probe u svom prirodnom stanju, fluorescencija fluorofora je prigušena zbog njegove blizine prigušivaču. Međutim, u prisutnosti ciljne DNK, probe hibridizuju u dodatnim redosledima i hidrolizuju se pomoću aktivnosti 5' 3' egzonukleaze polimeraze DNK dok se ona sintetizuje sa nascentnom trakom duž cdnk šablona. Kao rezultat, fluorofori se odvajaju od molekula prigušivača i emituje se fluorescencija. Sistem BD MAX prati ove signale u svakom ciklusu i tumači podatke na kraju programa kako bi izvestio o krajnjim rezultatima. REAGENSI I MATERIJALI Kat. br. Sadržaj Količina BD MAX Enteric Viral Panel Master Mix (glavna mešavina panela pretraga na enterične viruse BD MAX) (D6) Sušena glavna mešavina za PCR koja sadrži DNK polimerazu, nukleotide, cilj i probe i prajmere specifične za kontrolu obrade uzoraka. BD MAX Enteric Viral Panel Master Mix (glavna mešavina panela pretraga na enterične viruse BD MAX) (D5) Sušena glavna mešavina za PCR koja sadrži DNK polimerazu, nukleotide, cilj i probe i prajmere specifične za kontrolu obrade uzoraka. BD MAX Enteric Viral Panel Unitized Reagent Strips (unificirane reagens trake panela pretraga na enterične viruse BD MAX) Reagens trake koje sadrže sve tečne reagense i vrhove pipeta za jednokratnu upotrebu potrebne za obradu uzoraka i izdvajanje DNK/RNK. BD MAX Enteric Viral Panel Extraction Tube (Epruveta za ekstrakciju za panel pretraga na enterične viruse BD MAX) (D4) Sušeni ekstrakcijski reagens koji sadrži DNK/RNK magnetne prianjajuće kuglice, proteinazu K i kontrolu obrade uzoraka. BD MAX Enteric Viral Panel Sample Buffer Tube (Epruveta sa puferom za uzorak panela pretraga na enterične viruse BD MAX) BD MAX Disposable Inoculating Loops (inokulacijske omče za jednokratnu upotrebu BD MAX) (potrebne za upotrebu s ovom analizom) 24 testa (2 x 12 epruveta) 24 testa (2 x 12 epruveta) 24 testa 24 testa (2 x 12 epruveta) 24 testa (2 x 12 epruveta) Opnasti čepići

3 POTREBNI MATERIJALI KOJI NISU PRILOŽENI BD MAX PCR Cartridges (BD MAX PCR patrone) (BD Diagnostic Systems kataloški br ) Vorteks mešalica VWR Multi-Tube Vortexer ili ekvivalent (VWR, kat. br. br ) Vortex Genie 2 (vorteks mešalica Genie 2) ili ekvivalent (VWR kat. br ) Nalgene Cryogenic Vial Holder (kriogenički držač bočica Nalgene) (VWR, kat. br ) Stalak kompatibilan sa višepozicionom vorteks mešalicom (npr. Cryogenic Vial Holder ili ekvivalent) Laboratorijski mantil i rukavice za jednokratnu upotrebu, bez pudera Štoperica ili tajmer Za nekonzervisanu vrstu uzorka stolice: Suvi, čisti kontejneri za skupljanje uzoraka tečne ili mekane stolice. Za konzervisanu vrstu uzorka stolice: Podloge za transport Cary-Blair (15ml). UPOZORENJA I MERE OPREZA Opasnost H360 Može štetno da deluje na plodnost ili da naškodi nerođenom detetu. P280 Nosite zaštitne rukavice/zaštitno odelo/zaštitu za oči/zaštitu za lice. P201 Pre upotrebe nabavite posebna uputstva. P202 Ne rukovati pre upoznavanja i razumevanja sigurnosnih mera opreza. P308+P313 U SLUČAJU izloženosti ili sumnje na izloženost: potražiti medicinski savet/mišljenje. P405 Čuvajte zaključano. P501 Sadržaj/kontejner odložite u skladu sa lokalnim/regionalnim/nacionalnim/međunarodnim zakonima. Test BD MAX Enteric Viral Panel se koristi samo za in vitro dijagnostiku. Inokulacione omče za jednokratnu upotrebu BD MAX Disposable Inoculating Loops se moraju koristiti sa testom BD MAX Enteric Viral Panel i nalaze se u pakovanju sa kompletom analiza. Opšte omče, bez obzira na njihovu vrstu i zapreminu, ne preporučuju se za upotrebu sa testom BD MAX Enteric Viral Panel i nisu potvrđene za njegovo sprovođenje. Lokalna, državna i savezna pravila i propisi za obaveštavanje o bolestima koje se obavezno prijavljuju neprekidno se ažuriraju i uključuju više organizama koje je važno nadzirati i koji su značajni za istrage slučaja izbijanja bolesti. 5,6 Laboratorije su odgovorne za praćenje državnih i/ili lokalnih pravila koja se odnose na patogene koji se obavezno prijavljuju i za smernice o predaji izolata i/ili kliničkog uzorka bi trebalo da se obratite svojim lokalnim i/ili državnim laboratorijama javnog zdravstva. Ovaj proizvod se može koristiti samo u sistemu BD MAX. Nemojte koristiti reagense i/ili materijale nakon isteka roka trajanja. Komplet nemojte upotrebljavati ako je sigurnosni pečat na spoljnoj kutiji slomljen prilikom dostave. Ne koristite reagense ako je njihova zaštitna kesica otvorena ili oštećena prilikom dostave. Ne koristite reagense ako u kesicama reagensa nema upijača vlage ili ako je slomljen. Ne uklanjajte upijač vlage iz kesica reagensa. Brzo zatvorite zaštitne kesice reagensa patent zatvaračem nakon svake upotrebe. Uklonite sav višak vazduha u kesicama pre zatvaranja. Zaštitite reagense od toplote i vlage. Duža izloženost vlazi može uticati na rad proizvoda. Ne koristite reagense ako je folija pocepana ili oštećena. Nemojte mešati reagense iz različitih kesica i/ili kompleta i/ili serija. Ne zamenjujte i ne koristite ponovo kapice poklopaca jer može doći do kontaminacije koja može da kompromituje rezultate. Proverite da li su unificirane reagens trake u dodiru sa odgovarajućim tečnostima (proverite da li su tečnosti na dnu epruveta [pogledajte sliku 1]). Proverite unificirane reagens trake da biste se uverili da sadrže vrhove pipeta (pogledajte sliku 1). Prilikom upotrebe hemijskih rastvora postupajte oprezno jer se čitljivost bar kodova glavne mešavine i epruvete za izdvajanje može smanjiti. Dobra laboratorijska tehnika ključna je za odgovarajuće sprovođenje ovog testa. Zbog visoke analitičke osetljivosti ovog testa potrebno je biti krajnje pažljiv kako bi se očuvala čistoća svih materijala i reagenasa. U slučaju da se drugi PCR testovi obavljaju u istom opštem području laboratorije, potrebno je biti oprezan kako se ne bi kontaminirao test BD MAX Enteric Viral Panel, ostali reagensi potrebni za testiranje, kao ni sistem BD MAX. Uvek izbegavajte kontaminaciju reagensa mikrobima, dezoksiribonukleazom (DNaza) i ribonukleazom (RNaza). Rukavice se moraju promeniti pre rukovanja reagensima i patronom. Kako bi se izbeglo zagađenje okoline bilo kojim ciljanim amplikonima, ne razdvajajte BD MAX PCR patronu nakon korišćenja. Sigurnosni pečati na BD MAX PCR patronama osmišljeni su za sprečavanje zagađenja. Laboratorija mora da obavlja rutinsko praćenje okoline kako bi se smanjio rizik unakrsne kontaminacije. Obavljanje testa BD MAX Enteric Viral Panel van preporučenih vremenskih i temperaturnih okvira preporučenih za prevoz i čuvanje uzoraka može dati pogrešne rezultate. Potrebno je ponoviti testove koji nisu završeni u okviru određenog vremena i određenom temperaturnom opsegu. Mogu se testirati dodatne kontrole u skladu sa smernicama ili zahtevima lokalnih, pokrajinskih i/ili državnih propisa ili organizacija koje donose propise. 3

4 Uvek rukujte uzorcima kao da su infektivni i u skladu sa sigurnosnim postupcima u laboratoriji, kao što su oni opisani u dokumentu CLSI M29 7 i dokumentu Biološka sigurnost u mikrobiološkim i biomedicinskim laboratorijima. 8 Dok rukujete svim reagensima, nosite zaštitnu odeću i rukavice za jednokratnu upotrebu. Nakon obavljenog testa temeljno operite ruke. Ne pipetirajte ustima. Ne pušite, ne pijte i ne jedite u prostorima gde se rukuje uzorcima ili reagensima kompleta. Neiskorišćene reagense i otpad odložite u skladu sa državnim, saveznim, pokrajinskim i lokalnim propisima. Proučite korisnički priručnik sistema BD MAX 9 za dodatna upozorenja, mere opreza i postupke. ČUVANJE I STABILNOST Prikupljeni uzorci, bilo nekonzervisana stolica ili stolica sačuvana na transportnoj podlozi Cary-Blair od 15 ml, tokom transporta bi trebalo da se čuvaju na temperaturi između 2 C i 25 C. Zaštitite ih od izlaganja prevelikoj toploti. Uzorak se može čuvati do 120 sati (5 dana) na 2 8 C ili do 48 sati na 2 25 C pre testiranja. Glavna mešavina BD MAX Enteric Viral Panel Master Mix stabilna je na 2 25 C do navedenog roka upotrebe. Nemojte koristiti komponente nakon isteka roka trajanja. Epruvete BD MAX Enteric Viral Panel Master Mix Tubes dolaze u zapečaćenim kesicama. Za zaštitu proizvoda od vlage, odmah zatvoriti nakon otvaranja. Epruvete sa glavnom mešavinom su stabilne do 14 dana na temperaturi 2 25 C nakon prvog otvaranja i zatvaranja kesice. UPUTSTVA ZA UPOTREBU Prikupljanje/transport uzoraka Da bi se dobio odgovarajući uzorak, mora se tačno pratiti postupak prikupljanja uzoraka. Koristeći suvi, čisti kontejner, uzorci tečne ili mekane stolice prikupljaju se u skladu sa sledećim postupkom: 1. Nekonzervisani uzorci: Uzorak tečne ili mekane stolice prenosite u suvom, čistom kontejneru. Izbegavajte kontaminaciju vodom ili urinom i mešanje toaletnog papira ili sapuna sa uzorkom. Označite kontejner i prenesite ga do laboratorije u skladu sa standardnim radnim procedurama ustanove (pogledajte poglavlje Čuvanje i stabilnost). 2. Uzorci konzervisani na transportnoj podlozi Cary-Blair: Prenesite uzorak tečne ili mekane stolice u transportni uređaj zapremine 15 ml prema uputstvima proizvođača. Izbegavajte kontaminaciju vodom ili urinom i mešanje toaletnog papira ili sapuna sa uzorkom. Označite kontejner i prenesite ga do laboratorije u skladu sa standardnim radnim procedurama ustanove (pogledajte poglavlje Čuvanje i stabilnost). Priprema uzoraka NAPOMENA: jedna (1) epruveta sa puferom za uzorak, jedan (1) opnasti čep, dve (2) epruvete za glavnu mešavinu (D6 i D5), jedna (1) epruveta za izdvajanje (D4) i jedna (1) unificirana reagens traka potrebni su za svaki uzorak i svaku spoljnu kontrolu koja se testira. Pripremite potrebnu količinu materijala i izvadite ih iz zaštitnih kesica ili kutija. Da biste odložili otvorene kesice glavne mešavine ili epruveta za izdvajanje, uklonite višak vazduha i zatvorite kesice patent zatvaračem. 1. Označite epruvetu BD MAX Sample Buffer Tube koja ima bar-kod (providni čep) odgovarajućim identifikatorom uzorka. Nemojte da prekrivate 2D bar-kod, niti da pišete ili označavate preko njega. 2. Mešajte u vorteks mešalici nekonzervisane uzorke ili uzorke konzervisane na podlozi Cary-Blair na najvećoj brzini 15 sekundi. 3. Skinite providni čep s epruvete sa puferom za uzorak i inokulišite na sledeći način: a. Umetnite inokulacionu omču za jednokratnu upotrebu tako da celo područje omče bude uronjeno u uzorak. Nemojte da ubacujete izvan omče jer svaka dodatna stolica na dršci može da preoptereti PCR reakciju; b. Umetnite napunjenu omču u epruvetu sa puferom za uzorak i istisnite uzorak vrtložnim pokretima. NAPOMENA: Nije neophodno ukloniti ceo uzorak sa omče. Dobijen rastvor u epruveti sa puferom za uzorak bi trebalo da ima boju čaja. 4. Poklopite inokuliranu epruvetu sa puferom za uzorak opnastim čepom. 5. Postavite epruvetu sa puferom za uzorak na stalak kompatibilan sa višepozicionom vorteks mešalicom, ako je dostupan (npr. kriogenički držač bočica ili ekvivalentan). 6. Pripremite sve dodatne uzorke za testiranje ponavljanjem koraka od 1 do 5; pritom vodite računa da rukavice budu čiste pre rukovanja dodatnim uzorcima. 7. Sve pripremljene uzorke mešajte istovremeno na višepozicijskoj vorteks mešalici na najvećoj brzini jedan (1) minut. 8. Za obavljanje testiranja BD MAX Enteric Viral Panel u sistema BD MAX, pređite na poglavlje Rad sistema BD MAX. Rad sistema BD MAX NAPOMENA: Detaljna uputstva potražite u Korisničkom priručniku sistema BD MAX 9 (pogledajte odeljak Rad sistema). NAPOMENA: Testiranje analize BD MAX Enteric Viral Panel se mora obaviti odmah nakon gore opisanog koraka mešanja u vorteks mešalici (pogledajte odeljak Priprema uzorka, korak 7). Ako je potrebno ponoviti testiranje, ponovo promešajte uzorke u vorteks mešalici. 1. Uključite sistem BD MAX (ako već niste) i prijavite se tako da unesete <user name> (korisničko ime) i <password> (lozinku). 2. Rukavice se moraju promeniti pre rukovanja reagensima i patronama. 3. Izvadite potreban broj unificiranih reagens traka iz kompleta BD MAX Enteric Viral Panel. Nežno tapkajte unificiranom reagens trakom o tvrdu površinu da biste sve tečnosti doveli na dno epruveta. 4

5 4. Iz kompleta BD MAX Enteric Viral Panel izvadite potreban broj epruveta za izdvajanje i epruveta sa glavnom mešavinom i izvadite ih iz zaštitnih kesica. 5. Uklonite sav višak vazduha iz kesica i zatvorite ih patent zatvaračem. 6. Za testiranje svakog uzorka postavite jednu (1) unificiranu reagens traku na stalak sistema BD MAX počevši od položaja 1 na stalku A. 7. Utisnite jednu (1) epruvetu za izdvajanje (D4) (bela folija) u unificirane reagens trake u položaju 1 kako je prikazano na slici Utisnite jednu (1) epruvetu glavne mešavine BD MAX Enteric Viral Panel (D6) (zelena folija) u unificirane reagens trake u položaju 2 kako je prikazano na slici Utisnite jednu (1) epruvetu glavne mešavine BD MAX Enteric Viral Panel (D5) (plava folija) u unificirane reagens trake u položaju 4 kako je prikazano na slici 1. Epruvete za umetanje #1 #2 #3 #4 Rezervoar za otpad Vrhovi pipeta Epruveta za liziranje/ oslobađanje Master Mix Epruveta za (D5) izdvajanje Master Mix (D6) Prazna epruveta (za mešanje) Pufer za ispiranje Pufer za eluciju Pufer za neutralizaciju #1 #2 #3 #4 Slika 1: Utiskivanje epruveta za izdvajanje za panel pretraga na enterične viruse BD MAX Enteric Viral Panel Extraction Tube i epruveta glavne mešavine panela pretraga na enterične viruse BD MAX Enteric Viral Panel Master Mix u unificirane trake reagensa 10. Kliknite na karticu Run (Pokreni), a zatim na pomoćnu karticu Inventory (Inventar) i unesite serijski broj kompleta za test BD MAX Enteric Viral Panel i serijski broj glavne mešavine za BD MAX Enteric Viral Panel (radi praćenja serije) skenirajući bar kod skenerom ili ga unesite ručno. NAPOMENA: Ponovite 10. korak prilikom svake upotrebe nove serije kompleta. 11. Dođite do kartice Worklist (Radna lista). U padajućem meniju izaberite <BD MAX ENT VIR 49>. 12. Izaberite odgovarajući serijski broj kompleta (nalazi se na spoljnoj kutiji testa BD MAX Enteric Viral Panel) i serijski broj glavne mešavine za BD MAX Enteric Viral Panel u padajućem meniju. 13. U radnu listu unesite ID epruvete sa puferom za uzorak za test BD MAX Enteric Viral Panel, ID pacijenta i Pristupni broj (ako se traži), što možete učiniti skeniranjem bar koda ili ručnim unosom. 14. Ponovite 13. korak za sve preostale epruvete sa puferom za uzorak. 15. Postavite epruvete sa puferom za uzorak na stalke sistema BD MAX u skladu sa unificiranim trakama reagensa složenim u koracima 6 do 9. NAPOMENA: Epruvete sa puferom za uzorak postavite u stalak tako da 1D nalepnice sa bar kodovima budu okrenute ka spolja (to će vam olakšati skeniranje epruveta sa puferom za uzorak prilikom prijave uzoraka). 16. Stavite potreban broj patrona BD MAX PCR u sistem BD MAX (pogledajte sliku 2): Svaka BD MAX PCR patrona omogućava 1 krug testiranja do 12 uzoraka za ukupno 12 uzorka. Sistem BD MAX će automatski odabrati položaj i red na patroni BD MAX PCR za svaki krug testiranja. BD MAX PCR patrone se koriste po obradi i po stalku (1 analiza po patroni i 1 patrona po stalku). Da biste maksimalno iskoristili patrone BD MAX PCR, u načinu 2000 Sample Mode (režim rada za 2000 uzoraka) odaberite Run Wizard (Čarobnjak za obradu) na kartici Worklist (Radna lista) za dodelu žleba. Više informacija potražite u Korisničkom priručniku za sistem BD MAX. 9 5

6 Slika 2: Umetanje patrona BD MAX PCR 17. Umetanje stalaka u sistem BD MAX (pogledajte sliku 3). Strana A Strana B Slika 3: umetanje stalaka u sistem BD MAX 18. Zatvorite poklopac sistema BD MAX i kliknite na <Start> (Pokreni) da biste pokrenuli obradu. 19. Na kraju ciklusa odmah proverite rezultate ili smestite epruvete sa puferom za uzorak na 2 8 C do 5 dana (120 sati) ILI na 2 25 C najviše do 48 sati dok se rezultati ne provere. NAPOMENA: Ako je tokom testiranja oštećen opnasti čepić, zamenite ga novim pre čuvanja uzorka. NAPOMENA: Pripremljene epruvete BD MAX Sample Buffer Tubes možete čuvati na 2 8 C najviše 120 sati (5 dana) ILI na 2 25 C najviše 48 sati. Kada se dobije Indeterminate (IND) (Neodređeni), Unresolved (UNR) (Nerazrešeni) ili Incomplete (INC) (Nepotpuni) rezultat, ili kada dođe do greške spoljnih kontrola, u tom vremenskom roku treba ponoviti testiranje sa pripremljenom epruvetom sa puferom za uzorak BD MAX UVE (pogledajte odeljak Ponavljanje postupka testiranja). KONTROLA KVALITETA Postupci kontrole kvaliteta osmišljeni su za nadzor izvođenja testa. Laboratorije su u obavezi da odrede broj, vrstu i učestalost testiranja kontrolnih materijala u skladu sa smernicama ili zahtevima lokalnih, regionalnih, državnih i federalnih propisa ili akreditacijske ustanove kako bi se nadgledala efikasnost celokupnog analitičkog postupka. Za opšte smernice u vezi sa kontrolom kvaliteta korisnik može da pogleda dokumente organizacije Clinical Laboratory Standards Institute MM3 10 i EP BD ne isporučuje materijale za spoljnu kontrolu. Spoljne pozitivne i negativne kontrole se ne koriste u softveru sistema BD MAX u svrhu interpretacije rezultata testa uzoraka. Spoljne kontrole se tretiraju kao da su uzorci pacijenata. (Radi detaljnog tumačenja rezultata testiranja spoljnih kontrola, pogledajte tabelu 2.) 2. Barem jednom dnevno potrebno je da se izvodi jedna (1) pozitivna spoljna kontrola i jedna (1) negativna spoljna kontrola dok se ne postigne zadovoljavajuća potvrda procesa u sistemu BD MAX u svim laboratorijskim okruženjima. Smanjivanje učestalosti kontrolnog testiranja treba sprovoditi u skladu sa primenjivim propisima. 3. Spoljna pozitivna kontrola je namenjena za nadzor velike greške u vezi sa reagensom. Spoljna negativna kontrola se upotrebljava za otkrivanje kontaminacije reagensa ili okoline (ili prenošenja) putem nukleinskih kiselina. 4. Preporučuje se sprovođenje različitih spoljnih kontrola kako bi se korisniku omogućilo da izabere onu koja je najprikladnija za program kontrole kvaliteta u svojoj laboratoriji. 6

7 a. Negativna spoljna kontrola: komercijalno dostupni kontrolni materijal ili prethodno okarakterizovani uzorak za koji se zna da je negativan. BD preporučuje da se negativne spoljne kontrole pripreme pre pozitivne spoljne kontrole kako bi se smanjila mogućnost kontaminacije kao posljedica pripreme kontrole. b. Pozitivna spoljna kontrola: komercijalno dostupni kontrolni materijali, kao što su sojevi koje nudi kompanija ZeptoMetrix navedeni u nastavku (pogledajte tabelu 1) ili prethodno okarakterizovani uzorci za koje se zna da su pozitivni. Tabela 1: komercijalno dostupni sojevi za spoljnu pozitivnu kontrolu Soj pozitivne spoljne kontrole Rekombinantni norovirus GI ili GII rotavirus A Adenovirus F40 ili F41 Humani astrovirus tipa 4 ili tipa 8 Broj dela ZeptoMetrix 0886CF ili 0887CF ZeptoMetrix 0841CF ili CF ZeptoMetrix 0884CF ili 885CF ZeptoMetrix CF ili CF Za pripremu suspenzije za spoljnu kontrolu, preporučuje se da se tečnost svake kulture virusa razredi u razmeri 1 : 10 u TE puferu. Inokulirajte 5 μl virusne suspenzije u odgovarajuću epruvetu s puferom za uzorak. Obradite i testirajte kao uzorak (pogledajte poglavlja Priprema uzoraka i Rad sistema BD MAX). 5. Sve spoljne kontrole treba da daju očekivane rezultate (pozitivne za pozitivne spoljne kontrole i negativne za negativne spoljne kontrole) bez neuspelih spoljnih kontrola (sa nerazrešenim, neodređenim, nepotpunim rezultatima). 6. Spoljna negativna kontrola koja da pozitivan rezultat testa ukazuje na rukovanje uzorkom i/ili na kontaminaciju. Razmotrite tehniku rukovanja uzorkom kako biste izbegli mešanje uzoraka i/ili kontaminaciju. Spoljna pozitivna kontrola koja daje negativan rezultat ukazuje na probleme pri rukovanju uzorkom / pripremi. Razmotrite tehniku rukovanja uzorkom / pripreme. 7. Spoljna kontrola koja da nerazrešeni, neodređeni ili nepotpuni rezultat ukazuje na grešku reagensa ili sistema BD MAX. Pogledajte na monitoru sistema BD MAX da li ima poruka o greškama. Pogledajte odeljak Sažetak grešaka sistema u Korisničkom priručniku sistema BD MAX 9 radi tumačenja kodova upozorenja i grešaka. Ako se problem ne ukloni, upotrebite reagense iz neotvorene kesice ili novi komplet BD MAX Enteric Viral Panel. 8. Svaka epruveta za izdvajanje BD MAX Enteric Viral Panel sadrži kontrolu obrade uzorka, odnosno konstrukt oklopljenog RNK koji sadrži sintetičku ciljnu sekvencu RNK. Kontrola obrade uzoraka se izdvaja, eluira i pojačava zajedno sa svim DNK/RNK eventualno prisutnim u obrađenom uzorku, što osigurava predvidivost analize. Kontrola obrade uzoraka nadgleda efikasnost hvatanja DNK/RNK, pranja i ispiranja tokom obrade uzoraka, kao i efikasnost konverzije RNK u DNK i pojačavanja i otkrivanja cilja DNK tokom PCR analize. Ako rezultati kontrole obrade uzorka ne ispune kriterijume prihvatljivosti, rezultat uzorka se prijavljuje kao nerešen; međutim, biće prijavljeni svi pozitivni rezultati ispitivanja (POS) i nijedan od ciljeva se neće smatrati NEG. Izveštaj će se pripremiti posebno za svaku glavnu mešavinu. Nerešen rezultat ukazuje na inhibitorno svojstvo uzorka ili na grešku reagensa. Ponovite svaki uzorak prijavljen kao nerazrešen kako je opisano u odeljku Ponavljanje postupka testiranja. TUMAČENJE REZULTATA Rezultati su dostupni na kartici <Results> (Rezultati) u prozoru <Results> (Rezultati) na monitoru sistema BD MAX. Softver sistema BD MAX automatski tumači rezultate testa. Rezultati se prijavljuju za svaki od analita i za kontrolu obrade uzorka. Rezultat testiranja može biti NEG (negativan), POS (pozitivan) ili UNR (nerazrešen) na osnovu amplifikacijskog statusa cilja i kontrole obrade uzorka. IND (neodređeni) ili INC (nepotpuni) rezultati posledica su greške u sistemu BD MAX. U slučaju delimičnog rezultata UNR, kada jedan ili više ciljeva imaju rezultat POS, a svi drugi ciljevi imaju rezultat UNR, nijedan od ciljeva sa rezultatom UNR neće imati rezultat NEG. Izveštaj će se pripremiti posebno za svaku glavnu mešavinu. Tumačenje rezultata testa BD MAX Enteric Viral opisano je u nastavku u tabeli 2. Tabela 2: Tumačenje rezultata testa BD MAX Enteric Viral Panel PRIJAVLJENI REZULTAT TESTA NoV POS RoV POS AdV POS hastv POS SaV POS NoV NEG RoV NEG AdV NEG hastv NEG SaV NEG TUMAČENJE REZULTATA otkriven je RNK norovirusa GI ili GII otkriven je RNK rotavirusa A otkriven je DNK adenovirusa F40/F41 otkriven je RNK humanog astrovirusa otkriven je RNK sapovirusa genogrupe I, II, IV ili V nije otkriven RNK norovirusa i otkrivena je kontrola obrade uzorka nije otkriven RNK rotavirusa A i otkrivena je kontrola obrade uzorka nije otkriven DNK adenovirusa F40/41 i otkrivena je kontrola obrade uzorka nije otkriven RNK humanog astrovirusa i otkrivena je kontrola obrade uzorka nije otkriven RNK sapovirusa genogrupe I, II, IV ili V i otkrivena je kontrola obrade uzorka 7

8 PRIJAVLJENI REZULTAT TESTA NoV UNR RoV UNR AdV UNR hastv UNR SaV UNR Indeterminate (IND) Incomplete (INC) TUMAČENJE REZULTATA nije otkriven RNK norovirusa GI ili GII i nije otkrivena kontrola obrade uzorka (ukazuje na inhibitorni uzorak ili na grešku reagensa) nije otkriven RNK rotavirusa A i nije otkrivena je kontrola obrade uzorka (ukazuje na inhibitorni uzorak ili na grešku reagensa) nije otkriven DNK adenovirusa F40/F41 i nije otkrivena kontrola obrade uzorka (ukazuje na inhibitorni uzorak ili na grešku reagensa) nije otkriven RNK humanog astrovirusa i nije otkrivena kontrola obrade uzorka (ukazuje na inhibitorni uzorak ili na grešku reagensa) nije otkriven RNK sapovirusa genogrupe I, II, IV ili V i nije otkrivena kontrola obrade uzorka neodređeni rezultat kao posledica greške u sistemu BD MAX (sa kodovima upozorenja ili greške a ) nepotpuna obrada (sa kodovima upozorenja ili greške a ) a Za tumačenje kodova upozorenja i greške pogledajte poglavlje Rešavanje problema u Korisničkom priručniku sistema BD MAX. 9 PONAVLJANJE POSTUPKA TESTIRANJA NAPOMENA: Epruveta sa puferom za uzorak sadrži dovoljnu količinu za jedno ponavljanje testiranja. Za epruvete sa puferom za uzorak koje se čuvaju na 2 25 C potrebno je ponoviti testiranje u roku od 48 sata nakon početne inokulacije epruvete sa puferom za uzorak. U protivnom, za epruvete sa puferom za uzorak koje se čuvaju na 2 8 C može se ponoviti testiranje u roku od 120 sati (5 dana) nakon početne inokulacije epruvete sa puferom za uzorak. Preostali uzorci stolice se mogu upotrebiti za ponovno testiranje unutar 120 sati (5 dana) od prikupljanja ako se čuvaju na 2 8 C ili unutar 48 sati ako se čuvaju na 2 25 C. NAPOMENA: Novi uzorci se mogu testirati u istom krugu sa ponovljenim uzorcima. NERAZREŠENI REZULTAT Do nerazrešenog rezultata može doći u slučaju kada inhibitorna svojstva uzorka ili greška reagensa spreče pravilnu amplifikaciju cilja ili kontrole obrade uzorka. Ako se kontrola obrade uzorka ne amplificira, uzorak se prijavljuje kao UNR, međutim, biće prijavljeni svi pozitivni (POS) rezultati analize i svi drugi ciljevi će biti obeleženi kao UNR. Sistem BD MAX izveštava o rezultatima pojedinačno za svaki cilj, a rezultat UNR se može dobiti za jedan ili više ciljeva testa BD MAX Enteric Viral Panel. U slučaju potpunog UNR-a, kada svi ciljevi imaju rezultat UNR, neophodno je ponoviti test. U slučaju parcijalnog rezultata UNR testa BD MAX Enteric Viral Panel, kada jedan ili više ciljeva imaju rezultat POS, a svi drugi ciljevi imaju rezultat UNR, test bi trebalo ponoviti na gore opisan način. U retkim slučajevima može doći do rezultata koji se ne podudaraju kod ponovljenog testiranja za one ciljeve koji su inicijalno zabeleženi kao POS. U tom slučaju, zadržava se svaki pozitivan rezultat. Uzorci se mogu ponoviti iz odgovarajućih epruveta sa puferom za uzorak u prethodno definisanim vremenskim rasponima. Promešajte uzorke na vorteks mešalici jedan (1) minut i krenite iznova iz odeljka Rad sistema BD MAX. Preostali uzorak stolice se može koristiti i za ponovljeno testiranje sa novom epruvetom sa puferom za uzorak unutar vremenskog raspona koji je prethodno definisan. Krenite iznova iz odeljka Priprema uzorka. NEODREĐENI REZULTAT Neodređeni rezultat se može dobiti u slučaju kvara sistema. Uzorci se mogu ponoviti iz odgovarajućih epruveta sa puferom za uzorak u prethodno definisanim vremenskim rasponima. Promešajte uzorke na vorteks mešalici jedan (1) minut i ponovno krenite pridržavajući se poglavlja Rad sistema BD MAX. Preostali uzorak stolice se može koristiti i za ponovljeno testiranje sa novom epruvetom sa puferom za uzorak unutar vremenskog raspona koji je prethodno definisan. Krenite iznova iz odeljka Priprema uzorka. Tumačenje kodova upozorenja ili grešaka potražite u Korisničkom priručniku sistema BD MAX 9 (Pogledajte poglavlje Rešavanje problema ). NEPOTPUNI REZULTAT Do nepotpunih rezultata može doći u slučaju da nije dovršena priprema uzorka ili PCR. Uzorci se mogu ponoviti iz odgovarajućih epruveta sa puferom za uzorak u prethodno definisanim vremenskim rasponima. Promešajte uzorke na vorteks mešalici jedan (1) minut i ponovno krenite pridržavajući se poglavlja Rad sistema BD MAX. Preostali uzorak stolice se može koristiti i za ponovljeno testiranje sa novom epruvetom sa puferom za uzorak unutar vremenskog raspona koji je prethodno definisan. Krenite iznova iz odeljka Priprema uzorka. Tumačenje kodova upozorenja ili grešaka potražite u Korisničkom priručniku sistema BD MAX 9 (Pogledajte poglavlje Rešavanje problema ). GREŠKA SPOLJNE KONTROLE Spoljne kontrole bi trebalo da daju očekivani rezultat prilikom testiranja. Ako se testiranje uzoraka mora ponoviti zbog netačnog rezultata spoljne kontrole, treba ih ponoviti iz njihovih epruvete sa puferom za uzorak zajedno sa sveže pripremljenim spoljnim kontrolama u prethodno definisanim vremenskim okvirima. Promešajte uzorke na vorteks mešalici jedan (1) minut i ponovno krenite pridržavajući se poglavlja Rad sistema BD MAX. 8

9 UZGOJ UZORAKA Uzgajanje i identifikovanje organizama iz pozitivnih uzoraka treba obaviti prema laboratorijskim procedurama. OGRANIČENJA PROCEDURE Ovaj proizvod se koristi isključivo sa sistemom BD MAX. Ovaj proizvod je namenjen za upotrebu samo sa uzorcima ljudske stolice koji su nekonzervisani ili konzervisani na transportnoj podlozi Cary-Blair. Uzorci stolice sa rektalnih briseva ili čvrste stolice nisu potvrđeni testom BD MAX Enteric Viral Panel. Pogrešni rezultati testa mogu se javiti i zbog nepravilnog prikupljanja uzorka, nepravilnog rukovanja ili čuvanja, tehničke greške, pomešanih uzoraka ili zbog toga što je broj organizama u uzorku manji od analitičke osetljivosti testa. Ako test BD MAX Enteric Viral Panel daje rezultat IND, INC ili UNR (za jedan cilj ili više njih), potrebno ga je ponoviti. Pozitivan rezultat testa BD MAX Enteric Viral Panel ne upućuje nužno na prisutnost vijabilnih organizama. Međutim, upućuje na prisutnost ciljne DNK/RNK. Mutacije ili polimorfizmi u područjima veze prajmera ili probe mogu da utiču na otkrivanje novih ili nepoznatih ciljanih varijacija, što rezultira lažnim negativnim rezultatom testa BD MAX Enteric Viral Panel. BD MAX Enteric Viral Panel istovremeno otkriva norovirus GI i GII i međusobno ne razlikuje te vrste. BD MAX Enteric Viral Panel istovremeno prepoznaje adenovirus F40/F41 i međusobno ne razlikuje te vrste. BD MAX Enteric Viral Panel istovremeno prepoznaje genogrupe sapovirusa I, II, IV i V i međusobno ne razlikuje te vrste. Kao i kod svih in vitro dijagnostičkih testova baziranih na PCR-u, moguće je detektovati izuzetno niske nivoe ciljane supstance ispod granice opažanja ili LoD, ali rezultat možda neće biti moguće reprodukovati. Lažni negativni rezultati se mogu pokazati zbog gubitka nukleinske kiseline zbog neprikladnog prikupljanja, transporta ili čuvanja uzoraka ili zbog neodgovarajuće lize virusnih ćelija. Testu je dodata kontrola obrade uzoraka kako bi potpomogla u identifikaciji uzoraka koji sadrže inhibitore PCR amplifikacije i delovala kao kontrola celovitosti reagensa i sistema za testiranje. Kontrola obrade uzoraka ne pokazuje da li je do gubitka nukleinske kiseline došlo zbog neprikladnog prikupljanja, transporta ili čuvanja uzoraka, kao ni da li su virusne kapside pravilno lizirane. Rezultati testa BD MAX Enteric Viral Panel treba da se koriste zajedno sa kliničkim opažanjima i drugim informacijama koje su lekaru dostupne. Kao kod svih in vitro dijagnostičkih testova, pozitivne i negativne prediktivne vrednosti veoma zavise od učestalosti. Uspešnost testa BD MAX Enteric Viral Panel se može razlikovati u zavisnosti od testirane učestalosti i populacije. Na rezultate testa BD MAX Enteric Viral Panel može i ne mora da utiče istovremena medicinska terapija, zbog koje može doći do smanjenja prisutnih ciljnih uzoraka. Ova epruveta sa puferom za uzorak nije osmišljena da podrži vijabilnost organizma. Ako je uzgoj neophodan, on mora da se obavi iz originalnog uzorka. Uspešnost tog testa nije utvrđena za nadzor tretmana norovirusa GI i GII, rotavirusa A, adenovirusa F40/41, sapovirusa (genogrupa I, II, IV i V) i zaraza humanim astrovirusom. Ovo je kvalitativni test i ne daje kvantitativne vrednosti, niti pokazuje u kojoj su količini organizmi prisutni. Performanse ovog testa nisu procenjene kada se on sprovodi na pojedincima sa narušenim imunim sistemom ili pacijentima bez simptoma gastrointestinalne infekcije. Efekat ometajućih supstanci je procenjen za one navedene u ovoj brošuri. Potencijalno ometajući efekat nije procenjen za supstance koje nisu opisane u odeljku Smetnje u nastavku. Ometajući efekat koji imaju supstance koje nisu opisane u odeljku Smetnje u nastavku može da dovede do pogrešnih rezultata. Pokazalo se da adenovirus tipa 1, koji se povezuje sa infekcijama kod ljudi, ima potencijal da unakrsno reaguje sa testom BD MAX Enteric Viral Panel. Nije procenjena unakrsna reaktivnost sa organizmima koji nisu navedeni u odeljku Analitička specifičnost u nastavku. FUNKCIONALNE KARAKTERISTIKE Kliničke karakteristike svojstava testa BD MAX Enteric Viral Panel utvrđene su internom, simuliranom kliničkom studijom pomoću klinički dobijenih prospektivnih i retrospektivnih uzoraka. Klinička studija je obuhvatila 2239 uzoraka, od kojih je 1048 uzoraka nekonzervisano, a 1191 uzoraka konzervisano na podlozi Cary-Blair. Rezultati svojstava iz simulirane kliničke studije za svaki cilj prikazani su u tabelama 3 do 7 u nastavku. Tabela 3: Svojstva norovirusa: Kombinovane vrste uzoraka Referentna metoda BD MAX Ukupno P N P N Ukupno PPA : 93,8% (88,7%, 96,7%) NPA : 99,5% (98,9%, 99,7%) 9

10 Tabela 4: Svojstva rotavirusa: Kombinovane vrste uzoraka Referentna metoda BD MAX Ukupno P N P N Ukupno PPA (95% CI): % (96,5%, %) NPA : 99,5% (99,0%, 99,8%) Tabela 5: Svojstva adenovirusa: Kombinovane vrste uzoraka Referentna metoda BD MAX Ukupno P N P N Ukupno PPA (95% CI): % (88,3%, %) NPA : % (99,7%, %) Tabela 6: Svojstva sapovirusa: Kombinovane vrste uzoraka Referentna metoda BD MAX Ukupno P N P N Ukupno PPA (95% CI): 87,5% (77,2%, 93,5%) NPA : 99,3% (98,7%, 99,6%) Tabela 7: Svojstva humanog astrovirusa: Kombinovane vrste uzoraka Referentna metoda BD MAX Ukupno P N P N Ukupno PPA (95% CI): 92,9% (83,0%, 97,2%) NPA : 99,8% (99,4%, 99,9%) Stopa neprijavljivih uzoraka Početna stopa nerešenih od 1724 prospektivnih uzoraka procenjivanih u ovoj studiji iznosila je 0,9% uzoraka konzervisanih na transportnoj podlozi Cary-Blair i 2,2% nekonzervisanih uzoraka. Stopa nerešenih uzoraka nakon valjanog ponovljenog testa iznosila je samo 0,1% prospektivnih uzoraka i 1,3% nekonzervisanih uzoraka (pogledajte tabelu 8). Od 1724 prospektivnih uzoraka procenjivanih u ovoj studiji, 0,5% uzoraka konzervisanih na transportnoj podlozi Cary-Blair i 1,6% nekonzervisanih uzoraka početno su prijavljeni kao neodređeni. Nakon valjanog ponovljenog testa, 0,1% uzoraka konzervisanih na transportnoj podlozi Cary-Blair i nijedan nekonzervisani uzorak ostali su označeni kao neodređeni (pogledajte tabelu 8). Od 1,724 prospektivnih uzoraka procenjivanih u ovoj studiji, 0,1% uzoraka konzervisanih na transportnoj podlozi Cary-Blair i 0,4% nekonzervisanih uzoraka početno su prijavljeni kao nepotpuni. Nakon valjanog ponovljenog testa, 0,1% uzoraka konzervisanih na transportnoj podlozi Cary-Blair i nijedan nekonzervisani uzorak ostali su označeni kao nepotpuni (pogledajte tabelu 8). 10

11 Kombinovani ciljevi Vrsta uzorka Uzorci konzervisani na transportnoj podlozi Cary- Blair Nekonzervisani uzorci Tabela 8: Stope neprijavljivih uzoraka za kombinovane ciljeve (ukupno) Stopa nerešenih uzoraka Početni EVP 0,9 9/952 (0,5, 1,8) 2,2 17/772 (1,4, 3,5) Kombinovano 1,5 26/1724 (1,0, 2,2) Konačni EVP 0,1 1/943 (0,0, 0,6) 1,3 10/762 (0,7, 2,4) 0,6 11/1705 (0,4, 1,2) Stopa neodređenih uzoraka Početni EVP 0,5 5/952 (0,2, 1,2) 1,6 12/772 (0,9, 2,7) 1,0 17/1724 (0,6, 1,6) Konačni EVP 0,1 1/943 (0,0, 0,6) 0,0 0/762 (0,0, 0,5) 0,1 1/1705 (0,0, 0,3) Stopa nepotpunih uzoraka Početni EVP 0,1 1/952 (0,0, 0,6) 0,4 3/772 (0,1, 1,1) 0,2 4/1724 (0,1, 0,6) Konačni EVP 0,1 1/943 (0,0, 0,6) 0,0 0/762 (0,0, 0,5) 0,1 1/1705 (0,0, 0,3) Ukupna stopa Početni EVP 1,6 15/952 (1,0, 2,6) 4,1 32/772 (3,0, 5,8) 2,7 47/1724 (2,1, 3,6) Konačni EVP 0,3 3/943 (0,1, 0,9) 1,3 10/762 (0,7, 2,4) 0,8 13/1705 (0,4, 1,3) Analitička uključivost U ovu studiju su uključene različite vrste ciljnih sojeva za analizu BD MAX Enteric Viral Panel. Kriterijumi izbora vrsta su uključivali prevalencu, serotip i geografsku lokaciju, u slučajevima gde je to bilo prikladno. Ispitano je pedeset osam (58) sojeva, uključujući sojeve iz javnih zbirki i dobro okarakterizovane kliničke izolate. Ispitivanje uključivosti uključivalo je 22 soja norovirusa GI i GII, 5 sojeva rotavirusa, 10 sojeva adenovirusa F40/F41, 11 sojeva sapovirusa i 10 sojeva humanog astrovirusa. Sojevi su testirani pri 3 x granice opažanja (LoD) odgovarajućeg soja u matrici nekonzervisane stolice. BD MAX Enteric Viral Panel tačno je prepoznao svih 58 sojeva koji su ispitani nakon početnog ispitivanja. Analitička osetljivost Analitička osetljivost (granica opažanja ili LoD) za test BD MAX Enteric Viral Panel u matrici uzorka urina i vaginalnog brisa utvrđena je na sledeći način: Svaki od ciljanih organizama je pripremljen i kvantifikovan pre uključivanja u ovu studiju. Pojedinačne omče za inokulaciju umočene su u svaki preparat organizma i zatim su prebačene u epruvetu sa puferom za uzorak koja je već sadržala fekalnu matricu (konzervisanu ili nekonzervisanu) koja je unapred određena kao negativna za sve ciljeve utvrđene pomoću testa BD MAX Enteric Viral Panel. Svaki organizam su ispitala 2 operatera sa minimalno 20 replika po vrsti uzorka (konzervisanog ili nekonzervisanog) pomoću 3 različite proizvodne serije testa BD MAX Enteric Viral Panel. Granica opažanja (LoD) za određene organizme potvrđena je ispitivanjem najmanje 20 dodatnih replika pri određenoj koncentraciji za granicu opažanja (LoD). Analitička osetljivost (LoD), definisana kao najniža koncentracija pri kojoj se očekuje da će 95% ili više procenata svih replika dati pozitivan rezultat testa (pogledajte tabelu 9). Tabela 9: Granica opažanja za pojedinačne ciljeve za BD MAX Enteric Viral Panel Ciljni organizam norovirus rotavirus adenovirus humani astrovirus sapovirus Soj Granica opažanja (LoD) za nekonzervisane uzorke (cp/ml u stolici) Granica opažanja (LoD) za uzorke konzervisane na transportnoj podlozi Cary- Blair (cp/ml u stolici) GI 6,28E+06 4,71E+06 GII 2,49E+05 2,49E+05 WA 6,46E+03 1,29E+04 Va70 1,16E+04 5,82E+03 F40 6,89E+04 2,75E+05 F41 8,16E+04 1,22E+05 tip 4 1,75E+07 3,49E+07 tip 8 5,23E+06 2,09E+07 GI 6,51E+07 6,51E+07 GII 1,94E+06 1,94E+06 Analitička specifičnost (unakrsna reaktivnost i isključivost) BD MAX Enteric Viral Panel izveden je na uzorcima koji su sadržali filogenetski povezane vrste i druge organizme (bakterije, viruse, parazite i gljivice) za koje postoji velika verovatnoća da se pronađu u uzorcima stolice. Bakterijske ćelije, gljivice, paraziti i virusi ispitani su u epruveti sa puferom za uzorak pri 10 6 CFU, ćelijskih ili genomskih ekvivalenata / ml u stolici, ili 10 5 PFU / ml u stolici ili TCID50/ml u stolici. Ukupno je ispitano 112 organizama. 11

12 Većina ispitanih bakterijskih sojeva, gljivica, parazita i virusa dali su negativan rezultat sa testom BD MAX Enteric Viral Panel. Adenovirus tipa 1, koji se povezuje sa bolestima kod ljudi, dao je pozitivne rezultate sa testom BD MAX Enteric Viral Panel. Međutim, nije zabeležen nijedan pozitivan rezultat pri 1,0 x 10 4,8 TCID50 jedinice / ml u stolici sa ovim sojem. Supstance koje izazivaju interferenciju Trideset dve (32) biološke i hemijske supstance koje mogu povremeno biti prisutne u uzorcima stolice procenjene su zbog moguće interferencije sa testom BD MAX Enteric Viral Panel. U ovu studiju je uključena i mešavina antibiotika, koja se sastojala od kombinacije 7 različitih antibiotika ili analgetika koji su istovremeno ispitani. Ti antibiotici ili analgetici uključivali su naproksen natrijum, dinatrijum ceftriakson, eritromicin, metronidazol, sulfametoksazol, tetraciklin hidrohlorid i trimetoprim. Utvrđeno je da hidrokortizon mast utiče na rezultate na nivoima većim od 25% količine. RotaTeq vakcina takođe je dala očekivane pozitivne rezultate jer se vakcina može zadržati u stolici do 9 dana nakon vakcinisanja. 12 Rezultati nisu pokazali nikakav zabeležen uticaj bilo koje druge ispitane supstance (pogledajte tabelu 10). Osim toga, mikroorganizmi koji mogu endogeno biti prisutni u uzorcima stolice procenjeni su zbog moguće interferencije sa testom BD MAX Enteric Viral Panel. Ispitano je pet (5) organizama u visokoj koncentraciji (1 x 10 6 stanica / ml stolice). Rezultati su pokazali da nije primećena interferencija nijednog ispitanog mikroorganizma (pogledajte tabelu 11). Tabela 10: Endogene i komercijalne egzogene supstance testirane testom BD MAX Enteric Viral Panel Naziv robne marke ili opis Rezultat Naziv robne marke ili opis Rezultat Fekalna masnoća NI Spermicidalni lubrikant NI Ljudska DNK NI Čepić (glicerin) NI Sluz NI Vagisil NI Puna ljudska krv NI Laksativi NI Hidrokortizon mast I Sredstvo protiv dijareje (tečno) NI Antiseptičke maramice NI Sredstvo protiv dijareje (kapsula) NI Klistir, mineralno ulje NI Mešavina antibiotika NI Gel za hemoroide NI Antacidi NI Nistatin mast NI Nesteroidni antiinflamatorni lekovi (NSAID) NI Topikalni antibiotici NI RoV vakcina (reasortirani rotavirus ATCC VR-2195 i VR-2415) NI I: Prijavljene interferencije sa testom BD MAX Enteric Viral Panel pri visokim koncentracijama. NI: Nema prijavljenih interferencija sa testom BD MAX Enteric Viral Panel. Tabela 11: Mikroorganizmi ispitani na interferencije sa testom BD MAX Enteric Viral Panel Mikroorganizam Salmonella typhimurium Escherichia coli Proteus vulgaris Enterococcus faecalis Peptostreptococcus anaerobius NI: Nema prijavljenih interferencija sa testom BD MAX Enteric Viral Panel. 12 Rezultat Kombinacija infektivne/kompetitivne interferencije Kombinovano ispitivanje infektivne/kompetitivne interferencije osmišljeno je da oceni sposobnost testa BD MAX Enteric Viral Panel da utvrdi niske pozitivne rezultate u prisutnosti drugih ciljanih supstanci u visokoj koncentraciji. Mešavina 2 od 3 organizma (norovirus, rotavirus, adenovirus) za Glavnu mešavinu D6 ili mešavina 1 od 2 organizma (sapovirus, humani astrovirus) za Glavnu mešavinu D5 pripremljena je pri procentu od 95 posto utvrđenom u kliničkom ispitivanju sa ciljem simulacije visokog kliničkog opterećenja koje treba da posluži kao visoki cilj za epruvetu sa puferom za BD MAX Enteric Viral Panel. Analit testa BD MAX Enteric Viral Panel koji nije prisutan u ciljnoj mešavini visoke koncentracije stavljen je epruvetu sa puferom u koncentraciji 2 x većoj od granice opažanja koja predstavlja ciljno nisko opterećenje zajedno sa 5 μl nekonzervisane stolice i ispitan je kako bi se simulirala kombinovana infekcija. U prisutnosti visokog opterećenja, svi organizmi koji odgovaraju svojim simuliranim preparatima kombinovanih infekcija uspešno su utvrđeni pomoću testa BD MAX Enteric Viral Panel. Preciznost Preciznost unutar laboratorija procenjena je za test BD MAX Enteric Viral Panel na jednoj lokaciji. Testiranje je vršeno tokom 12 dana sa 2 testa svakoga dana (2 operatera po jedan test), za ukupno 24 testa. Pet određenih ciljnih organizama korišćeno je pri različitim koncentracijama za izradu uzoraka za ovo ispitivanje. Uzorci za ispitivanje sadržali su norovirus, rotavirus, adenovirus, sapovirus i humani astrovirus. Sledeće vrednosti su korišćene kao gornji nivoi za ciljane organizme sadržane u svakom uzorku studije. Umereno pozitivna (UP): 2,99 x LoD Nisko pozitivna (NP): 1,99 x LoD Stvarno negativna (SN): nema ciljanog rezultata. NI NI NI NI NI