Utjecaj moringe na fizikalno-kemijske karakteristike i fermentaciju kravljeg mlijeka

Величина: px
Почињати приказ од странице:

Download "Utjecaj moringe na fizikalno-kemijske karakteristike i fermentaciju kravljeg mlijeka"

Транскрипт

1 Utjecaj moringe na fizikalno-kemijske karakteristike i fermentaciju kravljeg mlijeka Miksera, Ivana Master's thesis / Diplomski rad 2020 Degree Grantor / Ustanova koja je dodijelila akademski / stručni stupanj: University of Zagreb, Faculty of Food Technology and Biotechnology / Sveučilište u Zagrebu, Prehrambeno-biotehnološki fakultet Permanent link / Trajna poveznica: Rights / Prava: Attribution-NoDerivatives 4.0 International Download date / Datum preuzimanja: Repository / Repozitorij: Repository of the Faculty of Food Technology and Biotechnology

2 SVEUČILIŠTE U ZAGREBU PREHRAMBENO - BIOTEHNOLOŠKI FAKULTET DIPLOMSKI RAD Zagreb, rujan Ivana Miksera 1252/PI

3 UTJECAJ MORINGE NA FIZIKALNO-KEMIJSKE KARAKTERISTIKE I FERMENTACIJU KRAVLJEG MLIJEKA

4 Rad je izrađen u Laboratoriju za tehnologiju mlijeka i mliječnih proizvoda na Zavodu za prehrambeno tehnološko inženjerstvo Prehrambeno-biotehnološkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu pod mentorstvom doc. dr. sc. Katarine Lisak Jakopović.

5 Zahvale Zahvaljujem se mentorici, doc. dr. sc. Katarini Lisak Jakopović na odabiru vrlo zanimljive teme, stručnim savjetima i velikoj pomoći i podršci za uspješnu izradu diplomskog rada. Zahvaljujem se doc. dr. sc. Ireni Barukčić na stručnim savjetima prilikom izrade ovog rada. Hvala teh. sur. Snježani Šimunić na pruženoj pomoći pri izvedbi eksperimentalnog dijela rada. Zahvaljujem se doc. dr. sc. Maji Repajić i suradnicima iz Laboratorija za kemiju i tehnologiju voća i povrća na pomoći pri izradi eksperimentalnog dijela rada. Veliko hvala mojim roditeljima i obitelji na bezuvjetnoj podršci, motivaciji i strpljenju tijekom svih godina studiranja. Hvala mojim prijateljima i kolegama što su bili tu za mene te mi uljepšali i upotpunili nezaboravne studentske dane. Najveće hvala mom djedu, kolegi dipl. ing. biotehnologije, što je uvijek bio tu za mene kao najveća podrška i poticaj. Nažalost on danas nije ovdje da vidi moj uspjeh.

6 TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA Sveučilište u Zagrebu Prehrambeno-biotehnološki fakultet Zavod za prehrambeno - tehnološko inženjerstvo Laboratorij za tehnologiju mlijeka i mliječnih proizvoda Diplomski rad Znanstveno područje: Biotehničke znanosti Znanstveno polje: Prehrambena tehnologija UTJECAJ MORINGE NA FIZIKALNO-KEMIJSKE KARAKTERISTIKE I FERMENTACIJU KRAVLJEG MLIJEKA Ivana Miksera, 1252/PI Sažetak: Fermentirani mliječni proizvodi poznati su po brojnim pozitivnim utjecajima na ljudsko zdravlje i njihova je konzumacija proširena diljem svijeta. Ekstrakt lista Moringe oleifere bogat je vitaminima, mineralnim tvarima, polifenolima, flavonoidima, taninima i proteinima te je njegov dodatak u mlijeko prije fermentacije izvrstan način obogaćivanja fermentiranih mliječnih proizvoda. Cilj ovog diplomskog rada bio je proizvesti jogurt s ekstraktom lista moringe i usporediti ga s kontrolnim uzorkom jogurta bez dodanog ekstrakta. Provedene su fizikalno kemijske, mikrobiološke, reološke i senzorske analize. Dodatak ekstrakta moringe u mlijeko prije fermentacije rezultiralo je kraćim vremenom fermentacije, nižom ph vrijednosti jogurta, povećanim rastom bakterija jogurtne kulture, boljim reološkim svojstvima, povećanim udjelom ukupnih fenola te povećanim antioskidacijskim kapacitetom jogurta. Ključne riječi: antioksidacijski kapacitet, fenoli, fermentacija, jogurt, Moringa oleifera Rad sadrži: 48 stranica, 16 slika, 16 tablica i 43 literaturna navoda Jezik izvornika: hrvatski Rad je u tiskanom i elektroničkom (pdf format) obliku pohranjen u: Knjižnica Prehrambeno biotehnološkog fakulteta, Kačićeva 23, Zagreb Mentor: doc. dr. sc. Katarina Lisak Jakopović Stručno povjerenstvo za ocjenu i obranu: 1. prof. dr. sc. Rajka Božanić (predsjednik) 2. doc. dr. sc. Katarina Lisak Jakopović (mentor) 3. doc. dr. sc. Maja Repajić (član) 4. doc. dr. sc. Nives Marušić Radovčić (zamjena) Datum obrane:

7 BASIC DOCUMENTATION CARD University of Zagreb Faculty of Food Technology and Biotechnology Department of Food Technology and Engineering Laboratory of Technology of Milk and Milk Products Graduate Thesis Scientific area: Biotechnical Sciences Scientific field: Food Technology INFLUENCE OF MORINGA ON PHYSICOCHEMICAL CHARACTERISTICS AND FERMENTATION OF COW'S MILK Ivana Miksera, 1252/PI Abstract: Fermented dairy products are known for their many positive effects on human health and their consumption is spread worldwide. Moringa oleifera leaf extract is rich in vitamins, minerals, polyphenols, flavonoids, tannins and proteins, and its addition to milk before fermentation is an excellent way to enrich fermented milk products. The aim of this thesis was to produce yogurt with moringa leaf extract and compare it with a control sample of yogurt without added extract. Physicochemical, microbiological, rheological and sensory analyzes were performed. The addition of moringa extract to milk before fermentation resulted in shorter fermentation time, lower yogurt ph, increased growth of yogurt bacteria, better rheological properties, increased total phenols content and increased antioxidant capacity of yogurt. Keywords: antioxidant capacity, phenols, fermentation, yogurt, Moringa oleifera Thesis contains: 48 pages, 16 figures, 16 tables and 43 references Original in: Croatian Graduate Thesis in printed and electronic (pdf format) version is deposited in: Library of the Faculty of Food Technology and Biotechnology, Kačićeva 23, Zagreb. Mentor: PhD. Katarina Lisak Jakopović, Assistant professor Reviewers: PhD. Rajka Božanić, Full Professor PhD. Katarina Lisak Jakopović, Assistant Professor PhD. Maja Repajić, Assistant Professor PhD. Nives Marušić Radovčić, Assistant Professor Thesis defended:

8 SADRŽAJ 1. UVOD TEORIJSKI DIO SASTAV KRAVLJEG MLIJEKA PROIZVODNJA JOGURTA MORINGA OLEIFERA Nutritivna i zdravstvena vrijednost moringe MLIJEČNI PROIZVODI OBOGAĆENI EKSTRAKTOM MORINGE EKSPERIMENTALNI DIO MATERIJALI METODE RADA Priprema ekstrakta moringe Proizvodnja jogurta Određivanje kiselosti Određivanje kiselosti mlijeka i fermentiranih mliječnih napitaka ph-metrom Titracijske metode Određivanje sinereze fermentiranog mlijeka Određivanje reoloških svojstava fermentiranih proizvoda Mikrobiološke analize mlijeka i mliječnih proizvoda Određivanje udjela fenolnih spojeva u jogurtu s ekstraktom moringe Određivanje antioksidacijskog kapaciteta jogurta s ekstraktom moringe FRAP metodom Određivanje boje fermentiranih mliječnih proizvoda Senzorsko ocjenjivanje fermentiranih mliječnih proizvoda Obrada rezultata REZULTATI I RASPRAVA AKTIVNA I TITRACIJSKA KISELOST JOGURTA SINEREZA JOGURTA REOLOŠKA SVOJSTVA JOGURTA MIKROBIOLOŠKA SVOJSTVA JOGURTA UDIO UKUPNIH FENOLA U JOGURTIMA ANTIOKSIDACIJSKI KAPACITET JOGURTA BOJA JOGURTA SENZORSKE OCJENE JOGURTA ZAKLJUČCI LITERATURA... 45

9 1. UVOD Fermentirani mliječni proizvodi konzumiraju se već nekoliko tisuća godina i ljudi su od davnina upoznati s njihovim zdravstvenim benefitima, a jogurt je svakako jedan od najpoznatijih i najčešće konzumiranih fermentiranih mliječnih proizvoda. Odlikuje ga visoka prehrambena vrijednost zbog vrijednih proteina, vitamina i mineralnih tvari, a važno je istaknuti da je jogurt kao i ostali fermentirani mliječni proizvodi bolje probavljiv od samog mlijeka. Mliječno kiselom fermentacijom dolazi do djelomične razgradnje proteina mlijeka čime oni postaju lakše probavljivi. Iako imaju slabiju proteolitičku moć u odnosu na druge bakterije, bakterije mliječne kiseline pomoću proteaza i peptidaza razgrađuju proteine što utječe na samu konzistenciju proizvoda. Stupanj proteolize ovisi o soju bakterija mliječne kiseline, uvjetima fermentacije i skladištenja, pa tako kod nekih fermentiranih proizvoda on može biti jače izražen. Pojava funkcionalne hrane omogućila je novi pristup ljudskoj prehrani te u isto vrijeme i brigu o zdravlju čovjeka. Samo značenje pojma funkcionalne hrane podrazumijeva hranu koja osim da služi isključivo za prehranu ljudi odnosno dobivanje energije, ima i dokazano pozitivno djelovanje na zdravlje čovjeka. Posebno su popularni fermentirani mliječni proizvodi koji sadrže bioaktivne komponena su tako fermentirana mlijeka sve češće obogaćena biljnim ekstraktima. Biljni ekstrakti u mliječnim proizvodima poboljšavaju fizikalno-kemijske karakteristike što pozitivno utječe na prihvatljivost od strane potrošača. Moringa oleifera je biljka porijeklom iz Indije čija je vrijednost prepoznata kako u medicini tako i u prehrambenom sektoru zbog bogatog nutritivnog sastava. Svi dijelovi biljke mogu se koristiti u različite svrhe, a ulje sjemenki i lišće moringe je najčešće u upotrebi u vidu različitih ekstrakata koji se dodaju namirnicama kako bi im se poboljšala nutritivna i zdravstvena vrijednost. Cilj ovog diplomskog rada je bio proizvesti jogurt s dodatkom ekstrakta lista moringe te ga usporediti s kontrolnim jogurtom bez dodataka. Isto tako, cilj rada je bio ispitati utjecaj dodatka ekstrakta lista moringe na tijek i trajanje same fermentacije mlijeka. Uzorcima jogurta su određene fizikalno-kemijske, mikrobiološke, reološke i senzorske analize, analize boje jogurta te im je određen udio ukupnih fenola i antioksidacijski kapacitet. 1

10 2. TEORIJSKI DIO 2.1. SASTAV KRAVLJEG MLIJEKA Mlijeko je kompleksna biološka tekućina koja sadrži tvari esencijalne za ljudsko zdravlje i normalnu funkciju organizma. Prema Pravilniku (2017), sirovo mlijeko (kravlje, ovčje, kozje i bivolje) je prirodni sekret mliječne žlijezde dobiven jednom ili više mužnji zdravih životinja, kojemu ništa nije dodano ili oduzeto, koje nije zagrijavano na temperaturu višu od 40 C niti je bilo podvrgnuto nekom drugom postupku koji ima isti učinak, a namijenjeno je konzumaciji kao tekuće mlijeko ili mlijeko za daljnju obradu odnosno preradu. Količinski gledano, kravljeg mlijeka ima najviše (oko 83 % od svjetske proizvodnje mlijeka), pa je većina mliječnih proizvoda na tržištu proizvedena upravo od kravljeg mlijeka. Mlijeko je promjenjiva sastava, boje od bijele do žućkasto bijele, karakterističnog okusa i mirisa. Ženke sisavaca neko vrijeme nakon poroda izlučuju mlijeko iz mliječnih žlijezdi za primarnu prehranu svoje mladunčadi. Mlijeko nastaje u mliječnoj žlijezdi iz specifičnih sastojaka koji tamo dospijevaju iz krvi životinje. Biokemijskim procesima sinteze u mliječnoj žlijezdi nastaju mliječni šećer-laktoza, mliječna mast i mliječni proteini: kazein, α-laktalbumin i β- laktoglobulin. Druge hranjive tvari kao što su minerali, vitamini, imunoglobulini i enzimi izravno iz krvi prelaze u mliječnu žlijezdu i na taj način postaju sastojci mlijeka (Tratnik i Božanić, 2012). Sastav mlijeka je varijabilan i ovisi o brojnim faktorima kao što su vrsta muzne životinje, pasmina, period laktacije, vrsta hranidbe i drugi (Šumić, 2008). Udio pojedinih sastojaka ovisi i o individualnim karakteristikama jedinke (dob, tjelesna masa, zdravstveno stanje). Kravlje mlijeko u prosjeku sadrži 3,7 % mliječne masti, 3,5 % proteina te 4,8 % laktoze (Joha, 2016), a udio vode u mlijeku može iznositi % (Tratnik i Božanić, 2012). Mliječna mast predstavlja glavni izvor energije u mlijeku. Fizikalna, senzorska i tehnološka svojstva mlijeka i mliječnih proizvoda najviše ovise upravo o mliječnoj masti (Joha, 2016). Udio mliječne masti je najviše promjenjiva komponenta mlijeka i može varirati od 2,0 do 6,0 %. Mliječna mast se u mlijeku nalazi u obliku globula kompleksne građe različitih lipidnih tvari, od kojih su najzastupljeniji triacilgliceroli. To su esteri alkohola glicerola i masnih kiselina koje mogu biti vrlo raznovrsne te njihov udio može biti vrlo promjenjiv. Smatra se kako je 70 % masnih kiselina u mliječnoj masti zasićeno od kojih najviše ima palmitinske, dok ostalih 30 % čine nezasićene masne kiseline s najvećim udjelom oleinske kiseline (Tratnik i Božanić, 2012). 2

11 U mlijeku se nalaze različite vrste proteina, a mogu se podijeliti u dvije glavne skupine. Prvoj skupini proteina pripadaju kazeini koji čine oko 80 % ukupnih proteina mlijeka i oni se mogu izdvojiti acidifikacijom mlijeka. Proteini koji ostaju otopljeni u mlijeku nakon acidifikacije nazivaju se proteini sirutke i oni čine 20 % proteina mlijeka (Joha, 2016). Međutim, sirutkini proteini su osjetljivi na toplinu pa denaturiraju već pri temperaturama višim od 60 ºC (Tratnik i Božanić, 2012). Laktoza je mliječni šećer i predstavlja glavni disaharid mlijeka koji se sastoji od monosaharida glukoze i galaktoze. Nalazi se samo u mlijeku i jedini je ugljikohidrat mlijeka, a udio laktoze je najmanje promjenjiva komponenta u mlijeku (Joha, 2016). Voda, mliječna mast, proteini i laktoza predstavljaju osnovne sastojke mlijeka (tablica 1), glavni su uzročnici promjena u istom te najviše utječu na sposobnost tehnološke obrade mlijeka i ostalih mliječnih proizvoda. Ostali sastojci mlijeka koji su zastupljeni u znatno manjim količinama su mineralne tvari i vitamini. Mineralne tvari su slabo zastupljene u mlijeku. Mlijeko sadrži najviše kalcija, magnezija, natrija i kalija od kationa, a od aniona anorganske fosfate, citrate i kloride. U mlijeku su navedeni ioni više ili manje međusobno povezani ili su povezani s proteinima. Natrij, kalij i kloridi su difuzni ioni, dok kalcij, magnezij, fosfati i citrati čine koloidne komplekse s molekulama kazeina, tzv. kazeinske micele (Gaucheron, 2005). Mineralne tvari u mlijeku se nalaze u međusobnom omjeru koji je optimalan za potrebe ljudskog organizma. Posebice je važan omjer kalcija i fosfora koji mora biti optimalan kako bi kalcij bio maksimalno iskoristiv za ljudski organizam (Tratnik i Božanić, 2012). Vitamini se u mlijeku nalaze u malim količinama i ne doprinose zadovoljavanju dnevnih potreba organizma za vitaminima, osim vitamina A, B2 i B12. Najzastupljeniji vitamin je vitamin A, koji se u mlijeku nalazi u obliku β-karotena koji mlijeku daje žućkastu boju i u obliku retinola. Budući da je vitamin A topljiv u mastima, obiranjem mlijeka se djelomično uklanja pa je obrano mlijeko praktički poprilično siromašno vitaminima topljivim u mastima. Vitamini B skupine su pak topljivi u vodi i mlijeko obiluje ovom skupinom vitamina pa već jedna šalica mlijeka dnevno može zadovoljiti dnevnu potrebu za vitaminima B2 i B12. Vitamin C zbog svoje termolabilnosti, osjetljivosti na svjetlost i brze razgradnje ne predstavlja značajan izvor vitamina u mlijeku (Dorić i sur., 2019). 3

12 Tablica 1. Prosječni kemijski sastav kravljeg mlijeka (Božanić i sur., 2018) Sastojak Kravlje mlijeko Energija (kj na 100 g) 264 Voda (%) 87,8 Proteini (%) 3,5 Mliječna mast (%) 3,7 Laktoza (%) 4,8 Pepeo (%) 0, PROIZVODNJA JOGURTA Jogurt je u današnjem svijetu široko rasprostranjeni proizvod zbog brojnih pozitivnih utjecaja na ljudsko zdravlje i bogate nutritivne vrijednosti jer obiluje proteinima, mastima, mineralnim tvarima i vitaminima. Jogurt je koagulirani mliječni proizvod koji se dobije fermentacijom mlijeka djelovanjem bakterija mliječne kiseline (Zhang i sur., 2018). Mikroorganizmi starter kulture u proizvodu moraju biti aktivni do isteka roka valjanosti ili roka upotrebe proizvoda. Broj i vrsta mikroorganizama starter kulture ovisi o specifičnosti određenog proizvoda (Pravilnik, 2017). Fermentacija mlijeka sastoji se od dva paralelna procesa. Jedan proces je konverzija laktoze do mliječne kiseline i drugih produkata, a drugi je formiranje strukture nastalog proizvoda (Pandžić, 2017). Bakterije mliječne kiseline laktozu iz mlijeka ne koriste izravno za proizvodnju mliječne kiseline, već ju pomoću specifičnih enzima permeaza prenose u svoje stanice gdje pomoću enzima β-galaktozidaze laktozu cijepaju na glukozu i galaktozu. Nastala glukoza se dalje u procesu glikolize razgrađuje do piruvata, koji se uz pomoć enzima laktat dehidrogenaze reducira do mliječne kiseline u anaerobnim uvjetima. Mliječna kiselina, osim što utječe na svježi kiseli okus fermentiranih proizvoda, utječe i na njihovu konzistenciju. Dolazi do fizikalno-kemijskih promjena micela kazeina koje destabiliziraju kazeinski sustav što posljedično dovodi do agregacije micela kazeina te formiranja mreže gela - koaguluma. To se zbiva pri ph vrijednosti izoelektrične točke kazeina (oko 4,6). Stoga je vrlo važno 4

13 postupno zakiseljavanje mlijeka kako bi se mreža gela pravilno oblikovala i kako bi konačni proizvod imao zadovoljavajuću konzistenciju. Bakterije mliječne kiseline koje se koriste u proizvodnji jogurta nazivaju se zajedničkim imenom jogurtna kultura. Tu pripadaju bakterije Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus i Streptococcus thermophilus. Pojedinačni sojevi bakterija jogurtne kulture rastu pri različitim optimalnim temperaturama, no kada zajednički rastu u mlijeku optimalna temperatura za oba soja je 42 ºC, optimalan omjer bakterija 1:1, a optimalna količina inokuluma 2 %. Pri navedenim uvjetima već u nekoliko sati može nastati oko 0,9 % mliječne kiseline (Tratnik i Božanić, 2012). Tehnološki proces proizvodnje jogurta (slika 1) kreće od odabira sirovine. Mlijeko od kojeg će se proizvesti jogurt mora biti najbolje mikrobiološke kvalitete, ne smije sadržavati antibiotike, rezidue pesticida i ostale inhibitorne tvari te ph vrijednost ne smije biti ispod 6,5. Zatim slijedi standardizacija mlijeka kako bi se prilagodio udio mliječne masti i udio suhe tvari. To je važno zbog postizanja poželjne i uvijek jednolične konzistencije krajnjeg proizvoda. U proizvodnji fermentiranih mlijeka obavezna je homogenizacija mlijeka s ciljem usitnjavanja globula masti, ali i radi njihove jednolike raspodjele. Homogenizacija sprečava izdvajanje masti na površinu proizvoda tijekom skladištenja i samim time proizvod postaje vizualno privlačniji kupcu. Osim pozitivnog utjecaja na mliječnu mast, homogenizacija omogućuje puniji okus proizvoda, povećanu viskoznost, ali i bolju probavljivost. Nakon homogenizacije slijedi toplinska obrada mlijeka zbog uništenja eventualnih patogenih mikroorganizama i inaktivacije enzima kako bi se osigurala aktivnost starter kulture za fermentaciju. Ona se provodi na temperaturama ºC, 5-10 min. Toplinska obrada od velike je važnosti za strukturu gotovog proizvoda jer pri povišenoj temperaturi dolazi do denaturacije proteina sirutke koji zatim ulaze u interakciju s kazeinom. Na taj način kazein postaje hidrofilniji i veže na sebe veću količinu vode što u konačnici sprječava sinerezu. To znači da koagulum dobiven fermentacijom toplinski obrađenog mlijeka bude nježniji i glađe teksture. Nakon toplinske obrade mlijeka, prvo slijedi hlađenje na temperaturu koja pogoduje inokulaciji mlijeka mikrobnom kulturom. Različiti proizvođači mikrobnih kultura za fermentaciju mlijeka daju svoje upute koliko kulture je potrebno dodati za vrenje određene količine mlijeka. Nakon što se mlijeko nacijepi kulturom, slijedi inkubacija pri temperaturi od 43 ºC, 4-6 sati, ovisno o aktivnosti upotrijebljene starter kulture. Inkubacija se provodi dok se ph proizvoda ne spusti na 4,6 kod kojeg je formiran koagulum optimalne teksture. Nakon što se dobije jogurt, on ide na hlađenje i skladištenje za što je potrebno osigurati temperaturu od +4 do +8 ºC (Tratnik i Božanić, 2012). 5

14 Mlijeko Standardizacija suhe tvari i masti Homogenizacija Toplinska obrada (90 95 ºC / 5 10 min) Hlađenje Inokulacija Pakiranje (ambalaža) Inkubacija / fermentacija Hlađenje Skladištenje ( + 4 ºC) ČVRSTI JOGURT Inkubacija / fermentacija (Homogenizacija) Hlađenje Pakiranje (ambalaža) Skladištenje (+ 4ºC) TEKUĆI JOGURT Slika 1. Shematski prikaz tehnološkog procesa proizvodnje jogurta (Tratnik i Božanić, 2012) 2.3. MORINGA OLEIFERA Moringa oleifera Lam. (slika 2) je najšire kultivirana vrsta iz porodice biljaka Moringaceae, podrijetlom iz subhimalajskih predjela Indije, Pakistana Bangladeša i Afganistana. Ovo brzorastuće stablo poznavali su još stari Rimljani, Grci i Egipćani, a danas je kultivacija moringe proširena na brojnim tropskim područjima (Fahey, 2005). Rasprostranjena je u Africi, Srednjoj i Južnoj Americi, Šri Lanci, Indiji, Meksiku, Maleziji, Indoneziji i na Filipinima (Hassan i sur., 2016). Moringa se već stoljećima koristi u tradicionalnoj medicini različitih naroda te kao hranjiva namirnica za konzumaciju budući da je svaki dio biljke jestiv (Fahey, 2005). 6

15 Slika 2. Moringa oleifera Lam. (Anonymous 1) Nutritivna i zdravstvena vrijednost moringe Moringa se često opisuje kao najnevjerojatnije stablo koje je Bog stvorio jer su korijen, listovi, cvjetovi, sjemenke i plodovi moringe nutritivno vrlo bogati. Sadrže proteine, vitamine, a obiluju provitaminom vitamina A β-karotenom (Pandey i sur., 2012). Lišće moringe bogato je vitaminima B kompleksa te sadrži sve esencijalne aminokiseline u idealnim omjerima (Hassan i sur., 2016). U kemijski sastav moringe uključene su i mineralne tvari kao što su željezo, kalij, kalcij i fosfor. Moringa oleifera sadrži čak više kalcija od mlijeka, a svi već navedeni mikronutrijenti uglavnom su koncentrirani u listu (Hassan i sur., 2017). U svom sastavu list moringe obiluje i polifenolima, fenolnim kiselinama, alkaloidima, taninima, saponinima, izotiocijanatima, glukozinolatima, flavonoidima i karotenoidima (Vergara- Jimenez i sur., 2017). Listovi moringe mogu se konzumirati svježi, kuhani ili u sušenom obliku u kojem se mogu čuvati dulje vrijeme bez gubitka nutritivne vrijednosti (Pandey i sur., 2012). Osim izvrsne hranjive vrijednosti, moringa ima i brojne zdravstvene dobrobiti. Istraživanja provedena na štakorima pokazuju pozitivno djelovanje moringe na simptome astme, njeno antiupalno, analgetsko i antipiretičko djelovanje. Studije provedene na laboratorijskim kunićima pokazale su i smanjenje lipidnog profila jetre, srca i aorte, odnosno smanjenje kolesterola nakon što su kunići tretirani ekstraktom lista moringe (Pandey i sur., 2012). Pokazalo se kako različiti ekstrakti lista moringe mogu inhibirati rast Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia. coli i Bacillus cereus. Ovi mikroorganizmi 7

16 mogu biti patogeni ili toksični te mogu izazvati kvarenje hrane ukoliko dođe do njihovog razvoja u namirnicama. Shodno tome, prenoseći se putem hrane do ljudskog organizma mogu izazvati bolesti i infekcije u ljudi (Hassan i sur., 2016). Uz antimikrobno djelovanje moringe, važno je istaknuti i njeno antioksidativno djelovanje. Fenolna frakcija iz lista moringe ima sposobnost vezanja slobodnih radikala, a etanolna frakcija pokazuje značajna kelacijska svojstva s metalima što sprečava vezanje metala na komponente DNK i njeno oštećenje (Pandey i sur., 2012) MLIJEČNI PROIZVODI OBOGAĆENI EKSTRAKTOM MORINGE Lišće moringe smatra se sigurnim dodatkom prehrani jer ne pokazuje toksična svojstva. Stoga nimalo ne čudi činjenica da je popularnost moringe naglo porasla u posljednjih nekoliko godina. Znanstvenici su prepoznali mogućnost široke primjene i beneficija moringe kako u agrikulturi tako i u industrijskoj proizvodnji hrane u vidu prehrambenih suplemenata. To ima posebno važnu ulogu za zemlje trećeg svijeta jer se moringa koristi u borbi protiv pothranjenosti u nekim dijelovima Afrike (Hassan i sur., 2017). Prehrambena industrija je prepoznala sve veće zahtjeve potrošača za proizvodima koji imaju funkcionalnu ulogu i povoljno utječu na zdravlje te se sve više okreće prema proizvodnji funkcionalnih proizvoda. Tu se posebno može istaknuti mliječna industrija čija je proizvodnja u zadnjih par godina usmjerena ka proizvodnji raznih mliječnih proizvoda s bioaktivnim sastojcima, primjerice jogurta s dodacima voća, povrća i raznih biljnih ekstrakata (Zhang i sur., 2018). Sukladno tome provedena su brojna znanstvena istraživanja kako bi se potvrdio pozitivan utjecaj moringe na obogaćenje prehrambenih proizvoda i poboljšanje tehnoloških svojstava prilikom proizvodnje, ali i kako bi se utvrdile brojne beneficije moringe na ljudsko zdravlje. Također, provedena su istraživanja o proizvodnji mliječnih proizvoda u koje su dodani ekstrakti osušenog lista moringe. Hassan i sur. (2016) objavili su članak na temu proizvodnje jogurta u koji je dodan ekstrakt lista Moringe oleifere. Ovaj eksperiment proveden je s ciljem proučavanja utjecaja moringe na senzorska i kemijska svojstva jogurta neposredno nakon proizvodnje te tijekom skladištenja. Također, cilj je bio ispitati može li se jogurt nutritivno obogatiti dodatkom moringe. Korišteno je svježe bivolje mlijeko i lišće moringe koje je prethodno osušeno i usitnjeno te prosijano kroz sita. Lišće moringe u mlijeko je dodano u različitim udjelima 0,5, 1 i 2 % uz dodatak starter kulture za fermentaciju. Nakon što je završila fermentacija mlijeka na 45 ºC, dobiveni jogurti 8

17 skladištili su se 15 dana pri 5 ºC. U jogurtima se određivala suha tvar, ukupni proteini i topljivi dušik, hlapljive masne kiseline i ukupne aminokiseline. Također su mjereni ph i viskoznost dobivenih jogurta. Provedene su i senzorske analize od strane 20 uvježbanih senzoričara kako bi se utvrdile aroma i boja te okus. Rezultati senzorske analize su pokazali da je kontrolni uzorak jogurta bez dodatka moringe dobio najbolje ocjene, nakon čega slijedi jogurt s 0,5 % moringe. Upravo tih 0,5 % praha lišća Moringe oleifere u jogurtu se smatra idealnom količinom za optimalan izgled, okus i aromu proizvoda. Rezultati također ukazuju kako jogurti obogaćeni prahom lišća moringe u odnosu na kontrolni uzorak imaju viši udio suhe tvari, viši udio proteina, višu kiselost i nižu ph vrijednost. Uspoređujući utjecaj vremena čuvanja proizvedenih jogurta na navedene karakteristike dalo se zaključiti kako se kroz vrijeme hladnog skladištenja kiselost, udio suhe tvari i proteina povećao i u kontrolnom uzorku i u obogaćenim uzorcima jogurta, dok se ph vrijednost smanjila. Viskoznost jogurta obogaćenih moringom je pak bila niža od viskoznosti kontrolnih uzoraka. Sukladno svemu navedenom autori su zaključili kako bi jogurt s 0,5 % praha lišća Moringe oleifere bio optimalan za proizvodnju. Taj udio moringe u jogurtu omogućuje povećanje hranjive vrijednosti te značajno ne utječe na senzorske ocjene u odnosu na kontrolni uzorak. Još je jedna studija provedena na temu dodatka moringe u mliječne proizvode s ciljem poboljšanja nutritivne vrijednost, a uključivala je proizvodnju sira s ekstraktom lista moringe. Hassan i sur. (2017) objavili su istraživanje o utjecaju dodatka Moringe oleifere u meki bijeli sir. Sirevi su proizvedeni od bivoljeg mlijeka te lišća moringe koje je prethodno osušeno i usitnjeno u prah te dodano u sireve neposredno nakon koagulacije u udjelima od 1, 2 i 3 %. Sirevi su podvrgnuti kemijskoj i senzorskoj analizi neposredno nakon proizvodnje te nakon 2, 4 i 6 tjedana. Rezultati su pokazali kako najbolja senzorska svojstva pokazuje sir obogaćen s 1 % praha lista moringe. Takav sir imao je najbolje ocijenjen izgled, teksturu i okus. Kemijska ispitivanja pokazala su da je sir s 1 % lista moringe imao višu kiselost i nižu ph vrijednost u odnosu na kontrolni uzorak sira bez dodatka moringe i to tijekom 6 tjedana čuvanja. Sir obogaćen moringom također je imao viši udio topljivog dušika, masnih kiselina, tirozina i triptofana u odnosu na na kontrolni uzorak. Uspoređujući sir s moringom i kontrolni uzorak sira, sir s moringom je očekivano imao tamniju boju, odnosno smanjenju bjelinu. Promjena boje tijekom tretmana može biti posljedica velikog udjela dijetalnih vlakana prisutnih u biljci Moringa oleifera. Nadalje, Zhang i sur. (2018) su proizveli funkcionalni jogurt s dodatkom moringe kako bi istražili njen utjecaj na fermentativna, teksturalna i bioaktivna svojstva proizvoda. Korišteno je 9

18 obrano mlijeko u prahu i prah lista moringe te jogurtna kultura. Iz praha lista moringe prvo je pripremljen vodeni ekstrakt koji se dodao u mlijeko prilikom proizvodnje jogurta, prije same fermentacije u udjelima od 0,05, 0,1 i 0,2 %. Rezultati ove studije pokazali su kako ekstrakt moringe smanjuje vrijeme fermentacije jogurta jer potiče rast bakterija mliječne kiseline korištene starter kulture. U usporedbi s kontrolnim uzorkom jogurta u koji nije dodan ekstrakt moringe, jogurt s ekstraktom moringe imao je višu viskoznost i veću sposobnost hvatanja slobodnih radikala, a manju sinerezu. Jogurt s dodatkom moringe je također pokazao bolja antioksidacijska svojstva. Osim navedenih ispitivanja, provedena je i senzorska analiza jogurta kako bi se ocijenili okus (slatkoća, gorčina, kiselost), aroma, tekstura, viskoznost i opća prihvatljivost proizvoda. Prema dobivenim rezultatima, jogurt s dodatkom 0,05 % ekstrakta moringe pokazao je najbolju opću prihvatljivost u odnosu na jogurte s višim udjelima moringe, iako je u svim jogurtima s moringom uočen lagani strani biljni okus. Na temelju svih rezultata, Zhang i sur. (2018) zaključili su kako jogurt s dodatkom ekstrakta moringe ima pozitivan utjecaj na ljudsko zdravlje i to bez prevelikog negativnog utjecaja na samu senzoriku proizvoda. 10

19 3. EKSPERIMENTALNI DIO 3.1. MATERIJALI Za eksperimentalni dio ovog rada korišteno je pasterizirano mlijeko s 3,2 % mliječne masti proizvođača Dukat Dukat svježe mlijeko (tablica 2). Za fermentaciju mlijeka korištena je jogurtna kultura YO - MIX 883 LYO 50 DCU (Danisco, Francuska). Tablica 2. Prosječna nutritivna vrijednost u 100 ml Dukat svježeg mlijeka (Anonymous 2) Sastojak Proteini Masti - zasićene masne kiseline Ugljikohidrati - šećeri Sol Kalcij Energija Vrijednost 3,3 g 3,2 g 2,4 g 4,6 g 4,6 g 0,1 g 120 mg (15 % PU*) 253 kj / 60 kcal PU* - Preporučeni dnevni unos 11

20 Za pripremu ekstrakta moringe korišten je prah lista moringe proizvođača Bio&Bio Superfoods (slika 3, tablice 3 i 4). Slika 3. Moringa u prahu (vlastita fotografija) Tablica 3. Prosječna hranjiva vrijednost praha moringe u 100 g proizvoda (Anonymous 3) Proteini Sastojak Ugljikohidrati - šećeri Masti - zasićene masne kiseline Sol Vlakna Energija Vrijednost 27,1 g 28,2 g 14,7 g 2,3 0,6 g 0,3 g 19,2 g 1349 kj / 320 kcal 12

21 Tablica 4. Sastav vitamina i mineralnih tvari praha moringe u 100 g proizvoda (Anonymous 3) Sastojak Vitamin A Vitamin E Tiamin Niacin Riboflavin Kalcij Kalij Magnezij Željezo Cink Bakar Vrijednost 0,0163 g 0,1130 g 0,0026 g 0,0205 g 0,0082 g 2,0030 g 1,3240 g 0,3680 g 0,0282 g 0,0033 g 0,0006 g 3.2. METODE RADA Priprema ekstrakta moringe Na analitičkoj vagi je izvagano 10 g praha moringe u laboratorijsku čašu. Destilirana voda je zagrijana do točke vrenja te je 200 ml preliveno preko praha moringe. Dobivena otopina se kuhala 30 min na grijaćoj ploči uz konstantno miješanje magnetskom miješalicom (Rotamix 550, Tehtnica) pokrivena aluminijskom folijom (slika 4). Zatim se otopina ohladila na 60 ºC te profiltrirala preko lijevka s filter papirom (Whatman TM, 150 mm). 13

22 Slika 4. Priprema ekstrakta moringe (vlastita fotografija) Proizvodnja jogurta Jogurtna kultura dostatna za fermentaciju 3,6 L mlijeka (0,0761 g) izvagana je na analitičkoj vagi (KERN KB, Balingen, Njemačka) i inokulirana u mlijeko temperirano na 43 ºC. Jedan dio inokuliranog mlijeka razliven je u sterilizirane staklene bočice za proizvodnju jogurta bez dodatka moringe, odnosno za kontrolne uzorke. U drugi dio inokuliranog mlijeka dodan je prethodno pripremljeni esktrakt moringe u udjelima od 1, 3 i 4 % i razliven u sterilne staklene bočice za fermentaciju. Bočice su pokrivene aluminijskom folijom i stavljene na fermentaciju u termostat (INKO 1935., Zagreb) na 43 ºC. Tijekom fermentacije praćena je ph vrijednost te broj laktobacila i streptokoka, a kada je ph vrijednost iznosila 4,6 bočice s jogurtima izvađene su iz termostata i stavljene na hlađenje kako bi se prekinula fermentacija. Dobiveni jogurti skladišteni su u hladnjaku (+4 C) 28 dana te su 7., 14., 21. i 28 dan provedene analize Određivanje kiselosti Određivanje ph vrijednosti i titracijske kiselosti (ºSH) provedeno je u mlijeku prije fermentacije. Za vrijeme fermentacije svakih sat vremena mjerena je ph vrijednost kako bi se fermentacija mogla pratiti i zaustaviti kad se ph dobivenih jogurta približi vrijednosti 4,6. Zatim su u razdoblju skladištenja jogurta vrijednosti ph i ºSH mjerene 1., 7., 14., 21.i 28. dan 14

23 kako bi se vidjele promjene u kiselosti jogurta s dodatkom ekstrakta moringe u odnosu na kontrolni jogurt Određivanje kiselosti mlijeka i fermentiranih mliječnih napitaka ph-metrom Parametar ph vrijednost predstavlja negativni logaritam koncentracije vodikovih iona u otopini te je mjerilo za aktivnu kiselost svježeg mlijeka. Koncentracija vodikovih iona najčešće se mjeri ph-metrom ili titracijskim metodama (Božanić i sur., 2010). Elektroda ph-metra (WTW ph3110, Njemačka) prvo je isprana destiliranom vodom i posušena staničevinom. Prije početka provođenja analize provedena je kalibracija elektrode ph metra prema uputama proizvođača. Elektroda je potom lagano uronjena u čašu s mlijekom ili fermentiranim mliječnim napitkom te je nakon što se ustalila, očitana ph vrijednost. Zatim je elektroda dobro isprana destiliranom vodom, posušena staničevinom te uronjena u otopinu KCl-a do sljedeće upotrebe Titracijske metode Jennes i Patton (1967) definiraju određivanje titracijske kiselosti kao mjerenje puferske sposobnosti mlijeka. Naime, svježe mlijeko zahvaljujući CO2, proteinima, fosfatima i citratima djeluje kao pufer čemu pridonose i laktati i ostali organski anioni proizvedeni djelovanjem mikroorganizama. Određivanjem titracijske kiselosti mlijeka mjeri se tzv. latentna kiselost koja potječe od trenutno nedisociranih kiselih sastojaka s velikim puferskim kapacitetom (Stelkić, 1968). Titracijska kiselost određuje se titracijom mlijeka s otopinom NaOH (Gram Mol, Hrvatska) određenog molariteta uz indikator fenolftalein. Metoda po Soxhlet-Henkelu u Republici Hrvatskoj predstavlja referentnu titracijsku metodu za određivanje stupnja kiselosti mlijeka i mliječnih proizvoda. Rezultati se izražavaju u stupnjevima po Soxhlet-Henkelu ( SH). Odvaga (20 g) fermentiranog napitka pipetom je prenesena u dvije Erlenmeyerove tikvice i razrijeđena s 20 ml destilirane vode. Prva tikvica je služila kao standardna boja do koje se mora titrirati analizirani uzorak, a pripremljena je tako da je u nju otpipetirano 0,4 ml 5 %-tne otopine kobaltova sulfata. U drugu Erlenmeyerovu tikvicu otpipetirano je 2 ml otopine fenolftaleina, a zatim titrirano s 0,1 M NaOH. Volumen utrošen za titraciju je očitan kad je postignuta boja otopine jednake onoj u prvoj tikvici. 15

24 Titracijska kiselost izračunata je prema izrazu: [a x 2 x f = SH] gdje je: a - 0,1 M NaOH ml utrošenih za neutralizaciju 20 ml mlijeka f - faktor otopine natrijeve lužine (NaOH) 0,1 M = 1 (Sabadoš, 1998) Određivanje sinereze fermentiranog mlijeka Sinereza je pojava izdvajanja sirutke ili seruma iz proteinske mreže koja zbog toga postaje vidljiva na površini proizvoda. Izdvajanje sirutke može biti spontano ili pod utjecajem vanjske sile, a posljedica je dinamičke kontrakcije nestabilne proteinske mreže ili prekomjerne preraspodjele čestica kazeina unutar mreže. Stupanj sinereze jogurta ovisi o brojnim tehnološkim parametrima kao što su udio proteina i mliječne masti u mlijeku, način i vrsta homogenizacije mlijeka, uvjeti inkubacije i sl. (Samaržija, 2015). U kivete od 50 ml odvagano je oko 20 g jogurta. Zatim su kivete s uzorcima centrifugirane na centrifugalnom separatoru (IKA, Rotina 380 R, Njemačka) pri okretaja u minuti tijekom 10 min. Nakon centrifugiranja, pipetom se odvojio supernatant, a zaostali talog u kiveti se izvagao. Razlika u masama predstavlja masu odvojenog supernatanta, a izdvojeni supernatant je u rezultatima prikazan u volumnim vrijednostima Određivanje reoloških svojstava fermentiranih proizvoda Reologija se bavi proučavanjem deformacija i protjecanja krutih i tekućih tvari podvrgnutih djelovanju sile. U prehrambenoj industriji reologija ima veliki značaj jer definira i opisuje teksturalna svojstva prehrambenih proizvoda. Za određivanje teksture fermentiranih mliječnih napitaka potrebne su složene analize različitih svojstava kao što su čvrstoća, stabilnost i viskoznost gela te intenzitet sinereze. Navedeni parametri razlikuju se ovisno o sastavu mlijeka, strukturi proteina, udjelu masti i stabilnosti emulzije masti u mlijeku, koncentraciji fosfatnih i kalcijevih iona u mlijeku, vrsti starter kulture korištene za fermentaciju, uvjetima fermentacije, uvjetima čuvanja i dr. (Stijepić i sur., 2011). Viskoznost svih fermentiranih mlijeka pa tako i jogurta, kompleksan je reološki parametar kvalitete koji predstavlja osnovu za optimiranje tehnološkog procesa, procesnu kontrolu i 16

25 potrošačku prihvatljivost proizvoda. Na vrijednost viskoznosti jogurta utječu sastav mlijeka od kojeg se jogurt priprema, način standardizacije mlijeka, toplinska obrada mlijeka, vrsta mikrobne kulture koja se koristi za fermentaciju mlijeka, količina inokuluma, temperatura i trajanje fermentacije. Također, na viskoznost mogu utjecati i dodaci koji se koriste kod proizvodnje jogurta. Utjecaj dodataka može biti pozitivan i negativan, ovisno o vrsti i količini koje se koriste (Zamberlin i sur., 2007). Viskoznost je svojstvo tekućine da se opire promjeni položaja svojih molekula, odnosno trenje koje djeluje unutar tekućine kao otpor tečenju. Deformacija izazvana djelovanjem sile može se izraziti kao gradijent brzine između dviju ploha, a izraz koji to opisuje je poznat kao Newtonov zakon: [τ = μ γ] gdje je: τ = smično naprezanje (Pa) μ = viskoznost (Pa s) γ = brzina smicanja (1 s -1 ) (Lovrić, 2003). Viskoznost jogurta mjerena je na rotacijskom reometru (Rheometric Scientific RM-180, Rheometric, Inc., Piscataway, SAD) (slika 5) koji se sastoji od cilindričnog vretena (br. 1 ϕ 30 mm, l = 45 mm) i vanjskog plašta (br. 1, ϕ 32,54 mm). U vanjski plašt stavljeno je 32 ml uzorka. Cilindrično vreteno s vanjskim plaštom se pričvrstilo za tijelo uređaja kako bi vreteno tijekom rotacije bilo konstantno uronjeno u uzorak. Za mjerenje obrnutog momenta koji se javlja na rotirajućem vretenu korišteno je relativno obrtanje mjerne osovine u odnosu na pogonsku osovinu. Uređaj potenciometar vezan je na dinometar i prima podatke o relativnom obrtanju, pri čemu se obrtni moment pretvara u električni signal koji se prevodi u digitalnu vrijednost koja je očitana sa zaslona uređaja. Mjerenje viskoznosti provedeno je 1., 7., 14., 21. i 28. dan čuvanja jogurta u području brzine smicanja od 100 do 1290 s

26 Slika 5. Rotacijski reometar (vlastita fotografija) Mikrobiološke analize mlijeka i mliječnih proizvoda Mikrobiološke analize provedene su u pasteriziranom inokuliranom mlijeku, neposredno prije fermentacije, u jogurtima s ekstraktom moringe (1, 3 i 4 %) i u kontrolnim uzorcima jogurta. Broj laktobacila i streptokoka je određen na početku fermentacije, na kraju fermentacije te na kraju perioda hladnog skladištenja od 28 dana. Uzorci za mikrobiološku analizu pripremljeni su u sterilnim uvjetima kako bi se spriječila kontaminacija. Aseptični uvjeti postignuti su suhom sterilizacijom laboratorijskog posuđa korištenog za analize, dezinficiranjem radne površine etanolom i sve su analize provedene pri otvorenom plamenu. Mikrobiološka analiza radila se u svrhu određivanja broja živih bakterijskih stanica bakterija Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus i Streptococcus thermophilus koji su sastavni dio jogurtne kulture korištene za inokulaciju mlijeka. Stoga su korištene dvije vrste podloga: MRSagar za laktobacile i M17-agar za streptokoke (obje podloge Biolife, Italija). MRS agar naročito je pogodan za razvoj i rast laktobacila. Osnovne komponente te podloge su ekstrakt mesa, ekstrakt kvasca, glukoza, pepton i tween 80. Konačni ph je 6,5 (Koritnik i Dragojlov, 1974). M17 agar koristi se za izolaciju i razmnožavanje bakterija iz roda Streptococcus, posebice za 18

27 selektivnu izolaciju bakterije Streptococcus thermophilus iz jogurta. Bogat je ekstraktom kvasca, mesa, mineralima, laktozom, a visoka koncentracija natrijevog glicerolfostfata inhibira rast laktobacila i omogućuje kultivaciju laktičkih streptokoka (Terzaghi i Sandine, 1975; IDF, 1981). Iz homogeniziranog uzorka mlijeka sterilnom mikropipetom prenesen je 1 ml uzorka u epruvetu koja je prethodno napunjena s 9 ml sterilne fiziološke otopine. Nastalo razrjeđenje se homogeniziralo na vorteks mješalici te se čistim sterilnim nastavkom za mikropipetu prenijelo 1 ml homogeniziranog razrjeđenja u sljedeću epruvetu s 9 ml sterilne fiziološke otopine. Postupak je ponavljan dok se nije dobio željeni broj decimalnih razrjeđenja. Mikrobiološka analiza navedenih uzoraka provodila se primjenom direktne metode nacjepljivanja decimalnih razrjeđenja na odgovarajuće prethodno pripremljene hranjive podloge i inkubacijom pri 43 C. Očitavanje rezultata Nakon 3 dana inkubacije pri 37 C izbrojane su kolonije koje su narasle na podlogama. Za brojanje su odabrane one podloge na kojima je naraslo od 30 do 300 kolonija. Broj poraslih kolonija po ml (eng. Colony-forming Unit, CFU) izračunat je prema formuli: [CFU ml -1 = broj kolonija / nasađen volumen x recipročna vrijednost decimalnog razrjeđenja] Određivanje udjela fenolnih spojeva u jogurtu s ekstraktom moringe Fenolni spojevi mogu se analizirati primjenom spektrofotometrijskih i kromatografskih metoda. Spektrofotometrijske metode su vrlo praktične i jednostavne, a za određivanje ukupnih fenola najviše se upotrebljava metoda s Folin-Ciocalteu regensom. Folin-Ciocalteu reagens je smjesa fosforwolframove i fosformolibdenske kiseline, a pri oksidaciji fenolnih tvari u blago alkalnim uvjetima ove kiseline se reduciraju do wolframovog oksida i molibdenovog oksida koji su plavo obojeni. Redukcija ovih kiselina bit će intenzivnija što je u fenolnim spojevima prisutan veći broj hidroksilnih skupina ili oksidirajućih grupa. Samim time nastalo plavo obojenje je jače i stabilnije, a intenzitet obojenja mjeri se pri valnoj duljini od 765 nm. Priprema uzoraka: Odvaga (20 g) uzorka jogurta s ekstraktom moringe izvagano je u falkonicu od 50 ml te centrifugirano 10 min pri okretaja. Nakon centrifugiranja, pipetom je odvojen supernatant u kojem je određen udio ukupnih fenola. 19

28 Postupak određivanja: U staklenu epruvetu otpipetirano je redom 100 µl ekstrakta, 200 µl Folin-Ciocalteu reagensa i 2 ml destilirane vode. Nakon 3 minute dodano je 1 ml zasićene otopine natrijeva karbonata. Sve skupa je promiješano pomoću vorteks mješalice, a potom su uzorci termostatirani 25 minuta pri 50 ºC u vodenoj kupelji. Zatim je izmjerena apsorbancija pri valnoj duljini od 765 nm. Na isti način pripremljena je slijepa proba, ali se umjesto uzorka koristilo otapalo za ekstrakciju (destilirana voda). Izračun Izrada baždarnog pravca Za pripremu baždarnog pravca odvagano je 0,5 g galne kiseline i otopljeno u 10 ml 96 %-tnog etanola u odmjernoj tikvici od 100 ml, koja je zatim nadopunjena do oznake destiliranom vodom. Zatim su od otopine galne kiseline napravljena razrjeđenja u odmjernim tikvicama od 100 ml kako bi se dobile koncentracije galne kiseline od 50, 100, 150, 250 i 500 mg L -1. Iz svake tikvice otpipetirano je 100 µl otopine standarda u staklene epruvete. Potom je redom dodano 200 µl Folin-Ciocalteu reagensa i 2 ml destilirane vode. Nakon 3 minute dodano je 1 ml zasićene otopine natrijeva karbonata. Sve skupa se promiješalo na vorteks mješalici i zatim termostatiralo u kupelji 25 minuta pri 50 ºC. Apsorbancija je izmjerena pri valnoj duljini od 765 nm. Iz izmjerenih vrijednosti apsorbancija nacrtan je baždarni dijagram u programu Microsoft Excel. Na apscisu su nanesene vrijednosti koncentracija galne kiseline, a na ordinatu izmjerene vrijednosti apsorbancija pri čemu je dobiven pravac uz pripadajuću jednadžbu. Udio ukupnih fenola izražen je kao mg L -1, a izračunat je prema dobivenoj jednadžbi pravca koja glasi: [y = 0,0035 x] Gdje je: y - izmjerena asporbancija pri 765 nm x - koncentracija galne kiseline (mg L -1 ) (Shortle i sur., 2014) Određivanje antioksidacijskog kapaciteta jogurta s ekstraktom moringe FRAP metodom FRAP metoda temelji se na reakciji žuto obojenog kompleksa željezo-2,4,6-tripiridil-s triazina (TPTZ) pri čemu nastaje plavo obojeni produkt. Reakcija se odvija u kiselom mediju pri ph 3,6 čime se osigurava topljivost željeza i niži ionizacijski potencijal potreban za prijenos elektrona, 20

29 a ujedno povećava i redoks potencijal koji dodatno pomiče reakciju u smjeru prijenosa elektrona. Intenzitet boje je proporcionalan redukcijskoj sposobnosti antioksidansa (Hagerman i sur., 1998; Šimić i Jovanović 1994). Metoda je jednostavna, jeftina i brza, stoga se koristi za određivanje antioksidacijskog kapaciteta u različitim vrstama namirnice. Rezultati se najčešće izražavaju preko FeSO4, ekvivalenta troloxa ili askorbinske kiseline (Benzie i Strain, 1996). Priprema uzoraka: Za određivanje antioksidacijskog kapaciteta uzorak je pripremljen na jednak način kao za određivanje udjela ukupnih fenola. Postupak određivanja: U staklenu epruvetu redom je otpipetirano 240 µl destilirane vode, 80 µl uzorka i 2080 µl prethodno pripremljenog FRAP reagensa. Sadržaj se dobro promiješao i 5 min termostatirao pri 37 ºC u vodenoj kupelji. Zatim je izmjerena apsorbancija pri 593 nm. Slijepa proba sadrži sve osim uzorka, umjesto kojeg se dodalo otapalo (destilirana voda). Izračun Izrada baždarnog pravca Za pripremu baždarnog pravca pripremljeno je 500 ml 1 mm otopine željezo (II) sulfata septahidrata od koje su napravljena razrjeđenja u koncentracijama 0, 25, 100, 250, 500 i 750 µl. U staklenu epruvetu redom je otpipetirano 240 µl destilirane vode, 80 µl otopine standarda i 2080 µl prethodno pripremljenog FRAP reagensa, kratko pomiješano na vorteks mješalici i termostatirano pri 37 ºC u vodenoj kupelji. Zatim je izmjerena apsorbancija na 593 nm. Slijepa proba sadrži sve osim uzorka, umjesto kojeg je dodana destilirana voda. Iz izmjerenih vrijednosti apsorbancije nacrtan je baždarni dijagram s vrijednostima koncentracije FeSO4 x 7H2O na apscisi, a vrijednostima apsorbancije na ordinati. Na temelju dobivenih rezultata dobivena je jednadžba pravca iz koje su izračunate vrijednosti antioksidacijskog kapaciteta uzoraka. Na temelju dobivenih rezultata jednadžba pravca glasi: [y = 0,0014 x - 0,0155] Gdje je : x ekvivalent Fe 2+ (µmol/l) y apsorbancija pri 593 nm 21

30 Prema dobivenoj jednadžbi pravca izračunate su vrijednosti antioksidacijskog kapaciteta uzoraka jogurta i izražene su kao kao µmol ekvivalenata Fe 2+ L Određivanje boje fermentiranih mliječnih proizvoda Mjerenje boje provedeno je pomoću uređaja Spectrophotometer CM-3500d (Konica Minolta, Japan). Određivana su tri parametra boje: L* (svjetlina), a* (odnos crvene i zelene) i b* (odnos žute i plave). Prije svakog mjerenja instrument je standardiziran s bijelom i crnom keramičkom pločicom. Uzorak jogurta stavljen je u staklenu kivetu, koja je zatim umetnuta u spektrofotometar. Na računalnom programu pokrenuto je očitavanje i rezultati su prikazani na računalu spojenom na spektrofotometar (slika 6). Slika 6. Spektrofotometar CM-3500d (vlastita fotografija) Senzorsko ocjenjivanje fermentiranih mliječnih proizvoda Senzorska analiza je znanstvena disciplina koja potiče, mjeri, analizira i interpretira reakcije onih karakteristika hrane i tvari koje se zapažaju osjetilima vida, mirisa, okusa, dodira i sluha. Senzorski panel provodi senzorsku analizu (Šurić, 2016). U ovom istraživanju skupina od 5 panelista ocjenjivala je uzorke jogurta s ekstraktom moringe i kontrolnih uzoraka jogurta. Uzorci su ocjenjivani 1., 7., 14., 21. i 28. dan skladištenja. Praćeni su sljedeći senzorski parametri: izgled, boja, konzistencija, miris i okus jogurta. Koristila se metoda bodovanja s ponderiranim sustavom bodova. Primjer obrasca za senzorsko ocjenjivanje fermentiranih mliječnih proizvoda nalazi se u tablici 5. 22

31 Tablica 5. Obrazac za senzorsku ocjenu fermentiranih mliječnih proizvoda sustavom od 20 ponderiranih bodova (Pravilnik, 2004) Svojstvo Najviši broj Postignut broj Napomena bodova bodova Izgled 1 Boja 1 Konzistencija 4 Miris 2 Okus 10 Sinereza 2 Ukupno Obrada rezultata Analizirani jogurti su napravljeni u duplikatu. Rezultati prikazani u poglavlju Rezultati i rasprava su srednje vrijednosti dobivenih rezultata. 23

32 4. REZULTATI I RASPRAVA Cilj ovog rada bio je proizvesti jogurte s dodatkom ekstrakta lista moringe te odrediti fizikalnokemijske, reološke, mikrobiološke i senzorske karakteristike tijekom hladnog skladištenja u razdoblju od 28 dana. Proizvedeni su kontrolni uzorak jogurta bez dodataka i jogurti s 1, 3 i 4 % ekstrakta. Jogurti s ekstraktom moringe uspoređeni su s kontrolnim uzorkom jogurta. Rezultati ph vrijednosti izmjerenih tijekom fermentacije jogurta prikazani su u tablici 6, a rezultati ph vrijednosti izmjerenih tijekom 1., 7., 14., 21. i 28. dana skladištenja prikazani su u tablici 7. Rezultati ºSH vrijednosti izmjerenih tijekom 1., 7., 14., 21. i 28. dana skladištenja prikazani su u tablici 8. Rezultati sinereze jogurta prvi i zadnji skladištenja prikazani su u tablici 9. Rezultati reoloških analiza jogurta 1., 7., 14., 21. i 28. dan skladištenja prikazani su na slikama 7, 8, 9, 10 i 11. Rezultati mikrobioloških analiza jogurta tijekom fermentacije prikazani su u tablicama 10 i 11, a rezultati mikrobioloških analiza zadnjeg dana skladištenja jogurta prikazani su u tablicama 12 i 13. Rezultati određivanja udjela ukupnih fenola u jogurtima tijekom 1., 7., 14., 21. i 28. dana skladištenja prikazani su u tablici 14. Rezultati određivanja antioksidacijskog kapaciteta jogurta 1., 7., 14., 21. i 28. dan skladištenja prikazani su u tablici 15. Rezultati boje jogurta tijekom 1., 7., 14., 21. i 28. dana skladištenja prikazani su u tablici 16. Rezultati senzorske analize jogurta tijekom 1., 7., 14., 21. i 28. dana skladištenja prikazani su na slikama 12, 13, 14, 15 i