НАСТАВНО-НАУЧНОМ ВЕЋУ ХЕМИЈСКОГ ФАКУЛТЕТА УНИВЕРЗИТЕТА У БЕОГРАДУ Предмет: Извештај о оцени научне заснованости и оправданости предложене теме за израду докторске дисертације Карле Илић Ђурђић, мастер дипломираног биохемичара. На редовној седници Наставно-научног већа Хемијског факултета, Универзитета у Београду, одржаној 16. маја 2019. године одређени смо у Комисију за подношење извештаја о оцени научне заснованости и оправданости предложене теме за израду докторске тезе Карле Илић Ђурђић, мастер дипломираног биохемичара, пријављене под насловом: Протеински инжењеринг лигнинолитичких пeроксидаза у циљу повећања ефикасности деградације текстилних боја На основу проучене документације подносимо Наставно-научном већу следећи ИЗВЕШТАЈ А. Основни подаци о кандидату Карла (Жељко) Илић Ђурђић рођена је 28. септембра 1993. године у Зрењанину, Република Србија. Средњу Медицинску школу, смер фармацеутски техничар завршила је у Зрењанину. Хемијски факултет Универзитета у Београду уписала је 2012. године као редован студент, а дипломирала у јуну 2015. године са просечном оценом 9,97 са завршним радом под насловом: Хетерологна експресија лигнин-пероксидазе Х2 и манган-пероксидазе Х1 из Phanerocheate chrysosporium у бактерији Escherichia coli оцењеним оценом 10. Мастер студије уписала је у септембру исте године, а завршила их је у августу 2016. године са просечном оценом 10,00 и одбранила мастер рад под називом Хетерологна експресија лигнинолитичких пероксидаза гљива у бактеријама и квасцима оцењен оценом 10. Исте године уписала је докторске студије на Хемијском факултету Универзитета у Београду, студијски програм доктор биохемијских наука. У току масер студија била је ангажована као сарадник у настави на више курсева ОАС Хемијског факултета, Универзитета у Београду, а као истраживач приправник запослена је новембра 2016. године на Хемијском факултету, Универзитета у Београду на пројекту Министарства просвете, науке и технолошког развоја бр. 172049: Алергени, антитела, ензими и мали физиолошки значајни молекули: дизајн, структура, функција и значај, под руководством професорке Марије Гавровић- Јанкуловић. У априлу 2018. године изабрана је у звање асистента Хемијског факултета, Универзитета у Београду за ужу научну област Биохемија.
У току завршне године ОАС и у току МАС била је стипендиста фонда Доситеј, а по завршетку ОАС добила је награду Хемијског факултета за студента генерације Хемијског факултета, Универзитета у Београду који је дипломирао у школској 2014/2015. години; награду Ректората Универзитета у Београду за најбољег студента генерације Хемијског факултета, Универзитета у Београду који је дипломирао у школској 2014/2015. години; годишњу награду Српског хемијског друштва за најбоље дипломиране студенте хемије и хемијске технологије у Републици Србији и диплому Ђорђе Стефановић за студента генерације смера Биохемичар Хемијског факултета, Универзитета у Београду. У току ДАС провела је два пута по три месеца као истраживач на Фраунхофер институту за молекуларну биологију и примењену екологију, Ахен, Немачка. За наведене боравке добила је стипендију Министарства просвете науке и технолошког развоја за студијске боравке у иностранству и стипендију DAAD фондације за кратке истраживачке боравке у Немачкој. Б. Објављени научни радови и саопштења Карла Илић Ђурђић се бави протеинским инжењерингом лигнинолитичких пероксидаза и развојем високо ефикасних метода за претрагу библиотека гена у циљу унапређења индустријски значајних карактеристика ових ензима. Такође, бави се проучавањем утицаја мутација у окружењу активног места лигнинолитичких пероксидаза на супстратну специфичност ових ензима и деградацију полутаната, пре свега текстилних боја, све у циљу унапређења ефикасности ових процеса. До сада је презентовала своје резултате на FEBS3+ конференцији у виду кратког предавања под називом Improvement of the oxidative stability of fungal ligninolytic peroxidases by FACS-based high throughput screening system. Поред овога коаутор је и једног научног рада објављеног у водећем међународном часопису. Радови објављени у истакнутим часописима међународног значаја (М22) 1. A.М. Balaž, J. Stevanović, R. Ostafe, M. Blazić, K. Ilić Đurđić, R. Fischer, R. Prodanović, Semirational design of cellobiose dehydrogenase for increased stability in the presence of peroxide, Molecular Diversity, 2019 (accepted). doi: 10.1007/s11030-019-09965-0 Научна саопштења на скуповима међународног значаја штампана у изводу (М34) 2. K. Ilic Durdic, R. Ostafe, H. Schinkel, S. Ece, S. Schillberg, R. Fischer, R. Prodanovic, Improvement of the oxidative stability of fungal ligninolytic peroxidases by FACS-based high throughput screening system, FEBS 3+ conference: From molecules to living systems, Syófok, Hungary, September, 2-5, 2018. p. 92. В. Образложење теме 1. Научна област Научна област је биохемија (биохемијски аспекти утицаја аминокиселинске секвенце ензима на активност), за коју је матичан Хемијски факултет, Универзитета у Београду.
2. Предмет рада Предмет научног истраживања је добијање мутаната лигнолитичких пероксидаза са повећаном стабилношћу у присуству водоник пероксида и већом ефикасношћу деградације текстилних боја. Испитивања планирана у оквиру ове докторске дисертације подразумевају сатурациону мутагенезу околине каталитичког триптофана версатилне и лигнин пероксидазе и испитивање утицаја замењених аминокиселина на супстратну специфичност ових ензима. Такође, подразумевају развој система базираног на проточној цитометрији за високо ефикасно претраживање библиотека гена лигнинолитичких пероксидаза ка мутантима са повећаном оксидативном стабилности и активности у присуству водоник пероксида, неопходне за примену пероксидаза у биоремедијационе сврхе. 3. Научни циљ истраживања У оквиру ове тезе формулисано је неколико научних циљева истраживања: А) Припрема сатурационих библиотека гена за лигнин и версатилну пероксидазу са уведеним мутацијама у окружењу каталитички активног триптофана и експресија добијених мутантата ензима у ћелијама квасца Saccharomyces cerevisiae EBY100 у виду химере приказане на површини ћелија. Б) Припрема библиотеке гена лигнин и версатилне пероксидазе методом случајних мутација и експресија у квасцу Saccharomyces cerevisiae EBY100 у виду химере приказане на површини ћелија. В) Развој методе за високоефикасну претрагу библиотека гена лигнинолитичких пероксидаза базираног на проточној цитометрији и флуоресценцијом активираном ћелијском сортирању у циљу селекције мутаната пероксидаза са повећаном активношћу и/или оксидативном стабилношћу. Г) Претрага добијених библиотека гена развијеним високо ефикасним методама претраживања за проналажење мутаната лигнолитичких пероксидаза повећане оксидативне стабилности и активности. Д) Претрага добијених библиотека гена у циљу проналажења мутаната ензима са повећаном каталитичком ефикасношћу за различите текстилне боје спектрофотометријским ензимским есејима у микротитар плочама. Ђ) Добијање препарата ћелијских зидова квасца са најстабилнијим и најактивнијим мутантима и њихова карактеризација за деградацију полутаната, посебно различитих текстилних боја. Резултати проистекли из ове тезе би могли да унапреде биоремедијационе системе за деградацију полутаната, омогуће вишеструку употребу пероксидаза у истим процесима, и да унапређењем стабилности обезбеде дугорочнију примену ензима. Такође, с обзиром на широку супстратну специфичност лигнинолитичких пероксидаза развијени системи и припремљене библиотеке гена могле би да имају примену у деградацији других полутаната, а систем за високоефикасну претрагу
библиотека гена примену за унапређење других, индустријски значајних карактеристика пероксидаза. 4. Методе истраживања У оквиру израде докторске тезе биће коришћене следеће експерименталне технике и методе истраживања, с обзиром на захтеве исказане у циљевима истраживања: А) Биохемијске методе: УВ/ВИС спектрофотометрија за одређивање концентрације протеина и мерење ензимске активности на спектрофотометру и флуориметру у киветама и микротитар плочама. Проточна цитометрија за анализу и сортирање ћелија које експримирају активније и/или оксидативно стабилније варијанте ензима. Б) Методе молекуларне биологије: PCR методе за сатурациону и насумичну мутагенезу гена; рестрикциона дигестија и лигација гена у одговарајуће векторе; трансформација бактерија и квасаца векторима са уклонираним генима и агарозна електрофореза за клонирање гена, В) Микробиолошке методе: гајење сојева бактерија и квасаца на течним и чврстим подлогама за експресију рекомбинантних протеина. 5. Актуелност проблематике Услед неефикасних процеса бојења у текстилној индустрији, 10 до 15 % синтетских боја бива отпуштено у животну средину загађујући, пре свега, водене површине. Отпуштање текстилних боја у животну средину може имати лош утицај на присутне екосистеме, као и на здравље људи. Развијени системи за деградацију ових полутаната су веома неефикасни и често резултују концентровању боја или продукцији секундарних полутаната [1]. Биоремедијација је тренутно најефикаснији процес, али је исти ограничен услед великих варијација у структури примењених текстилних боја [2]. Лигнинолитичке пероксидазе су често примењивани ензими у биоремедијацији услед своје широке супстратне специфичности. Каталитички циклус ових ензима подразумева водоникпероксидом посредовану оксидацију супстрата уз формирање радикала на површински лоцираном, каталитички активном триптофану. Показано је да само окружење ове аминокиселине може да има утицај на специфичност лигнинолитичких пероксидаза. Иако је водоник-пероксид неопходан за активност наведених ензима вишак истог доводи до формирања неактиног интермедијера и трајног губитка активности ензима [2-5]. Диригована еволуција и примена високоефикасних метода за претраге библиотека гена базиране на проточној цитометрији показале су се као врло ефикасним за унапређење индустријски значајних карактеристика различитих ензима [6,7]. Сходно свему наведеном припрема сатурационих библиотека гена са уведеним мутацијама у окружењу каталитичког тирптофана лигнин и версатилне пероксидазе могле би ба доведу до проналажења мутаната ових ензима са повећаном активношћу за различите текстилне боје, а припрема насумично мутираних библиотека гена и развој система за високоефикасну претрагу
библиотека гена могла би да доведе до селекције мутаната ензима са повећаном оксидативном стабилношћу, што би даље довело до унапређења процеса деградације текстилних боја. 6. Очекивани резултати У оквиру рада на тези очекује се креирање библиотека гена лигнолитичких пероксидаза сатурационом мутагенезом и случајном мутагенезом као и њихова експресија у квасцу Saccharomyces cerevisiae у виду химере са АГА2 протеином приказаном на површини ћелија квасца. Такође се очекује развој високо ефикасних метода претраживања библиотека гена лигнолитичких пероксидаза ка мутантима са повећаном оксидативном стабилношћу и повећаном активности, заснованих на проточној цитометрији и флуоресцентом обележавању ћелија производима ензимских реакција ових ензима. Као резултат ових експеримената се очекује проналажење и детаљна карактеризација мутаната лигнолитичких пероксидаза који су активнији и стабилнији у односу на природни облик ензима, те самим тим и погоднији за употребу у разградњи текстилних боја. На крају, очекује се добијање препарата ћелијских зидова квасца са најактивнијим и најстабилнијим мутантима лигнолитичких пероксидаза и њихова употреба у деградацији текстилних боја. 7. Литература [1] Nigam, P.; Banat, I. M.; Singh, D.; and Marchant, R. Microbial process for the decolorization of textile effluent containing azo, diazo and reactive dyes. Proc. Biochem. 1996, 31 (5), 435-442. [2] Robinson, T.; Mcmullan, G.; Marchant, R.; and Nigam, P. Remediation of dyes in textile effluent: a critical review on current treatment technologies with a proposed alternative. Biores. Technol. 2001, 77 (3), 247-255. [3] Smith, A. T.; and Veitch N. C. Substrate binding and catalysis in hem peroxidases. Curr. Opin. Chem. Biol. 1998, 2, 269-278. [4] Cai, D.; and Tien, M. Kinetic studies on the formation and decomposition of compounds II and III Reactions of lignin peroxidase with H 2O 2. J. Biol. Chem. 1992, 267 (16), 1149 11155. [5] Pérez-Boada, M.; Ruiz-Dueñas, F. J.; Pogni, R.; Basosi, R.; Choinowski, T.; Martínez, M. J.; Piontek, K.; and Martínez, A. T. Versatile peroxidase oxidation of high redox potential aromatic compounds: sitedirected mutagenesis, spectroscopic and crystallographic investigations of three long-range electron transfer pathways. J. Mol. Biol. 2005, 354 (2), 385 402. [6] Gai, S. A.; and Wittrup, K. D. Yeast surface display for protein engineering and characterization. Curr. Oppin. Struct. Biol. 2007, 17 (4), 467-473. [7] Boder, E. T.; and Wittrup, K. D. Yeast surface display for directed evolution of protein expression, affinity and stability. Methods Enzimol. 2000, 328 (4) 430-444.
Г. Закључак На основу свега изложеног сматрамо да предложена тема одговара савременим трендовима из области биохемије и биотехнологије. Резултати ове докторске тезе могли би да унапреде биоремедијационе системе за деградацију полутаната, омогуће вишеструку употребу пероксидаза у истим процесима и унапређењем стабилности ензима обезбеде њихову дугорочнију употребу. У складу са законом о стицању академских степена и Статутом Хемијског факултета Универзитета у Београду, сматрамо да кандидаткиња испуњава све предвиђене услове за одобрење израде докторске тезе. На основу свега изложеног Комисија предлаже Наставно-научном већу Универзитета у Београду-Хемијског факултета да одобри израду докторске тезе Карли Илић Ђурђић, мастер-дипломираном биохемичару, под измењеним насловом: Протеински инжењеринг лигнинолитичких пeроксидаза у циљу повећања ефикасности деградације текстилних боја За ментора се предлаже др Радивоје Продановић, ванредни професор Универзитета у Београду- Хемијског факултета. Списак радова предложеног ментора из којег се може видети да испуњава услове из Стандарда за акредитацију студијских програма дат је у Прилогу. У Београду, 03.06.2019. Комисија: 1. Др Радивоје Продановић, ванредни професор Хемијског факултета Универзитета у Београду, ментор 2. Др Тања Ћирковић Величковић, редовни професор Хемијског факултета Универзитета у Београду, дописни члан САНУ, члан
3. Др Марија Гавровић-Јанкуловић, редовни професор Хемијског факултета Универзитета у Београду, члан 4. Др Зоран Вујчић, редовни професор Хемијског факултета Универзитета у Београду, члан 5. Др Наташа Божић, научни саветник Института за хемију, технологију и металургију Универзитета у Београду, члан