Određivanje specifičnih protutijela. (anti-sars-cov-2) i vitamina D

Величина: px
Почињати приказ од странице:

Download "Određivanje specifičnih protutijela. (anti-sars-cov-2) i vitamina D"

Транскрипт

1 1 Određivanje specifičnih protutijela na novi koronavirus SARS-CoV-2 (anti-sars-cov-2) i vitamina D Andrea Radeljak, spec. medicinske biokemije i laboratorijske medicine Klinički zavod za medicinsku biokemiju i laboratorijsku medicinu Kliničke bolnice Merkur - HRN EN ISO 15189:2012 akreditiran i EN ISO 9001 certificiran Referentni centar Ministarstva zdravstva za izradu i primjenu bioloških referentnih intervala medicinskobiokemijskih pretraga Tečaj trajnog usavršavanja HKMB "Laboratorijska dijagnostika u epidemiji bolesti COVID-19 uzrokovanoj virusom SARS-CoV2" - 12.lipnja 2021

2 2 Imunološki odgovor nakon infekcije SARS-CoV-2 nakon kontakta sa novim koronavirusom SARS-CoV-2 aktivira se imunološki odgovor posredovan protutijelima B limfociti, potpomognuti T limfocitima, diferenciraju se u plazma stanice koje potom proizvode protutijela specifična za virusni antigen nasuprot tome, odgovor staničnog imuniteta odvija se unutar zaraženih stanica, a posredovan je T limfocitima cjelokupni adaptivni imunološki odgovor usmjeravaju pomoćnički T limfociti, dok citotoksični T limfociti imaju ključnu ulogu u čišćenju virusom zaraženih stanica

3 3 Imunološki odgovor nakon infekcije SARS-CoV-2 nejasno je koje su komponente imunološkog sustava najvažnije za borbu protiv SARS-CoV-2 i koje su razine protutijela potrebne za održavanje imuniteta protutijela su samo jedan od elemenata imunološkog odgovora stanični imunološki odgovor ne može se izmjeriti testom na protutijela razumijevanje imunološkog odgovora je presudno za razumijevanje patogeneze bolesti i korisnost terapija te za razvoj cjepiva, farmakoloških i imunoloških terapeutika

4 4 Racionalna upotreba i interpretacija seroloških testova serološki testovi danas široko dostupni od strane raznih proizvođača odgovarajuće kliničke i analitičke karakteristike izvedbe nužne za primjenu u rutinskom radu? nesigurnosti u pogledu vremena, kinetike i trajanja prisutnosti protutijela na SARS-CoV-2 u različitim populacijama - asimptomatski, simptomatski, hospitalizirani kliničke indikacije za serološka ispitivanja u zdravstvenim ustanovama i dalje su ograničene

5 5 Smjernice u odabiru, provjeri i provedbi seroloških testova

6 6 Kliničke indikacije za serološko testiranje 1) testiranje bolesnika kojima je prošlo >14 dana od pojave simptoma, a molekularno testiranje je negativno, neodređeno ili nedostupno 2) dodatak molekularnom testiranju gdje su trajno pozitivni molekularni testovi unatoč poodmakloj infekciji novim koronavirusom SARS-CoV-2 3) dijagnostička obrada multisistemskog upalnog sindroma u djece (engl. Multisystem Inflamatory Sindrom - Children, MIS-C)

7 7 Kliničke indikacije za serološko testiranje 4) otkrivanje prethodne infekcije kod ne-hospitaliziranih osoba (asimptomatskih i simptomatskih) i utvrđivanje seroprevalencije u određenoj populaciji protutijela se otkrivaju već 6 dana nakon pojave simptoma i postupno rastu tijekom prva 3 4 tjedna nakon pojave simptoma vršnu koncentraciju dosežu dana nakon pojave simptoma, a zatim polako padaju kroz 2-3 mjeseca razine IgA i IgM protutijela padaju nakon 60 dana od pojave simptoma, a dokazano je da IgG protutijela traju i do 90 dana, čak i u blažim slučajevima bolesnici s ozbiljnom simptomima i s teškim oblikom bolesti COVID-19 imaju višu razinu protutijela

8 8 Kliničke indikacije za serološko testiranje 5) kvantitativna procjena stupnja imunološkog odgovora stvaranjem protutijela u oboljelih od bolesti COVID-19 6) pomoć u identificiranju potencijalnih darivatelja rekonvalescentne plazme (od engl. convalescent plasma, CP) terapija rekonvalescentnom plazmom se koristi od početka 20. st. za liječenje novih zaraznih bolesti; njezina je djelotvornost povezana s dokazima o poliklonskim neutralizirajućim protutijelima koja mogu smanjiti trajanje viremije; djelotvornost ove terapije funkcija je nekoliko čimbenika: vremena doniranja plazme, doziranja i vremena primjene u odnosu na pojavu bolesti kod primatelja

9 9 Kliničke indikacije za serološko testiranje 7) utvrđivanje imuniteta i procjena imunološkog odgovora stvaranjem protutijela nakon cijepljenja zaštita koju izazivaju trenutno dostupna cjepiva primarno se zasniva na protutijelima koja neutraliziraju novi koronavirus SARS-CoV-2 blokiraju interakciju novog koronavirusa SARS-CoV-2 sa staničnim receptorima ili sprječavaju konformacijske promjene potrebne za stapanje virusa sa staničnom membranom - važna zaštitna uloga u kasnijoj fazi infekcije i sprječavanje ponovne infekcije 8) serološki testovi, zbog kašnjenja u stvaranju protutijela, ne smiju se koristiti u dijagnozi akutne infekcije virusom SARS-CoV-2 (0 <14 dana) gdje i dalje zlatni standard ostaje molekularno testiranje

10 10 Ciljna populacija za serološko testiranje vrijednost serološkog testiranja ovisi o pravilnoj upotrebi testa s obzirom na procijenjenu prevalenciju bolesti COVID-19 na globalnoj razini, davanje prioriteta pacijentima s kliničkim simptomima ili onima s većim rizikom može poboljšati kliničku izvedbu i/ili dijagnostičku točnost seroloških ispitivanja i smanjiti rizik od pogrešne dijagnoze prema preporukama IFCC- a prednost pri serološkom testiranju trebale bi imati osobe sa simptomima bolesti COVID-19 negativne pri molekularnom testiranju (odgođeni klinički početak bolesti)

11 11 Izbor serološkog testa serološki testovi detektiraju IgM, IgG, IgA ili ukupna protutijela specifična dinamika odgovora IgM, IgG i IgA protutijela utječu na izbor serološkog testa kao i na rezultate ispitivanja Prema: Ghaffari A, Meurant R, Ardakani A. COVID-19 Serological Tests: How Well Do They Actually Perform? Diagnostics (Basel) Jul 4;10(7):453. doi: /diagnostics PMID: ; PMCID: PMC

12 12 SARS-CoV-2 serološki testovi kvalitativni kvantitativni NALAZ: pozitivan ili negativan Prema: Ghaffari A, Meurant R, Ardakani A. COVID-19 Serological Tests: How Well Do They Actually Perform? Diagnostics (Basel) Jul 4;10(7):453. doi: /diagnostics PMID: ; PMCID: PMC NALAZ: brojčani (titar antitijela) Prema:

13 13 SARS-CoV-2 serološki testovi protutijela stvorena na S-protein IgM SP, IgG SP zaraženi cijepljeni protutijela stvorena na nukleokapsid IgM NCP, IgG NCP zaraženi Prema:

14 14 SARS-CoV-2 serološki testovi protutijela stvorena na S-protein IgM SP, IgG SP zaraženi cijepljeni IgG SP - IgG SP - IgG NCP - IgG NCP + nije bilo kontakta s virusom prethodna infekcija protutijela stvorena na nukleokapsid IgM NCP, IgG NCP zaraženi IgG SP + IgG SP + IgG NCP + IgG NCP - prethodna infekcija prethodna infekcija ili cijepljenje

15 15 Tumačenje rezultata seroloških testiranja rezultate serološkog testiranja tumačiti u kontekstu vremena od pojave simptoma bolesti COVID-19 negativan rezultat ne potvrđuje nedostatak izloženosti pozitivan nalaz ne potvrđuje izloženost SARS-CoV-2 kako bi se izbjegli lažno negativni i lažno pozitivni rezultati serološkog testiranja, presudno je da i osjetljivost i specifičnost metode ispitivanja protutijela na novi koronavirus SARS-CoV-2 budu što veći u kliničkoj populaciji za koju će se test primjenjivati VAŽNO!!! pozitivan rezultat serološkog testa na protutijela SARS-CoV-2 ne znači da osoba više nije zarazna ili da je imuna na ponovne infekcije!!!

16 16 Nalaz laboratorijske pretrage NEGATIVAN NALAZ

17 17 Nalaz laboratorijske pretrage POZITIVAN NALAZ

18 18 Verifikacija analitičkih i kliničkih karakteristika seroloških testova prije upotrebe seroloških testova u rutinskom radu nužno je provjeriti analitičke karakteristike metode na analitičkom sustavu koji će se upotrebljavati dijagnostičke studije točnosti i specifikacije kliničkih karakteristika trebaju se zasnivati na stvarnoj svrsi upotrebe serološkog testa uzorci koji se koriste za provjeru metode trebaju biti jednaki onima koji se očekuju tijekom ispitivanja

19 19 Analitička verifikacija testa - iskustva KZMBLM - sukladno zahtjevima norme HR EN ISO i CLSI smjernicama (engl. Clinical Laboratory Standards Institut) sastoji se od: I. Period upoznavanja sa sustavom kvalitativni test: Elecsys Anti SARS-CoV-2 (ECLIA) kvantitativni test: Alinity i SARS-CoV-2 IgG (CMIA)

20 20 Analitička verifikacija testa - iskustva KZMBLM - sukladno zahtjevima norme HR EN ISO i CLSI smjernicama (engl. Clinical Laboratory Standards institut) sastoji se od: I. Period upoznavanja sa sustavom II. Procjena preciznosti sustava prema CLSI EP 17-A2 analiza kontrolnih uzoraka iz dana u dan ponovljivost međupreciznost ukupna laboratorijska preciznost

21 21 Analitička verifikacija testa - iskustva KZMBLM - III. Procjena sustavne pogreške Elecsys Anti SARS-CoV-2 (ECLIA) sudjelovanje u vanjskoj pocjeni kvalitete akreditiranog organizatora Labquality

22 22 Analitička verifikacija testa - iskustva KZMBLM - III. Procjena sustavne pogreške Alinity i SARS-CoV-2 IgG (CMIA) provedena međulaboratorijska usporedba sa Kliničkim zavodom za laboratorijsku dijagnostiku Kliničke bolnice Dubrava analiza rezultata: Passing-Bablok regresijska analiza

23 23 Analitička verifikacija testa - iskustva KZMBLM - IV. Provjera mjernog područja (linearnost) V. Provjera i ocjena referentnih intervala verifikacija sukladno protokolu CLSI 28-A3 analizom 20 referentnih osoba ispitivane populacije dobiveni rezultati potvrdili su prihvatljivost definiranih referentnih intervala na ispitivanu populaciju Alinity i SARS-CoV-2 IgG (CMIA) spol m, ž RI (negativno) < 50,0 AU/mL N 20 verifikacija 20/20 (100%)

24 24 Iskustvo KZMBLM - kvalitativni test: Elecsys Anti SARS-CoV-2 (ECLIA) svibanj 2020.g. (nakon prvog vala ) elektrokemiluminescentni imunokemijski test (ECLIA) za kvalitativno dokazivanje IgM / IgG antitijela na virus SARS-CoV2 u humanom serumu; analizator: Roche cobas e411 analizirano 10 uzoraka pacijenata za koje se očekivalo da budu negativni (negativna epidemiološka anamneza i negativan qrt-pcr test za RNA virusa SARS-CoV2) i 12 uzoraka pacijenata za koje se očekivalo da budu pozitivni (pozitivan qrt-pcr test za RNA virusa SARS-CoV2; pacijenti smješteni u PRIC-u KB Dubrava) NEGATIVAN REAKTIVAN NEGATIVNI 10 0 POZITIVNI 0 12

25 25 Iskustvo KZMBLM - kvalitativni test: Elecsys Anti SARS-CoV-2 (ECLIA) analizirano je 110 uzoraka zaposlenika Kliničke bolnice Merkur ~ 10% ukupnog broja zaposlenih djelatnici kojima nije potvrđena infekcija COVID-19, a koji su bili najizloženiji infekciji trijažno observacijski centar, izoloacijski odjel, trijaža ulaza u bolnicu, djelatnici na šalterima, laboratorijski djelatnici NEGATIVAN REAKTIVAN Djelatnici KZMBLM 30 0 Djelatnici ostalih 80 0 ustrojstvenih jedinica Ukupno 110 0

26 26 Iskustvo KZMBLM - kvantitativni test: Alinity i SARS-CoV-2 IgG (CMIA) veljača ožujak 2021.g. kemiluminescentni imunokemijski test na mikročesticama (CMIA) za kvantitativno dokazivanje IgG antitijela domenu vezanja receptora (engl. receptor binding domain, RBD) S1 podjedinice S-proteina (engl. spike protein) virusa SARS- CoV2 u humanom serumu; analizator: Abbott Alinity i analizirani uzorci: osobe koje nisu preboljele COVID-19 osobe koje su imale dokazanu infekciju SARS-CoV-2 cijepljeni djelatnici KB Mekur

27 27 Osobe koje nisu preboljele COVID-19 nisu imali simptome bolesti COVID-19 nisu bili testirani molekularnim testom (RT-PCR) ili su na testiranju bili negativni

28 Osobe koje su preboljele COVID-19 28

29 29 Titar SARS-CoV-2 IgG SP nakon cijepljenja OSOBE KOJE PRETHODNO NISU PREBOLJELE COVID-19 (N=87) SARS-CoV-2 IgG AU/mL Nakon 1. doze Nakon 2. doze Medijan porasta titra antitijela nakon druge doze u odnosu na prvu Medijan 922, , 4 11,7 x Minimalna vrijednost 18,2 1392,8 1,1 x Maksimalna vrijednost , ,8 112,8 x OSOBE KOJE SU PRETHODNO PREBOLJELE COVID-19 (N=16) SARS-CoV-2 IgG AU/mL Nakon 1. doze Nakon 2. doze Medijan porasta titra antitijela nakon druge doze u odnosu na prvu Medijan , , 4 1,1 x Minimalna vrijednost 7 225, ,0 0,8 x Maksimalna vrijednost , ,3 1,6 x

30 30 Titar SARS-CoV-2 IgG SP nakon cijepljenja OSOBE KOJE PRETHODNO NISU PREBOLJELE COVID-19 (N=30) SARS-CoV-2 IgG AU/mL 1 mj. nakon cijepljenja 3 mj. nakon cijepljenja Pad titra antitijela Medijan 8897, , 7-65, 9 % Minimalna vrijednost 1392,8 351, 2-0,2 % Maksimalna vrijednost ,8 7478, 5-81,7 % vrijeme, kinetika i trajanja prisutnosti protutijela na SARS-CoV-2??? pozitivan rezultat većine komercijalnih seroloških testova ne ukazuje na imunitet na ponovnu infekciju, jer nijedan nema dokazanu sposobnost otkrivanja neutralizacijskih protutijela bez obzira na ciljni antigen za određivanje sposobnosti neutralizacije seruma pacijenta trebaju se koristiti neutralizacijski testovi (metode smanjenja plaka i mikroneutralizacije) protutijela su samo jedan od elemenata imunološkog odgovora

31 31 Racionalna upotreba i interpretacija seroloških testova pozitivan nalaz ukazuje na prijašnji kontakt s virusom ili imunološki odgovor nakon cijepljenja negativan nalaz ne isključuje akutnu infekciju serološki testovi nikako se ne smiju koristiti u dijagnozi SARS-CoV-2 infekcije u akutnoj fazi bolesti (0 <14 dana) rezultate interpretirati u skladu sa kliničkom slikom i u odnosu na pripadajuće granične vrijednosti pozitivan rezultat većine komercijalnih seroloških testova ne ukazuje na imunitet na ponovnu infekciju, jer nijedan nema dokazanu sposobnost otkrivanja neutralizacijskih protutijela radi potvrde pozitivnih rezultata, preporuka bila ispitati isti uzorak pacijenta i na alternativnoj platformi (po mogućnosti na različiti ciljni antigen) rezultati dobiveni upotrebom različitih imunokemijskih metoda ne smiju se međusobno usposređivati

32 32 Uloga vitamina D u prevenciji bolesti COVID-19 i težini kliničke slike

33 33 Uloga vitamina D u prevenciji bolesti COVID-19 i težini kliničke slike vitamin D je steroidni hormon koji se proizvodi od 7- dehidrokolesterola izlaganjem UVB zrakama smatra se da populacije s redovitijom i većom izloženošću sunčevim zrakama imaju manji nedostatak vitamina D i stoga nižu stopu smrtnosti od bolesti COVID-19 potvrđeno je da zemlje bliže ekvatoru imaju niže stope smrtnosti od bolesti COVID-19 od onih udaljenih od ekvatora sve je više pokazatelja da je nedostatak vitamina D povezan s drugim nezaraznim bolestima kao i povećanom osjetljivošću na zarazne bolesti, posebno infekcije gornjih dišnih puteva

34 34 Vitamin D i imunološki sustav vitamin D igra važnu imunološku regulatornu ulogu smanjenjem adaptivnih imunoloških odgovora u stanicama respiratornog epitela tijekom virusnih infekcija prigušivanjem proliferacije T stanica pomicanjem sa T pomagačkih stanica tipa 1 (Th1) na T pomagačke stanice tipa 2 (Th2) smanjena proliferacija Th1 smanjenje razine proupalnih citokina i smanjeni stečeni imunološki odgovor što može biti kontraproduktivno u uspostavljanju uspješnog imunološkog odgovora na infekciju smanjena ekspresija proupalnih citokina sputava diferencijaciju i aktivaciju različitih tipova imunih stanica i može spriječiti imunološki posredovana oštećenja

35 35 Deficijencija vitamina D niska razina vitamina D povezana je sa povećanim rizikom od upale pluća i virusnih infekcija gornjih dišnih puteva, a nedostatak sa porastom trombotičkih stanja u oboljelih od bolesti COVID-19 manjak vitamina D češće se javlja u bolesnika s pretilošću i dijabetesom rizična skupina u obolijevanju od teškog oblika bolesti COVID-19 suplementacija vitamina D u bolesnika koji pripadaju rizičnim skupinama bi mogla biti ključna relativno jeftin, siguran i široko dostupan kao dodatak prehrani malim, redovnim dnevnim dozama vitamina D moguće je jačanje imunološkog sustava, a za njegov optimalni učinak na kosti potrebna je doza od IU. Dnevne doze vitamina D do IU se smatraju sigurnima, ali i znatno iznad potrebnih

36 36 Određivanje koncentracije vitamina D u osoba sa vrijednošću vitamina D ispod 50 nmol/l se preporuča testirati razinu 25-OH vitamina D ako je moguće referentnom metodom tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti spregnute s dvojnom spektrometrijom masa (LC-MS/MS) kako bi se izbjegao interferirajući učinak drugih steroidnih struktura, a suplementima opskrbili isključivo oni kojima su suplementi neophodni Klinički zavod za medicinsku biokemiju i laboratorijsku medicinu KB Merkur i Klinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku KB Dubrava proveli su pilot-studiju: određivanje koncentracije vitamina D LC-MS/MS metodom osobama koje su se javile u hitnu službu KB Merkur i KB Dubrava sa simptomima bolesti COVID-19 (proljeće 2021.g) 2 skupine ispitanika. pozitivan qrt-pcr test za RNA virusa SARS-CoV2 negativan qrt-pcr test za RNA virusa SARS-CoV2

37 Postoji li statistički značajna razlika u koncentraciji vitamina D u osoba kojima je potvrđena infekcija SARS- CoV-2 u odnosu na one sa negativnim qrt-pcr testom? 37

38 Postoji li statistički značajna razlika u koncentraciji vitamina D u osoba kojima je potvrđena infekcija SARS- CoV-2 u odnosu na one sa negativnim qrt-pcr testom? 38

39 39 Postoji li statistički značajna razlika u koncentraciji vitamina D u osoba kojima je potvrđena infekcija SARS- CoV-2 u odnosu na one sa negativnim qrt-pcr testom? 75 mmol/l 16% - vitamin D >75 mmol/l 12% - vitamin D >75 mmol/l

40 40 Zaključci određivanje specifičnih protutijela na virus SARS-CoV-2 serološkim testovima predstavlja dodatni alat u borbi i kontroli pandemije bolesti COVID-19 udio stanovništva koje je preboljelo bolest (epidemiološko praćenje, gospodarski oporavak (smanjenje broja samoizolacija i karantena radno sposobnog stanovništva) i normalizacija raznih segmenata društva, npr. školsko-obrazovni i zdravstveni sustav) cijepljenje - trenutno jedini siguran način sprečavanje zaraze nužno kontrolirati i planirati kroz praćenje titra specifičnih protutijela (docjepljivanje?) rezultati serološkog testiranja korisni su ako se ispravno interpretiraju informacije o vrsti testa (kvalitativni ili kvantitativni), izotip i ciljni antigen mjerenog protutijela (IgM, IgA ili IgG stvoren na S protein ili nukleokapsidni protein virusa) i vremenu testiranja u odnosu na vrijeme kontakta sa virusom (infekcija ili cijepljenje) u nedostatku specifičnih i ciljnih farmaceutika, nužno raditi na podizanju imunološkog statusa organizma vitamin D jeftin i pristupačan suplement, vrlo dobra suportivna terapija nisu dokazane nuspojave u slučaju unosa većih količina od preporučene; u određenih rizičnih skupina (dijabetičari, pretile osobe, kardiovaskularni bolesnici) preporuča se praćenje koncentracije vitamina D specifičnim metodama (LC-MS7MS) u svrhu korekcije terapije